Summary
进行了检查适体，纳米金比色法检测小分子在得到了实地应用的设计与开发。此外，一个智能设备色度应用（应用程序）的验证，并建立了在该领域使用的测定法的长期贮存。
Abstract
进行了检查适体 - 金纳米粒子（金纳米粒子）比色法检测小分子中的非现场应用的设计与开发。基于目标的选择性金纳米粒子的颜色检测已经发展证明了概念控制的实验室设置。然而，这些方案没有被施加到故障点，以确定其超出实验室设置实际使用。这部作品描述了一个通用的方法来设计，开发和故障排除为小分子分析物和使用试验中，该场设置的适体 - 金纳米粒子比色测定。该测定是有利的，因为吸附适体钝化纳米颗粒表面并提供减少和消除对非靶分析物的假阳性反应的手段。转换该系统的实际应用所需的限定不仅适体 - 金纳米粒子测定的保质期，但是建立延伸长期存储capabil方法和程序伊蒂埃斯。此外，与比色读出公认的问题之一是放置于分析师准确识别颜色往往微妙变化的负担。以减少在现场上分析的责任，颜色分析协议设计为无需进行实验室级装备该任务执行的颜色标识的职责。描述了用于创建和测试数据分析的协议的方法。然而，为了理解和影响吸附的适配体测定法的设计中，与适体，目标相关联的交互，以及金纳米粒子需要进一步研究。所获得的知识可能导致剪裁适体的改进的功能。
Introduction
比色法是在分析化学中使用的最古老的技术之一。对于这种技术，分析物的定性或定量测定由根据生产的有色化合物1。通常情况下，颜色测定法使用体验中的分析物质的存在，这将导致在可见光光谱中观察到的或检测的颜色变化的色移的试剂。比色法已在检测的目标，从原子，离子和小分子到复杂的生物分子，如脱氧核糖核酸（DNA）的肽，和蛋白质2-4这样被使用。在过去的二十年中，纳米材料已经彻底改变了检测分析的领域中，特别是与基于颜色测定5-6。与靶选择性识别元件结合纳米材料的独特的化学和物理性质，例如抗体，寡核苷酸适体或肽适体，导致了再起我n中的设计和比色检测试验7的发展。
金属纳米颗粒具有一个证实大小相关的色彩变化特性，这已在许多比色测定法的设计被利用。金粒子（AuNPs）是特别感兴趣的，由于独特的红至蓝色移，当粒子的分散液被诱导聚合8，典型地通过精确的加成盐。控制从分散（红色）过渡到聚集的（蓝色）状态的能力已经导致建立比色传感器，用于离子，小分子，肽，蛋白质和细胞靶2-4,9的。许多这些传感器采用适体作为目标识别基序。
适体是由10 12 -10 15个不同的序列10-11的无规池选择的DNA或核糖核酸（RNA）分子。选择过程确定的目标重新认知元件在低纳摩尔政权结合亲和性，并通过指数富集（SELEX） 的配体的系统进化是最公知的过程12-13。基于寡核苷酸适体用于感测应用的优点包括易于合成的，可控的化学修饰，和化学稳定性14-15。
一种方法来创建一个比色测定结合纳米材料与识别元件，包括通过DNA适配子分子金纳米粒子表面的物理吸附这两个物种结合。通过目标核酸适体结合，适体经受能改变与金纳米粒子表面，从而导致与加成盐的可诱导的红至蓝颜色响应19中的适体的相互作用的结构变化16-18。金纳米粒子的这一惊人的特性提供了一种可观察到的比色反应的机制，可用于脱基于适体的设备签署不同的分析物比色法。
