Summary
La progettazione e lo sviluppo di un saggio colorimetrico nanoparticelle aptameri oro per il rilevamento di piccole molecole per applicazioni sul campo è stata esaminata. Inoltre, una smart-dispositivo di applicazione colorimetrico (app) è stato convalidato e conservazione a lungo termine del test è stata stabilita per l'uso nel campo.
Abstract
La progettazione e lo sviluppo di una nanoparticella aptameri oro (AUNP) saggio colorimetrico per la rilevazione di piccole molecole per applicazioni sul campo è stata esaminata. saggi di colore a base di destinazione AUNP selettivo sono stati sviluppati in laboratorio proof-of-concept controllati. Tuttavia, questi sistemi non sono stati esercitato ad un punto di errore per determinare il loro uso pratico oltre impostazioni di laboratorio. Questo lavoro descrive un approccio generico per progettare, sviluppare e risolvere i problemi di un saggio colorimetrico aptameri-AUNP per piccole analiti molecola e con il saggio per le impostazioni in-the-field. Il saggio è vantaggioso perché aptameri adsorbiti passivazione delle superfici nanoparticelle e forniscono un mezzo per ridurre ed eliminare le risposte positive falsi per analiti non bersaglio. Transizione questo sistema per usi pratici necessario definire non solo la shelf-life del test aptameri AUNP, ma che fissa i metodi e le procedure per estendere l'capabil conservazione a lungo terminevità. Inoltre, una delle preoccupazioni riconosciuti con lettura colorimetrica è l'onere che gli analisti a identificare con precisione i cambiamenti spesso sottili di colore. Per diminuire la responsabilità analisti nel settore, un protocollo di analisi del colore è stato progettato per eseguire le funzioni di identificazione del colore senza la necessità di eseguire questa operazione su attrezzature di laboratorio di grado. Il metodo per la creazione e test del protocollo di analisi dei dati è descritto. Tuttavia, per capire e influenzare la progettazione di test aptamer adsorbite, le interazioni associate al aptamer, bersaglio, e AuNPs richiedono ulteriori studi. Le conoscenze acquisite potrebbe portare a sartoria aptameri per una migliore funzionalità.
Introduction
Colorimetria è una delle tecniche più antiche utilizzate in chimica analitica. Per questa tecnica, una determinazione qualitativa o quantitativa dell'analita viene effettuata in base alla produzione di un composto colorato 1. Tipicamente, saggi colori utilizzano reagenti che subiscono un cambiamento di colore in presenza della specie analiti, che si traduce in una variazione di colore osservabile o rilevabile nello spettro della luce visibile. Colorimetria è stato utilizzato nella rilevazione di bersagli che vanno da atomi, ioni e piccole molecole alle molecole biologiche complesse come gli acidi nucleici (DNA), peptidi e proteine 2-4. Negli ultimi due decenni, i nanomateriali hanno rivoluzionato il campo di test di rilevazione, in particolare con test basati colore 5-6. Combinando le proprietà chimiche e fisiche uniche di nanomateriali con un elemento di destinazione di riconoscimento selettivo, come gli anticorpi, aptameri oligonucleotide o aptameri peptidici, ha portato alla recrudescenza in la progettazione e lo sviluppo di test di rilevazione colorimetrici 7.
nanoparticelle metalliche hanno una proprietà viraggio dipendente dalle dimensioni dimostrato, che è stato sfruttato nella progettazione di numerosi test colorimetrici. Nanoparticelle di oro (AuNPs) sono di particolare interesse per uno specifico spostamento di colore rosso al blu, quando la soluzione dispersa di particelle è indotta ad aggregare 8, tipicamente attraverso la precisa aggiunta di sale. La capacità di controllare la transizione dalla disperso (rosso) alle (blu) stati aggregati ha portato alla creazione di sensori colorimetrici per ionica, piccolo molecolare, peptidi, proteine e bersagli cellulari 2-4,9. Molti di questi sensori impiegano aptameri come il motivo di puntamento.
Aptameri sono molecole di acido ribonucleico (RNA) DNA o selezionati da un pool casuale di 10 12 -10 15 diverse sequenze 10-11. Il processo di selezione individua re bersaglioElementi cognizione con affinità di legame nel regime bassa nanomolari, e l'evoluzione sistematica dei ligandi per arricchimento esponenziale (SELEX) è il processo più comunemente noto 12-13. I vantaggi di aptameri a base di oligonucleotidi per applicazioni di rilevamento sono la facilità di sintesi, modifica chimica controllabile, e stabilità chimica 14-15.
