Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول لتصور اميلويد لويحات Aβ في نماذج الفئران مرض الزهايمر باستخدام ميثوكسي-X04، الذي يعبر حاجز الدم في الدماغ وبشكل انتقائي يربط بيتا-مطوي أوراق وجدت في لويحات Aβ نواة كثيفة. فإنه يسمح الفرز المسبق من أقسام الأنسجة التي تحتوي على لوحة قبل المناعية وتجهيز المجهر الإلكتروني.
Abstract
ويرد بروتوكول مفصلة هنا لتحديد اميلويد لويحات Aβ في أقسام الدماغ من نماذج الماوس مرض الزهايمر قبل المناعية تضمين ما قبل (على وجه التحديد لالمتأين ملزم الكالسيوم محول جزيء 1 (IBA1)، وهو بروتين ملزمة الكالسيوم التي أعرب عنها الخلايا الدبقية الصغيرة) ومعالجة الأنسجة ل المجهر الإلكتروني (EM). ميثوكسي-X04 هو صبغة الفلورسنت التي تعبر حاجز الدم في الدماغ وبشكل انتقائي بربط أوراق بيتا مطوي وجدت في لويحات Aβ نواة كثيفة. حقن الحيوانات مع ميثوكسي-X04 قبل للتضحية وتثبيت الدماغ يسمح الفرز المسبق واختيار من أقسام الدماغ التي تحتوي على لوحة لمزيد من المعالجة مع التلاعب تستغرق وقتا طويلا. وهذا مفيد بشكل خاص عند دراسة علم الأمراض في وقت مبكر م ضمن مناطق محددة في الدماغ أو الطبقات التي قد تحتوي على عدد قليل جدا من لويحات والحاضر إلا في جزء صغير من الأقسام. معالجة ما بعد الوفاة من أقسام الأنسجة مع الكونغو الأحمر، Thioflavin S، وThioflتي AVIN (أو حتى مع ميثوكسي-X04) يمكن تسمية ورقة بيتا مطوي، ولكن يتطلب تطهير واسعة مع الإيثانول لإزالة الصبغة الزائدة وهذه الإجراءات لا تتفق مع الحفاظ التركيبية. ومن شأنه أيضا أن تكون غير فعالة لأداء العلامات لAβ (وغيرها من علامات الخلوية مثل IBA1) على جميع أقسام الدماغ من المناطق ذات الاهتمام، إلا أن تسفر عن جزء صغير يحتوي على لويحات Aβ في الموقع المناسب. الأهم من ذلك، لويحات Aβ لا تزال مرئية بعد معالجة الأنسجة لEM، والسماح لتحديد دقيق للمناطق (بشكل عام ليصل إلى بضعة مليمترات مربعة) لفحص بالمجهر الإلكتروني.
Introduction
اميلويد Aβ تشكيل اللوحة هو السمة المميزة عصبية مرضية الرئيسية لمرض الزهايمر (AD). ومع ذلك أدلة متزايدة تشير إلى الأدوار المهمة للنظام المناعي في 1،2 تطور المرض. على وجه الخصوص، أنشأت بيانات جديدة من الدراسات قبل السريرية والسريرية الخلل المناعي كمحرك أساسي ومساهم في AD علم الأمراض. مع هذه النتائج، ظهرت الخلايا المناعية المركزية والطرفية الأهداف العلاجية بأنها واعدة لمدة 3 م. بروتوكول التالي يجمع بين الضوء والمجهر الإلكتروني (EM) لتوليد رؤى جديدة في العلاقة بين Aβ ترسب البلاك والتعديلات المظهرية دبقية في م. يسمح هذا البروتوكول وصفها لويحات Aβ في نماذج الفئران ميلادي استخدام في حقن الجسم الحي من صبغة الفلورسنت ميثوكسي-X04. ميثوكسي-X04 هو مشتق الكونغو الأحمر التي يمكن بسهولة عبور حاجز الدم في الدماغ لدخول حمة الدماغ وربط صحائف β-مطوي مع ارتفاعffinity. منذ صبغ فلوري، يمكن استخدامه في الجسم الحي الكشف عن Aβ وحة ترسب مع اثنين من الفوتون المجهري 4. مرة واحدة متجهة إلى Aβ، ميثوكسي-X04 لا فصل أو إعادة توزيع بعيدا من لويحات، وأنه يحتفظ مضان على مر الزمن. يدار بشكل عام محيطيا للسماح للتصوير غير الغازية للديناميات الدماغ 5. يبقى مضان أيضا بعد تثبيت ألدهيد، والسماح لتحليل المتلازم بعد الوفاة، بما في ذلك التحقيق في وفاة الخلايا العصبية في المنطقة المجاورة لويحات Aβ 6.
