Summary
تم فحص تصميم وتطوير أبتمر الذهب فحص جسيمات متناهية الصغر اللونية للكشف عن جزيئات صغيرة للتطبيقات في الميدان. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من صحة تطبيق اللونية جهاز ذكي (التطبيق) وتأسست تخزين طويل الأجل للمقايسة لاستخدامها في هذا المجال.
Abstract
تم فحص تصميم وتطوير جسيمات متناهية الصغر أبتمر الذهب (AuNP) فحص اللونية للكشف عن جزيئات صغيرة للتطبيقات في الميدان. وقد وضعت الهدف انتقائية AuNP المقايسات اللون مقرها في بيئة معملية إثبات صحة مفهوم رقابة. ومع ذلك، لم تمارس هذه المخططات إلى نقطة عدم تحديد الاستخدام العملي إلى ما وراء بيئة معملية. يصف هذا العمل النهج العام لتصميم وتطوير واستكشاف مقايسة أبتمر-AuNP اللونية للالتحاليل جزيء صغير وباستخدام مقايسة للإعدادات في الميدان. في الاختبار هو مفيد لالأبتامرات كثف إيقاف فاعلية السطوح جسيمات متناهية الصغر وتوفر وسيلة للحد والقضاء على ردود فعل إيجابية كاذبة لالتحاليل غير المستهدفة. الانتقال هذا النظام لاستخدامات عملية يتطلب تحديد ليس فقط العمر الافتراضي للفحص أبتمر-AuNP، ولكن وضع أساليب وإجراءات لتوسيع مقدرات التخزين على المدى الطويلities. أيضا، واحدة من الاهتمامات المعترف بها مع قراءات اللونية هو العبء الملقى على عاتق المحللين لتحديد بدقة التغيرات غالبا ما تكون خفية في اللون. للتخفيف من المسؤولية على المحللين في هذا المجال، وقد تم تصميم بروتوكول تحليل اللون لأداء واجبات تحديد اللون من دون الحاجة لأداء هذه المهمة على معدات الصف المختبر. وصفت طريقة لإنشاء واختبار بروتوكول تحليل البيانات. ولكن لفهم والتأثير على تصميم فحوصات أبتمر كثف، والتفاعلات المرتبطة مع أبتمر والهدف، وAuNPs تتطلب مزيدا من الدراسة. المعرفة المكتسبة يمكن أن يؤدي إلى الخياطة الأبتامرات لتحسين الأداء الوظيفي.
Introduction
قياس الألوان هي واحدة من أقدم التقنيات المستخدمة في الكيمياء التحليلية. لهذه التقنية، وهو تقرير نوعي أو كمي لتحليلها وتقديمها بالاستناد على إنتاج مركب اللون 1. عادة، المقايسات اللون استخدام الكواشف التي تشهد تحول لون في وجود الأنواع تحليلها، مما يؤدي إلى تغيير اللون يمكن ملاحظتها أو كشفها في طيف الضوء المرئي. وقد استخدم قياس الألوان في الكشف عن الأهداف التي تتراوح بين الذرات أو الأيونات، والجزيئات الصغيرة إلى جزيئات بيولوجية معقدة مثل الأحماض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA)، والببتيدات والبروتينات 2-4. على مدى العقدين الماضيين، أحدثت ثورة في المواد النانوية في مجال فحوصات الكشف، لا سيما مع فحوصات على أساس اللون 5-6. الجمع بين الخصائص الكيميائية والفيزيائية الفريدة للمواد متناهية الصغر مع وجود عنصر الهدف الاعتراف انتقائي، مثل الأجسام المضادة، الأبتامرات النوكليوتيد أو الأبتامرات الببتيد، أدى إلى انبعاث طن تصميم وتطوير فحوصات الكشف اللونية 7.
المعادن النانوية لها أثبتت تعتمد على حجم الممتلكات تغيير اللون، والتي تم استغلالها في تصميم العديد من المقايسات اللونية. جزيئات الذهب (AuNPs) ذات أهمية خاصة نظرا لالمميز الحمراء إلى اللون الأزرق تحول لون، عندما يتم يسببها الحل فرقت الجسيمات لتجميع 8، وعادة من خلال إضافة دقيقة من الملح. وقد أدى القدرة على التحكم في الانتقال من تشتت (أحمر) إلى (الأزرق) الدول تجميعها لإنشاء أجهزة الاستشعار اللونية لالأيونية، صغير الجزيئي، الببتيد، البروتين، والأهداف الخلوية 2-4،9. العديد من هذه المجسات توظيف الأبتامرات كما عزر الاعتراف الهدف.
الأبتامرات هي DNA أو الحمض النووي الريبي (RNA) جزيئات يختار من بين مجموعة عشوائية من 10 12 -10 15 سلاسل مختلفة 10-11. تحدد عملية الاختيار إعادة الهدفعناصر الإدراك مع الانتماءات الملزمة في النظام nanomolar منخفضة، والتطور المنهجي للبروابط كتبها تخصيب الأسي (سيليكس) هي العملية الأكثر المعروف 12-13. وتشمل مزايا الأبتامرات أساس النوكليوتيد لتطبيقات الاستشعار عن سهولة تركيب وتعديل مادة كيميائية يمكن السيطرة عليها، والاستقرار الكيميائي 14-15.
نهج واحد لخلق مقايسة اللونية يجمع المواد النانوية مع عناصر الاعتراف، ويتألف من الجمع بين هذين النوعين من خلال امتصاص المادي للجزيئات الحمض النووي أبتمر على الأسطح AuNP. من خلال ملزمة المستهدفة أبتمر، وأبتمر يواجه التغيير الهيكلي 16-18 الذي يغير تفاعل أبتمر مع سطح AuNP، الأمر الذي يؤدي إلى الحمراء إلى اللون الأزرق استجابة اللون محرض 19 مع إضافة الملح. هذه الميزة المدهشة من AuNPs توفر آلية استجابة اللونية يمكن ملاحظتها للأجهزة القائمة على أبتمر التي يمكن استخدامها لإزالةتوقيع المقايسات اللونية للالتحاليل المختلفة.