Un approccio per la creazione di un saggio colorimetrico combina nanomateriali con elementi di riconoscimento, consiste nel combinare queste due specie attraverso l'adsorbimento fisico di molecole di DNA-aptamer alle superfici AUNP. Attraverso obiettivo vincolante-aptamer, l'aptamero sperimenta un cambiamento strutturale 16-18 che altera l'interazione del aptamer con la superficie AUNP, che porta ad una risposta inducibile colore rosso-to-blu 19 con l'aggiunta di sale. Questa caratteristica sorprendente di AuNPs fornisce un meccanismo di risposta colorimetrica osservabile per i dispositivi aptamer-based che possono essere utilizzati per defirmare test colorimetrici per i diversi analiti.
saggi di colore progettati utilizzando non covalenti, fisicamente assorbiti aptameri di DNA su superfici AUNP hanno lo stigma di essere una piattaforma sensore debole a causa di problemi con la robustezza, una propensione per il fallimento di fuori di impostazioni di laboratorio controllate, e la mancanza di informazioni disponibili per l'uso in pratica impostazioni. Tuttavia, il saggio colorimetrico basato aptameri AUNP era di interesse per la semplicità di funzionamento e risposta cromatica osservabile. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo per la progettazione, lo sviluppo, il funzionamento, la riduzione della superficie correlata risposta falso positivo, e la conservazione a lungo termine di DNA-AUNP test colorimetrici basati uso di cocaina come l'analita rappresentante. Inoltre, abbiamo proposto questo adsorbito aptamer approccio test (figura 1) come vantaggioso per la semplicità e facilità d'uso che ha provocato meno passaggi rispetto all'approccio convenzionale per questi aptameri AUNP assAYS. Per questo test, l'aptamero è stato aggiunto ai AuNPs, che era permesso assorbire alla superficie per un periodo prolungato di tempo. Un ulteriore vantaggio di questo approccio è la riduzione della risposta non bersaglio nuove molecole legate alle interazioni di superficie AUNP. Tuttavia, la riduzione in risposta falsi positivi a scapito della sensibilità del test. Quindi un equilibrio tra la protezione superficiale e analita accessibilità è necessario mantenere una corretta funzione test. Inoltre, un grave difetto di analisi saggi colore attraverso mezzi diversi con strumentazione è che i risultati sono spesso soggettivi e aperto all'interpretazione da analista-a-analista, soprattutto quando si cerca di distinguere sottili differenze di colore. Al contrario, ci sono una serie di problemi con fare strumentazione basata laboratorio utilizzabile al di fuori del laboratorio, come la disponibilità di energia, la praticità con la portabilità, ecc In questo lavoro, un protocollo di analisi del colore è stato sviluppato per More la portabilità e per eliminare alcune delle congetture comunemente associati con l'interpretazione del test basato colore 20-21. Rispetto ai precedenti approcci, questo sforzo è sforzato di spingere questi test ai loro limiti per applicazioni al di là delle impostazioni di laboratorio.
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Protocol
1. Sintesi via citrato Riduzione di oro nanoparticelle (AUNP) e caratterizzazione
- Pulire una beuta (500 ml) e grande ancoretta con 5 ml di acido nitrico concentrato e 15 ml di acido cloridrico concentrate in cappuccio della sicurezza chimica.
- Bagnare l'intera superficie del pallone con il lavaggio acido, lavare il pallone con acqua priva di nucleasi, e consentire il pallone asciugare.
- Aggiungere 100 ml di 1 oro cloruro mM (III); utilizzare un foglio di alluminio per coprire la parte superiore del decapaggio beuta e di calore con agitazione continua su una piastra calda fino ad ebollizione.
- Aggiungere 10 ml di sodio citrato 38,8 mm. Il colore cambia da chiaro / grigio, al rosso blu / nero, e, infine, scuro scuro per diversi minuti. Continuare a mescolare con il riscaldamento spento per 10 min.
- Lasciare che la sospensione AUNP raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere 110 ml di dietilpirocarbonato (DEPC) con agitazione continua.
- Coprire l'intero pallone confoglio di alluminio e consentono il trattamento DEPC di incubare una notte. Conservare tutti i AuNPs al buio, in contenitori di stoccaggio ambra o coperto con un foglio di alluminio.
- Autoclave la sospensione AUNP, raffreddare a temperatura ambiente, e filtrare su un 0,22 micron pori della membrana di acetato di cellulosa. Conservare il filtrato, autoclavato soluzione madre AUNP al buio a 4 ° C.
NOTA: Il trattamento con DEPC, la sterilizzazione tramite autoclave, e la conservazione a 4 ° C migliorerà la shelf-life del test aptameri AUNP. Bagagli in questo modo consentirà per il saggio a funzionare per più di 2 mesi. - Calcolare la concentrazione AUNP ottenendo Ultra Violet assorbimento-visibile a 520 nm, e utilizzare il coefficiente di estinzione (Ɛ) 2,4 x 10 8 L mol -1 cm -1 con la legge di Beer calcolando la concentrazione (c). La concentrazione è stata determinata da 10 nM con una dimensione di 15 nm determinato dalla dispersione della luce dinamica.
NOTA: Le concentrazioni variano from lotto a lotto. Diluire le scorte AUNP con acqua priva di nucleasi se necessario per mantenere la desiderata 10 nM AUNP sospensione.