使用上金纳米粒子表面的非共价键，物理吸附的DNA核酸适体设计的彩色测定有被微弱的传感器平台的耻辱由于与稳健性，对未受控实验室环境以外的倾向，以及可用于实际应用的信息缺乏问题设置。然而，基于适体的金纳米粒子比色法是因为操作和观察到的色彩响应的简单的兴趣。这项工作的目的是提供一种用于设计，开发，操作，减少表面的相关的假阳性反应，和长期存储用可卡因为代表分析物DNA的金纳米粒子基于比色测定法提供的协议。此外，我们提出了本吸附适配体测定方法（ 图1）为是有利的，由于使用的简单和易用性，导致比这些适体-金纳米粒子屁股常规方法更少的步骤AYS。对于这个测定法中，适体首先被加入到纳米金，这被允许吸附到表面的时间较长。一个附加的优点，以这种方法是响应于与金纳米粒子表面的相互作用的非目标分析物分子的减少。然而，在假阳性反应的减少是在测定灵敏度为代价的。因此，表面保护和辅助分析物之间的平衡是必要保持适当的检测功能。此外，通过对色彩分析的一个重大缺陷是指除与仪器是结果往往是主观的和分析师对分析师公开的解释，试图区分颜色的细微差别时尤为如此。反之，有许多与使得基于实验室可用的仪器在实验室外，如电源的可用性，实用性与便携性， 等。在此工作的问题，一个色分析协议是为MOR开发Ë便携性并消除一些通常与基础色法20-21解释相关的猜测。相比于以前的方法，这一努力争取到这些分析推到他们的实验室之外设置的应用程序的限制。
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Protocol
1.通过金纳米粒子柠檬酸还原（金纳米粒子）与表征合成
- 清洁的Erlenmeyer烧瓶（500ml）中和大型搅拌棒用5毫升浓硝酸和15毫升浓缩的化学安全罩盐酸。
- 湿用酸洗涤烧瓶的整个表面，冲洗用不含核酸酶的水的烧瓶中，并允许烧瓶干燥。
- 加入100毫升1mM的金（III），氯化;使用铝箔的片材，以覆盖酸清洗Erlenmeyer烧瓶和加热连续搅拌的顶部的热板上直到沸腾。
- 加入10 mL 38.8毫米柠檬酸钠。颜色由透明/灰在几分钟内改变，深蓝色/黑色，最后暗红色。继续加热搅拌关闭10分钟。
- 允许金纳米粒子悬浮液冷却至室温，并连续搅拌添加110微升酸二乙酯（DEPC）的。
- 覆盖整个烧瓶铝箔和允许DEPC处理孵育过夜。存储所有纳米金在黑暗中，在琥珀储存容器或用铝箔覆盖。
- 高压灭菌的金纳米粒子悬浮液，冷却至室温，并通过0.22μm孔径的醋酸纤维素膜过滤。存储过滤，高压灭菌金纳米粒子库存在黑暗中在4℃下溶液。
注：治疗用DEPC，通过高压灭菌，并储存在4℃下将改善适体 - 金纳米粒子测定的保质期。存储以这种方式将允许用于测定保持功能为2个月以上。 - 通过在520nm处获得紫外-可见吸收计算金纳米粒子浓度，并通过计算浓度（c）使用的消光系数（ɛ）2.4×10 8升摩尔-1 -1与Beer定律。测定浓度为10nM的与尺寸为15nm的通过动态光散射来确定。
注：浓度会有所不同FROM批次到批次。稀释金纳米粒子股用核酸酶游离水作为必要保持所期望的10nM的金纳米粒子的悬浮液。
2. DNA的适体，缓冲液，溶液，和检测制剂
- 购买或合成以下可卡因结合使用标准亚磷酰胺化学22适配子序列：
MN4 19：5'-GAC GGC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3'
MN6 19：5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3' - 净化使用标准脱盐23的适体。在任100μM的或1mM的储备溶液重建在不含核酸酶的水的寡核苷酸。分装和储存在-20°C几个月。
- 购买或制备无菌的1M 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）pH为7.4的股，100毫氯化镁（MgCl 2的），和1M氯化钠（NaCl）。
- 制备50ml的缓冲液中在无核酸酶水无线的20mM HEPES，2mM的MgCl 2的，pH为7.4的第浓度，并储存于室温下个月。
- 孵育股票金纳米粒子溶液（10纳米）3-4小时，在室温下将DNA和从光保护。根据需要变化，以提供足够的样本为要执行的测试（2.5-7.5毫升）金纳米粒子的体积。