المقايسات اللون تصميم باستخدام غير تساهمية، الأبتامرات الحمض النووي كثف جسديا على الأسطح AuNP لها وصمة كونها ضعيفة منصة استشعار بسبب القضايا مع متانة، والميل للفشل خارج بيئة معملية خاضعة للرقابة، ونقص المعلومات المتاحة للاستخدام في عملي إعدادات. ومع ذلك، كان الفحص اللونية أبتمر-AuNP أساس المصالح نظرا لبساطة التشغيل واستجابة اللون يمكن ملاحظتها. والهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكول لتصميم وتطوير وتشغيل والحد من سطح المتعلقة استجابة إيجابية كاذبة، والتخزين على المدى الطويل من الحمض النووي AuNP المقايسات اللونية القائمة على استخدام الكوكايين كما الحليلة تمثيلا. وعلاوة على ذلك، اقترحنا هذا كثف أبتمر نهج فحص (الشكل 1) بأنها المفيد بسبب البساطة وسهولة الاستخدام التي أسفرت عن خطوات أقل من النهج التقليدي لهذه أبتمر-AuNP الحمارآيس. لهذا الاختبار، كان أول أضافت أبتمر إلى AuNPs، والتي سمحت كثف إلى السطح لفترة طويلة من الزمن. وكان ميزة إضافية لهذا النهج على الحد من الاستجابة لجزيئات الحليلة غير المستهدفة المرتبطة بتفاعلات سطح AuNP. ومع ذلك، كان انخفاض استجابة إيجابية كاذبة على حساب حساسية الفحص. وبالتالي توازن بين حماية السطح وسهولة الوصول إليها تحليلها ضروري للحفاظ على وظيفة الفحص المناسبة. وعلاوة على ذلك، وجود خلل كبير في تحليل فحوصات اللون بوسائل أخرى غير مع الأجهزة هو أن النتائج غالبا ما تكون غير موضوعية ومفتوحة للتفسير من محلل إلى محلل، لا سيما عند محاولة للتمييز الفروق الدقيقة في اللون. على العكس من ذلك، هناك عدد من القضايا مع جعل مختبر القياس على أساس قابل للاستخدام خارج المعمل، مثل توفر الطاقة، والتطبيق العملي مع قابلية، وما إلى ذلك في هذا العمل، تم وضع بروتوكول تحليل اللون لمورقابلية وللقضاء على بعض من التخمين المرتبطة عادة مع اللون الفحص القائمة على التفسير 20-21 ه. بالمقارنة مع المناهج السابقة، سعت هذه الجهود لدفع هذه المقايسات لحدودها لتطبيقات خارج بيئة معملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليف عبر الحد من السيترات من الذهب النانوية (AuNP) وتوصيف
- تنظيف قارورة مخروطي (500 مل)، وبقضيب كبير مع 5 مل يتركز حامض النيتريك وتتركز 15 مل حمض الهيدروكلوريك في غطاء محرك السيارة سلامة الكيميائية.
- الرطب كامل سطح القارورة مع حامض يغسل، شطف القارورة بالماء مجانا نوكلياز، والسماح للقارورة لتجف.
- إضافة 100 مل من الذهب كلوريد 1 ملم (الثالث)؛ استخدام ورقة من رقائق الألومنيوم لتغطية الجزء العلوي من حمض تنظيفها مخروطي قارورة والحرارة مع التقليب المستمر على طبق ساخن حتى الغليان.
- إضافة 10 مل من 38.8 ملي سيترات الصوديوم. فإن اللون تغيير من واضح / رمادي، إلى الأحمر الداكن الأزرق / الأسود، وأخيرا الظلام على مدى عدة دقائق. تواصل اثارة مع الحرارة قبالة لمدة 10 دقيقة.
- السماح للتعليق AuNP ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة 110 ميكرولتر من diethylpyrocarbonate (DEPC) مع التقليب المستمر.
- تغطية قارورة كاملة معرقائق الألومنيوم، والسماح للعلاج DEPC لاحتضان بين عشية وضحاها. تخزين جميع AuNPs في الظلام، في حاويات التخزين العنبر أو مغطاة بورق الألمنيوم.
- الأوتوكلاف تعليق AuNP، بارد لدرجة حرارة الغرفة، وتصفية من خلال 0.22 ميكرون مسام الغشاء خلات السليلوز. تخزين، تعقيمها حل الأسهم AuNP تصفيتها في الظلام في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: سوف المعاملة مع DEPC، والتعقيم عن طريق التعقيم، وتخزين عند 4 درجات مئوية تحسين العمر الافتراضي للفحص أبتمر-AuNP. سوف التخزين في هذه الطريقة تسمح للمقايسة على البقاء وظيفية لأكثر من 2 أشهر. - حساب تركيز AuNP بحصولها على امتصاص البنفسجية المرئية فائقة في 520 نانومتر، واستخدام معامل انقراض (ɛ) 2.4 × 10 8 L مول -1 سم -1 مع قانون بير عن طريق حساب تركيز (ج). تم تحديد تركيز ليكون 10 نانومتر بحجم 15 نانومتر التي يحددها تشتت الضوء الديناميكي.
ملاحظة: سوف تركيزات تختلف الابOM-دفعة لدفعة واحدة. تمييع الأسهم AuNP مع المياه nuclease مجانا عند الضرورة للحفاظ على المطلوب 10 نانومتر AuNP تعليق.
