Summary
В данной статье описывается протокол для визуализации амилоидных бляшек A & beta; в мышиных моделях болезни Альцгеймера с помощью метокси-X04, который пересекает гематоэнцефалический барьер и избирательно связывается с бета-складчатые листы, найденные в плотном ядре A & beta бляшек. Это позволяет предварительный отбор срезов ткани зубной налет, содержащий до иммунной окраски и обработки для электронной микроскопии.
Abstract
Подробный протокол приводится здесь для выявления амилоида A & beta; бляшек в срезах мозга от мышиных моделей болезни Альцгеймера до того перед вложением иммуноокрашивания (специально для ионизированного кальция связывания адаптера молекулы 1 (Iba1), кальций-связывающий белок выражается микроглии) и обработки тканей для электронная микроскопия (ЭМ). Метокси-X04 представляет собой флуоресцентный краситель, который пересекает гематоэнцефалический барьер и избирательно связывается с бета-плиссе листов найдены в плотном ядре A & beta бляшек. Инъекция животных с метокси-X04 до умерщвления и фиксации мозга позволяет предварительный отбор и отбор бляшек, содержащих срезов мозга для дальнейшей обработки с трудоемких манипуляций. Это особенно полезно при изучении ранней патологии AD в пределах определенных областей головного мозга или слоев, которые могут содержать очень мало бляшек, присутствующих в лишь небольшая часть из секций. обработка Посмертное срезов ткани Конго красным Тиофлавин S и ThioflAvin T (или даже с метокси-x04) может пометить бета-складчатой листов, но требует обширных клиринг с этанолом для удаления избытка красителя и эти процедуры несовместимы с сохранением ультраструктурным. Было бы также неэффективным для выполнения маркировки на A & beta; (и других клеточных маркеров, таких как Iba1) на всех участках мозга из регионов, представляющих интерес, только, чтобы получить небольшую фракцию, содержащую A & beta; бляшками в нужном месте. Важно отметить, что Ар бляшек все еще видны после обработки ткани для ЭМ, что позволяет для точной идентификации областей (как правило, до нескольких квадратных миллиметров) для изучения с помощью электронного микроскопа.
Introduction
Амилоида A & beta; формирование бляшек является основным нейропатологических признаком болезни Альцгеймера (AD). Тем не менее все больше доказательств свидетельствует о важной роли иммунной системы в прогрессировании заболевания у детей в 1,2 раза . В частности, новые данные из доклинических и клинических исследований установлено, дисфункции иммунной системы в качестве основного водителя и вкладчика в AD патологии. С этими выводами, центральной и периферической иммунные клетки появились в качестве перспективных терапевтических мишеней для 3 AD. Следующий протокол сочетает в себе световой и электронной микроскопии (ЭМ) для создания новое понимание взаимосвязи между Ар осаждения бляшек и микроглии фенотипических изменений в AD. Этот протокол позволяет маркировать A & beta ; бляшек в мышиных моделях AD с использованием в естественных условиях инъекции флуоресцентного красителя метокси-X04. Метокси-X04 является конго красным производным инструментом, который может легко пересечь гематоэнцефалический барьер, чтобы войти в паренхиму мозга и связывать β-складчатой листы с высокой аffinity. Поскольку краситель флуоресцентный, он может быть использован для обнаружения в естественных условиях осаждения бляшек Ар с двухфотонной микроскопии 4. После того, как связан с A & beta;, метокси-X04 не диссоциирует или перераспределить от бляшек, и он сохраняет свою флуоресценцию с течением времени. Это , как правило , вводят периферически , чтобы позволить неинвазивной визуализации динамики мозга 5. Флуоресценции также остается следующая альдегидной фиксации, что позволяет анализирует соотносительны некропсический, включая расследование гибели нейронов в районе Ар бляшек 6.
