Abstract
Dondurularak kırık numunelerin Cryo-taramalı elektron mikroskobu (SEM) yakın yerli koşullarında biyolojik yapıların soruşturma sağlar. Burada, yaprak örneklerinde içinde fotosentetik (tilakoit) membranların supramoleküler örgütü incelemek için bir teknik açıklar. Bu yüksek basınçlı yaprak dokularının dondurma, dondurma-kırılma, çift katmanlı bir kaplama ve son olarak kriyo-SEM görüntü alma ile elde edilir. çift katmanlı kaplama yönteminin kullanımı yüksek büyütme elde veriyor (> 100,000X) dondurulmuş sulu numuneler için en az ışın hasar yanı sıra en az şarj etkileri ile görüntüler. Açıklanan prosedürler kullanılarak in situ, diriliş bitki Craterostigma pumilum dehidrasyonu sırasında gerçekleşecek fotosistem ve hafif hasat anten protein kompleksleri supramoleküler dağılımındaki değişiklikler araştırıldı.
Introduction
Oksijenik fotosentez, antik siyanobakteri menşeli, kloroplast organelle gelişmesine yol açmıştır endosimbioz olaylarla yosun ve kara bitkileri tarafından miras. Bütün günümüz oksijenik fototroflardır olarak, fotosentetik elektron taşıma ve proton motif kuvvet üretimi ve indirgeme gücü 'tilakoit' membranlar olarak adlandırılan düzleştirilmiş kese benzer kesecikler içinde yürütülmektedir. Bu membranlar fotosentezin ışık güdümlü reaksiyonlar yürütmek ve enerji iletimi için bir ortam sağlamak protein kompleksleri ev. Bitkiler ve (bazı) alg tilakoit membranlar iki ayrı morfolojik etki alanlarına ayrılır: 'stroma lamel' olarak adlandırılan 'grana' ve granaları birbirine istiflenmemiş membranlar denilen sıkı appressed zar bölgeleri, 1. bitki ve alg tilakoit membranlarda çeşitli donma-fraktür çalışmaları 1970'lerde başlayarak gerçekleştirilmiştir. Ne zaman donma-kırık, membranlarHücresel bölmeye bağlı bir exoplasmic yüzü (EF) ve bir protoplazmik yüz (PF) üreten, kendi hidrofobik çekirdek 2 boyunca bölünmüş olan yarı-zar sınırları, aslında Branton ve arkadaşları tarafından icat olarak. ., sırasıyla 's' ve 'u' ifade eden 'yığılmış' ve 'unstacked' zar bölgeleri ile, EF'lerine, EFU, Proje Fişlerini ve Pfu: 1975 yılında 3 Bitki ve alg thylakoid dört farklı kırılma yüzleri var. bölünmüş veya kırık olmayan membran protein kompleksleri, E veya zarın P tarafı biriyle kalması eğilimi var. Thylakoid'in farklı kırılma yüzeyleri farklı büyüklüklerde olan ve yoğunluklarını 4 ve ardından çok sayıda soruşturma içeren ilk gözlem, açık reaksiyonlar yürütmek görülen parçacıklar ve membran protein kompleksleri ile tanımlanması ve korelasyon yol 5-13 (ayrıca bkz 14,15 değerlendirmeleri).
fretilakoit membranların eze-kırık deneyler genellikle izolasyon işlemi sırasında oluşabilecek yapısal ve / veya supramoleküler kuruluşta herhangi bir değişiklik riski, (ama 16,17 bakınız) kloroplastlar veya izole tilakoit membranlarda hazırlıkları yürütülmektedir. Kırık ardından kopyaları daha sonra karbon (C) ve kalın bir tabaka ile platin / karbon (Pt / C), buharlaştırma ile hazırlanır, ve biyolojik madde 18 son olarak sindirim. Replicas transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından görüntülenmiştir. Geleneksel dondurarak kırık-çoğaltma tekniği farklı için supramoleküler fotosentez membranların organizasyon ve adaptasyon eğitimi için önemli bir araç, örneğin olarak hizmet vermeye devam etmektedir., Hafif, koşullar 19-23.