2. الحمض النووي أبتمر، العازلة، الحل، وإعداد الفحص
- شراء أو تجميع الكوكايين التالية ملزم متواليات أبتمر باستخدام معيار phosphoramidite الكيمياء 22:
MN4 19: 5'-GGC GAC مجموعة الاهلي غا AAT CCT TCA ACG مجموعة الاهلي TGG GTC دول مجلس التعاون الخليجي 3 "
MN6 19: 5'-GAC مجموعة الاهلي غا AAT CCT TCA ATG مجموعة الاهلي TGG GTC-3 " - تنقية الأبتامرات باستخدام تحلية القياسية 23. إعادة أليغنوكليوتيد في nuclease خالية من المياه في إما 100 ميكرومتر أو 1 الحلول الأسهم ملم. قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
- شراء أو إعداد مخزونات عقيمة 1 M 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) ودرجة الحموضة 7.4، و 100 ملي المغنيسيوم كلوريد (MgCl 2)، و 1 M كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم).
- تجهيز 50 مل من العازلة في nuclease خالية واي المياهتركيزات ال 20 ملي HEPES، 2 مم MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.4 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
- احتضان الحمض النووي مع محلول المخزون AuNP (10 نانومتر) لمدة 3-4 ساعة في درجة حرارة الغرفة، وحماية من ضوء. تختلف حجم AuNPs كما هو مطلوب لتوفير عينة كافية للاختبارات التي يتعين القيام بها (2،5-7،5 مل).
- هنا، استخدم الكثافة تحميل 90، 120، 150، و 180 جزيئات الحمض النووي / AuNP في هذا العمل. تختلف حجم وتركيز الحمض النووي وفقا لذلك. ضبط تغطية الحمض النووي للحد من AuNP المتعلقة سطح الردود اللون غير مقصودة من التحاليل غير المستهدفة.
ملاحظة: زيادة التغطية الحمض النووي تقليل حساسية الفحص. يتم احتساب كثافة التحميل من معرفة تركيز الأسهم AuNP، واحتساب العدد الكلي للAuNPs الحالي في حجم المطلوب لاستخدامها في التجارب. وإذا رغبت في كثافة التغطية الفعلية، وجود بروتوكولات للحصول على تلك القيم 7. تم تحديد تغطية الحمض النووي باستخدام 50 كيلو دالتون مolecular وزن العمود قطع تدور لفصل الحمض النووي AuNP بد من الحمض النووي مجانا. وAuNPs هي كبيرة جدا لتمرير من خلال عمود الدوران، في حين أن الحمض النووي الحرة سوف يمر بسهولة. الخطوة التالية هي تحديد الحمض النووي الحرة التي تم جمعها باستخدام قياسات الامتصاصية أو واحد الذين تقطعت بهم السبل صبغة الفلورسنت الحمض النووي.
- هنا، استخدم الكثافة تحميل 90، 120، 150، و 180 جزيئات الحمض النووي / AuNP في هذا العمل. تختلف حجم وتركيز الحمض النووي وفقا لذلك. ضبط تغطية الحمض النووي للحد من AuNP المتعلقة سطح الردود اللون غير مقصودة من التحاليل غير المستهدفة.
- إضافة حجم مساو من 20 ملي HEPES، 2 مم MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.4 العازلة ووضع العينة في 4 درجات مئوية في ليلة وضحاها الظلام. وكان فحص أبتمر-AuNP في 10 ملي HEPES، 1 ملم MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.4 (عازلة الفحص).
3. الملح المعايرة وإعداد الفحص
- تحديد تركيز الملح الأولي اللازم للحث على الاستجابة اللون فحص من قبل المعايرة الملح مع الفراغ الفحص. إضافة 20 ميكرولتر من الميثانول (فارغة) إلى 180 مكل من أبتمر-AuNP فحص في لوحة 96-جيدا. عاير العينات مع زيادة حجم من محلول كلوريد الصوديوم الأسهم (1 م أو 2 م) وتحديد نقطة التكافؤ (الشكل 2 ملاحظة: يمكن زيادتها في مقايسة إلى كميات أصغر عن طريق الحفاظ على نسبة الميثانول فارغة (أو تحليلها المنحلة) لأبتمر-AuNP فحص نفسه.
- هنا، وتحديد حجم كلوريد الصوديوم اللازمة لإحداث أدنى تغيير اللون عن طريق الملاحظة البصرية. وكان تركيز البداية لفحص 75 ملم و 130 ملم للMN4 وMN6 على التوالي في 60 الحمض النووي جزيء / AuNP كثافة التغطية.
ملاحظة: للحصول تقرير الكمي لتركيز الملح الأولي، منتصف منحنى المعايرة بمثابة نقطة انطلاق جيدة. أيضا، سوف التراكيز المستخدمة تختلف استنادا إلى أبتمر، الحمض النووي كثافة التغطية ومن أداء يوما بعد يوم، ودفعة لدفعة واحدة.
- هنا، وتحديد حجم كلوريد الصوديوم اللازمة لإحداث أدنى تغيير اللون عن طريق الملاحظة البصرية. وكان تركيز البداية لفحص 75 ملم و 130 ملم للMN4 وMN6 على التوالي في 60 الحمض النووي جزيء / AuNP كثافة التغطية.
- تحسين استجابة الفحص، إضافة 20 ميكرولتر من جزيئات الحليلة المخفف في الميثانول إلى 180 مكل من أبتمر-AuNP فحص في لوحة 96-جيدا في درجة حرارة الغرفة. على الفور إضافة تركيز كلوريد الصوديوم تحديدها في الخطوة السابقة لبدء استجابة فحص اللون.
لاالشركة المصرية للاتصالات: الاستفادة من ماصة الأقنية لإجراء تجارب متعددة في وقت واحد. - الحصول على أكبر تغيير اللون من الممكن عن طريق زيادة أو تقليل تركيز كلوريد الصوديوم، ومقارنة استجابة الهدف للاستجابة فارغة. استخدام تركيز كلوريد الصوديوم التي توفر أكبر الفرق استجابة.