يأخذ هذا البروتوكول الاستفادة من خصائص ميثوكسي-X04 لتحديد أقسام الدماغ من APP SWE / PS1A 246E الفئران (APP-PS1، coexpressing طفرة مزدوجة في APP الجينات Lys670Asn / Met671Leu، والإنسان presenilin PS1-A264E البديل) 7 الذي يحمل Aβ لويحات في مناطق معينة من الفائدة (CA1 الحصين، المشععة طبقات، والجوبية-moleculare) قبل إلى ما قبل تضمين المناعية ضد علامة دبقية المتأينة ملزم الكالسيوم محول جزيء 1 (IBA1) لتصور أجسام الخلايا الدبقية والعمليات مع EM. أعطيت الفئران حقن داخل الصفاق من حل ميثوكسي-X04، 24 ساعة قبل تثبيت الدماغ من خلال نضح transcardial. ويتم الحصول على أقسام الدماغ الاكليلية باستخدام vibratome. يتم فحص الأجزاء التي تحتوي على CA1 الحصين تحت المجهر الفلورسنت لوجود لويحات Aβ في المشععة لطبقات والجوبية-moleculare. المناعية لIBA1، ثم يتم إجراء رباعي أكسيد الأوزميوم بعد التثبيت، والبلاستيك الراتنج التضمين على أقسام الدماغ المحدد. في نهاية هذا البروتوكول، وأقسام يمكن أرشفة دون مزيد من التدهور التركيبية، وعلى استعداد لباجتزاء سامسونج وفحص التركيبية. الأهم من ذلك، لويحات لا تزال فلوري بعد المناعية مع الأجسام المضادة مختلفة، على سبيل المثال IBA1 كما هو الحال في هذا البروتوكول. فإنها تصبح أكثر قتامة رهان neuropil من المحيط التالية رباعي أكسيد الأوزميوم بعد التثبيت، بشكل مستقل عن ميثوكسي-X04 تلطيخ، مما يساعد على تحديد دقيق للمناطق الفائدة، بشكل عام ليصل إلى بضعة مليمترات مربعة، لفحصها بالمجهر الإلكتروني النافذ.
ويوفر هذا النهج مترابط وسيلة فعالة لتحديد أقسام الدماغ محددة لفحص على مستوى التركيبية. وهذا مفيد بشكل خاص عند دراسة علم الأمراض الميلادي في وقت مبكر، في مناطق محددة في الدماغ أو الطبقات التي قد تحتوي سوى عدد قليل من لويحات Aβ، موجودة في جزء صغير فقط من أقسام الأنسجة. خلال هذه الأوقات خاصة، فإنه سيكون غير فعال لاستخدام المناعية لAβ (ووضع العلامات مزدوج للعلامات الخلوية الأخرى مثل IBA1) على عدة أقسام الدماغ ببساطة أن تسفر عن جزء صغير يحتوي على لويحات Aβ في الموقع المناسب. وبالإضافة إلى ذلك، حقن الفئران حية مع ميثوكسي-X04 قبل أن يضحي ومعالجة الأنسجة لا التراضيالبريد الحفاظ التركيبية. الطرق البديلة مثل تلطيخ بعد الوفاة مع الكونغو الأحمر، Thioflavin S، Thioflavin تي أو ميثوكسي-X04 على أقسام الأنسجة الثابتة تتطلب التفريق تلطيخ في الإيثانول، 11/08 الذي يسبب الضغط الاسموزي ويعطل التركيب الدقيق. الكونغو الأحمر هو أيضا مادة مسرطنة معروفة الإنسان 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب وتنفيذها في إطار المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية، بما يتفق مع المجلس الكندي بشأن المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان كما تدار من قبل لجنة رعاية الحيوان من جامعة لافال. واستخدمت APP-PS1 الفئران الذكور ما بين 4 و 21 شهرا من العمر. وتم إيواء هذه الحيوانات في إطار دورة ضوء الظلام 12 ساعة في 22-25 درجة مئوية مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
1. إعداد الحل ميثوكسي-X04
- إعداد 5 ملغ / مل حل من ميثوكسي-X04 9 عن طريق إذابة ميثوكسي-X04 في محلول يحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، و 45٪ بروبيلين غليكول، و 45٪ فوسفات الصوديوم مخزنة المالحة (0.9٪ كلوريد الصوديوم في 100 ملي العازلة الفوسفات ، ودرجة الحموضة 7.4).
- باستخدام توازن دقيق، تزن 5 ملغ من مجمع ميثوكسي-X04. تحت غطاء الدخان، حل ميثوكسي-X04 في DMSO ويحرك حتى يتم الحصول على حل مخضر واضح. تباعا إضافة غليكول البروبيلين وفتاهosphate العازلة المالحة مع التحريك مع كل إضافة.
