Summary
Questo articolo descrive un protocollo per la visualizzazione di amiloide Ap placche in modelli murini della malattia di Alzheimer con metossi-X04, che attraversa la barriera emato-encefalica e si lega alla beta-pieghe fogli trovati nella fitta principali placche Ap selettivamente. Esso consente di pre-screening delle sezioni di tessuto placca contenenti prima dell'immunocolorazione ed elaborazione per la microscopia elettronica.
Abstract
Un protocollo dettagliato è fornito qui per identificare amiloidi Ap placche nelle sezioni del cervello di modelli murini della malattia di Alzheimer prima pre-embedding immunostaining (in particolare per ionizzato adattatore molecola legante il calcio 1 (Iba1), un calcio proteina legante espressa da microglia) e la lavorazione dei tessuti per microscopia elettronica (EM). Metossi-X04 è un colorante fluorescente che attraversa la barriera emato-encefalica e si lega ai fogli beta a pieghe si trovano in fitto nucleo placche Ap selettivamente. Iniezione degli animali con metossi-X04 prima del sacrificio e la fissazione del cervello consente di pre-screening e selezione delle sezioni di cervello placca contenenti per l'ulteriore elaborazione con manipolazioni in termini di tempo. Ciò è particolarmente utile quando si studia la patologia AD presto all'interno delle regioni specifiche del cervello o strati che possono contenere pochissime targhe, presenti in solo una piccola frazione delle sezioni. trattamento post-mortem di sezioni di tessuto con Rosso Congo, Thioflavin S, e ThioflAvin T (o anche con metossi-X04) possono etichettare fogli beta-pieghe, ma richiede una compensazione con etanolo per rimuovere colorante in eccesso e queste procedure sono incompatibili con la conservazione ultrastrutturali. Sarebbe anche inefficiente per realizzare un'etichettatura per Ap (e altri marcatori cellulari quali Iba1) su tutte le sezioni di cervello dalle regioni di interesse, solo per produrre una piccola frazione contenente placche Ap nella posizione giusta. È importante sottolineare che, placche Ap sono ancora visibili dopo la lavorazione dei tessuti per EM, permettendo una precisa identificazione delle aree (in genere fino a pochi millimetri quadrati) esaminare con il microscopio elettronico.
Introduction
Amiloide Ap formazione della placca è il principale segno distintivo neuropatologici della malattia di Alzheimer (AD). Tuttavia crescente evidenza suggerisce un ruolo importante del sistema immunitario nella progressione della malattia 1,2. In particolare, i nuovi dati provenienti da studi preclinici e clinici stabiliti disfunzione immunitaria come un driver principale e collaboratore di AD patologia. Con questi risultati, le cellule immunitarie centrali e periferiche sono emersi come bersagli terapeutici promettenti per AD 3. Il seguente protocollo combina luce e microscopia elettronica (EM) per generare nuove intuizioni sulla relazione tra la deposizione di placche Ap e le alterazioni fenotipiche microgliali in AD. Questo protocollo permette l'etichettatura delle placche Ap in modelli murini di AD utilizzando a iniezione vivo del colorante fluorescente metossi-X04. Metossi-X04 è un derivato Rosso Congo che può facilmente attraversare la barriera emato-encefalica per entrare nel parenchima cerebrale e si legano fogli β-pieghe con alto unffinity. Poiché il colorante è fluorescente, può essere utilizzato per il rilevamento in vivo della deposizione della placca Ap con microscopia a due fotoni 4. Una volta legato alla Ap, metossi-X04 non si dissocia o ridistribuire lontano da placche, e mantiene la sua fluorescenza nel tempo. E 'generalmente somministrato perifericamente per consentire imaging non invasiva della dinamica cerebrale 5. La fluorescenza rimane anche dopo fissazione aldeide, consentendo analisi correlativa post-mortem, inclusa la verifica di morte neuronale in prossimità delle placche Ap 6.