- مراقبة أو قياس ثانية استجابة فحص 150 التالية كلوريد الصوديوم بالإضافة. تحليل الامتصاصية في 650 نانومتر و 530 نانومتر باستخدام مطياف أو الحصول على صور الكاميرا الرقمية من الاستجابة فحص (انظر القسم 4 لبروتوكول تحليل الصورة).
ملاحظة: تم استخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية في الحصول على قياسات لهذا العمل. - رسم النتائج على النحو نسبة الامتصاصية التي تم الحصول عليها في 650 نانومتر و 530 نانومتر (E 650 / E 530) كدالة للتركيز تحليلها. تطبيع استجابة فحص للإشارة فارغة كما حدث في هذا العمل.
4. الصور والصور الرقمية تحليل اللون تحليل بروتوكول
- Preparالبريد عينات الفحص كما هو موضح (أقسام 3،2-3،3). وضع لوحة 96 جيدا على نقل transilluminator.
ملاحظة: لنقل transilluminator المختبر هو معيار عادة مشرق للغاية للحصول على صور رقمية يمكن استخدامها لهذا التحليل. هذه transilluminators تسبب متباعدة بانتظام "خطوط داكنة" لتظهر في الصورة الرقمية نظرا لشدة مصدر الضوء. جعل نقل transilluminator من الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) على ضوء مربع وقطعة من البلاستيك مبهمة يعمل بشكل جيد. - الحصول على صور من لوحة 96-جيدا في 150 ثانية بعد كلوريد الصوديوم بالإضافة إلى ذلك، استيراد الصور في برنامج تحليل الصور، وحساب متوسط الأحمر والأخضر والأزرق (RGB) القيم، وذلك باستخدام تقنية المتوسط الإضافية، كما هو مبين في المعادلة 1 (24):
(1)
- تحويل القيم RGB من RGB (إس آر جي بي) مساحة لون موحد للون الفضاء اللونية الرسم البياني (CIExyY)، وذلك باستخدام المعادلات التالية 24:
(2)
(3)
(4)
- تحويل القيم RGB الأسي لقيم RGB الخطية باستخدام المعادلة 2. مصفوفة محددة في المعادلة 3 يستخدم لحساب X، Y والقيم Z من لون الفضاء CIE 24.
- حساب القيم x و y اللونية باستخدام المعادلة 4 يمثل متوسط لون بكسل في المنطقة المختارة للتحليل 24.
- إجراء تحليل في كل جيدا ورسم القيم اللونية لتوليد منحنى المعايرة (الشكل 4). الحصول على الخطأ المعياري من خلال تحليل اللون من مناطق مختلفة من نفس البئر.
5. تجميد أبتمر-AuNP الفحص للتخزين طويل الأجل
- إعداد مكونات مقايسة أبتمر AuNP كما هو موضح في المقاطع 2.4 و 2.5. جعل الحلول منفصلة تحتوي على 1 غرام / طرهالوز مل و 1 غرام / مل السكروز في nuclease خالية من المياه لجعل الحل كريوجين.
ملاحظة: تركيزات عالية من طرهالوز والسكروز واستخدمت للحد من عامل التخفيف عند إعداد مقايسة لتجميد. تسخين حلول السكر على طبق ساخن في كوب من الماء لإذابة تماما السكريات قبل الاستخدام. - جعل الحل الذي يحتوي على 19.2 ملغ / مل طرهالوز و 4.8 ملغ / مل السكروز مع 60 MN4-DNA / AuNP فحص في الحجم النهائي من 200 ميكرولتر في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. سوف تختلف تركيزات حل كريوجين النهائية مع تغطية الحمض النووي.
ملاحظة: عينات ليتم تجميد يجب ألا يتجاوز 300 ميكرولتر. كميات أكبر قد لا تجمد بشكل صحيح. - فلاش تجميد العينات باستخدام -146 درجة مئوية الثلاجة أو في النيتروجين السائل. تخزين العينات المجمدة حتى الاستخدام. ويمكن تخزين في -80 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية وميض مرة واحدة تجميد كاملة.
- لهذا العمل، وترك العينات في -146 درجة مئوية الفريزر علىليلة، ثم نقل إلى -20 درجة مئوية الثلاجة لمدة التخزين على المدى الطويل.
ملاحظة: فلاش تجميد يمكن أن يسبب أبتمر-AuNPs لتجميع. اختبار سلامة عملية التجميد عن طريق مراقبة الشخصي الامتصاصية ومقارنتها عينة غير المجمدة. إذا لوحظ التجميع، وزيادة كمية حل كريوجين للتعويض عن هذه المسألة. - ذوبان الجليد العينات في درجة حرارة الغرفة، واستخدام فقط ما يكفي من عينات الضرورة لإجراء التجارب. الحصول على أطياف الامتصاص من عينات إذابة وقارن بين أطياف الأساسي من حل كريوجين عينة غير المجمدة المعالجة. قياس الامتصاصية من 400 نانومتر إلى 700 نانومتر.
- أداء المعايرة الملح (القسم 3.1)، واختبار (القسم 3.2) الفحص، ورسم النتائج (أقسام 3.3 و 3.4) كما هو موضح سابقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان الهدف الرئيسي من هذا العمل لتطوير وتحقيق الاستقرار ومتانة أبتمر أساس AuNP المقايسات اللونية لاستخدامها في هذا المجال. كما سلط الضوء في المنشور السابق، وقد تم التحقيق استراتيجيتين متميزة لخلق فحص 7. ويطلق على فحوصات وأبتمر الفحص مجاني وكثف أبتمر الفحص. كان أبتمر الفحص كثف أكثر جاذبية لأغراض فحص الكشف fieldable (الشكل 1).