- 这里，使用90，120，150，和180的DNA分子/金纳米粒子的装载密度在这项工作。变化的体积，并相应的DNA的浓度。调该DNA的覆盖，以减少非目标分析物的意想不到的金纳米粒子表面的相关色反应。
注：增加DNA覆盖率将降低检测的灵敏度。装载密度从知道的金纳米粒子的库存的浓度，并计算存在于期望在实验中使用的体积金纳米粒子的总数来计算。如果实际的覆盖密度所需，协议存在以获得这些值7。该DNA覆盖通过使用50kDa的米确定olecular重量截止旋转柱的金纳米粒子结合的DNA从游离DNA中分离出来。在金纳米粒子太大，通过离心柱，而游离DNA很容易通过。下一步骤是量化使用吸光度测量或单链DNA的荧光染料收集的游离DNA。
- 这里，使用90，120，150，和180的DNA分子/金纳米粒子的装载密度在这项工作。变化的体积，并相应的DNA的浓度。调该DNA的覆盖，以减少非目标分析物的意想不到的金纳米粒子表面的相关色反应。
- 加20毫米的HEPES，2mM的MgCl 2的，pH为7.4的缓冲等体积的，并放置在4℃下将样品在黑暗中过夜。适体-金纳米粒子测定在10mM的HEPES，1mM的MgCl 2的，pH为7.4（测定缓冲液）。
3.盐滴定法测定设置
- 确定以诱导由盐滴定与测定空白测定颜色响应所需的初始盐浓度。加入20μl甲醇（空白），以适体 - 金纳米粒子测定的180微升等分试样的在96孔板中。随的库存NaCl溶液（1 M或2M）体积滴定样品，并确定当点（ 图2 注：该测定可以通过保持甲醇空白（或溶解分析物）与适体 - 金纳米粒子测定中相同的比率来缩放到较小体积。
- 这里，确定以引起用肉眼观察丝毫颜色变化所需的氯化钠量。该分析的起始浓度为75毫和130毫用于MN4和MN6，分别在60 DNA分子/金纳米粒子覆盖密度。
注：对于定量测定的初始盐浓度，滴定曲线的中点作为一个很好的起点。另外，使用的浓度将取决于适体，DNA的覆盖密度，从白天到一天的性能，以及批与批。
- 这里，确定以引起用肉眼观察丝毫颜色变化所需的氯化钠量。该分析的起始浓度为75毫和130毫用于MN4和MN6，分别在60 DNA分子/金纳米粒子覆盖密度。
- 优化测定法的反应，在室温下加入20微升在甲醇稀释至适体 - 金纳米粒子测定的180微升等分试样的分析物分子的在96孔板中。立即加入在先前步骤中以引发该测定颜色响应中确定的NaCl浓度。
没有TE：利用多道移液器同时执行多个实验。 - 获得最大的颜色变化可以通过提高或降低NaCl浓度，并比较目标响应于空白响应。使用NaCl浓度，提供最大的反应差异。
- 观察或测量以下的NaCl除了测定反应150秒。分析用分光计在650nm和530nm处的吸光度，或获取测定响应（参见照片分析协议第4节）的数码相机照片。
注：在获得对这项工作的测量用酶标仪。 - 积的结果作为在650纳米和530纳米（E 650 / E 530），为分析物浓度的函数得到的吸光度的比率。正常化测定响应于该空白信号作为在此工作已完成。
4.照片和数字图像色彩分析协议分析
- PreparË试验样品描述（第3.2-3.3）。放置96孔板上的透射。
注：标准实验室透射通常是太亮，以获得可用的数字图像进行这种分析。这些透照导致规则间隔的“暗线”出现在数字图象中，由于光源的强度。从发光二极管（LED）基于光盒制作透射和一块不透明的塑料效果很好。 - 获得在氯化钠添加后150秒时的96孔板的照片，导入图像转换成图像分析软件，并计算平均红色，绿色和蓝色（RGB）值，使用增量平均技术，如公式1 24：
（1）
- 转换的RGB值，从标准RGB（sRGB的）色空间的色度 图（CIExyY）色空间，使用以下公式24：
（2）
（3）
（4）