Questo protocollo sfrutta le proprietà di metossi-X04 per selezionare le sezioni del cervello di topi APP SWE / PS1A 246E (APP-PS1; coexpressing una doppia mutazione in APP gene Lys670Asn / Met671Leu, e la variante presenilina PS1-A264E umano) 7 che esibiscono A? placche in determinate regioni di interesse (ippocampo CA1, radiatum strati, e lacunosum-moleculare) Prima di pre-embedding immunocolorazione contro il marcatore microglial ionizzato legante il calcio adattatore molecola 1 (Iba1) per visualizzare i corpi cellulari microgliali e processi con EM. I topi sono dati iniezione intraperitoneale di soluzione metossi-X04, 24 ore prima della fissazione cervello attraverso perfusione transcardial. sezioni di cervello coronali sono ottenuti utilizzando un vibratome. Sezioni contenenti il CA1 dell'ippocampo sono proiettati sotto un microscopio a fluorescenza per la presenza di placche Ap in radiatum strati e lacunosum-moleculare. Immunocolorazione per Iba1, tetrossido di osmio post-fissazione, e resina plastica incorporamento vengono poi eseguite su sezioni di cervello selezionati. Alla fine di questo protocollo, le sezioni possono essere archiviati senza ulteriore degrado ultrastrutturali, pronto per ultrasottili sezionamento e l'esame ultrastrutturale. È importante sottolineare che le placche sono ancora fluorescenti dopo immunostaining con anticorpi diversi, per esempio Iba1 come nel presente protocollo. Essi diventano più scure than loro neuropil circostante seguente tetrossido di osmio post-fissazione, indipendentemente metossi-X04 colorazione, che aiuta a identificare accuratamente le regioni di interesse, generalmente fino a pochi millimetri quadrati, da esaminare con il microscopio elettronico a trasmissione.
Questo approccio correlativo offre un modo efficace per identificare le sezioni specifiche del cervello per esaminare a livello ultrastrutturale. Ciò è particolarmente utile quando si studia la patologia AD precoce, all'interno delle regioni specifiche del cervello o strati che possono contenere solo poche placche Ap, presenti solo in una piccola frazione di sezioni di tessuto. Durante questi periodi particolare, sarebbe inefficiente per usare immunostaining per Ap (e doppia etichettatura per altri marcatori cellulari quali Iba1) in diverse sezioni di cervello semplicemente per fornire una piccola frazione contenente placche Ap nella posizione giusta. Inoltre, l'iniezione di topi dal vivo con metossi-X04 prima del sacrificio e la lavorazione dei tessuti non lo fa compromisvia e la conservazione ultrastrutturali. Metodi alternativi come il post mortem colorazione con Rosso Congo, Thioflavin S, T o Thioflavin metossi-X04 su sezioni di tessuto fissate richiedono differenziazione colorazione in etanolo, 8-11 che causa stress osmotico e disturba l'ultrastruttura. Congo Rosso è anche un noto cancerogeno per l'uomo 12.
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Protocol
Nota: Tutti gli esperimenti sono stati approvati ed eseguiti in base alle direttive del comitato etico degli animali istituzionale, in conformità con il Consiglio canadese sugli orientamenti cura degli animali come amministrato dal Comitato Animal Care di Université Laval. APP-PS1 topi maschi tra i 4 ei 21 mesi di età sono stati utilizzati. Questi animali sono stati alloggiati in un ciclo luce-buio 12 ore a 22 - 25 ° C, con libero accesso a cibo e acqua.
1. Metossi-X04 Solution Preparazione
- Preparare a 5 mg / ml soluzione di metossi-X04 9 sciogliendo metossi-X04 in una soluzione contenente il 10% dimetilsolfossido (DMSO), 45% di glicole propilenico, e il 45% di fosfato di sodio salina tamponata (0,9% NaCl in 100 mM tampone fosfato , pH 7.4).
- Utilizzando una microbilancia, pesare 5 mg del composto metossi-X04. Sotto una cappa aspirante, sciogliere il metossi-X04 in DMSO e mescolare fino ad ottenere una soluzione verde chiaro. Successivamente aggiungere glicole propilenico e phosphate tampone salina mescolando con ogni aggiunta.