. الشكل 1. تمثيل تخطيطي للكثف أبتمر الفحص كانت مختلطة وأبتمر مع AuNPs وحضنت بين عشية وضحاها. أضيفت جزيئات الحليلة الذائبة في الميثانول إلى أبتمر الفحص الممتصة، وتليها مباشرة إضافة كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) للحث على AuNP تجميع عندما أضاف الهدف.EF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويرجع ذلك إلى انخفاض في معدلات إيجابية كاذبة لالتحاليل غير المستهدفة، والبساطة النسبية، وسهولة استخدام كثف أبتمر الفحص. لإعداد كثف أبتمر الفحص، تم خلط-أبتمر الحمض النووي مع AuNPs وحضنت بين عشية وضحاها في المنطقة العازلة الفحص. هذا ما سمح للأبتمر إلى كثف بسهولة على سطح AuNP، مما قلل من التعرض للمقايسة للاستجابات إيجابية كاذبة لجزيئات الحليلة غير المستهدفة مثل إخفاء أو وكلاء القطع. ومع ذلك، لم يكن سوى هيكل قبل المشكل من أبتمر MN4 الكوكايين نشط في وجود الكوكايين (الهدف) في هذا التصميم الفحص. كان يعمل على فحص بإضافة حلول تحليلها تليها إضافة الفورية للتركيز مناسب من كلوريد الصوديوم. تم استخدام المحاليل الملحية للشروع في ملاحظتها والشرق الأوسط وأفريقياsurable تغيير لون الفحص. تم تنفيذ الاختبار ضمن مدة 2-3 دقيقة. بعد إضافة محلول تحليلها.
وعمل حاسم في تنفيذ هذه المقايسات اللونية كثف جسديا الحمض النووي القائم هو الرد اللون يسببها، من خلال إضافة تركيز مناسب من الملح. من المعروف أن إضافة الأملاح لزعزعة استقرار تعليق AuNP مما أدى إلى تجميع الجزيئات التي كتبها اخفاء الشحنات السالبة للطبقة سترات أن استقرار AuNPs، ومن ثم يقلل من التفاعل بين الجسيمات كهرباء. والنتيجة هي تغير لونها يمكن ملاحظتها الأحمر إلى الأزرق. لوحظ نفس التأثير مع الحمض النووي تعامل AuNPs. في حالة الحمض النووي الأبتامرات، المحلل تحديد تركيز الملح الضروري أن يسبب الحد الأدنى من زعزعة الاستقرار AuNP يمكن ملاحظتها (تلوين الأزرق). مع إضافة الهدف، يتم تقليل استقرار AuNPs من الحمض النووي أبتمر بشكل كبير مما أدى إلى observable وقابلة للقياس جرعة الهدف تغير لونها استجابة. هذا تغيير اللون لا يمكن إلا أن ينظر إليها مع إضافة كمية محددة سلفا مناسبة من الملح.
المهم بالقدر نفسه هو العملية التي تم تحديد التركيز المناسب من الملح. وقد تحقق ذلك عن طريق إجراء منحنى المعايرة عن طريق إضافة زيادة تركيزات محلول كلوريد الصوديوم إلى سلسلة من الفراغات فحص (الشكل 2).
الشكل 2. يسببها الملح منحنى المعايرة. السيترات استقرت (الحمراء)، MN4 الكوكايين ملزمة أبتمر (الأخضر)، وMN6 الكوكايين ملزمة أبتمر (البنفسجية) معاملة عينات AuNP ومعاير مع كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم). وأشار إلى تركيز الملح الأولية التي تم الحصول عليها بصريا مع المقابلة السهام الملونة لكل منحنى. يتم تحديد أشرطة الخطأ من قبل الانحراف المعياري فيثلاث نسخ القياسات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هنا، تم تحديد تركيز الملح الأولي التي يستخدمها الفحص البصري، واتخذ ليكون تركيز الملح الذي تسبب في أدنى تلوين الأزرق يمكن ملاحظتها مع الفراغ الفحص. ولكن لاتباع نهج أكثر الكمي، نيو الباحثين في هذا المجال من البحث يمكن استخدام منتصف نقطة المعايرة التكافؤ كما تركيز الملح البدء. أبعد من هذه النقطة تبدأ استجابة اللون لتحقيق زيادة سريعة. وعلاوة على ذلك، تم تعديل تركيز الملح المستخدمة في تنفيذ الاختبار لتحقيق أقصى قدر من الاختلاف بين الألوان والاستجابات الفارغة والكوكايين الفحص. وقد تحقق ذلك من خلال زيادة وخفض تركيز الملح من المبلغ المحدد من قبل المعايرة. تم تنفيذ الإجراء الملح المعايرة يوميا لحساب لتقلب يوما بعد يوم مع الفحص. كان التغير دفعة في تركيز الأملاح اللازمة لفحص ما لا يزيد عن 20٪. الشكل 2 ديها ثلاث عينات AuNP متميزة، استقرت سترات (أي DNA)، MN4 (استقرت الحمض النووي أبتمر)، وMN6 (DNA-أبتمر استقرت). كانت تغطية الحمض النووي لعينات MN4 وMN6 60 جزيئات الحمض النووي / AuNP، وكل منحنى المعايرة لديه نقطة المعايرة التكافؤ مختلفة ومنتصف استنادا إلى مستوى من الاستقرار الذي توفره المعالجة السطحية. قدم سترات الاستقرار قليلا، MN4 (مزدوجة تقطعت بهم السبل مثل هيكل) تقدم مزيدا من الاستقرار وMN6 (الذين تقطعت بهم السبل واحد مثل هيكل) قدمت معظم الاستقرار في AuNPs. وكانت مسألة التركيزات الملحية الأولية المستخدمة في هذا العمل مصممة لتكون ~ 50 ملم، ~ 90 ملم، و ~ 130 ملم بصريا. ويتفق هذا الاتجاه مع الفهم التقليدي للبنية الحمض النووي وأثر في تحقيق الاستقرار على AuNPs 24-25. عند إجراء هذا الاختبار بصريا، وأظهر الفراغ فحص وCOLORA الأزرق طفيف نشوئها مع تركيز الملح على النحو المحدد في الشكل 2 مع السهام، والتي هي قريبة من نقاط المنتصف كما هو مبين. مسألة التركيزات الملحية قبل نقطة أطروحات توفر القليل أو أي تغيير اللون يمكن ملاحظتها، وراء هذه النقاط الزيادات اللون بسرعة. لهذا العمل، تم تحديد تركيز الملح الأولي بصريا ثم صقله باستخدام مقارنات قياس قارئ صفيحة من عينات فارغة والكوكايين الفحص.