- تحريك الحل في 4 درجات مئوية على محور دوار O / N. الحصول على مستحلب الأخضر المصفر. يمكن تخزين الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين دون تدهور.
2. ميثوكسي-X04 الحل حقن
- 24 ساعة قبل التروية، وتزن الفئران وإعطاء كل فأر حقنة داخل الصفاق من ميثوكسي-X04 بجرعة 10 ملغم / كغم من وزن الجسم باستخدام إبرة 27 ½ G.
3. Transcardial الإرواء من الفئران المحقونة
- في اليوم قبل التروية، وإعداد كميات مناسبة من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 3.5٪ الأكرولين، والحلول 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) 13 وتخزينها في 4 درجات CO / N.
ملاحظة: سيتم استخدام هذه الحلول على حد سواء نضح وقبل تضمينها المناعية. عناية خاصة عند العمل مع الأكرولين، كما هو تآكل والسامة على حد سواءالباحثون والبيئة. وبالإضافة إلى ذلك، منذ الأكرولين هو تآكل إلى البلاستيك، دائما استخدام الأواني الزجاجية مناسبة لإعداد حلول الأكرولين. - في يوم التروية، تصفية PFA والأكرولين باستخدام ورق الترشيح الخشنة من 25 ميكرون الاحتفاظ الجسيمات.
- خلال التروية، واستخدام مضخة تحوي على تسليم 15 مل من برنامج تلفزيوني، 75 مل من الأكرولين، و 150 مل من PFA تباعا إلى الدورة الدموية الماوس، بمعدل تدفق 25 مل / دقيقة.
توخي الحذر. أداء نضح بدقة داخل غطاء الدخان لتجنب أبخرة ضارة من منهاج العمل والأكرولين.- لإعداد مضخة، أدخل أحد طرفيه في حل برنامج تلفزيوني، وملء الأنبوب (عقد حوالي 15 مل) مع برنامج تلفزيوني، وإصلاح 25 G المجنحة إبرة جمع الدم إلى الطرف الآخر. في جميع الأوقات، تأكد من أن أنابيب خالية من أي فقاعات الهواء المحاصرين.
- وضع أنبوب مباشرة في زجاجة الأكرولين بعد وضع مضخة نضح مع أنابيب مليئة برنامج تلفزيوني.
- لaesthetize الماوس في وقت واحد مع 90 ملغم / كغم من وزن الجسم جرعة من الصوديوم بنتوباربيتال حقن داخل الصفاق باستخدام 27 ½ G إبرة. تقييم الاستجابات لالقرصات الذيل / اصبع القدم. المضي قدما إلا إذا كان الماوس لا يستجيب لمثل هذه مكره، المحفزات المؤلمة.
- تأمين الماوس في موقف ضعيف (مستلقيا على ظهره ووجهه لأعلى) عن طريق تسجيل في الأرجل الأمامية وhindpaws إلى سطح العمل وفضح بعناية قلب دون أن تسبب تلفا للأعضاء أخرى. مما لا شك فيه للعمل بسرعة بعد ثقب الحجاب الحاجز.
- إجراء شق طريق الجلد مع مقص جراحي على طول خط الوسط الصدري ابتداء الذيلية إلى القفص الصدري والمضي قدما منقاري إلى الترقوة.
- جعل اثنين من الشقوق الجانبية إضافية على طول قاعدة القفص الصدري البطني. تحرك بلطف ويعلقون اللوحات اثنين من الجلد، مما لا شك فيه أن كشف التجويف الصدري بأكمله.
- عقد عملية الخنجري مع ملقط حادة لفضح تجويف الصدري وتحقيق استقرار مقص أشارالصورة. قطع طريق الحجاب الحاجز والقفص الصدري، والحرص على تجنب ثقب الرئتين، والاستمرار في منقاري شق إلى الترقوة. مما لا شك فيه للعمل بسرعة بعد ثقب الحجاب الحاجز.
- المسيل للدموع بلطف كيس التامور مع ملقط حادة. عقد قلب ثابت مع ملقط حادة، وقطع الأذين الأيمن، وبدء ضخ PBS. إدراج الفور الإبرة جمع الدم إلى البطين الأيسر.
- يروي الماوس مع برنامج تلفزيوني (في الأنبوب)، يليه الأكرولين لمدة 3 دقائق (الموافق 75 مل) ثم التبديل إلى منهاج العمل لمدة 6 دقائق (الموافق 150 مل). تأكد من إيقاف تدفق المضخة قبل ان ينتقل الحل لمنع الفقاعات من دخول الأنبوب.