2. DNA-aptameri, tampone, soluzione, e test di preparazione
- Acquistare o sintetizzare la seguente cocaina sequenze aptamer utilizzando standard di fosforammidito chimica 22 rilegatura:
MN4 19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
MN6 19: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 ' - Purificare i aptameri utilizzando dissalazione standard 23. Ricostituire oligonucleotidi in acqua priva di nucleasi sia a 100 micron o 1 soluzioni madre mm. Aliquotare e conservare a -20 ° C per diversi mesi.
- Acquisto o preparare scorte di sterile 1 M 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) pH 7.4, 100 mM di cloruro di magnesio (MgCl 2) e 1 M di cloruro di sodio (NaCl).
- Preparare 50 ml di tampone in priva di nucleasi wi acquaLe concentrazioni Th di 20 mm HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7.4 e conservare a temperatura ambiente per mesi.
- Incubare la DNA con soluzione madre AUNP (10 nM) per 3-4 ore a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. Variare il volume di AuNPs come desiderato per fornire abbastanza campione per le prove da eseguire (2.5-7.5 ml).
- Qui, utilizzare densità di carico di 90, 120, 150, e 180 molecole di DNA / AUNP in questo lavoro. Variare il volume e le concentrazioni di DNA di conseguenza. Tune la copertura del DNA per ridurre le indesiderate AUNP relative superficiali risposte a colori di analiti non bersaglio.
NOTA: L'aumento della copertura DNA riduce la sensibilità del test. Le densità di carico sono calcolate dal conoscere la concentrazione dello stock AUNP, e calcolando il numero totale di AuNPs presenti nel volume desiderato per esperimenti. Se le densità di copertura attuali sono desiderati, i protocolli esistenti per ottenere quei valori 7. La copertura DNA è stata determinata utilizzando un 50 kDa mpeso olecular colonna di cutoff di selezione per separare il DNA AUNP vincolati dal DNA libero. I AuNPs sono troppo grandi per passare attraverso la colonna di spin, mentre il DNA libero attraverserà facilmente. Il passo successivo è quello di quantificare il DNA libero raccolti con misure di assorbanza o un singolo colorante fluorescente DNA incagliato.
- Qui, utilizzare densità di carico di 90, 120, 150, e 180 molecole di DNA / AUNP in questo lavoro. Variare il volume e le concentrazioni di DNA di conseguenza. Tune la copertura del DNA per ridurre le indesiderate AUNP relative superficiali risposte a colori di analiti non bersaglio.
- Aggiungere un uguale volume di 20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,4 tampone e posizionare il campione a 4 ° C nella notte scura. Il saggio aptameri-AUNP era in 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, pH 7.4 (tampone).
3. Sale Titolazione e configurazione Assay
- Determinare la concentrazione di sale iniziale necessario per indurre la risposta colore saggio per titolazione del sale con il vuoto test. Aggiungere 20 ml di metanolo (vuoto) a 180 aliquote microlitri di test aptameri-AUNP in una piastra da 96 pozzetti. Titolare campioni con volumi crescenti di soluzione madre NaCl (1 M o 2 M) e determinare il punto di equivalenza (Figura 2 NOTA: Il test può essere scalata a volumi più piccoli, mantenendo il rapporto di metanolo vuoto (o analita disciolto) di aptameri AUNP test stesso.
- Qui, determinare il volume di NaCl necessaria a provocare il minimo cambiamento di colore mediante osservazione visiva. La concentrazione di partenza per il test è stata di 75 mm e 130 mm per MN4 e MN6, rispettivamente, ad una molecola di DNA 60 / AUNP densità di copertura.
NOTA: Per una determinazione quantitativa della concentrazione iniziale del sale, il punto medio della curva di titolazione serve come un buon punto di partenza. Inoltre, le concentrazioni utilizzate variano in base alla aptamer, DNA densità di copertura, fin dal primo giorno per giorno le prestazioni, e da lotto a lotto.
- Qui, determinare il volume di NaCl necessaria a provocare il minimo cambiamento di colore mediante osservazione visiva. La concentrazione di partenza per il test è stata di 75 mm e 130 mm per MN4 e MN6, rispettivamente, ad una molecola di DNA 60 / AUNP densità di copertura.
- Ottimizzazione della risposta del test, aggiungere 20 ml di nuove molecole diluito in metanolo a 180 aliquote microlitri di test aptameri-AUNP in una piastra da 96 pozzetti a temperatura ambiente. Aggiungere immediatamente la concentrazione di NaCl determinato nella fase precedente per avviare la risposta cromatica dosaggio.
NOTE: Utilizzare una pipetta multicanale per effettuare esperimenti multipli contemporaneamente. - Ottenere la più grande cambiamento di colore possibile aumentando o diminuendo la concentrazione di NaCl, e confrontando la risposta obiettivo alla risposta vuota. Utilizzare la concentrazione di NaCl, che offre la più grande differenza di risposta.