Craterostigma 24 pumilum homoiochlorophyllous diriliş bitki bizim son çalışmada, biz supramoleküler organizasyon o değişiklikleri incelemeyi amaçladıkdehidrasyon ve rehidrasyon sırasında f tilakoit membranlar yanı sıra genel hücresel organizasyonu. homoiochlorophyllous Resurrection tür özgünlüğü onların fotosentetik cihaz koruyarak, kendi bitkisel dokularda (yaprak) içinde kuruma koşulları hayatta mümkün olmasıdır. Su kullanılabilir olduğunda, bu bitkiler kurtarmak ve birkaç gün ila 25 saat içinde fotosentez etkinliğini devam ettirir. Bu çalışma için, donma-kırık yaprak örneklerinin cryo-tarama EM (SEM) görüntüleme yüksek basınçlı örnek cryo-Hareketsizleştirmesi için dondurma ile kombine edildi. Bu işlemler kendi ana devlete 26 yakın bir devlet olarak dondurulmuş sulu biyolojik örnekler görselleştirmek için bir araç sağlar. Bir ana yararı örnekleri herhangi bir ardışık adımlarda ile dondurularak kırılma ve kaplamanın hemen sonra incelenir olmasıdır. hidrasyon durumu hazırlanması sırasında korunur gibi bu, farklı bağıl su içeriği (RWC) bitkilerin araştırılmasında özellikle uygundur. NasılHiç, bir kritik dezavantaj fotosentez komplekslerinin büyüklüğünün doğru ölçümü için gerekli olan yüksek büyütme, tarandığında dondurulmuş sulu numuneler özellikle, görüntüleme sırasında kiriş hasar muzdarip olabilir olmasıdır. Bunun üstesinden gelmek için, bir yöntem 'çift katmanlı kaplama' (DLC) özel cryo-SEM görüntüleme koşulları yararlanılmıştır ile birlikte 27,28 denir. Bunlar önemli ölçüde daha az ışın duyarlı numunelerin sonuçlandı ve fotosentetik protein supramoleküler örgütü ve diriliş bitki C diğer hücresel bileşenleri hakkında değerli bilgiler aydınlatılması için izin in situ yüksek büyütme oranlarında pumilum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yüksek basınçlı Dondurma Leaf Dokuların 1. Cryo-sabitleme
Not: Bu bölüm, bir dondurma-kırık deney için yaprak dokularının yüksek basınçlı dondurma yürütmek açıklamaktadır. Bitki örneklerinde ilgili hususlar için 29 bkz. Bu, bazı değişikliklerle doku ya da örneklerin diğer türleri için uyarlanabilir.
- Bir traş makinesi bıçak köşesi kullanılarak, (Şekil 1), bir 0.1 / 0.2 mm alüminyum trombosit 0.1 mm boşluğunun alt kazıyın. en az bir düzine trombositler (6 örnek) hazırlayın. Diskin çevresi üzerinde bıçak işaretleri oluşturmak için değil dikkatli olun.
- çizilmemesi sonra, mutlak etanol diskleri yıkama kurumaya bırakın ve temiz bir tabak içinde tutun.
- üreticinin talimatlarına uygun olarak, yüksek basınçlı dondurma makinesi hazırlayın. izopropanol ile yüksek basınçlı dondurma makinenin alkol odasına doldurun.
- Bir ev yapımı vakum destekli infiltrasyonu hazırlayınN cihazı sıvıyla yaprak dokusunda bulunan gaz değiştirmek için kullanılır.
- Sıkıca bir 10 ml şırınga sonuna kadar 200 ul pipet bağlayın. ucu ~ 1 cm kesin. sıkıca kesme ucu sığdırmak için 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kapağı bir delik açın. Vakum şırınga pistonu çekerek tüp içinde oluşturulabilir.
- Bir jilet kullanarak bitkiden yaprak küçük bir parça kesin ve cımbızla 1-heksadekanda ile yarım dolu bir mikrosantrifüj tüp içine yaprak yerleştirin. nazikçe vakum oluşturmak için piston çekerek sıvı ile yaprak arası boşluk sızmak, yaklaşık 30 saniye basılı tutun ve sonra pistonu yavaşça serbest bırakın.
- cımbız kullanarak tüpten yaprak parçasını çıkarınız. 0.2 mm'den kalın olması durumunda bir jilet ile yaprak Trim ve trombosit uyacak küçük bir parça kesti.
- donma Makinenin tutucu içine çizilmiş tarafı temiz bir platelet yerleştirin ve sonra le kesim parça yertrombosit içine af. 1-heksadekanda ile yaprak çevreleyen kalan boşluğu doldurmak. yaprak bakan çizik, başka trombosit kullanarak sandviç kapatın.