مع اقتراب الحرة أبتمر الفحص، وكانت الردود إيجابية كاذبة قضية. التفاعلات سطح جزيئات الحليلة هي مصدر واحد لهذه المشكلة، كما هو موضح في نشرة السابق 7. لمنع الردود اللون غير مقصود بسبب التفاعلات سطح AuNP غير محددة، وكثافة التغطية الحمض النووي للأبتمر ملزم الهدف وتمت السيطرة (الشكل 3).
JPG "/>
الشكل 3. كثف أبتمر استجابة فحص مع اختلاف كثافة التغطية الحمض النووي. استجابة تجميع لالكوكايين (الأحمر والهدف)، EME (الأخضر والسيطرة)، والبروكين (الأزرق)، على سطح AuNP جزيء نشط، ل90، 120، 150، وعرضت 180 DNA / AuNP كثافة التغطية. تم حل جميع العينات التي تم تحليلها في الميثانول في 1 ملغ / مل. يتم تحديد أشرطة الخطأ من قبل الانحراف المعياري في القياسات ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بشكل عام، انخفض معدل استجابة ايجابية كاذبة من جزيئات الحليلة غير المستهدفة بسبب التفاعلات AuNP مع زيادة كثافة تغطية الحمض النووي. ومع ذلك، تم تخفيض حساسية الفحص نتيجة لزيادة التغطية الحمض النووي. في هذا العمل، كثافة الحمض النووي من 60، 90، 120، 150، 180، و 300 DNA / AuNP كانت investigaتيد. وقد وصفت كثافة 60 و 300 على نطاق واسع في الأعمال السابقة 7 الشكل 3 يمثل كثافة الحمض النووي إضافية دراستها. كان البروكين واحدة من السطح أكثر شدة التحاليل غير المستهدفة النشطة التي شملها الاستطلاع. لكل من التغطيات الحمض النووي الفردية، وتعظيم الاستجابة فحص عن طريق ضبط تركيز الملح كما هو موضح. بشكل عام كما يزيد تغطية الحمض النووي، والفرق بين استجابة التحكم (EME) واستجابة الكوكايين يتناقص. وبالمثل، فإن استجابة الفحص في حضور البروكين تنخفض إلى مستويات الخلفية مع زيادة التغطيات. سطح 180 DNA / AuNP كثافة القضاء يرتبط استجابة إيجابية كاذبة لالبروكين، مع الحفاظ على استجابة الهدف عالية. يصف هذا التقييم عملية لضبط هذه المقايسات اللون للحد المتعلقة سطح ردودا إيجابية كاذبة، مع الحفاظ على استجابة الهدف قدر الإمكان. ولا يمكن تحقيق تحسين الحساسيات من خلال الحد من تغطية الحمض النووي. ومع ذلك، POSI كاذبةقد تصبح ردود TIVE قضية اعتمادا على التطبيق.
تستخدم المقايسات اللونية شيوعا للاختبارات سريعة وبسيطة في كثير من الأحيان الظنية النوعية والكمية حتى. القضايا المشتركة مع قرارات اللونية هي طبيعة ذاتية للتمييز اللون، وخاصة مع وجود اختلافات اللون خفية والشريط الحدودي. المكالمات الحكم الذي يجب أن يتم من قبل المحلل يمكن أن يؤدي إلى سوء تفسير البيانات. القياسات على المعدات المختبرية تقلل من عدم اليقين والتردد المرتبطة بتقييم نتائج الفحص. ولكن في هذا العمل، وكان ذلك بقصد تقديم فحص استعداد الحقل الذي قدم نتائج فورية إلى المحلل. على هذا النحو، وقد تم تأسيسها تقنية تحليل الصور الصورة التي وفرت أكثر حسما نتيجة اللون (الشكل 4).
الشكل (4).
مع زيادة تركيزات من الكوكايين، أدى لون فحص في اللون الأزرق زيادة. وقد تم الحصول على الصور الرقمية من منحنيات المعايرة باستخدام اثنين من الهواتف الذكية المختلفة، والمستوردة إلى جهاز كمبيوتر محمول القياسية للتحليل باستخدام برنامج ImageJ. تم استخدام القيم اللونية لرسم جمنحنيات alibration كما هو مبين في الشكل (4). وقدم تحليل الصور استجابة خطية إلى زيادة تركيز الكوكايين مع كل من مجموعات من الصور الذكي كما يتضح من 2 قيم R. وقد انتقلت هذه الطريقة إلى التطبيق الجهاز الذكية لمساعدة المحلل في هذا المجال. تم إجراء تقييم مفصل من التطبيق في منشور السابق 7. القضاء على التطبيق الكثير من الشكوك والتردد المرتبطة خفية نتائج تغيير لون أقل تركيز الكوكايين.