- Osservare e misurare la risposta del test 150 sec dopo NaCl aggiunta. Analizzare l'assorbanza a 650 nm e 530 nm con uno spettrometro o ottenere una macchina fotografica digitale della risposta dosaggio (vedere la sezione 4 per la foto protocollo di analisi).
NOTA: un lettore di micropiastre è stato utilizzato per ottenere le misurazioni per questo lavoro. - Tracciare i risultati come il rapporto di assorbanza ottenuto a 650 nm e 530 nm (E 650 / E 530) in funzione della concentrazione dell'analita. Normalizzare la risposta del test al segnale vuoto come è stato fatto in questo lavoro.
4. Photo and Digital Image Analysis colori Protocollo di analisi
- preparall'e i campioni di analisi come descritto (sezioni 3.2-3.3). Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un transilluminatore.
Nota: un transilluminatore standard di laboratorio è in genere troppo luminoso per ottenere immagini digitali utilizzabili per questa analisi. Questi transilluminatori causare spaziate regolarmente "linee scure" a comparire nell'immagine digitale per l'intensità della fonte di luce. Fare un transilluminatore da un diodo ad emissione luminosa (LED) light box based e un pezzo di plastica opaca funziona bene. - Ottenere foto della piastra a 96 pozzetti a 150 sec dopo NaCl Inoltre, importare le immagini in software di analisi dell'immagine, e calcolare i valori medi di rosso, verde e blu (RGB), utilizzando una tecnica di averaging incrementale, come mostrato nell'equazione 1 24:
(1)
- Convertire i valori RGB da RGB (sRGB) spazio colore standard per lo spazio colore diagramma di cromaticità (CIExyY), utilizzando le seguenti equazioni 24:
(2)
(3)
(4)
- Convertire i valori RGB esponenziali in valori RGB lineare utilizzando l'equazione 2. La matrice specificata nell'equazione 3 viene utilizzato per calcolare la X, Y e Z valori dello spazio colore CIE 24.
- Calcolare i valori X e Y cromaticità utilizzando la formula 4 che rappresenta il colore medio dei pixel nell'area selezionata per l'analisi 24.
- Eseguire l'analisi in ogni pozzetto e riportare i valori di cromaticità per generare una curva di calibrazione (Figura 4). Ottenere l'errore standard analizzando il colore delle diverse aree dello stesso bene.
5. Congelamento Aptamero-AUNP Assay per la conservazione a lungo termine
- Preparare i componenti del dosaggio aptameri AUNP come descritto nelle sezioni 2.4 e 2.5. Realizzare soluzioni separate contenenti 1 g / trealosio ml e 1 g / ml di saccarosio in acqua priva di nucleasi per rendere la Soluzione Cryogen.
NOTA: Elevate concentrazioni di trealosio e saccarosio sono stati usati per ridurre il fattore di diluizione durante la preparazione del test per il congelamento. Riscaldare le soluzioni di zucchero su una piastra calda in un bicchiere di acqua per sciogliere completamente gli zuccheri prima dell'uso. - Effettuare una soluzione contenente 19,2 mg / ml trealosio e 4,8 mg / ml di saccarosio con il test 60 MN4-DNA / AUNP ad un volume finale di 200 microlitri in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Le concentrazioni di soluzioni cryogen finali varieranno con una copertura del DNA.
Nota: I campioni da congelare non deve superare i 300 ml. volumi più grandi non possono bloccare in modo corretto. - Flash congelare i campioni utilizzando un C freezer -146 ° o in azoto liquido. Conservare i campioni congelati fino al momento dell'uso. Memorizzazione può essere in una -80 ° C o -20 ° C una volta congelamento flash è completa.
- Per questo lavoro, lasciare i campioni in C congelatore -146 ° corsonotte e poi trasferire in un congelatore C -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
NOTA: Flash congelamento può causare la aptameri-AuNPs di aggregare. Testare l'integrità del processo di congelamento monitorando l'assorbanza profilo e confrontandola con un campione scongelati. Se si osserva aggregazione, aumentare la quantità di soluzione criogeno per compensare questo problema. - Scongelare i campioni a temperatura ambiente ed utilizzare solo sufficiente campioni necessari per la sperimentazione. Ottenere assorbanza spettri dei campioni scongelati e confrontare gli spettri della linea di base di un campione scongelato soluzione cryogen trattata. Misurare l'assorbanza da 400 nm a 700 nm.
- Eseguire la titolazione sale (sezione 3.1), verificare il (punto 3.2) del test, e tracciare i risultati (sezioni 3.3 e 3.4), come descritto in precedenza.
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Representative Results
L'obiettivo principale di questo lavoro è stato quello di sviluppare e studiare la stabilità e la robustezza di aptameri basato AUNP test colorimetrici per l'utilizzo in campo. Come evidenziato in una precedente pubblicazione, due strategie distinte per la creazione del test sono stati esaminati 7. I saggi sono stati chiamati il Aptamero Assay libero e la Adsorbed Aptamero Assay. Il adsorbito Aptamero Assay era più attraente ai fini di un test di rilevazione fieldable (Figura 1).