- قطع رأس الماوس واستخراج الدماغ ثابتة ووضعه مباشرة في قارورة زجاجية تحتوي على 4٪ PFA لا يقل عن 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
- لاستخراج المخ، استخدم مقص وملاقط لقطع طريق الجلد لفضح الجمجمة. بعناية كسر المرجع الجمجمةأون بين العينين، ورقاقة قطع صغيرة منه لفضح الدماغ الكامنة.
- إزالة بعناية يتعرض الدماغ وظيفة الإصلاح مع PFA 4٪ لمدة 2 ساعة إضافية قبل الانتقال لvibratome باجتزاء.
4. الدماغ باجتزاء باستخدام vibratome
- غسل الدماغ ثابت 3 مرات مع المبردة برنامج تلفزيوني. باستخدام شفرة حلاقة حادة، وإزالة البصلة الشمية (ما لم تكن هذه المنطقة قيد التحقيق) وقطع الدماغ عرضيا إلى 2-3 قطع من يساوي تقريبا الارتفاع، والتي يمكن مقطوع في وقت واحد من أجل تسريع العملية.
- الغراء قطعة من نسيج الدماغ عموديا على لوحة عينة المضمون في الدرج. تأكد من أن قطع سطح أملس تتمسك بحزم إلى لوحة العينة ولا يحصل طردت أثناء إجراء باجتزاء. إضافة ما يكفي من حل PBS في الدرج حتى غمرت سطح الدماغ بأكمله تماما. فمن المهم للحفاظ على عشرقطع المخ الإلكترونية وأقسام لاحقة مغمورة تماما في برنامج تلفزيوني في جميع أنحاء هذه الخطوة.
- وضع صينية في vibratome، وضبط سرعة باجتزاء إلى 0.5 ملم / ثانية، وتواتر باجتزاء إلى 90 هرتز، وسمك تغذية إلى 50 ميكرون من أجل تسفر عن 50 ميكرون أبواب سميكة. ثم نقل المقاطع في قوارير الزجاج 20 مل تحتوي على حل cryoprotectant (40٪ في برنامج تلفزيوني، و 30٪ جلايكول الإثيلين، و 30٪ الجلسرين) باستخدام الفرشاة الجميلة. تخزين قوارير في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. بدلا من ذلك، والحفاظ على المقاطع في برنامج تلفزيوني لفحص فوري كما هو موضح في الخطوات التالية.
5. القسم فحص للوجود لويحات الملون ميثوكسي-X04-
- مع المعونة من مخ الفأر التجسيمي أطلس 14، مقاطع مختارة الدماغ الذي يحتوي على منطقة الفائدة، على سبيل المثال، CA1 الحصين المستخدمة في المثال الحالي. وضع كل قسم في بئر في لوحة الثقافة 24 أيضا تحتوي على حل cryoprotectant يكفيوذلك لمنع المقاطع من الجفاف.
- دراسة كل قسم على التوالي، لتجنب الجفاف الأقسام، وذلك باستخدام الإجراء التالي:
- إضافة قطرات من برنامج تلفزيوني على شريحة المجهر مع ماصة للتصرف، ووضع القسم الخاص الحبرية.
- دراسة قسم تحت المجهر الفلورسنت لتحديد المناطق التي تحتوي على ميثوكسي-X04 المسمى لويحات Aβ.
ملاحظة: ميثوكسي-X04 يمكن تصور بسهولة باستخدام مضان الأشعة فوق البنفسجية (UV) مرشح (الإثارة 340-380 نانومتر).
- التقاط الصور من المناطق ذات الاهتمام (ROI) في حقل مشرق وكذلك في وضع مضان دون تحريك المسرح المجهر، لأن كل صورة يجب أن تظهر نفس المنطقة في كل المجالات من أجل ربط وجود لويحات مباشرة إلى المنطقة الهيكلية لل قسم الأنسجة.
- حفظ وتسمية الصور الملتقطة وفقا لعدد الحيوانات. سجل أيضا عدد جيد في لوحة ومجال الصور تاكين. على سبيل المثال، مثال: 9978A1B. عدد الحيوانات: 9978. حسنا رقم: A1؛ الملعب: مشرق. وضع القسم الخلفي في المعينة بشكل جيد بمجرد الانتهاء من التصوير.
ملاحظة: في النهاية، لكل قسم فحص، ويتم الحصول على صورتين، واحدة في مشرق الميدان وآخر في مجال الأشعة فوق البنفسجية. - فتح الصورتين من نفس العائد على الاستثمار (واحد في مجال مشرق والآخر في مجال الأشعة فوق البنفسجية) في صورة ياء، واستخدام البرنامج المساعد MosaicJ، محاذاة حواف الصورتين وحفظ الصورة الانحياز ومجتمعة وفقا لعدد جيدا جاءت.