Этот протокол использует свойств метокси-X04 , чтобы выбрать разделы мозга от APP SWE / PS1A 246E мышей (APP-PS1; совместной экспрессии двойной мутации в APP гене Lys670Asn / Met671Leu и вариант пресенилин PS1-A264E человек) 7 , которые проявляют A & beta бляшки в конкретных регионах, представляющих интерес (гиппокампа СА1, пластового radiatum и lacunosum-moleculare) До предварительно встраивания иммуноокрашивания против микроглии маркера ионизированного кальция связывающей молекулы адаптер 1 (Iba1) для визуализации микроглии органы и процессы с EM клеток. Мышам дают внутрибрюшинную инъекцию раствора метокси-x04, 24 ч до начала фиксации мозга через transcardial перфузией. Коронарные срезы мозга получены с использованием vibratome. Разделы, содержащие гиппокампа CA1 подвергают скринингу под флуоресцентным микроскопом на наличие бляшек A & beta; в слоях radiatum и lacunosum-moleculare. Иммуногистохимическое Iba1, четырехокись осмия после фиксации и пластиковой смолы вложение затем выполняются на отдельных участках мозга. В конце этого протокола, секции могут быть сохранены без дальнейшей деградации ультраструктурным, готовый к ультратонкой секционирования и ультраструктурным экспертизы. Важно отметить, что бл шки еще флуоресцентный после иммунным с различными антителами, например Iba1, как в настоящем протоколе. Они становятся темнее, тхань окружающих их нейропиля следующие четырехокись осмия после фиксации, независимо от метокси-X04 окрашивания, что позволяет точно определить регионы, представляющие интерес, как правило, до нескольких квадратных миллиметров, чтобы быть исследованы с помощью просвечивающего электронного микроскопа.
Этот соотносительны подход предлагает эффективный способ идентификации конкретных участков мозга для изучения на ультраструктурном уровне. Это особенно полезно при изучении ранней патологии AD, в пределах определенных областей головного мозга или слоев, которые могут содержать только несколько A & beta; бляшками, присутствует только небольшая часть срезов ткани. В это время особенно, было бы неэффективно использовать иммуногистохимическое (A & beta; и двойной маркировки для других клеточных маркеров, таких как Iba1) на нескольких срезах мозга просто, чтобы получить небольшую фракцию, содержащую A & beta; бляшками в нужном месте. Кроме того, инъекции живых мышей с метокси-X04 перед умерщвлением и обработки тканей не Специальное соглашениеЕ ультраструктурную сохранение. Альтернативные методы , такие как посмертного окрашивания Конго красным Тиофлавин S, Тиофлавин T или метокси-X04 на участках фиксированных тканей требуют окрашивания дифференциации в этаноле, 8-11 , который вызывает осмотический стресс и разрушает ультраструктуры. Конго красный также является известным канцерогеном для человека 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все эксперименты были одобрены и выполнены в соответствии с руководящими принципами институционального комитета по этике животных, в соответствии с Канадского совета по руководящим принципам ухода за животными в ведении Животных ухода Комитета Université Laval мимо. были использованы APP-PS1 самцов мышей от 4 до 21-месячного возраста. Эти животные были помещены под циклом свет-темнота в 12 ч при температуре 22 - 25 ° C со свободным доступом к пище и воде.
1. Подготовка Метокси-X04 Решение
- Приготовьте 5 мг / мл раствора метокси-X04 9 растворением метокси-X04 в раствор , содержащий 10% диметилсульфоксид (ДМСО), 45% пропиленгликоля, а 45% фосфата натрия буферном физиологическом растворе (0,9% NaCl в 100 мМ фосфатном буфере , рН 7,4).
- С помощью микровесов, взвешивают 5 мг соединения метокси-x04. Под вытяжкой, растворите метокси-X04 в ДМСО и перемешивают до тех пор, пока не будет получен прозрачный зеленоватый раствор. Последовательно добавляют пропиленгликоль и рНosphate солевого буфера при перемешивании с каждым добавлением.
- Раствор перемешивали при 4 ° С на вращающей O / N. Получают желто-зеленую эмульсию. Раствор можно хранить при температуре 4 ° С в течение до двух месяцев без ухудшения качества.
2. Метокси-X04 Раствор для инъекций
- 24 ч до перфузией, взвешивают мышей и дают каждой мыши, внутрибрюшинно инъекцию метокси-X04 в дозе 10 мг / кг массы тела с помощью иглы 27 G ½.
3. Transcardial перфузия вводили мышам
- В день перед перфузией, подготовить соответствующие объемы фосфатно - солевого буфера (PBS), 3,5% акролеина и решения 13 4% параформальдегида (PFA) и хранить их при температуре 4 ° CO / N.