. Figura 1. Rappresentazione schematica della Adsorbed Aptamero Assay La aptameri è stato mescolato con AuNPs e incubato durante la notte; nuove molecole disciolti in metanolo sono stati aggiunti assorbita Aptamero Assay, immediatamente seguita dalla aggiunta di cloruro di sodio (NaCl) per indurre AUNP aggregazione quando è stato aggiunto il bersaglio.ef = target "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Ciò è dovuto alla riduzione dei tassi di falsi positivi per analiti non bersaglio, relativa semplicità e la facilità d'uso del Adsorbed Aptamero Assay. Per preparare il Adsorbed Aptamero Assay, la DNA-aptamero è stato mescolato con AuNPs ed incubata durante la notte nel tampone. Questo ha permesso la aptameri di adsorbire facilmente sulla superficie AUNP, che ha ridotto la suscettibilità del test per le risposte positive falsi a molecole di analiti non bersaglio, come adesivo o agenti di taglio. Tuttavia, solo la struttura preformata del aptamer MN4 cocaina era attiva in presenza di cocaina (target) in questo disegno dosaggio. Il dosaggio è stato impiegato aggiungendo soluzioni dell'analita seguita dalla immediata aggiunta della concentrazione appropriata di NaCl. soluzioni saline sono stati usati per avviare la osservabili e meacambiamento di colore surable del test. Il dosaggio è stato eseguito entro 2-3 minuti. dopo l'aggiunta della soluzione di analita.
Un'azione critico nella esecuzione di questi test colorimetrici basati DNA fisicamente adsorbite è la risposta cromatica indotta, mediante l'aggiunta della concentrazione appropriata di sale. L'aggiunta di sali sono noti per destabilizzare sospensioni AUNP conseguente aggregazione delle particelle mascherando le cariche negative dello strato citrato che stabilizzano la AuNPs, e quindi diminuisce le interazioni elettrostatiche interparticellari. Il risultato è osservabile cambiamento di colore rosso al blu. Lo stesso effetto si osserva con DNA trattato AuNPs. Nel caso del DNA aptameri, analista determinare la concentrazione di sale necessaria per causare il minimo destabilizzazione AUNP osservabile (colorazione blu). Con l'aggiunta di destinazione, la stabilizzazione dei AuNPs nel DNA-aptamero è significativamente ridotta con conseguente observable, misurabile cambiamento di colore risposta dose target. Questo cambiamento di colore può essere percepito solo con l'aggiunta della quantità predeterminata appropriata di sale.
Altrettanto importante è il processo in cui si determina la concentrazione appropriata di sale. Ciò è stato realizzato costruendo una curva di titolazione aggiungendo concentrazioni crescenti di soluzione di cloruro di sodio a una serie di spazi di analisi (Figura 2).
Figura 2. curva di titolazione Salt-indotto. Citrato stabilizzato (rosso), MN4 cocaina vincolante aptamero (verde), e vincolanti aptamer (viola) campioni AUNP trattati MN6 cocaina sono stati titolato con cloruro di sodio (NaCl). Le concentrazioni di sale iniziali ottenuti visivamente sono stati indicati con i corrispondenti frecce colorate per ogni curva. Le barre di errore sono definiti dalla deviazione standardtriplicare le misurazioni. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Qui, la concentrazione salina iniziale utilizzato è stato determinato mediante ispezione visiva, ed è stata presa come la concentrazione di sale che ha causato la minima colorazione blu osservabile con il dosaggio bianco. Tuttavia, per un approccio più quantitativo, i ricercatori nuovi a questo settore di ricerca è possibile utilizzare il punto medio del punto di titolazione di equivalenza come una concentrazione iniziale di sale. Oltre questo punto la risposta cromatica inizia ad aumentare rapidamente. Inoltre, la concentrazione di sale utilizzata nell'esecuzione del test è stata regolata per massimizzare la differenza di colore tra le risposte in bianco e cocaina dosaggio. Ciò è stato realizzato aumentando e diminuendo la concentrazione del sale dal l'importo determinato per titolazione. La procedura di titolazione del sale è stata eseguita quotidianamente perconto giorno per giorno variabilità con il test. La variabilità batch nella concentrazione salina richiesto per il dosaggio non era superiore al 20%. La Figura 2 presenta tre campioni AUNP distinti, citrato stabilizzato (senza DNA), MN4 (DNA-aptamero stabilizzato), e MN6 (DNA-aptamero stabilizzati). La copertura DNA per i campioni MN4 e MN6 erano 60 molecole di DNA / AUNP, e ciascuna curva di titolazione ha un diverso punto di titolazione equivalenza e punto medio in base al livello di stabilità fornita dal trattamento superficiale. Citrato fornito poca stabilità, MN4 (doppia elica come la struttura) fornito più stabilità e MN6 (a singolo filamento come la struttura) ha fornito la più stabilità alle AuNPs. Le concentrazioni di sale iniziali utilizzati in questo lavoro sono stati determinati ad essere ~ 50 mm, ~ 90 mm e 130 mm ~ visivamente. La tendenza è d'accordo con la comprensione convenzionale della struttura del DNA e il suo effetto stabilizzante sui AuNPs 24-25. Durante l'esecuzione di questo test visivo, il vuoto test ha mostrato un lieve colora blu zione con le concentrazioni di sale individuate nella figura 2 con le frecce, che sono vicini ai punti medi come discusso. Le concentrazioni di sale prima tesi punti forniscono poco o nessun cambiamento di colore osservabile, e al di là di questi punti il colore aumenta rapidamente. Per questo lavoro, la concentrazione iniziale del sale è stata determinata visivamente e poi messo a punto con lettore di micropiastre confronti di misura di campioni bianchi e cocaina test.