- Agitare la soluzione a 4 ° C su un rotatore O / N. Ottenere una emulsione verde giallastro. La soluzione può essere conservato a 4 ° C per un massimo di due mesi senza degrado.
2. Metossi-X04 soluzione per l'iniezione
- 24 ore prima della perfusione, pesare i topi e dare ogni topo un'iniezione intraperitoneale di metossi-X04 alla dose di 10 mg / kg di peso corporeo usando un ago 27 G ½.
3. transcardial perfusione del topi iniettati
- Il giorno prima della perfusione, preparare volumi adeguati di tampone fosfato salino (PBS), 3,5% acroleina, e le soluzioni di 13 4% paraformaldeide (PFA) e conservarli a 4 ° CO / N.
Nota: Queste soluzioni saranno utilizzate sia per la perfusione e pre-embedding immunoistochimica. Prestare particolare attenzione quando si lavora con acroleina, in quanto è corrosivo e tossico per entrambiricercatori e l'ambiente. Inoltre, poiché acroleina è corrosivo per plastica, utilizzare sempre vetreria adatto per preparare le soluzioni acroleina. - Il giorno della perfusione, filtrata del PFA e acroleina utilizzando carta da filtro grossolana di ritenzione delle particelle 25 micron.
- Durante la perfusione, utilizzare una pompa peristaltica per fornire 15 ml di PBS, 75 ml di acroleina, e 150 ml di PFA successivamente nella circolazione mouse, ad un flusso di 25 ml / min.
Fai attenzione. Eseguire perfusione rigorosamente all'interno di una cappa aspirante per evitare i fumi nocivi di PFA e acroleina.- Per impostare la pompa, inserire un'estremità nella soluzione PBS, riempire il tubo (tenendo circa 15 ml) con PBS, e fissare un 25 G alato raccolta del sangue ago per l'altra estremità. In ogni momento, in modo che il tubo è esente da bolle d'aria intrappolate.
- Posizionare il tubo direttamente nella bottiglia acroleina dopo aver impostato la pompa di perfusione con il tubo riempito con PBS.
- Unaesthetize un mouse alla volta con 90 mg / kg di peso corporeo dosi di pentobarbital sodico iniettati per via intraperitoneale con una ½ ago 27 G. Valutare le risposte a pizzichi coda / tep. Procedere solo se il mouse non risponde a tali avverse, stimoli dolorosi.
- Fissare il mouse in posizione supina (sdraiato sulla schiena con la faccia verso l'alto) con nastro adesivo le zampe anteriori e hindpaws al piano di lavoro ed esporre con cura il cuore senza causare danni ad altri organi. Essere sicuri di lavorare subito dopo la puntura del diaframma.
- Eseguire un'incisione attraverso la pelle con le forbici chirurgiche lungo la linea mediana del torace cominciando caudale alla cassa toracica e procedere rostrale alla clavicola.
- Fare due incisioni laterali supplementari lungo la base della gabbia toracica ventrale. Delicatamente spostare e pin i due lembi di pelle, avendo cura di esporre tutta la cavità toracica.
- Tenere il processo xifoideo con una pinza smussato per esporre la cavità toracica e stabilizzare la forbice a puntaS. Tagliare attraverso il diaframma e la gabbia toracica, facendo attenzione a evitare la puntura i polmoni, e continuare il rostrale incisione per le clavicole. Essere sicuri di lavorare subito dopo la puntura del diaframma.
- strappare delicatamente il sacco pericardico con una pinza smussato. Tenere il cuore stabile con una pinza smussato, tagliare l'atrio destro e iniziare l'infusione di PBS. Inserire immediatamente l'ago di raccolta del sangue nel ventricolo sinistro.
- Profumato il mouse con PBS (nel tubo) seguita da acroleina per 3 min (corrispondente a 75 ml) quindi passare alla PFA per 6 minuti (corrispondenti a 150 ml). Assicurarsi di mettere in pausa la portata della pompa prima di passare soluzione per evitare le bolle di penetrare nel tubo.