- Kapatın ve tutucu sıkın ve makinenin haznesine takın. Sonra (~ 300 2100 bar - 500 ms) dondurmak için 'Jet' düğmesine basın ve hızlı bir şekilde sıvı azot içine tutucu aktarın. Dikkatle sandviç kırık özen önceden soğutulmuş cımbız kullanarak sahibinden dondurulmuş sandviç çıkarın.
Not: Kapalı dondurulmuş sandviç hemen kırılan dondurma veya daha sonra kullanmak için sıvı nitrojen içinde muhafaza olabilir. sıvı azot kullanırken koruyucu kıyafet ve gözlük kullanın.
2. Freeze-kırık ve çift katmanlı Kaplama 27,28
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, platinyum / karbon (Pt / C) ve karbon buharlaşması için iki tüfek de dahil olmak üzere kullanımı için dondurma parçalama makinesi hazırlayın. 45 derece Pt / C silahı yerleştirin birnd 90 derecede karbon tabancası.
- Ön programı Pt / C (kaplama oranı 0,02-0,04 nm / saniye) bir 2-mil tabakanın bir kaplama düzeni ile (0.1 nm / saniye ° 'de) bir karbon 6 nm katman.
- donma-kırık makinenin ekranında kurulumuna girin. Kaplama şeması kaydedilecek bir kullanıcı numarası seçin.
- 'Katman 1' için Pt / C seçin. Bir zaman çerçevesi seçin örneğin., 5 dk (kaplama tamamlamak için gereken gerekli zamanı aşmak için). 2 nm kalınlığında tanımlamak için yukarı-aşağı okları kullanın.
- seçin karbon dışında, 2. adımları tekrarlayın 2.1.1.2 Layer taşımak ve 6 nm'lik bir kalınlığa tanımlamak için 'Katman' düğmesine basın.
- Test ve silah operasyonu ayarlayın.
- Seç 'Katman 1'. 'GUN1' düğmesine basarak Pt / C silahı seçin ve dondurarak kırık makinesinin buharlaşma kontrol ünitesindeki "ON" butonuna basın. buharlaşma oranını izlemek ve unt gerilim ve emisyon düğmeleri kullanarak ayarlayın0.04 nm / sn - il 0.02 oranında ulaştı. Basın 'KAPALI' Pt / C silahı kapatmak için.
- Seç 'Layer 2'. select 'GUN2' dışında, 2.1.2.1 tekrarlayın ve 0.1 nm / sn ~ bir buharlaşma oranı ayarlayın.
- Ön programı Pt / C (kaplama oranı 0,02-0,04 nm / saniye) bir 2-mil tabakanın bir kaplama düzeni ile (0.1 nm / saniye ° 'de) bir karbon 6 nm katman.
- (Hidratlı veya susuz yaprakları, sırasıyla) -140 ˚C veya -160 ˚C için donma kırık sistemi sahne soğutun. Makineye vakum cryo transfer servisi takın ve sıvı azot ile odasını doldurun. -7 10 X 8 mbar - soğutuldu donma-fraktür odasındaki basınç genelde 1 arasındadır.
- Yükleme istasyonu içine dondurma kırılma örnek tutucu (3 mm trombositlerin için uygundur) yerleştirin. sıvı azot ile yükleme istasyonu odasını boyayın.
- yüksek hassasiyetli sınıf cımbız kullanarak tek sahibi birinin üzerine iki dondurulmuş sandviç yükleyin. yerine güvenli sığar olmadığını kontrol etmek yuvasını ters çevirin sonra tutucu içine ilk sandviç sıkın ve. İkinci sandviç için tekrarlayın.
- Ddonma kırık makineden soğutulmuş mekik etach ve yükleme istasyonuna bağlayın. , Mekik vanasını açın tutucu içine geri çekme kolunu tanıtmak ve yerine oturtun. mekik içine tutucu ile yeniden kol-tanıtmak ve yükleme istasyonu düğmesini kullanarak mekik vanasını kapatın. dondurarak kırık makinesine transfer takın ve geri çekme kolu ile odasına tutucu tanıtmak. makineden mekik ayırın.
- o sandviç üst trombositler knock off gibi bir yüksekliğe donma kırık mikrotom bıçak hizalayın.