Примечание: Эти решения будут использованы для обоих перфузия и предварительно встраивание иммуногистохимии. Соблюдайте особую осторожность при работе с акролеин, так как она вызывает коррозию и токсичен для обоихисследователей и окружающей среды. Кроме того, так как акролеин разъедает пластик, всегда используйте подходящую стеклянную посуду для приготовления растворов акролеина. - В день перфузией, фильтровать PFA и акролеина с помощью фильтра грубой очистки бумаги 25 мкм удержани частиц.
- Во время перфузии используют перистальтический насос для доставки 15 мл PBS, 75 мл акролеин, и 150 мл PFA последовательно в обращение мыши, при скорости потока 25 мл / мин.
Соблюдайте осторожность. Выполните перфузию строго внутри вытяжкой, чтобы избежать вредных паров PFA и акролеин.- Чтобы установить насос, вставьте один конец в раствор PBS, заполняют трубку (проведение около 15 мл) с PBS, и зафиксировать крылатый забора крови иглу 25 G к другому концу. Во все времена, убедитесь, что трубка свободна от каких-либо захваченных пузырьков воздуха.
- Поместите пробирку непосредственно в бутылке акролеина после установки перфузионного насоса с трубкой, заполненной PBS.
- aesthetize одну мышь одновременно с 90 мг / кг массы тела дозы пентобарбитала натрия внутрибрюшинно с использованием 27 ½ G иглы. Оценка ответов на хвост / ног щепотки. Продолжайте только если мышь не реагирует на такие аверсивных, болевые стимулы.
- Закрепите мышь в положении лежа на спине (лежа на спине с лицом вверх) лентой передние лапы и hindpaws на рабочую поверхность и осторожно обнажить сердце, не причиняя ущерба другим органам. Обязательно работать быстро после того, как прокалывание диафрагму.
- Выполните разрез через кожу с хирургическими ножницами вдоль средней линии грудной клетки начинают каудально к ребрам и приступить к ростральной ключицы.
- Сделайте две дополнительные боковые разрезы вдоль основания брюшной ребрам. Аккуратно переместите и пин-код два лоскуты кожи, убедившись в том, чтобы выставить всю грудную полость.
- Держа мечевидного отростка с тупыми щипцами подвергать грудной полости и устойчиво заостренный ножничныеs. Вырезать через диафрагму и грудную клетку, соблюдая осторожность, чтобы избежать прокола легких, и продолжают надрез ростральнее ключиц. Обязательно работать быстро после того, как прокалывание диафрагму.
- Осторожно порвите перикард с тупыми щипцами. Держите сердце устойчивый с тупыми щипцами, разрезать правое предсердие, и начать вливание PBS. Немедленно вставить сбора крови иглу в левый желудочек.
- Заливать мышь с PBS (в НКТ) с последующим акролеина в течение 3 мин (что соответствует 75 мл), а затем перейти к PFA в течение 6 мин (что соответствует 150 мл). Обязательно, чтобы приостановить поток насоса перед переключением раствора, чтобы предотвратить попадание пузырьков в трубку.
- Обезглавьте мыши и извлечь фиксированный мозг и поместить его непосредственно в стеклянный флакон, содержащий 4% PFA в течение по крайней мере 2 ч при 4 ° С.
- Для того, чтобы извлечь мозг, используйте ножницы и пинцет, чтобы прорваться через кожу, чтобы подвергать черепа. Осторожно разбить череп оран между глазами, и чип от небольшие кусочки него, чтобы выставить основной мозг.
- Осторожно снимите обнажённым мозгом и послевузовском еекнопку с 4% PFA в течение еще 2 ч, прежде чем приступить к vibratome секционирования.
4. Мозг Секционирование Использование Vibratome
- Вымойте Фиксированный мозг 3 раза охлажденным PBS. Используя острый лезвие бритвы, удалите обонятельной луковицы (если этот регион не находится под следствием) и разрезают мозг трансверсально на 2 - 3 частей примерно одинаковой высоты, все из которых могут быть секционного одновременно для того, чтобы ускорить процедуру.