- Decapitare il mouse ed estrarre il cervello fisso e inserirlo direttamente in una fiala di vetro contenente 4% PFA per almeno 2 ore a 4 ° C.
- Per estrarre il cervello, usare le forbici e pinzette per tagliare attraverso la pelle per esporre il cranio. rompere con cautela il op cranioit in mezzo agli occhi, e chip off piccoli pezzi di esso per esporre il cervello sottostante.
- Rimuovere con attenzione il cervello e post correzione esposto con 4% PFA per un ulteriore 2 ore prima di procedere per vibratome sezionamento.
4. Cervello sezionamento Utilizzando un Vibratome
- Lavare il cervello fisso 3 volte con PBS freddo. Utilizzando una lama di rasoio affilata, rimuovere il bulbo olfattivo (a meno che questa regione è indagato) e tagliare il cervello trasversalmente in 2 - 3 pezzi di approssimativamente uguale altezza, ognuno dei quali può essere sezionati simultaneamente per accelerare la procedura.
- Incollare i pezzi di tessuto cerebrale verticalmente sul piatto portacampione fissata nel vassoio. Assicurarsi che la superficie di taglio liscia attacca saldamente alla piastra campione e non viene spostato durante la procedura di sezionamento. Aggiungere sufficiente soluzione di PBS nel cassetto fino a quando l'intera superficie del cervello è completamente sommerso. È importante mantenere thpezzi di cervello e e le sezioni successive completamente immersi in PBS in tutta questa fase.
- Posizionare il vassoio nel vibratome, regolare la velocità di taglio di 0,5 mm / sec, la frequenza di taglio di 90 Hz, e lo spessore di alimentazione a 50 micron per produrre 50 sezioni micron di spessore. Poi il trasferimento delle sezioni in fiale di vetro da 20 ml contenenti soluzione crioprotettore (40% PBS, 30% glicole etilenico, e il 30% glicerolo) utilizzando un pennello fine. Conservare le fiale a -20 ° C fino all'utilizzo. In alternativa, mantenere le sezioni in PBS per lo screening immediato come descritto nella procedura seguente.
5. Sezione Screening per la presenza di placche metossi-X04-macchiati
- Con l'aiuto di un cervello stereotassico topo atlas 14, selezionare sezioni di cervello contenenti la regione di interesse, per esempio, il CA1 dell'ippocampo come utilizzato nel presente esempio. Mettere ogni sezione in un pozzo all'interno di una piastra di coltura da 24 pozzetti contenente soluzione crioprotettore abbastanzain modo da impedire sezioni si secchi.
- Esaminate ogni sezione in successione, per evitare l'essiccazione sezioni, utilizzando la seguente procedura:
- Aggiungere una goccia di PBS ad un vetrino da microscopio con una pipetta monouso e posizionare la sezione sul droplet.
- Esaminare la sezione al microscopio a fluorescenza per identificare le regioni contenenti placche Ap metossi-X04 etichettati.
Nota: metossi-X04 può essere facilmente visualizzato utilizzando un filtro a fluorescenza ultravioletta (UV) (eccitazione 340 - 380 nm).
- Catturare immagini di regioni di interesse (ROI) in campo chiaro e in modalità di fluorescenza senza spostare la fase di microscopio, poiché ogni immagine deve mostrare la stessa regione in entrambi i campi per correlare la presenza delle placche direttamente alla regione strutturale la sezione di tessuto.
- Salvare e denominare le immagini scattate in base al numero degli animali. Registrare inoltre il numero di pozzetto nella piastra e il campo delle immagini taken. Ad esempio, Es: 9978A1B; il numero di animali: 9978; Bene numero: A1; Campo: luminoso. Posizionare la sezione posteriore nel suo designato bene una volta di imaging è stata completata.
Nota: Alla fine, per ciascuna sezione esaminato, due immagini sono ottenute, uno in campo chiaro e un altro nel campo UV. - Aprire le due immagini della stessa ROI (uno in campo chiaro e l'altro nel campo UV) in figura J, e utilizzando il plugin MosaicJ, allineare i bordi delle due immagini e salvare l'immagine allineata e combinato secondo il numero bene venire da.