- 转换的指数RGB值，使用式（2）在方程3中指定的矩阵的线性RGB值被用来计算在X，Y和CIE颜色空间24中的Z值。
- 计算使用等式4表示选择用于分析24中的区域中的像素的平均颜色的x和y色度值。
- 执行在每次分析井并绘制色度值以产生校准曲线（ 图4）。通过分析同一孔的不同区域的颜色获得的标准误差。
5.冷冻适配子的金纳米粒子含量为长期储存
- 如第2.4和2.5的描述准备适体 - 金纳米粒子测定组分。使含有1微克/毫升的海藻糖和1μg/ ml的蔗糖在不含核酸酶的水，使冷冻剂溶液分开的溶液。
注意：高浓度的海藻糖和蔗糖的用于制备测定冻结时减少稀释因子。热火在电热板上的糖溶液中的水的烧杯中使用前彻底溶解糖。 - 使包含19.2毫克/毫升海藻糖和在200微升1.5毫升微量离心管的终体积4.8毫克/毫升蔗糖与60 MN4-DNA /金纳米粒子测定的溶液。最后制冷剂的溶液浓度将DNA覆盖率有所不同。
注：样品被冻结不得超过300微升。较大的体积可能无法正确冻结。 - 闪光灯使用-146℃的冰箱或液氮冷冻的样品。冷冻保存，直到使用样本。存储可在-80℃或-20℃一次冻结闪烁完成。
- 对于这项工作，在离开样品中的-146℃的冷冻夜，然后转移到-20℃的冷冻长期储存。
注：闪存冷冻可能导致适体 - 金纳米颗粒聚集。通过监测吸光分布和比较，以解冻样品测试冷冻过程的完整性。如果观察到凝集，提高的冷冻剂溶液的量来弥补这个问题。 - 解冻样品在室温下，只使用足够的样本所必需的实验。获得解冻的样品的吸收光谱，并比较未冻结的冷冻剂溶液处理的样品的基线光谱。测量吸光度从400nm到700nm的。
- 执行滴定盐（3.1节），测试分析（3.2节），并绘制结果（第3.3和3.4），如前所述。
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Representative Results
这项工作的主要目标是开发和研究基于金纳米粒子比色分析在现场使用的稳定性和适体的稳健性。如在先前的出版物强调，用于创建该测定两种不同的策略进行了调查7。该测定法被称为自由适配体测定和吸附适配体测定。的吸附适配体测定是一个fieldable检测测定（ 图1）的目的更吸引人。
图 1. 的吸附适配体测定的示意图的适体与金纳米粒子混合并孵育过夜溶解在甲醇中分析物分子加入到该吸收适配体测定，随后立即通过加入氯化钠（NaCl）来诱导金纳米粒子聚集中加入目标时。EF =“https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
这是由于在假阳性率非目标分析物，相对简单，并且便于使用的吸附适配体测定的的降低。为了制备吸附适配体测定，将DNA适配子与金纳米粒子混合并在测定缓冲液中温育过夜。这允许适体的金纳米粒子的表面，这减少了该测定的易感性到非目标分析物分子如掩蔽或切削剂的假阳性反应的容易吸附。然而，只有MN4可卡因适体的预先形成的结构是在可卡因（目标）的本测定法的设计中存在的活性。该测定通过加入分析物溶液随后立即加入NaCl适当浓度的使用。盐溶液用于引发可观察和MEA该测定的保的颜色变化。该试验2-3分钟内执行。在加入分析物溶液的后。
在这些物理吸附的基于DNA的比色测定法的执行的一个关键作用是感应颜色响应，通过加成盐的适当浓度的。盐的加成是已知的通过掩蔽该稳定金纳米粒子，然后减小颗粒间的静电相互作用的柠檬酸层的负电荷动摇导致的粒子的聚集金纳米粒子悬浮液。结果是观察到的红至蓝的颜色变化。相同的效果用DNA处理金纳米粒子观察到。在DNA的适体的情况下，分析确定必要的盐的浓度以使最少的可观察到的金纳米粒子的不稳定（蓝色着色）。通过加入目标的，由该DNA适配子的金纳米颗粒的稳定化是显著减少从而导致OBSErvable，可衡量的目标剂量反应的颜色变化。这种颜色的变化只能用加成盐的适当的预定量的感知。