- Клей кусочки ткани мозга вертикально на образец пластину, прикрепленную в лоток. Убедитесь, что гладкая поверхность среза плотно прилипает к пластине образца и не получают смещаются во время процедуры секционирования. Добавьте достаточное количество раствора PBS в лоток, пока вся поверхность мозга не полностью погружен в воду. Важно, чтобы держать юе части мозга и последующие разделы полностью погружена в PBS в течение этого этапа.
- Поместите лоток в vibratome, регулировать скорость секционирования до 0,5 мм / сек, секционирования частотой до 90 Гц, а также от толщины подачи до 50 мкм для того, чтобы выход 50 мкм толщиной секций. Затем перенесите секции в 20 мл стеклянные флаконы, содержащие криопротектора раствор (40% PBS, 30% этиленгликоля и 30% глицерин) с помощью тонкой кистью. Хранить флаконы при температуре от -20 ° С до дальнейшего использования. В качестве альтернативы, держать секций в PBS для немедленного скринингу, как описано в следующих шагах.
5. В разделе Скрининг на присутствие Метокси-X04-окрашенных бл шки
- Устанавливают с помощью стереотаксической мозга мыши атласе 14, выбираем участки мозга , содержащие интересующую область, к примеру, гиппокампа CA1 , как используется в данном примере. Поместите каждую секцию в скважину в культуральный планшет 24-луночный, содержащей достаточное количество криопротектора решениес тем, чтобы предотвратить секции от высыхания.
- Осмотрите каждую секцию последовательно, чтобы избежать высыхания секций, используя следующую процедуру:
- Добавить каплю PBS на предметное стекло микроскопа с одноразовой пипетки, и поместите раздел о капельке.
- Осмотрите участок под флуоресцентным микроскопом, чтобы определить области, содержащие метокси-X04 меченых бляшками A & beta.
Примечание: метокси-X04 можно легко визуализировать с помощью флуоресцентной ультрафиолетового (УФ) фильтр (возбуждения 340 - 380 нм).
- Захват изображений областей интереса (ROI) в светлом поле, а также в режиме флуоресценции без перемещения столика микроскопа, так как каждое изображение должно показать ту же область в обоих полях, чтобы коррелировать наличие бляшек непосредственно к структурной области срез ткани.
- Сохранить и назовите снимки, сделанные в соответствии с количеством животных. Также запишите номер скважины на пластине и поле картин Taкен. Например, Ex: 9978A1B; Количество животных: 9978; Ну номер: A1; Поле: Светлый. Поместите раздел обратно в назначенный им хорошо, как только визуализация завершается.
Примечание: В конце концов, для каждой секции рассмотрены две картины получаются, один в светлом поле, а другой в УФ-области. - Откройте два изображения одного и того же ROI (один в светлом поле, а другой в УФ-области) в изображения J, и с помощью плагина MosaicJ, выровняйте края двух изображений и сохранить выровненный и комбинированное изображение в соответствии с количеством хорошо он пришли из.
- Сохранения изображения в отдельной папке с номером конкретного животного. Объедините изображения для идентификации и локализации бляшек в разделе ткани, и имеют полное представление всей секции в двух различных областях (яркие и УФ).
- После того, как процесс проверки будет завершен, хранить исследуемые участки при -20 ° С в культуральный планшет 24-луночный, содержащей криопротектора до иммунное или дальнейшей обработки не чаrried вне.
6. Предварительно вложение иммуногистохимическое Iba1
Примечание: Выполните иммунным для Iba1 на выбранных свободно плавающих участков путем размещения пластины на медленно движущейся качалке при комнатной температуре.
- Тщательно промойте Срезы 3 раза приблизительно 1 мл PBS, каждый стирке длящейся в течение 10 мин.
- Угашайте эндогенные пероксидазы с 0,3% перекиси водорода в растворе PBS в течение 10 мин. Этот шаг предотвращает неспецифическую пероксидазной активности, что очень важно, чтобы избежать фонового окрашивания.
- Промыть ткань в PBS 3 раза в течение 10 мин каждый раз.
- Инкубируйте разделы в 0,1% борогидрида натрия в растворе PBS в течение 30 мин. Этот шаг важен, чтобы уменьшить все оставшиеся альдегиды на стадии фиксации, и это особенно важно, если акролеин используется в фиксации ткани.
- Мытье ткани в PBS 3 раза в течение 10 минут каждый раз, и убедитесь, чтобы удалить все пузырьки.