- Salvare l'immagine in una cartella separata con il numero del particolare animale. Combinare le immagini per identificare e localizzare le placche nella sezione di tessuto, e hanno una vista completa dell'intera sezione i due campi diversi (luminose e UV).
- Dopo il processo di screening è completato, memorizzare sezioni esaminate a -20 ° C in una piastra di coltura a 24 pozzetti contenenti crioprotettore fino immunocolorazione o alla trasformazione è caRRied fuori.
6. Pre-embedding Immunocolorazione per Iba1
Nota: Eseguire la immunocolorazione per Iba1 su sezioni liberamente fluttuanti selezionati posizionando la piastra su una sedia a dondolo che si muovono lentamente a temperatura ambiente.
- Lavare accuratamente le sezioni 3 volte con circa 1 ml di PBS, ogni lavaggio della durata di 10 min.
- Quench perossidasi endogena con perossido di idrogeno 0,3% in soluzione PBS per 10 min. Questo passaggio impedisce perossidasi non specifico, che è importante per evitare colorazione di fondo.
- Lavare il tessuto in PBS 3 volte per 10 minuti ciascuno.
- Incubare le sezioni in boroidruro di sodio allo 0,1% in soluzione PBS per 30 min. Questo passo è importante per ridurre eventuali rimanenti aldeidi dalla fase di fissaggio, ed è particolarmente importante se acroleina è utilizzato in fissaggio del tessuto.
- Lavare il tessuto in PBS 3 volte per 10 minuti ogni volta e assicurarsi di rimuovere tutte le bolle.
- Bloccare le sezioni per 1 ora.Diversi anticorpi possono richiedere diversi tempi e le soluzioni di blocco. Per Iba1, preparare un tampone di bloccaggio contenente 10% di siero fetale bovino, 3% di albumina sierica bovina, e 0,01% Triton X-100 in 50 mM di soluzione salina tamponata con Tris (TBS; pH 7,4).
Nota: Il passo di blocco è quello di prevenire il legame non specifico dell'anticorpo primario. La bassa concentrazione di Triton X-100 permette leggera permeabilizzazione delle membrane per una migliore colorazione, ed è abbastanza basso per preservare maggior parte delle caratteristiche ultrastrutturali del tessuto sotto EM. - Rimuovere il tampone bloccante dal tessuto e incubare in soluzione di anticorpo primario (coniglio anti-Iba1, diluito [1: 1000] in tampone bloccante) a 4 ° CO / N.
- Lavare in TBS 3 volte per 10 minuti ogni volta.
- Incubare in anticorpo secondario (goat anti-rabbit coniugata con biotina) [1: 200] in 0,05 M TBS per 90 min.
- Lavare in TBS 5 volte per 5 minuti ogni volta.
- Incubare in soluzione del complesso avidina-biotina (avidina [1: 100], biotina [1: 100]) in TBSsoluzione per 1 ora.
- Lavare in TBS 5 volte per 5 minuti ogni volta.
- Rivela la colorazione Iba1 con 0,05% diaminobenzidina (DAB) e perossido di idrogeno 0,015% in TBS per 8 min.
Nota: I tempi di sviluppo DAB può variare da protocollo per il protocollo e deve essere determinata esaminando velocemente le sezioni colorate al microscopio ottico.
Nota: Per Iba1, si dovrebbe essere in grado di visualizzare chiaramente i corpi cellulari e dei processi delle microglia Iba1 macchiati a 20X (vedi figura 2 per esempio rappresentativo). Essere cauti con DAB, in quanto è un noto cancerogeno. - Evitare over-sviluppo controllando attentamente le sezioni (come descritto sopra) in questa fase. Arrestare la reazione lavando sezioni in PB refrigerata 5 volte per 5 minuti ogni volta.
7. elaborazione per la microscopia elettronica
- Preparare 1% soluzione di osmio tetrossido in PBS in una fiala di vetro. Tetrossido di osmio è fotosensibile; coprire la gfiala lass con un foglio di alluminio per proteggere la soluzione dalla luce.