Con l'approccio libero Aptamero Assay, risposte falsi positivi erano un problema. Interazioni di superficie delle molecole di analiti sono una fonte di questo problema, come descritto in una precedente pubblicazione 7. Per evitare che le risposte dei colori non intenzionali a causa di non specifiche interazioni superficiali AUNP, le densità di copertura del DNA del aptameri obiettivo vincolante è stato controllato (Figura 3).
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Figura 3. adsorbito aptameri risposta test con densità variabile di copertura del DNA. Risposta aggregazione alla cocaina (rosso, target), EME (verde, di controllo), e procaina (blu), una superficie AUNP molecola attiva, per il 90, 120, 150, e sono state esposte 180 DNA / AUNP densità di copertura. Tutti i campioni analizzati sono stati disciolti in metanolo a 1 mg / ml. Le barre di errore sono definiti dalla deviazione standard nelle misurazioni triplice copia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
In generale, il tasso di risposta di falsi positivi di molecole di analiti non bersaglio a causa di interazioni AUNP è stato ridotto con l'aumento della densità di copertura del DNA. Tuttavia, la sensibilità del test è stato ridotto a seguito di una maggiore copertura DNA. In questo lavoro, la densità di DNA di 60, 90, 120, 150, 180, e 300 DNA / AUNP erano INDAGINETed. Densità di 60 e 300 sono state ampiamente descritte nel precedente lavoro 7. La figura 3 rappresenta la densità del DNA aggiuntivi studiati. Procaina è stato uno degli analiti non bersaglio più altamente superficie attiva intervistati. Per ciascuna delle singole coperture DNA, la risposta dosaggio è stato massimizzato regolando la concentrazione del sale come descritto. In generale, all'aumentare copertura DNA, la differenza di risposta tra controllo (EME) e la risposta di cocaina diminuisce. Analogamente, la risposta test in presenza di procaina diminuisce a livelli di fondo con crescenti coperture. La superficie di 180 DNA / densità AUNP eliminato collegata risposta falso positivo per la procaina, pur mantenendo una risposta target alto. Questa valutazione descrive un procedimento per modificare questi saggi di colore per ridurre risposte positive legate superficie falsi, preservando risposta obiettivo per quanto possibile. sensibilità migliorate possono essere raggiunti attraverso la riduzione della copertura del DNA. Tuttavia, falsi positivirisposte tive potrebbero diventare un problema a seconda dell'applicazione.
test colorimetrici sono comunemente usati per semplici test qualitativi e quantitativi anche veloci, spesso presunti. Problemi comuni con determinazioni colorimetriche sono la natura personale di discernimento colore, in particolare con differenze di colore sottili e borderline. Le chiamate di giudizio che devono essere effettuate dall'analista possono causare errori di interpretazione dei dati. Misure su attrezzature di laboratorio ridurre l'incertezza e l'indecisione associati con la valutazione dei risultati del test. Tuttavia, in questo lavoro, l'intento era quello di fornire un campo di test pronto che ha fornito risultati immediati per l'analista. Come tale, una tecnica di analisi image photo è stabilito che ha fornito un risultato colore più determinante (Figura 4).
Figura 4.
Con concentrazioni crescenti di cocaina, il colore dosaggio determinato un colore blu crescente. Le foto digitali di curve di calibrazione sono stati ottenuti utilizzando due smartphone diversi, e importati in un computer portatile standard per l'analisi utilizzando il software ImageJ. I valori di cromaticità sono stati usati per tracciare il ccurve alibration come mostrato in figura 4. L'analisi di immagine fornito una risposta lineare per aumentare la concentrazione di cocaina con entrambi i set di immagini di smartphone come indicato dai valori di R 2. Questo metodo è stato trasferito ad una applicazione Smart-dispositivo per facilitare l'analista nel campo. Una valutazione dettagliata delle app è stata effettuata in una precedente pubblicazione 7. L'applicazione ha eliminato gran parte della incertezza e indecisione associata con i risultati del cambiamento di colore sottili delle concentrazioni di cocaina più bassi.