- Блок-секции в течение 1 часа.Различные антитела могут потребоваться разные периоды времени блокирования и решения. Для Iba1, подготовить блокирующем буфере, содержащем 10% фетальной бычьей сыворотки, 3% бычьего сывороточного альбумина и 0,01% Тритона Х-100 в 50 мМ Трис-буферном солевом растворе (TBS, рН 7,4).
Примечание: Ступень блокировки является предотвращение неспецифического связывания с первичным антителом. Низкая концентрация Тритона Х-100 позволяет легкое пермеабилизации мембран для лучшего окрашивания, и является достаточно низким, чтобы сохранить большинство ультраструктурным особенности ткани под EM. - Удалить блокирующий буфер из ткани, и инкубировать в растворе первичного антитела (кроличьи антитела Iba1, разбавленный [1: 1000] в блокирующем буфере) при 4 ° CO / N.
- Промыть в TBS 3 раза в течение 10 мин каждый раз.
- Инкубируйте в вторичными антителами (козий анти-кроличий, конъюгированного с биотином) [1: 200] в 0,05 М TBS в течение 90 мин.
- Стирать в TBS 5 раз в течение 5 минут каждый раз.
- Выдержите в комплексном решении авидинбиотиновом (авидином [1: 100], биотин [1: 100]) в TBSраствор в течение 1 часа.
- Стирать в TBS 5 раз в течение 5 минут каждый раз.
- Выявить Iba1 окрашивание 0,05% диаминобензидино (DAB) и 0,015% пероксида водорода в TBS в течение 8 мин.
Примечание: Сроки разработки DAB может отличаться в зависимости от протокола к протоколу и должен определяться быстро просмотрев окрашенные участки под световым микроскопом.
Примечание: Для Iba1, один должен быть в состоянии четко визуализировать клеточные тела и процессы в Iba1 окрашенных микроглии на 20X (см рисунок 2 для репрезентативного примера). Будьте осторожны с использованием DAB, поскольку это является известным канцерогеном. - Избегайте чрезмерной разработке путем тщательного мониторинга секций (как описано выше) в течение этого шага. Остановить реакцию путем промывки секций в охлажденном PB 5 раз в течение 5 минут каждый раз.
7. Обработка для электронной микроскопии
- Готовят 1% раствор четырехокиси осми в PBS в стеклянном сосуде. Осмий Четырехокись фоточувствителен; покрывать гдеваха флакон с алюминиевой фольгой для защиты раствора от света.
Будьте осторожны, используя осмий осмия, так как это очень опасное химическое вещество. Выполните это и следующие шаги внутри вытяжного шкафа. - Удалите PBS из секций и развести их с помощью плоской тонкой кистью. Выполните этот шаг одну скважину, в то время, чтобы сохранить разделы от высыхания. Обязательно расправьте секции непосредственно перед добавлением осмия осмия, так как любые складки в секциях станут постоянными и попытки придавить ткани пост осмий фиксации нарушит только разделы.
- Погружают секции в осмия в течение 30 мин при комнатной температуре, добавив одну каплю осмия в то время, с пересадкой пипеткой, чтобы предотвратить секции от складывания. Накройте хорошо с алюминиевой фольгой для защиты от света секций.
Примечание: Этот шаг фиксирует липиды внутри секций. Ткань будет казаться очень темным после того, как осмия после фиксации. - В то время как секции в осмия TETROXide, готовят пластиковые смолы в одноразовом химическом стакане смешивают 20 г компонента А, 20 г компонента В, 0,6 г компонента С, и 0,4 г компонента D. Объединяют компоненты вместе в указанном выше порядке, и смешивать их с помощью 10 мл серологической пипеткой пока не будет получен однородный цвет.
- Передача приготовленной смеси на алюминиевые чашки для взвешивания. Они будут получать срезах тканей, как только они были обезвожены.
- Обезвоживают секций в возрастающих концентрациях этанола в течение 2 мин в следующем порядке: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.
- Для удаления остаточного этанола, погрузить секции в пропиленоксида 3 раза в течение 2 мин каждый раз. Удалить обезвоженные сечения из культуральной пластины 24-луночного в 20 мл стеклянные флаконы. Всегда используйте стеклянные флаконы при работе с оксидом пропилена, как он растворяет пластик, и сохранять осторожность, так как это опасно.