لم تدرس تخزين طويل الأجل للفحوصات الحمض النووي كثف جسديا من هذا النوع بقدر كبير من التفصيل، وكان أحد أهداف هذا العمل على إيجاد الظروف لتمديد فحص فترة الصلاحية. تم تفصيل العلاج من مكونات فحص لتخزين عند 4 درجات مئوية في منشور السابق 6. لهذا العمل، واعتبر تجفيد من مكونات فحص مستعدة لاستخدام على المدى الطويل وتخزين سو الفحص. Lyophilizing مكونات فحص لديها ميزة واضحة لحفظ وتخزين العينات في درجة حرارة الغرفة، والتي من شأنها القضاء على الحاجة إلى الثلاجة أو الفريزر. والخطوة الأولى في عملية lyophilizing هو تجميد لأول مرة في العينة. للتحقق من عينات AuNP البقاء على قيد الحياة عملية التجميد، إجراء مقارنة بين أطياف الامتصاص للفحص قبل تجميد إلى أن العينة إذابة. يجب أن تطابق المسح بالضبط. إذا كانت العينات لا تنجو من عملية التجميد، وعينة الطيف إذابة زادت الامتصاصية في منطقة فوق 525 نانومتر. هذا يدل على أن AuNPs تجميعها أثناء التجميد وللخطر العينة إذابة. تم اختبار جدوى الفحص إذابة مع الكوكايين وEME (الشكل 5).
الرقم 5. كثف أبتمر الفحص دراسة استجابة الجرف الحياة. Quantificaنشوئها رد فحص لEME (الأخضر والسيطرة)، والكوكايين (الأحمر والهدف) أداء مع المجمدة ثم إذابة العينات أبتمر الفحص كثف خلال فترة أربعة أسابيع. يتم تحديد أشرطة الخطأ من قبل الانحراف المعياري في القياسات ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وظلت العينات فارغة فحص إذابة بنفس القيمة خلال فترة الدراسة والعينات التي تم إجراؤها واستخدامها على الفور (لا التخزين). وكانت ردود عينات الكوكايين وEME تتفق مع ردود نموذجية لوحظ مع عينات المحرز واستخدامها على الفور (لا التخزين). تم رصد العينات المجمدة لمدة 4 أسابيع مع أي تغيير على أداء الفحص بالمقارنة مع العينات المخزنة في 4 درجات مئوية خلال نفس الفترة الزمنية (7) أو لعينات فحص جعلت واستخدمت فوراذ. وكانت ردود الكوكايين ثابتة نسبيا خلال فترة 4 أسابيع، والذي لوحظ أيضا ل 4 ° C عينات 7. وكثيرا ما لوحظ انخفاض في إشارة EME من الأسبوع 1 إلى 2 في الأسبوع مع درجة حرارة الغرفة و 4 درجات مئوية تخزين كذلك. والظاهرة التي تنسب إلى نضوج الفحص خلال الأسبوع الأول. زدت هذا النهج الخيارات المتاحة للتخزين طويل الأجل للفحوصات اللونية كثف الحمض النووي، وتوفير بوابة لخيارات التخزين على المدى الطويل إضافية، وهي تجفيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على مدى العقد الماضي، وقد وضعت جسيمات متناهية الصغر أساس المقايسات اللونية للكشف عن الأهداف تشمل الجزيئات الصغيرة، والحمض النووي والبروتينات، والخلايا 2-4. المقايسات التي تستخدم الحمض النووي الأبتامرات مع النانوية قد تكتسب الفائدة. عادة، يتم تنفيذ هذه المقايسات اللونية عن طريق خلط الحمض النووي أبتمر مع جزيئات الحليلة تليها بالإضافة إلى AuNPs 9-10. ومع ذلك، فقد استخدمت هذه المقايسات في إثبات صحة مفهوم المظاهرات مع بيئة معملية للرقابة ومع محدودية الضوابط، تم اختيارها. التطورات الأخيرة للانتقال هذه التكنولوجيا في مجال بذلت 7. في هذا النهج، والحمض النووي أبتمر وقد كثف لAuNP السطوح قبل إضافة جزيئات تحليلها لفحصها (الشكل 1). تطوير إما أبتمر الذهب جسيمات متناهية الصغر المقايسات اللونية القائمة على تتطلب التحسين في مراحل مختلفة من عملية تصنيع / التحليل. وهكذا، أولئك جديدة إلى القرصipline يجب أن تكون على بينة من الفروق الدقيقة المرتبطة التكرير واستكشاف هذه المقايسات لتكون ناجحة.
تتطلب فحوصات جسيمات متناهية الصغر أبتمر الذهب كثف الأمثل دقيق لكل زوج أبتمر / الهدف. ومع ذلك، وبعد شرح الخطوات هنا يقدم بروتوكول ثابت لأداء الأمثل من هذه المقايسات اللونية. تحديد وضبط تركيز الملح في ذلك من الحد الأقصى للتغير لونها يمكن ملاحظتها أو قياسها بين الفراغ هدف والاختبار هو إحدى الخطوات الأمثل أكثر أهمية (الشكلان 2 و 3). بالنسبة لبعض الأزواج أبتمر / الهدف، لاحظنا أن استخدام تركيزات عالية من الملح بالقرب من نقطة نهاية منحنى المعايرة قد أدى إلى تحول لون الأزرق إلى الأحمر 18. وهذا يدل على استقرار AuNPs من قبل أبتمر على إضافة الهدف والملح.
ومن العوامل الأخرى التي قد تؤثر على المؤسسة العامة مقايسةrformance تشمل مكونات العازلة وتركيز، حجم التغطية الحمض النووي أبتمر، المذيبات المستخدمة، ودرجة الحرارة، وتسلسل أبتمر وهيكل، والوقت المستهدفة فحص الحضانة (الوقت الذي أضاف الهدف إلى فحص، قبل إضافة الملح)، والوقت اللازم لتطوير اللون ( الوقت اللازم للون لتطوير، بعد إضافة الملح). و10 ملي HEPES، 1 ملم MgCl 2 درجة الحموضة كان 7.4 عازلة المخزن المؤقت فحص الاختيار في كثير من أزواج الهدف / أبتمر المستخدمة في عملنا. ومع ذلك، قد لا يكون هذا المخزن المؤقت المثالي لجميع الأبتامرات. للحصول على للطي السليم للأبتمر، قد تحتاج مكونات عازلة الفحص إلى أن تكون مصممة، وأبقى أقرب وقت ممكن لتكوين المستخدمة في المخزن المؤقت اختيار أبتمر. عندما تستخدم منطقة عازلة مع AuNPs، يجب النظر في مكونات العازلة وتركيز، لا سيما مع المواد الأيونية. تركيزات عالية من مركبات الأيونية يمكن أن يسبب تراكم السابق لأوانه AuNPs. وقد تجلى تغطية DNA / AuNP في الشكل (3). وبما أن الحمض النوويزيادة تغطية 90-180 DNA / AuNP، انخفضت استجابة الحليلة المستهدفة مما تسبب في خفض حساسية الفحص. لذلك، هناك حاجة إلى المفاضلة التي تعتمد على كل أبتمر، نظرا للطي ودرجة التفاعل مع سطح AuNP معين.