Sia prudente con tetrossido di osmio, in quanto è una sostanza chimica molto pericolosa. Eseguire questa e le seguenti operazioni all'interno di una cappa aspirante. - Rimuovere la PBS dalle sezioni e diffonderli piatta usando un pennello fine. Eseguire questo passo si bene alla volta per mantenere sezioni si secchi. Assicurarsi di appiattire le sezioni immediatamente prima di aggiungere tetrossido di osmio, come eventuali pieghe nelle sezioni diventeranno permanenti e il tentativo di appiattire il tessuto messaggio osmio fissazione romperà solo sezioni.
- Immergere le sezioni in tetrossido di osmio per 30 minuti a RT, aggiungendo una goccia di tetrossido di osmio per volta con una pipetta di trasferimento, per evitare che le sezioni di piegatura. Coprire il bene con un foglio di alluminio per proteggere le sezioni dalla luce.
Nota: Questo passaggio consente di risolvere i lipidi all'interno delle sezioni. Il tessuto apparirà molto scuro dopo osmio post-fissazione. - Mentre le sezioni sono in osmio TetroXide, preparare resina plastica in un bicchiere usa e getta mescolando 20 g componente A, 20 g di componente B, 0,6 g componente C, e 0,4 g componente D. Unire i componenti insieme nell'ordine sopra e mescolare bene con un 10 ml pipetta sierologica fino ad ottenere un colore uniforme.
- Trasferire la miscela preparata ai piatti del peso di alluminio. Essi riceveranno le sezioni di tessuto, una volta che sono stati disidratati.
- Disidratare sezioni in concentrazioni crescenti di etanolo per 2 minuti nel seguente ordine: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
- Per rimuovere l'etanolo residuo, immergere le sezioni in ossido di propilene 3 volte per 2 minuti ogni volta. Rimuovere le disidratati sezioni dalla piastra di coltura da 24 pozzetti in 20 ml fiale di vetro. Utilizzare sempre fiale di vetro quando si lavora con ossido di propilene come si scioglie in plastica, e mantenere la cautela, in quanto è pericolosa.
- Utilizzare una punta di vetro curvato pipetta o un pennello fine di trasferire le sezioni da soluti ossido di propilenesulla nella resina e lasciare O / N per l'infiltrazione a RT. Fare attenzione a non diluire la resina con ossido di propilene.
- Incorporare la sezione con la resina di poli-cloro-tri-fluoro-etilene (PCTFE) filmsheets:
- Porre le capsule del peso di alluminio contenenti i campioni in un 50 - 60 ° C forno per 10 - 15 minuti prima di incorporare le sezioni filmsheets PCTFE.
- Quando l'incorporamento sezioni, lavorare con uno in alluminio del peso di piatto alla volta. Utilizzando un pennello fine, dipingere un sottile strato di resina su un foglio di pellicola PCTFE.
- Spostare una sezione di tessuto alla volta dal alluminio di peso piatto per il foglio di pellicola PCTFE. Rimuovere la resina in eccesso provenienti da tutto il tessuto, facendo attenzione a non disturbarlo.
- Dopo aver spostato tutte le sezioni da un peso piatto per il foglio di pellicola PCTFE, posizionare un secondo foglio PCTFE sopra il primo, creando un sandwich di tessuto e resina tra 2 fogli.
- Polimerizzare la resina in un incubatore per 3 giorni a 55-60 ° C.
- Il materiale è ora pronto per ultrasottile sezionamento ed esame ultrastrutturale, tecniche specializzate che sono spesso eseguite da strutture principali EM. Conservare i campioni tra fogli di pellicola PCTFE tranquillamente a RT senza degradazione ultrastrutturali.
Nota: I passi successivi per ultrasottili sezionamento e la trasmissione esame al microscopio elettronico sono spiegate in un protocollo separato 13.