- حفظ الصورة في مجلد منفصل مع عدد من الحيوان معين. الجمع بين الصور لتحديد وحصر لويحات في قسم الأنسجة، ولها مرأى ومسمع من قسم كامل في اثنين من مجالات مختلفة (مشرق والأشعة فوق البنفسجية).
- بعد الانتهاء من عملية الفرز، وتخزين أقسام فحص عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في لوحة الثقافة 24 أيضا تحتوي على cryoprotectant حتى المناعية أو مزيد من المعالجة هو كاليفورنياrried بها.
6. قبل تضمين المناعية للIBA1
ملاحظة: إجراء المناعية للIBA1 على أقسام عائمة بحرية اختيار عن طريق وضع لوحة على الكرسي الهزاز تتحرك ببطء في RT.
- اغسل الأقسام 3 مرات مع ما يقرب من 1 مل برنامج تلفزيوني، كل غسل دائم لمدة 10 دقيقة.
- إخماد بيروكسيديزات الذاتية مع 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين في محلول برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. هذه الخطوة يمنع النشاط البيروكسيديز غير محددة، وهو أمر مهم لتجنب تلطيخ الخلفية.
- غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- احتضان المقاطع في 0.1٪ بوروهيدريد الصوديوم في محلول برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. هذه الخطوة مهمة للحد من أي الألدهيدات المتبقية من الخطوة التثبيت، وأهمية خاصة إذا تم استخدام الأكرولين في تثبيت الأنسجة.
- غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 10 دقيقة في كل مرة، وتأكد من إزالة جميع الفقاعات.
- منع المقاطع لمدة 1 ساعة.قد تتطلب الأجسام المضادة المختلفة مرات الحجب المختلفة والحلول. لIBA1، وإعداد عازلة تمنع تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 3٪ زلال المصل البقري، و 0.01٪ تريتون X-100 في 50 المالحة ملي تريس مخزنة (TBS، ودرجة الحموضة 7.4).
ملاحظة: الخطوة الحجب هو منع انوعي ملزمة من الأجسام المضادة الأولية. على تركيز منخفض من تريتون X-100 يسمح permeabilization طفيف من الأغشية لتحسين تلطيخ، ومنخفض بما فيه الكفاية للحفاظ على معظم ملامح التركيبية من الأنسجة تحت EM. - إزالة المنطقة العازلة حظر من الأنسجة، واحتضان في حل الأجسام المضادة الأولية (أرنب مكافحة IBA1، مخففة [1: 1000] في المخزن حجب) في 4 درجات CO / N.
- يغسل في TBS 3 مرات لمدة 10 دقيقة في كل مرة.
- احتضان في الضد الثانوية (الماعز المضادة للأرنب مترافق لالبيوتين) [1: 200] في 0.05 M TBS لمدة 90 دقيقة.
- يغسل في TBS 5 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- احتضان في أفيدين-البيوتين حل معقد (أفيدين [1: 100]، البيوتين [1: 100]) في TBSالحل لمدة 1 ساعة.
- يغسل في TBS 5 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- الكشف عن تلطيخ IBA1 مع 0.05٪ diaminobenzidine (DAB) و0.015٪ بيروكسيد الهيدروجين في TBS لمدة 8 دقائق.
ملاحظة: توقيت التنمية DAB قد تختلف من بروتوكول للبروتوكول وينبغي أن تحدد من خلال دراسة بسرعة الأقسام الملون تحت المجهر الضوئي.
ملاحظة: للحصول على IBA1، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على تصور واضح للأجسام الخلايا والعمليات في الخلايا الدبقية الصغيرة ملطخة IBA1 في 20X (انظر الشكل 2 على سبيل المثال تمثيلي). كن حذرا باستخدام DAB، كما هو مادة مسرطنة معروفة. - تجنب الإفراط في وضع من خلال رصد دقيق لأقسام (كما هو موضح أعلاه) خلال هذه الخطوة. وقف رد فعل عن طريق غسل المقاطع في الجريدة الرسمية المبردة 5 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة.
7. معالجة المجهري للإلكترون
- إعداد 1٪ حل رباعي أكسيد الأوزميوم في برنامج تلفزيوني في قارورة زجاجية. رباعي أكسيد الأوزميوم هو حساس. تغطية زقارورة معشوقة مع رقائق الألومنيوم لحماية الحل بعيدا عن الضوء.
كن حذرا باستخدام رباعي أكسيد الأوزميوم، كما هو مادة كيميائية خطرة جدا. تنفيذ هذه والخطوات التالية داخل غطاء الدخان. - إزالة برنامج تلفزيوني من الأقسام ونشرها شقة باستخدام الفرشاة الجميلة. تنفيذ هذه الخطوة بشكل جيد في وقت واحد للحفاظ على أقسام من الجفاف. تأكد لشد الأجزاء على الفور قبل أن يضيف رباعي أكسيد الأوزميوم، لأن أي طيات في الأقسام سيصبح دائما ومحاولة لشد الأنسجة آخر الأوسيميوم التثبيت سوف فقط كسر الفروع.