同样重要的是在被确定的盐的合适的浓度的过程。这是通过加入氯化钠溶液浓度增加的一系列测定法坯料（ 图2）执行滴定曲线来实现。
图2. 盐诱导的滴定曲线。柠檬酸盐稳定化的（红色），MN4可卡因结合适体（绿色），和MN6可卡因结合适体（紫色）处理金纳米粒子的样品用氯化钠（NaCl）中进行滴定。目测获得的初始盐的浓度表示以相应彩色箭头为每条曲线。误差棒是通过在标准偏差定义三次测量。 请点击此处查看该图的放大版本。
这里，所用的初始盐浓度通过视觉检查确定，并且被视为导致轻微的蓝色着色观察到与测定空白的盐浓度。然而，对于更加定量的办法，研究新的这方面的研究可以用滴定等当点的中点作为起始盐浓度。超过该点的颜色响应开始迅速增加。此外，在测定的执行中使用的盐的浓度调节为最大化测定空白和可卡因响应之间的色差。这是通过增加和从通过滴定确定的量降低盐浓度来完成。每天被执行的盐滴定法占一天到一天的变化与分析。在所需的测定盐浓度批次变异是不超过20％。 图2有三个不同的金纳米粒子的样品，柠檬酸盐稳定的（无DNA），MN4（DNA的适体稳定化），和MN6（DNA的适体稳定化）。为MN4和MN6样品的DNA覆盖率为60的DNA分子/金纳米粒子，并且每个滴定曲线具有不同滴定等当点和中点基于稳定性的通过表面处理提供的水平。柠檬酸提供稍微安定，MN4（双链状结构）提供了更多的稳定性和MN6（单链状结构）提供了最稳定的金纳米粒子。在这项工作中使用的初始盐浓度确定为〜50毫米，〜90毫摩尔，和〜130毫目测。这一趋势与DNA结构的常规理解和金纳米粒子的24-25稳定作用同意。当在视觉上执行此测试中，测定空白显示出轻微蓝色colora灰与如在图2中标识有箭头的盐浓度，这是接近中点如所讨论的。之前的论文分盐浓度提供很少或没有观察到颜色变化，超越这些点的颜色迅速增加。对于这项工作，初始盐浓度目视测定，然后使用测定空白和可卡因样品酶标仪测量比较微调。
随着自由适配体测定方法，假阳性反应是一个问题。分析物分子的表面的相互作用是一个源针对此问题，如在先前的出版物7所述。为了防止由于非特异性金纳米粒子表面的相互作用的无意颜色响应，靶结合适体的DNA的覆盖密度被控制（ 图3）。
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图3. 吸附适配体测定反应具有不同的DNA覆盖密度。聚合反应可卡因（红，目标），EME（绿色，对照），与普鲁卡因（蓝色），一个金纳米粒子表面活性分子，为90，120，150，并显示180 DNA /金纳米粒子覆盖密度。分析的所有样品在1毫克/毫升溶解在甲醇中。误差线是由一式三份测量的标准偏差定义。 请点击此处查看该图的放大版本。
一般情况下，由于金纳米粒子相互作用的非目标分析物分子的假阳性反应率随着DNA覆盖密度降低。然而，该测定灵敏度降低作为增加DNA的覆盖范围的结果。在这项工作中，60，90，120，150，180，和300的DNA /金纳米粒子是investiga的DNA的密度特德。 60和300的密度在以前工作的7人有广泛的描述。 图3表示研究额外的DNA密度。普鲁卡因被调查的更高表面活性非目标分析物之一。对于每个单独的DNA覆盖范围的，该测定响应通过如上所述调节盐浓度最大化。一般来说随着DNA覆盖范围的增加，控制（EME）和可卡因反应之间的差异反应降低。同样地，在普鲁卡因的存在下测定反应减小到随着覆盖范围的背景水平。 180 DNA /金纳米粒子密度消除表面对相关假普鲁卡因积极响应，同时保持较高的目标响应。这种评估描述用于调谐用于减少表面相关的假阳性反应，这些色测定法，同时保持尽可能目标响应的方法。改进的灵敏度可以通过DNA覆盖的减少来实现。然而，假POSI根据应用的应对措施可能成为一个问题。