- Используйте изогнутую кончик стеклянной пипетки или тонкой кистью, чтобы перенести разделы из окиси пропилена Solutiна в смоле и оставить O / N для инфильтрации при комнатной температуре. Будьте осторожны, чтобы не разбавить смолу с пропиленоксидом.
- Вставить раздел со смолой на поли-хлор-три-фтор-этилена (PCTFE) filmsheets:
- Поместите алюминиевые чашки для взвешивания, содержащие образцы в 50 - печи 60 ° C в течение 10 - 15 мин до встраивания секций на PCTFE filmsheets.
- При укладке секций, работать с одним из алюминия весом блюдо в то время. Использование тонкой кистью, нарисуйте тонкий слой смолы на одну PCTFE пленочного листа.
- Переместить одну часть ткани в то время из алюминия весом блюдо на пленку листа PCTFE. Удалите излишки смолы из вокруг ткани, соблюдая осторожность, чтобы не нарушить его.
- После перемещения всех секций от одного взвешивания блюдо к пленочного листа PCTFE, поместите второй PCTFE лист над первым, создавая бутерброд из ткани и смолы между 2-х листах.
- Полимеризуется смола в инкубаторе в течение 3-х дней при 55 - 60 ° С.
- Материал готов к ультратонкого секционирования и ультраструктурным экспертизы, специализированные методы, которые часто выполняются основные объекты EM. Храните образцы между ПХТФЭ листами пленки безопасно при комнатной температуре без ультраструктурным деградации.
Примечание: Последующие шаги для сверхтонких секционирования и просвечивающей электронной микроскопии обследования описаны в отдельном протоколе 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В данном разделе представлены результаты, которые могут быть получены при различных критических шагов протокола. В частности, результаты показывают примеры срезов мозга, содержащих метокси-X04 окрашивали бляшек в конкретном регионе и слои, представляющие интерес: гиппокампа СА1, пластового radiatum и lacunosum-moleculare. Пластинки и региональные / пластинчатые организация гиппокампа последовательно визуализируются с использованием комбинации УФ и полевых фильтров ярких (рисунок 1). Выбранные участки мозга впоследствии иммуноокрашиванию и обрабатываются для EM, сохраняя при этом их бляшек A & beta ; , принимая во внимание , что они по - прежнему флуоресцентный следующие иммунное и становятся темнее , чем окружающие нейропиля после обработки осмия и встраивания (рисунок 1). Это позволяет определить области (как правило, несколько миллиметров в квадрате) исследовать с помощью электронного микроскопа основано на Locaция бляшек. Кроме того, улучшенный протокол для предварительного вложения иммунное микроглии с Iba1 описан здесь. Этот протокол дает исключительную визуализацию микроглии клеточных тел, больших и малых процессов (рисунок 2), а также проникновение антител внутри секций мозга. Таким образом , он облегчает идентификацию микроглии клеток органов и процессов на ультраструктурном уровне, а также изучение их взаимодействия с A & beta ; бляшек (рис 3 и 4).