بالإضافة إلى ذلك، والمذيبات اللازمة لإذابة الجزيئات تحليلها قد يؤدي إلى تجميع غير مقصود من AuNPs. وقد استخدمت المياه، عازلة الفحص، والميثانول من دون قضية. تستخدم بدون تخفيف، الأسيتونتريل وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كثف إلى السطح AuNP مما تسبب في تراكم غير مقصودة. كان الأسيتونتريل مشكلة حتى في التخفيفات أقل من 1٪ (الحجم النهائي). وينبغي اختبار المذيبات مع AuNPs قبل الاستخدام مع مقايسة اللونية. درجة الحرارة التي يتم تنفيذ الفحص يمكن أن يكون لها تأثير على ما إذا كان لوحظ استجابة مع الفحص. هذا له علاقة مع هيكل أبتمر ودرجة حرارة انصهار، واستقرار هيكل أبتمر عند درجة حرارة معينة، منمع النانوية. في عملنا، ونحن مصممون أن يكون هناك توازن دقيق بين وجود أبتمر في بنية ما قبل المشكل مع الحمض النووي في شكل مطوية، وأيضا ليست تماما في هيكل الذين تقطعت بهم السبل واحد. وهذا هو الحال بالنسبة لشكل فحص كثف أبتمر من هذه المقايسات اللونية (الشكل 1). وعند النظر في الهيكل، كما يجب التفكير في تسلسل أبتمر لأن الكثير من هيكل أبتمر هو نتيجة لمتواليات النوكليوتيد الفردية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق في هذا الجانب.
بشكل عام، النهج الذي استخدم في تطوير أبتمر-AuNP أساس مقايسة اللونية هو نفسه بالنسبة لجميع أزواج أبتمر / الهدف. أولا، الحصول على أبتمر لهدف الفائدة. ويمكن تحقيق ذلك من خلال البحث في الأدب أو اختيار من أبتمر لجزيء من الفائدة. في هذه المرحلة، لا توجد وسيلة لمعرفة ما إذا كان أبتمر هو مرشح جيد لخلق اللونيةفحص. لا يمكن تحديد ذلك من خلال التجريب. المقبل، يتم تحضين أبتمر مع AuNPs بين عشية وضحاها لافتعال فحص أبتمر كثف (الشكل 1). النهج هو معيار لبدء اختبار مع 60 الأبتامرات / AuNP. ومع ذلك، يتم إعداد التغطيات متعددة للمرحلة المقبلة من الاختبار. عندما المقايسات جاهزة للاختبار، وإجراء التحقيقات منحنى المعايرة كما هو موضح (الشكل 2). منتصف منحنى المعايرة بمثابة بدء تركيز موثوق الملح لاستخدامها لهدف، فارغة الفحص، واختبارات مراقبة. وصقل تركيز الملح لتوفير اختلاف لون الحد الأقصى بين الهدف وفحص عينات فارغة. لاختبار استجابة حقيقية وسببها أبتمر-هدف ملزم وليس بسبب الهدف / التفاعلات المذيبات غير محددة، إجراء فحص مع الضوابط. في وقت واحد، ويتم التحقيق الأوقات اللون التنمية الفحص في 5 فترات دقيقة. تليها حضانة مرات المستهدفة فحص في 5 دقائق الأسواق العالمية ضغطهاrvals، وتستخدم في البداية 15+ مرات دقيقة الحضانة حتى يتم تحسين هذه الخطوة. اعتمادا على هذه النتائج، مزيد من التحسين من تركيز الملح، وتغطية أبتمر، فترة حضانة والوقت اللازم لتطوير اللون قد يكون ضروريا (الشكل 3). يصف هذا النهج بروتوكول لتصميم وتطوير أبتمر-AuNP المقايسات اللونية لزوج الهدف / أبتمر. مزيد من التحقيقات في تسلسل أبتمر وتأثيرات هيكلية على تحسين أبتمر كثف المقايسات اللونية ذات أهمية كبيرة. هناك حاجة لفهم التفاعلات المرتبطة أبتمر والهدف، وAuNPs. هذه المعرفة يمكن أن يؤدي إلى الخياطة الأبتامرات حصول على وظائف أفضل وحتى التنبؤ الذي الأبتامرات سوف تكون نشطة في شكل فحص كثف أبتمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
References
- Housecroft, C., Constable, E. Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , Pearson Education. ISBN: 9780131275676 349-353 (2006).
- Bunka, D., Stockley, P. Aptamers come of age-at last. Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).
- Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells. Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).
- Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. Gold nanoparticles for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).
- Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. Aptamer in bioanalytical applications. Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).
- Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Chávez, J., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
- Alivasatos, A., et al. Organization of nanocrustal molecules using DNA. Nature. 382, 609-611 (1996).
- Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers. Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).
- Liu, J., Lu, Y. Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles. Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).
- Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin. J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).
- Hermann, T., Patel, D. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science. 287 (5454), 820-825 (2000).
- Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).
- Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. Aptamer-based biosensors. TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).
- Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles. Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).
- Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles. Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).
- Chávez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).
- Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Li, H., Rothberg, L. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells. Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).
- Martin, J., Chávez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
- Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. Point-of-care colorimetric detection with a smartphone. Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).
- Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil. Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).