比色测定法通常用于快速，简单往往推定定性和甚至定量试验。用比色法测定常见的问题是颜色辨别的主观性，尤其是微妙和边缘的颜色差异。必须由分析师作出的判断调用可以导致数据的误解。实验室设备测量降低与评估分析结果的不确定性和优柔寡断。然而，在这项工作中，目的是为了提供提供即时成果的分析师场准备检测。这样，一个照片图像分析技术确定，提供了一种更决定性色结果（ 图4）。
图4。
与可卡因浓度增加，测定颜色导致增加的蓝色。使用两种不同的智能手机得到了校正曲线的数码照片，并导入到标准的笔记本电脑使用ImageJ软件分析。色度值被用来绘制的Calibration曲线如图4中所示，图像分析提供与由R 2值表示两组智能图像增加可卡因浓度的线性响应。该方法过渡到智能设备应用程序，以帮助分析师在现场。应用程序的详细评测在之前发布7进行。该应用程序消除了很多与最低可卡因浓度的细微的颜色变化结果的不确定性和优柔寡断。
这种类型的物理吸附的DNA检测的长期存放尚未研究非常详细和这项工作的目标之一是要找到条件，延长试验保质期。在4℃下测定组件存储的处理在先前的出版物6详细说明。对于这项工作，将制备的测定组分的冷冻干燥被认为是长期使用和贮存öF中的检测。冻干测定组分具有保持并存储在环境温度下的样品中，这将消除用于冰箱或冷冻机的需求的明显的优势。在冻干过程中的主要步骤是先冷冻样品。查询的金纳米粒子样品生存的冷冻过程中，冷冻至该解冻样品之前进行测定的吸收光谱的比较。该扫描应该完全匹配。如果样品没有生存的冻结过程中，解冻样品频谱将在上述地区的525 nm增加到吸光度。这表明，在冷冻过程中聚集的金纳米粒子和解冻的样品受到损害。解冻的测定的存活率与可卡因和EME（ 图5）检测。
图5. 吸附适配体测定响应保质期的研究。Quantifica和灰 冷冻进行测定响应于电磁辐射（绿色，对照），和可卡因（红，目标），然后在为期四周的解冻吸附适配体测定样本。误差线是由一式三份测量的标准偏差定义。 请点击此处查看该图的放大版本。
解冻法空白样品保持在作为样本相同的值在研究期间被创造，可以立即（无存储）。可卡因和EME样品的反应是与立即作出和使用的样本（无存储）观察到典型的回答是一致的。冷冻样品4周的与不改变的测定性能的期间进行了监测相比，在一段时间7同期储存在4℃下的样品或测定样品制造和使用立即出现年。可卡因的反应是在4周的时间，这也是为4℃样品7观察到相对恒定。在EME信号至2周减少1周通常与室温和4℃下贮存观察为好。一个现象我们在第一周期间归因于测定的成熟。这种方法增加可用于吸附的DNA的比色测定法的长期储存的选项，并提供一个网关额外的长期存储选项，即冻干。
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Discussion
在过去十年中，基于纳米颗粒的比色测 定法已被用于检测的目标开发包括小分子，DNA，蛋白质和细胞2-4。使用DNA适体纳米粒子实验已获得的利益。通常，这些比色测 定法是通过将DNA的适体与分析物分子，随后加入到纳米金9-10进行。但是，这些测定法已经用于证明的概念展示具有受控的实验室设置，以有限的，所选择的控制。最新进展过渡这项技术进入该领域已经进行了7。在这种方法中，将DNA适配子被吸附至金纳米粒子表面进行测试之前，加入分析物分子（ 图1）。任一适体 - 金纳米颗粒根据比色测定法的发展，需要在制造/分析过程的各个阶段的优化。因此，这些新的光盘ipline必须注意到提炼和解决这些试验获得成功相关的细微差别。