Рисунок 1. Визуализация A & beta ; бляшками 21-месячных мышей APP-PS1 с использованием световой микроскопии, После системной инъекции флуоресцентного красителя Метокси-X04. AB) Двойной изображений одного гиппокампа секции с использованием ярких мод поля и флуоресценции. Области и слои, представляющие интерес, визуализируются при ярком поле(А), и Бляшки A & beta; последовательно локализованы с помощью УФ-фильтра в диапазоне 340 - 380 нм (B). CD) Двойной изображений другого гиппокампа секции до того (С), и после того, как (D), предварительно встраивание иммуногистохимическое Iba1, а затем после фиксации в осмия, дегидратации в этаноле, и встраивание в полиэтиленовом смолы, как требуется для просвечивающей электронной микроскопии. Следует отметить, бляшки (окруженный пунктирной линией) остается видимой при обработке ткани для электронной микроскопии. Визуальное бляшки при обрезке блоков ткани позволяет для точного выбора областей для изображения при высоким пространственным разрешением. Масштабные полоски = 300 мкм для А и В, 150 мкм для C и D. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Vi sualization из микроглии клетки тела и изобразительных процессов в 21-месячных мышей APP-PS1 по Iba1 Окрашивание на свет микроскопическом уровне. AB) Примеры Iba1 окрашенном микроглии, показывающий распределение кластерный, когда они связывают с A & beta; бляшек (идентифицированных корреляционного флуоресцентной визуализации метокси-X04; окруженными пунктирной линией), наблюдаемых ранее четырехокись осмия пост-фиксации и пластиковой смолы вложения. CD) Примеры Iba1 окрашенном микроглии, связанных с A & beta бляшек после того, как четырехокись осмия после фиксации и пластиковой смолы вложение. Обратите внимание, что бляшки становятся темнее, чем окружающие их нейропиля следующим осмия, после фиксации, что позволяет определять их местонахождение. Шкала бар = 250 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
060 / 54060fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Двойной Визуализация Ар бляшек и Iba1-иммунным в 6-месячного APP-PS1 мышей на уровне Ультраструктурный. A) Пример из плотного ядра Ар бляшек , признанной своей компактной структурой фибриллярного (см врезку) и ассоциации с дистрофических нейритов с ультраструктурным особенностями аутофагии. Б) Пример Iba1 окрашенном микроглии процесса (м, окрашенные в фиолетовый) обнаружили неподалеку от зубного налета Ар, который содержит амилоидные отложения. Митохондриальные изменения (показаны звездочками) также можно рассматривать в рамках микроглии процесса. Следует отметить, эта картина была приобретена на границе ткани смолы (белый, справа от картинки), где проникновение антител и интенсивности окрашивания максимальна. Масштабные полоски = 2 мкм при 1 мкм B. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Дополнительные примеры Iba1-иммуноокрашиванию микроглии в 6-месячных APP-PS1 мышей , как Наблюдаемые с просвечивающей электронной микроскопии. AD) Примеры Iba1 окрашенного тела микроглии клеток и процессов (м) приобретенной дальше от границы тканевого смолы , демонстрируя превосходное проникновение антител и интенсивности окрашивания глубже в секции, используя этот протокол. БВ = кровеносный сосуд, d = дендритов, в = включение, s = дендритные позвоночника, т = аксона. Стрелки показывают синаптических щелях. Масштабные полоски = 1 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол объясняет корреляционный подход к ориентации плотного ядра A & beta; бляхи с ЕМ. Метокси-X04 в естественных условиях инъекции позволяет быстро выбор участков мозга , которые содержат A & beta ; бляшками в пределах отдельных регионов и слоев , представляющих интерес, например гиппокампа CA1, пластового radiatum и lacunosum-moleculare. В настоящем примере, метокси-X04 предварительного отбора сочеталась с предварительно встраивание иммуногистохимическое Iba1 для изучения, как различные микроглии фенотипы взаимодействуют с синапсах на ультраструктурным уровне в присутствии плотного ядра A & beta; бляшек.
Микроглия невероятно реагировать на их окружение и их противовоспалительную активность уже давно изучен в контексте подрыва нормальной функции мозга и повышения продвижению нашей эры. В частности, эти клетки были вовлечены в нейродегенеративных процессов из-за их обширной активации и высвобождения провоспалительных цитокинов, что приводит к CHRОНИК нейровоспаления, и нарушение нормального мозга гомеостаза 15. В последние годы, однако, эти клетки иммунной системы резидентные Показано также активно реконструируют нейронные цепи в здоровом мозге, что приводит к идентификации новых патогенных механизмов 16,17. Их физиологические роли в синапсах может стать дизрегуляции во время нейровоспаления АД, что приводит к потере усиленным синаптическую, в настоящее время лучший патологической коррелят когнитивных нарушений в различных нейродегенеративных условиях 18,19.
Изменения , внесенные в предыдущий предварительно вложение Iba1 метода окрашивания 13 теперь позволяют лучшее проникновение антител через срезах головного мозга, а также визуализации микроглии клеточных тел и тонких процессов на ультраструктурном уровне. В целом, протокол требует не должна быть выполнена строго с перфузией мыши до пластиковой смолы вложения срезах тканей, учитывая, что ультраструктурную деградациипроисходящие на любом этапе между ними может привести к нарушению целостности клеточных мембран, органелл, цитоскелета элементов и т.д..