- تزج المقاطع في رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة 30 دقيقة في RT، مضيفا قطرة واحدة من رباعي أكسيد الأوزميوم في وقت واحد مع ماصة نقل، لمنع المقاطع من للطي. تغطية البئر مع رقائق الألومنيوم لحماية أقسام من الضوء.
ملاحظة: هذه الخطوة على إصلاح الدهون داخل الأقسام. سوف تظهر الأنسجة مظلمة جدا بعد الأوسيميوم بعد التثبيت. - في حين أقسام هي في tetro الأوسيميومشي ده، وإعداد راتنج البلاستيك في دورق المتاح عن طريق خلط 20 غراما مكون A، 20 ز مكون B، 0.6 غرام مكون C، و 0.4 مكون ز د الجمع بين المكونات معا في الترتيب المذكور أعلاه ومزجها جيدا باستخدام 10 مل ماصة المصلية حتى يتم الحصول على لون موحد.
- نقل الخليط على استعداد للأطباق الألومنيوم وزنها. سيحصلون على أقسام الأنسجة بمجرد أن يتم المجففة.
- يذوى المقاطع في زيادة تركيزات الإيثانول لمدة 2 دقيقة في الترتيب التالي: 35٪، 35٪، 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، 100٪، 100٪، 100٪.
- لإزالة الإيثانول المتبقية، وتزج المقاطع في أكسيد البروبيلين 3 مرات لمدة 2 دقيقة في كل مرة. إزالة المقاطع المجففة من لوحة الثقافة 24 بشكل جيد في 20 مل قارورة من الزجاج. دائما استخدام قوارير زجاجية عند العمل مع أكسيد البروبيلين كما يذوب البلاستيك، والحفاظ على الحذر، كما هو الحال الخطرة.
- استخدام عازمة طرف زجاج ماصة أو الفرشاة الجميلة لنقل أقسام من soluti أكسيد البروبيلينعلى في الراتنج وترك O / N للتسلل في RT. يجب الحرص على عدم تمييع الراتنج مع أكسيد البروبيلين.
- تضمين المقطع مع الراتنج على بولي كلورو ثلاثي فلورو الإيثيلين (PCTFE) filmsheets:
- وضع أطباق الألومنيوم وزنها تحتوي على عينات إلى 50 - 60 درجة مئوية الفرن لمدة 10-15 دقيقة قبل تضمين المقاطع على filmsheets PCTFE.
- عند تضمين أقسام، والعمل مع واحدة من الألمنيوم تزن الطبق في وقت واحد. باستخدام الفرشاة الجميلة، والطلاء بطبقة رقيقة من راتنج على ورقة فيلم PCTFE واحد.
- نقل قسم واحد من الأنسجة في وقت من الألومنيوم وزنها الطبق إلى ورقة فيلم PCTFE. إزالة الراتنج الزائدة من جميع أنحاء الأنسجة، والحرص على عدم تعكير صفو ذلك.
- بعد نقل جميع الأقسام عن بعضها وزنها الطبق إلى ورقة فيلم PCTFE، ضع ورقة PCTFE الثانية على الأولى، وخلق شطيرة من الأنسجة والراتنج في الفترة ما بين 2 ورقة.
- بلمرة الراتنج في حاضنة لمدة 3 أيام في 55-60 درجة مئوية.
- والمواد هي الآن جاهزة للباجتزاء سامسونج وفحص التركيبية والتقنيات المتخصصة والتي غالبا ما يتم تنفيذها من قبل المرافق الأساسية EM. تخزين العينات بين الصفائح الرقيقة PCTFE بسلام في RT دون تدهور التركيبية.