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Representative Results
Questa sezione illustra i risultati ottenibili in diverse fasi critiche del protocollo. In particolare, i risultati mostrano esempi di sezioni del cervello che contengono metossi-X04 placche macchiati della regione specifica e strati di interesse: il CA1 dell'ippocampo, radiatum strati, e lacunosum-moleculare. Le placche e l'organizzazione regionale / lamellare dell'ippocampo sono successivamente visualizzati utilizzando una combinazione di filtri UV e in campo chiaro (Figura 1). Le sezioni di cervello selezionati vengono successivamente immunostained e trattati per EM, mantenendo traccia dei loro placche Ap, visto che sono ancora fluorescenti dopo immunostaining, e diventano più scure rispetto alla neuropil circostante dopo il trattamento con tetrossido di osmio e incorporazione (Figura 1). Questo permette di identificare le aree (generalmente una qualche millimetro quadrato) esaminare con il microscopio elettronico basato sulla locazione di placche. Inoltre, una migliore protocollo per pre-embedding immunocolorazione della microglia con Iba1 è descritto qui. Questo protocollo produce una visualizzazione eccezionale di corpi cellulari microgliali, grandi e piccoli processi (Figura 2) e la penetrazione degli anticorpi all'interno delle sezioni cerebrali. Essa facilita quindi l'identificazione dei corpi cellulari microgliali e processi a livello ultrastrutturale, e lo studio delle loro interazioni con Ap placche (Figure 3 e 4).
Figura 1. Visualizzazione di Ap placche a 21 mesi di età topi APP-PS1 utilizzando la luce Microscopia, dopo l'iniezione sistemica del colorante fluorescente Metossi-X04. AB) Doppio immagini di una parte dell'ippocampo utilizzando modalità di campo e di fluorescenza. Le regioni e gli strati di interesse vengono visualizzati in campo chiaro(A), e le placche Ap successivamente localizzate utilizzando un filtro UV ad una gamma 340 - 380 nm (B). CD) doppio di imaging di un'altra sezione dell'ippocampo prima (C) e dopo (D) pre-embedding immunocolorazione per Iba1, seguita da post-fissazione in tetrossido di osmio, disidratazione in etanolo, e incorporandoli in una resina plastica come richiesto per la microscopia elettronica a trasmissione. Da notare, la placca (circondata da una linea tratteggiata) è ancora visibile al trattamento dei tessuti per la microscopia elettronica. Visualizzare le placche taglio dei blocchi di tessuto permette una selezione precisa delle aree di immagine ad alta risoluzione spaziale. Scala bar = 300 micron per A e B, 150 micron per C e D. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Vi sualization di microglia cellulare Corpo e processi Belle a 21 mesi di età APP-PS1 topi Iba1 colorazione al microscopio livello di luce. AB) Esempi di microglia Iba1 macchiato che mostra una distribuzione di cluster quando si associano con placche Ap (identificate dal imaging di fluorescenza correlativa metossi-X04, circondate da una linea tratteggiata), come osservato prima tetrossido di osmio post-fissazione e resina plastica incorporamento. CD) Esempi di microglia Iba1 macchiati associata a placche Ap dopo tetrossido di osmio post-fissazione e embedding resina plastica. Si noti che le placche diventerà più scuro del loro neuropil circostante a seguito di osmio post-fissazione, permettendo così il monitoraggio della loro posizione. Scala bar = 250 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Doppia visualizzazione delle placche Ap e Iba1-immunocolorazione in 6 mesi topi APP-PS1 a livello ultrastrutturale. A) Esempio di denso nucleo Ap targa riconosciuta per la sua struttura fibrillare compatta (vedi riquadro) ed associazioni con neuriti distrofici con le caratteristiche ultrastrutturali di autofagia. B) Esempio di processo di microglia Iba1 macchiato (m; colorata in viola) Nelle vicinanze della targa Ap che contiene depositi di amiloide. alterazioni mitocondriali (indicati con un asterisco) può essere visto anche all'interno del processo di microglia. Da notare, questa immagine è stata acquisita al confine tessuto-resina (bianco, in alto a destra della foto) dove la penetrazione di anticorpi e di intensità di colorazione è massima. Scala bar = 2 micron per A, 1 micron per B. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Esempi aggiuntivi di Iba1-immunostained microglia a 6 mesi di età topi APP-PS1 come osservato con microscopia elettronica a trasmissione. DC) Esempi di Iba1 macchiati corpo cellule microgliali e processi (m) ha acquisito più lontano dal confine di tessuto-resina , mostrando un eccellente penetrazione degli anticorpi e la colorazione di intensità più profonda all'interno della sezione utilizzando questo protocollo. bv = vaso sanguigno, d = dendriti, in = inclusione, s = spine dendritiche, t = terminale degli assoni. Le frecce mostrano fessure sinaptiche. Scala bar = 1 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo spiega un approccio correlativo per il targeting denso nucleo placche Ap con EM. Metossi-X04 a iniezione vivo permette una rapida selezione di sezioni del cervello che contengono placche Ap all'interno di particolari regioni e strati di interesse, ad esempio, il CA1 dell'ippocampo, radiatum strati, e lacunosum-moleculare. Nel presente esempio, metossi-X04 pre-screening è stato combinato con pre-embedding immunocolorazione per Iba1 per studiare come i diversi fenotipi microgliali interagiscono con le sinapsi a livello ultrastrutturale in presenza di denso nucleo placche Ap.