Этот протокол может быть выполнена без каких-либо иммунное окрашивание (опуская раздел 6), чтобы только визуализировать плотное ядро A & beta; бляшками, но он также является мощным инструментом для изучения сложных механизмов AD патогенеза, имеющие отношение к отложению Ар, так как различные антитела могут быть использованы для сосредоточить внимание на различных типах клеток, в том числе периферически полученных макрофагов, эндогенной микроглии, астроциты, олигодендроциты и их предшественников, а также многих нейрональных подтипов.
Учитывая инъекции в естественных условиях метокси-X04, этот протокол не может быть выполнена на фиксированных участках мозга, что исключает возможность его использования с посмертных образцов человеческого мозга. Кроме того, Противоположно иммунным против A & beta, который маркирует растворимых и нерастворимых форм A & beta;, использование красителей связывания с бета-плиссе sHeet белковые структуры, такие как метокси-X04 позволяет только визуализацию плотных основных бляшек, что составляет еще одно ограничение.
Тем не менее, важные приложения могут включать в себя изучение роли микроглии и других различных типов клеток, которые перекрывают друг друга и усилить их деятельность, а также могут иметь прямое воздействие на налёт гомеостаза и функции нейронов по ходу AD патологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methoxy-X04 | Tocris Bioscience | 4920 | 10 mg substrate per tablet |
| Propylene glycol | Sigma Aldrich | W294004 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-1 | Caution: toxic |
| Sodium Chloride NaCl | Sigma | S9625 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | |
| Tris Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153500 | |
| Acrolein | Sigma | 110221 | Caution: Toxic |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Caution: Toxic |
| Filter paper | Fisher | 09-790-14F | |
| Peristaltic Pump with Tubing | ColeParmer | cp.78023-00 | |
| Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G | Becton Dickinson | 367341 | |
| Extrafine Forceps | F.S.T | 11152-10 | Tip shape: curved |
| Scissors | F.S.T | 14090-09 | Tip shape: straight |
| Hartman Hemostats | F.S.T | 13003-10 | Tip shape: curved |
| Surgical Scissors | F.S.T | 14004-16 | Tip shape: straight |
| Micro Dissecting Scissors | ROBOZ surgical store | 5818 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific | 74515-20 | |
| Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S | Leica Biosystems | 14047235612 | |
| Vibratome blades | Electron microscopy Sciences | 71990 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 24-well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 353047 | |
| Ethylene Glycol | Fisher BioReagents | BP230-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-4 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% | J.T.BAKER | cat: 2186-01 | |
| Sodium borohydride | Sigma | 480886 | |
| Tris HCl | Fisher | BP153-500ML | |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F1051 | |
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Thomas Scientific | C001H24 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Anti IBA1, Rabbit | WAKO | 019-19741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111066046 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard) | Vector Labs | PK-6100 | |
| 3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB) | Sigma | D5905-50TAB | Caution: toxic |
| Osmium tetroxide, 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Caution: toxic |
| Durcupan™ ACM single component A | Sigma | 44611 | Resin Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component B | Sigma | 44612 | Hardener Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component C | Sigma | 44613 | Plasticizer Caution: Toxic |
| Durcupan™ ACM single component D | Sigma | 44614 | Accelerator Caution: Toxic |
| Ethanol | LesAlcoolsdeComerce | 151-01-15N | |
| Propylene oxide | Sigma | 110205 | Caution: corrosive |
| Aluminum weigh dishes | Electron Microscopy Sciences | 70048-01 | |
| ACLAR®–Fluoropolymer Films | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Oven/Incubator | VWR |
References
- Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).
- Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).
- Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging. Front Psychiatry. 3, 26 (2012).
- Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).
- Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. J Vis Exp. (53), (2011).
- Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. Targeting prion amyloid deposits in vivo. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).
- Bussière, T., Bard, F., et al. Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).
- Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue. Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).
- Afkhami, A., Moosavi, R. Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles. J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).
- Tremblay, M. -E., Riad, M., Majewska, A. Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy. J Vis Exp. (41), (2010).
- Konsman, J. -P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), Academic Press. New York. (2003).
- Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease. Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).
- Tremblay, M. -E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. The role of microglia in the healthy brain. J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).
- Šišková, Z., Tremblay, M. è Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration. Neural Plast. 2013, 425845 (2013).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).
- Terry, R. D., Masliah, E., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).