ملاحظة: يتم شرح الخطوات اللاحقة لسامسونج باجتزاء ونقل الفحص المجهري إلكترون في بروتوكول منفصل 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح هذا القسم النتائج التي يمكن الحصول عليها في المراحل الحرجة مختلفة من البروتوكول. على وجه الخصوص أظهرت النتائج أمثلة من أقسام الدماغ التي تحتوي على ميثوكسي-X04 لويحات الملون في منطقة محددة وطبقات من الفائدة: وCA1 الحصين، المشععة طبقات، والجوبية-moleculare. وتصور لويحات ومنظمة إقليمية و/ رقائقي من الحصين على التوالي وذلك باستخدام مزيج من الأشعة فوق البنفسجية ومرشحات حقل مشرق (الشكل 1). وimmunostained أقسام الدماغ مختارة في وقت لاحق ومعالجتها لم في حين تتبع لويحات Aβ، وبالنظر إلى أن أنها لا تزال الفلورسنت المناعية التالية، وتصبح أغمق من neuropil المحيطة بعد العلاج مع رباعي أكسيد الأوزميوم وتضمينها (الشكل 1). هذا يسمح احد لتحديد المجالات (المربعة عموما بضعة ملليمترات) لفحص مع المجهر الإلكتروني على أساس المحلىنشوئها لويحات. وعلاوة على ذلك، يتم وصف بروتوكول محسن لمرحلة ما قبل التضمين-المناعية من الخلايا الدبقية الصغيرة مع IBA1 هنا. هذا البروتوكول يعطي مردود التصور استثنائية من أجسام الخلايا الدبقية والعمليات الكبيرة والصغيرة (الشكل 2)، وكذلك اختراق الأجسام المضادة داخل أقسام الدماغ. وبالتالي فإنه يسهل التعرف على أجسام الخلايا الدبقية والعمليات على مستوى التركيبية، ودراسة تفاعلاتها مع لويحات Aβ (الشكلان 3 و 4).
الشكل 1. التصور من Aβ لويحات في الفئران APP-PS1 عمرها 21 شهرا عن طريق المجهر الضوئي، وبعد حقن الجهازية لصبغ نيون ميثوكسي-X04. AB) التصوير المزدوج من قسم الحصين واحد باستخدام وسائط الميدان ومضان مشرق. وتصور المناطق والطبقات الفائدة في ظل مشرق الميدان(A)، ولويحات Aβ المترجمة تباعا باستخدام فلتر الأشعة فوق البنفسجية في مجموعة من 340-380 نانومتر (B). CD) التصوير المزدوج من قسم الحصين آخر قبل (C) وبعد (D) قبل تضمينها المناعية للIBA1، تليها مرحلة ما بعد التثبيت في رباعي أكسيد الأوزميوم، والجفاف في الإيثانول، وتضمينها في راتنج البلاستيك على النحو المطلوب لانتقال المجهر الإلكتروني. أن يكون لاحظت، اللوحة (محاطة خط منقط) لا تزال واضحة على معالجة الأنسجة للفحص المجهري الإلكترون. تصور لويحات عند تقليم كتل الأنسجة يسمح لاختيار دقيق للمناطق لصورة في قرار مكانية عالية. على نطاق والحانات = 300 ميكرون A و B، و 150 ميكرون لجيم ودال الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. السادس sualization من دبقية خلايا الجسم والعمليات الجميلة في عمرها 21 شهرا الفئران APP-PS1 التي كتبها IBA1 تلطيخ في ضوء مجهرية مستوى. AB) أمثلة على الخلايا الدبقية الصغيرة ملطخة IBA1-تظهر توزيع تتجمع عندما ربطوا مع لويحات Aβ (حددها التصوير مضان مترابط من ميثوكسي-X04، محاطة خط منقط) كما لوحظ من قبل رباعي أكسيد الأوزميوم آخر تثبيت وراتنج البلاستيك التضمين. CD) أمثلة على الخلايا الدبقية الصغيرة ملطخة IBA1 المرتبط ويحات Aβ بعد الأوسيميوم رباعي أكسيد بعد تثبيت والبلاستيك الراتنج التضمين. لاحظ أن لويحات تصبح أكثر قتامة من neuropil المحيط بهم التالية الأوسيميوم بعد التثبيت، مما يتيح تتبع مواقعها. مقياس شريط = 250 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
060 / 54060fig3.jpg "/>
الشكل 3. التصور المزدوج لويحات Aβ وIBA1-المناعية في عمره 6 أشهر الفئران APP-PS1 على مستوى التركيبية. أ) مثال من الكثيفة الأساسية Aβ وحة معترف بها من قبل هيكل ييفي المدمجة (انظر الشكل) وبالتعاون مع neurites التي التصنع مع ميزات التركيبية الالتهام الذاتي. ب) مثال على عملية دبقية الملون IBA1 (م؛ الملونة في اللون البنفسجي) وجدت بالقرب من لوحة Aβ التي تحتوي على رواسب أميلويد. ويمكن أيضا أن التعديلات الميتوكوندريا (كما هو موضح من قبل العلامات النجمية) أن ينظر في إطار عملية دبقية صغيرة. أن يكون لاحظت، وقد حصلت هذه الصورة على الحدود الراتنج الأنسجة (أبيض، على يمين الصورة) حيث تغلغل الأجسام المضادة وكثافة تلطيخ هو الحد الأقصى. على نطاق والحانات = 2 ميكرون لA، 1 ميكرون ل B. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 4. أمثلة إضافية من الخلايا الدبقية الصغيرة immunostained IBA1 في الفئران APP-PS1 عمرها 6 أشهر كما لوحظ مع نقل المجهر. م) أمثلة الملون IBA1 الجسم خلية دبقية صغيرة والعمليات (م) حصلت أبعد من الحدود الراتنج النسيج ، والتي تبين لاختراق ممتازة من الأجسام المضادة وتلطيخ كثافة أعمق داخل قسم باستخدام هذا البروتوكول. BV = الأوعية الدموية، د = التغصنات، في = إدراج، ق = العمود الفقري شجيري، T = محطة محور عصبي. وتظهر رؤوس سهام الشقوق متشابك. على نطاق والحانات = 1 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يشرح هذا البروتوكول نهج مترابط لاستهداف ويحات Aβ نواة كثيفة مع EM. ميثوكسي-X04 في حقن الجسم الحي يسمح اختيار السريع لأقسام الدماغ التي تحتوي على لويحات Aβ في مناطق معينة وطبقات من الفائدة، وعلى سبيل المثال CA1 الحصين، المشععة طبقات، والجوبية-moleculare. في المثال الحالي، وكان الجمع بين ميثوكسي-X04 قبل الفحص مع ما قبل التضمين المناعية للIBA1 لدراسة كيفية مختلفة تتفاعل الظواهر دبقية صغيرة مع نقاط الاشتباك العصبي في مستوى التركيبية في وجود لويحات Aβ نواة كثيفة.