lo stoccaggio a lungo termine dei test del DNA fisicamente adsorbite di questo tipo non sono state studiate in modo molto dettagliato e uno degli obiettivi di questo lavoro è stato quello di trovare le condizioni per estendere il test shelf-life. Il trattamento dei componenti del dosaggio per la conservazione a 4 ° C è stato dettagliato in una precedente pubblicazione 6. Per questo lavoro, liofilizzazione dei componenti del dosaggio preparato è stato considerato per un uso a lungo termine e di stoccaggio of dosaggio. Liofilizzazione componenti del dosaggio ha il vantaggio di mantenere e conservare i campioni a temperatura ambiente, che eliminerebbe la necessità di un frigorifero o congelatore. Il passo principale nel processo di liofilizzazione è di congelare primo campione. Per controllare i campioni AUNP sopravvivono al processo di congelamento, eseguire un confronto degli spettri di assorbanza del dosaggio prima del congelamento a quella del campione scongelato. Le scansioni devono corrispondere esattamente. Se i campioni non sopravvivono il processo di congelamento, lo spettro del campione scongelato sarà aumentata assorbanza nella regione sopra 525 nm. Ciò indica che le AuNPs aggregate durante il congelamento e il campione scongelato è compromessa. La vitalità del saggio scongelato è stato testato con la cocaina e EME (Figura 5).
Figura 5. adsorbito studio risposta shelf-life Aptamero Assay. Quantificazione di la risposta saggio di EME (verde, di controllo), e la cocaina (rosso, target) eseguita con congelato e poi scongelato adsorbito campioni Aptamero Assay nel corso di un periodo di quattro settimane. Le barre di errore sono definiti dalla deviazione standard nelle misurazioni triplice copia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
I campioni bianchi di analisi scongelati è rimasto allo stesso valore nel periodo di studio come i campioni che sono state fatte e utilizzato immediatamente (nessun deposito). Le risposte dei campioni di cocaina e EME erano coerenti con le risposte tipiche osservate con i campioni realizzati e utilizzati immediatamente (senza memorizzazione). I campioni congelati sono stati monitorati per un periodo di 4 settimane senza modificare le prestazioni del test rispetto ai campioni conservati a 4 ° C nello stesso periodo di tempo 7 o campioni in esame realizzati ed utilizzati immediately. Risposte cocaina erano relativamente costante durante il periodo di 4 settimane, che è stato anche osservato per i campioni C 7 4 °. La diminuzione del segnale EME dalla settimana 1 alla settimana 2 si osserva spesso con temperatura ambiente e di stoccaggio 4 ° C pure. Un fenomeno abbiamo attribuito alla maturazione del dosaggio durante la prima settimana. Questo approccio aumentato le opzioni disponibili per la conservazione a lungo termine delle adsorbiti DNA test colorimetrici, e ha fornito un gateway per opzioni di storage a lungo termine aggiuntive, vale a dire liofilizzazione.
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Discussion
Negli ultimi dieci anni, nanoparticelle basato test colorimetrici sono stati sviluppati per la rivelazione di bersagli includono piccole molecole, DNA, proteine e cellule 2-4. Assays che utilizzano DNA aptameri con nanoparticelle sono state guadagnando interesse. Tipicamente, questi test colorimetrici vengono eseguite mescolando il DNA-aptamer con nuove molecole seguita da aggiunta a AuNPs 9-10. Tuttavia, questi test sono stati utilizzati in proof-of-concept dimostrazioni con le impostazioni di laboratorio controllate e con limitati, controlli selezionati. I recenti progressi di transizione di questa tecnologia nel campo sono stati fatti 7. In questo approccio, la DNA-aptamero è stato adsorbito AUNP superfici prima dell'aggiunta delle nuove molecole da testare (Figura 1). Lo sviluppo di saggi colorimetrici basati sia aptameri oro nanoparticelle richiede ottimizzazione nelle varie fasi del processo di fabbricazione / analisi. Così, chi è nuovo al discoipline deve essere consapevole delle sfumature connesse con la raffinazione e la risoluzione di questi test per avere successo.
I saggi nanoparticelle aptameri-oro adsorbite richiedono ottimizzazione attenzione per ogni coppia aptameri / target. Tuttavia, seguendo i passi spiegati qui offre un protocollo consistente di eseguire l'ottimizzazione di questi test colorimetrici. La determinazione e la regolazione della concentrazione salina che determina la massima variazione di colore osservabile o misurabile tra il target e dosaggio vuoto è uno dei passi più critici di ottimizzazione (figure 2 e 3). Per alcune coppie aptamero / bersaglio, abbiamo osservato che l'uso di alte concentrazioni di sale in prossimità del punto finale della curva di titolazione hanno portato ad un cambiamento di colore blu-a-rosso 18. Questo indica una stabilizzazione dei AuNPs dal aptamer dopo l'aggiunta del target e sale.