Microglia sono incredibilmente sensibili alle loro ambiente e la loro attività infiammatoria è stata a lungo studiata nel contesto di minare normali funzioni cerebrali e migliorare l'avanzamento di AD. In particolare, queste cellule sono stati implicati nei processi neurodegenerativi causa del loro ampio attivazione e rilascio di citochine pro-infiammatorie, portando a chrneuroinfiammazione onic, e la rottura del cervello normale omeostasi 15. Negli ultimi anni, tuttavia, queste cellule immunitarie residenti sono stati mostrati anche per rimodellare attivamente circuiti neuronali nel cervello sano, che porta alla individuazione di nuovi meccanismi patogenetici 16,17. I loro ruoli fisiologici a livello delle sinapsi possono diventare deregolazione durante neuroinfiammazione in AD, con conseguente perdita sinaptica esacerbato, attualmente la migliore correlazione patologica di declino cognitivo attraverso varie condizioni neurodegenerative 18,19.
Le modifiche apportate al precedente Iba1 metodo di colorazione pre-embedding 13 ora permettono una migliore penetrazione degli anticorpi attraverso le sezioni di cervello, nonché visualizzazione dei corpi cellulari microgliali e processi sottili a livello ultrastrutturale. Nel complesso, il protocollo deve essere eseguita rigorosamente dal perfusione mouse fino resina plastica incorporamento delle sezioni di tessuto, considerando che il degrado ultrastrutturalesi verificano in qualsiasi fase intermedia potrebbe compromettere l'integrità delle membrane cellulari, organelli, elementi del citoscheletro, ecc.
Questo protocollo è stato possibile eseguire senza immunostaining (omettendo sezione 6) per visualizzare solo nucleo denso placche Ap, ma fornisce anche un potente strumento per studiare i complessi meccanismi di patogenesi in relazione alla deposizione Ap, come differenti anticorpi possono essere usati per concentrarsi su differenti tipi cellulari, incluse macrofagi perifericamente-derivati, microglia endogena, astrociti, oligodendrociti e loro progenitori, così come molti sottotipi neuronali.
Considerando l'iniezione in vivo di metossi-X04, questo protocollo non può essere eseguita su sezioni cerebrali fissi, che preclude l'uso con campioni di cervello umano post-mortem. Inoltre, contrariamente s dell'immunocolorazione contro Ap cui etichette forme solubili e insolubili di Ap, l'uso di coloranti legame con beta-pieghestrutture proteiche Heet, come metossi-X04 consente solo la visualizzazione delle placche nucleo denso, che costituisce un altro limite.
Tuttavia, importanti applicazioni potrebbero includere lo studio dei ruoli di microglia e di altri vari tipi di cellule, che si sovrappongono e aumentare la loro attività, e potrebbero avere effetti diretti sulla omeostasi placca e la funzione neuronale nel corso di AD patologia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
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