الخلايا الدبقية الصغيرة تستجيب بشكل لا يصدق ما يحيط بهم، وقد نشاطهم التهابات درس طويل في سياق تقويض وظيفة المخ المعتادة وتعزيز النهوض م. على وجه الخصوص، تورط هذه الخلايا في عمليات الاعصاب بسبب تفعيلها واسعة وإطلاق السيتوكينات الموالية للالتهابات، مما يؤدي إلى لجنة حقوق الإنسانneuroinflammation أونك، واضطراب الدماغ العادي التوازن 15. في السنوات الأخيرة، ومع ذلك، وعرضت أيضا هذه الخلايا المناعية المقيمين لإعادة بنشاط الدوائر العصبية في الدماغ السليم، مما يؤدي إلى تحديد آليات المسببة للأمراض جديدة 16،17. قد تصبح أدوارهم فسيولوجية في نقاط الاشتباك العصبي dysregulated خلال neuroinflammation في ميلادي، مما أدى إلى فقدان متشابك إلى تفاقم، حاليا أفضل المضاهاة المرضية من التدهور المعرفي في مختلف الظروف الاعصاب 18،19.
التعديلات التي أدخلت على تضمين السابق قبل IBA1 طريقة تلوين 13 تسمح الآن أفضل الاختراق من الأجسام المضادة عبر أقسام الدماغ، فضلا عن التصور من أجسام الخلايا الدبقية والعمليات غرامة على مستوى التركيبية. عموما، يحتاج البروتوكول التي يتعين القيام بها بشكل صارم من نضح الماوس حتى التضمين راتنج البلاستيك من المقاطع الأنسجة، بالنظر إلى أن تدهور التركيبيةيمكن أن تحدث في أي خطوة في بين تهدد سلامة الأغشية الخلوية، العضيات، عناصر هيكل الخلية، وما إلى ذلك.
يمكن عمل هذا البروتوكول من دون أي المناعية (بحذف المادة 6) لتصور لويحات Aβ نواة كثيفة فقط، ولكنها توفر أيضا أداة قوية لدراسة الآليات المعقدة م المرضية وعلاقتها Aβ ترسب، والأجسام المضادة المختلفة التي يمكن استخدامها ل التركيز على أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الضامة المستمدة محيطيا، الخلايا الدبقية الصغيرة الذاتية، النجمية، قليلة التغصن والأسلاف، وكذلك العديد من الأنواع الفرعية العصبية.
وبالنظر إلى حقن في الجسم الحي من ميثوكسي-X04، وهذا البروتوكول لا يمكن أن يؤديها على أقسام الدماغ ثابتة، الأمر الذي يحول دون استخدامه مع مرحلة ما بعد الوفاة عينات الدماغ البشري. أيضا، ق بعكس المناعية ضد Aβ التي تصف أشكال قابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان من Aβ، واستخدام الأصباغ ملزمة لبيتا-مطويالهياكل بروتين هيت مثل ميثوكسي-X04 يسمح فقط التصور لويحات الأساسية كثيفة، والذي يشكل الحد آخر.
ومع ذلك، يمكن أن تشمل التطبيقات الهامة دراسة دور الخلايا الدبقية الصغيرة وغيرها من أنواع الخلايا المختلفة، والتي تتداخل وزيادة أنشطتها، ويمكن أن يكون لها آثار مباشرة على توازن الترسبات وظيفة الخلايا العصبية على مدى AD علم الأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), Academic Press. New York. (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. è Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