吸附的适配子的金纳米粒子实验要求每个适配子/目标对细致的优化。但是，具体操作如下解释在这里提供了一个一致的协议来执行这些比色法的优化。盐浓度导致在目标和测定空白之间的最大可观测或可测量的颜色变化的确定和调整是更关键的优化步骤（ 图2和3）之一。对于一些适体/靶对，我们已经观察到，采用滴定曲线的终点附近高盐浓度导致在蓝色到红色的颜色偏移18。这表明通过在加入靶和盐的适体的金纳米颗粒的稳定化。
可能影响该测定PE的其他因素rformance包括缓冲成分和浓度，DNA的适体的覆盖量，所使用的溶剂，温度，适体序列和结构，靶的测定温育时间（当靶被添加到测定中，盐除了之前的时间），和显色时间（所需的颜色来开发，加入盐后的时间）。 10毫米HEPES，1毫米氯化镁2个 pH 7.4缓冲液的选择在很多我们的工作使用的目标/适体对的分析缓冲液。然而，这个缓冲区可能不适合于所有适体。以获得的适体正确折叠，所述测定缓冲液组分，可能需要进行调整，并保持尽可能接近到在适体选择缓冲液中使用的组合物。当利用具有金纳米粒子的缓冲液中，缓冲部件和浓度必须加以考虑，特别是与离子性物质。高浓度的离子化合物的可能导致金纳米粒子的过早聚合。 DNA /金纳米粒子覆盖率表现在图3中 ，作为该DNA从90-180的DNA /金纳米粒子覆盖率增大，目标分析物响应下降引起降低测定灵敏度。因此，需要一个折衷依赖于每个适体，由于其特殊的折叠并与金纳米粒子表面的相互作用的程度。
此外，以溶解分析物分子需要的溶剂可能导致金纳米颗粒的意外聚集。水，测定缓冲液和甲醇都被用来没有问题。使用未经稀释，乙腈和二甲基亚砜（DMSO）吸附到金纳米粒子表面引起意想不到的聚集。乙腈是有问题的，即使在小于1％（最终体积）稀释。溶剂应与金纳米粒子具有比色测定在使用前进行测试。在其中进行，测定中的温度可以有一个响应是否与测定观察到的影响。这具有更在给定温度做与适体结构和熔融温度，或适体结构的稳定性，比与纳米颗粒。在我们的工作中，我们已经确定，存在具有在折叠形式在与DNA的预制结构的适配子之间的微妙平衡，并且还没有完全的单链结构。这是对这些比色测 定法的吸附适配体测定形式（ 图1）的情况。当考虑结构，适体序列也必须被考虑，因为大部分的适体结构是单个寡核苷酸序列的结果。然而，需要进一步调查这一方面。
在一般情况下，我们在发展适体 - 金纳米粒子基于比色法使用的方法是对所有适体/靶对的相同。首先，获取用于所关注的靶的适体。这可以通过搜索文献或适体的感兴趣的分子的选择来实现。在此阶段，没有办法知道适体是否是一个很好的候选用于创建比色检测。这只能通过实验来确定。接着，将适体与金纳米粒子温育过夜来制造吸附适配体测定（ 图1）。标准的做法是开始与60适配/金纳米粒子测试;然而，多个覆盖量进行检测的下一个阶段制备。当检测是准备进行测试，执行滴定曲线调查所描述（ 图2）。滴定曲线的中点作为可靠起始盐浓度被用于目标，测定空白，并控制测试。盐的浓度是微调，以提供目标和测定空白样品之间的最大色差。为了测试响应是真实的，由适体 - 靶结合引起，而不是由于非特异性靶/溶剂的相互作用，执行与控制测定。同时，法显色时间以5分钟的间隔调查。其次是目标检测孵育时间在5分钟INTErvals，使用最初15+分钟的温育时间，直到此步骤进行了优化。根据结果，盐浓度，适体覆盖，孵育时间和彩色显影时间的进一步优化可能是必要的（ 图3）。这种方法描述了设计和适体 - 金纳米粒子比色分析的发展目标/适配子对的协议。进一步调查吸着适体比色法的改良适体序列和结构的影响是极大的兴趣。有必要了解与适体，靶，和金纳米颗粒相关的相互作用。这方面的知识可能导致剪裁适体为更好的功能，甚至预测哪些适体将在吸附适配体测定形式活性。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
References
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