Altri fattori che potrebbero influenzare i test performance includere componenti tampone e concentrazioni, quantità di copertura DNA-aptameri, solventi impiegati, della temperatura, sequenza aptameri e la struttura, momenti target-assay incubazione (tempo quando il bersaglio viene aggiunto al test, prima dell'aggiunta di sale), e tempo di sviluppo del colore ( tempo necessario per sviluppare il colore, dopo l'aggiunta del sale). A 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2 a pH 7,4 tampone era il tampone di scelta in molte delle coppie porta / aptamer utilizzati nel nostro lavoro. Tuttavia, questo buffer non può essere ideale per tutti aptameri. Per ottenere un corretto ripiegamento della aptamer, può essere necessario i componenti tampone per essere adattato, e mantenuto il più vicino possibile alla composizione utilizzata nel buffer selezione aptamer. Quando si utilizza un buffer con AuNPs, i componenti del tampone e le concentrazioni devono essere considerate, in particolare con sostanze ioniche. Elevate concentrazioni di composti ionici potrebbero causare aggregazione prematura delle AuNPs. Copertura DNA / AUNP è stata dimostrata in figura 3. Poiché il DNAcopertura aumenta da 90-180 DNA / AUNP, la risposta target dell'analita diminuita causando una minore sensibilità del test. Pertanto, un compromesso è necessario che dipende da ogni aptamer, grazie alla sua particolare piegatura e grado di interazione con la superficie AUNP.
Inoltre, i solventi necessari per sciogliere nuove molecole possono provocare l'aggregazione non intenzionale delle AuNPs. Acqua, tampone, e metanolo, sono stati utilizzati senza alcun problema. Utilizzato senza diluizione, acetonitrile e dimetilsolfossido (DMSO) adsorbono alla superficie AUNP provocando l'aggregazione non intenzionale. Acetonitrile era problematico anche a diluizioni di meno di 1% (volume finale). I solventi devono essere testati con AuNPs prima di utilizzarlo con il saggio colorimetrico. La temperatura alla quale viene effettuato il test può avere un impatto su se una risposta viene osservata con il dosaggio. Questo ha a che fare con la struttura aptamer e temperatura di fusione, o la stabilità della struttura aptamero ad una data temperatura, checon le nanoparticelle. Nel nostro lavoro, abbiamo determinato che vi è un delicato equilibrio tra l'avere l'aptamero in una struttura preformata con il DNA in una forma piegata, e anche non completamente in un'unica struttura filamento. Questo è il caso per la forma dosaggio adsorbito aptameri di questi test colorimetrici (Figura 1). Quando si considera la struttura, la sequenza aptamer deve anche prevedere per gran parte della struttura aptamer è il risultato delle singole sequenze oligonucleotidiche. Tuttavia, sono necessarie ulteriori indagini in questo aspetto.
In generale, l'approccio usiamo nello sviluppo di un saggio colorimetrico basato aptameri AUNP è lo stesso per tutte le coppie aptamer / bersaglio. In primo luogo, ottenere un aptamero per un target di interesse. Ciò può essere ottenuto attraverso la ricerca nella letteratura o la selezione di un aptamero per una molecola di interesse. A questo punto, non vi è alcun modo di sapere se l'aptamero è un buon candidato per la creazione di un colorimetricosaggio. Questo può essere determinato solo attraverso la sperimentazione. Successivamente, il aptamer viene incubato con AuNPs overnight per fabbricare il saggio aptamer adsorbito (Figura 1). L'approccio standard è quello di iniziare a testare con 60 aptameri / AUNP; tuttavia, più coperture sono preparati per la prossima fase di test. Quando i saggi sono pronti per il test, eseguire le indagini curva di titolazione come descritto (Figura 2). Il punto medio della curva di titolazione serve come affidabile concentrazione iniziale di sale da utilizzare per il bersaglio, test vuoto e test di controllo. La concentrazione di sale è messo a punto per fornire una differenza massima di colore tra i campioni vuoti di destinazione e di analisi. Per testare la risposta è reale e causato dal legame aptameri-target e non a causa di non specifici bersaglio / interazioni solvente, eseguire il test con i controlli. Allo stesso tempo, i tempi di sviluppo di colore di analisi sono indagati a 5 min intervalli. Seguito da tempi di incubazione bersaglio-test a 5 min intervals, inizialmente 15+ volte min di incubazione vengono utilizzati fino a quando è ottimizzato questo passaggio. A seconda dei risultati, un'ulteriore ottimizzazione della concentrazione di sale, la copertura aptamer, tempo di incubazione e tempi di sviluppo colore può essere necessario (Figura 3). Questo approccio descrive un protocollo per la progettazione e lo sviluppo di aptameri-AUNP test colorimetrici per un paio di destinazione / aptameri. Ulteriori indagini nella sequenza aptamer e gli effetti strutturali sul miglioramento delle adsorbito aptamer test colorimetrici sono di grande interesse. Vi è la necessità per la comprensione delle interazioni associate ai aptamer, target, e AuNPs. Questa conoscenza potrebbe portare a sartoria aptameri per una migliore funzionalità e persino predire che aptameri saranno attivi nel formato saggio adsorbito aptameri.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
References
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