- mikrotom bıçakla, hızlı sandviç kırmak ve daha sonra hemen bıçak enkaz yapışan tarafından örneklerin bulaşmasını önlemek için o kadar yükseltmek ve su molekülleri tarafından olası kontaminasyon örnekleri korumak için yeni maruz kalan düzlemin üzerinde soğutulmuş deklanşör açmak odası.
- Coat platin ve karbon örnekleri.
- sc üzerinde 'Layer 1' Enterreen. "ON" butonuna ardından 'GUN1' düğmesine basarak Pt / C tabancası açın. buharlaşma oranını incelemek ve 0.02 ulaştığında - 0.04 nm / sn, aynı anda örnekleri ortaya çıkarmak ve biriken tabakasının kalınlığını izlemek için 'Tedbir' düğmesine basın.
Not: kalınlığı önceden seçilmiş değere ulaştığında Gun otomatik olarak kapanacaktır. - Pt / C buharlaşma tamamlandığında çekim ile örnekleri örtün.
- 'Katman 2' geçmek için 'Katman' düğmesine basın. Tekrar (karbon) 'GUN2' ve 0.1 nm / saniye ~ bir buharlaşma hızını seçme hariç olmak üzere, 2.8.1 ve 2.8.2 adımları tekrarlayın.
- sc üzerinde 'Layer 1' Enterreen. "ON" butonuna ardından 'GUN1' düğmesine basarak Pt / C tabancası açın. buharlaşma oranını incelemek ve 0.02 ulaştığında - 0.04 nm / sn, aynı anda örnekleri ortaya çıkarmak ve biriken tabakasının kalınlığını izlemek için 'Tedbir' düğmesine basın.
- -120 ˚C için donma kırık sistemi sahne ısıtın.
3. Elektron Mikroskop Cryo-taramaya
- cryo çalışmaları için taramalı elektron mikroskobu hazırlayın.
- ana menü ve onaylayın Sahne / Sahne initialise seçin.
- Seç Araçları / Goto Panel ve listeden seçerek 'Airlock' panelini açın. 'Close Sütun Odası Vana' düğmesine tıklayın. 'Vakum' sekmesinin altında Vent butonuna tıklayarak mikroskop odasına havalandırın.
- Seç Araçlar / Goto Paneli ve 'Sahne Noktaları Listesi' panelini açın. Numune tutucu kabul edilmesi için uygun koordinatlara sahne taşımak için cryo değişim konumunu seçin. Not: 'cryo-döviz pozisyonu' vakum transfer ünitesinin pozisyonu ile uyum içinde olması için ayarlanmıştır.
- eldiven temiz bir çift ile numune odasına açın ve mikroskop ana sahneye cryo-sahne yerleştirin. odasına kapatın ve 'Vakum sekmesi' altındaki Pompa düğmesine tıklayın.
- -120 ˚C için mikroskop soğutun. sıvı azot ile mikroskop Dewar doldurun. Sahnenin sıcaklığı altında -120 ˚C düşer kez -120 ˚C için cryo-devret kontrol ünitesindeki ısı fonksiyonunu etkinleştirin.
- Avmikroskop cryo transfer servisi ach ve (adım 2.5 gibi) mikroskop cryo aşamasında içine geri çekilme kolunu kullanarak örnek tutucu aktarın. mikroskop mekik ayırın.
- Airlock Masası'nda 'Açık Sütun Odası Vana' butonuna tıklayın.
- joystick'i kullanarak - dikkatle objektif lens (2 mm çalışma mesafesi 1) yakın örnek tutucu taşıyın. 'Delikler' Tab 10 mikron diyafram seçin. 'Gun' sekmesinde EHT alanını çift tıklatın. EHT hedef için 10 (kV) girin ve Tamam'a tıklayın. alt EHT sekmesine tıklayın ve 'EHT On' seçeneğini seçin.
- 'Dedektörlerinin' sekmesinde Dedektörleri açılan listeden 'InLens' seçin. Uygun gibi görüntüleme koşulları (odak, parlaklık ve kontrast, ışın hizalama, astigmatizma) optimize edin.
- 'Tarama' sekmesine tıklayın. ışın zararı en aza indirmek için (piksel başına NSEC 100 bir bekleme süresine tekabül 'Tarama Hızı = 1'), bir hızlı tarama seçin ve1024 x 768 piksel bir 'Store çözünürlük'. 'Gürültü Azaltma' açılır listesinden 'Satır Ort' seçeneğini seçin. arama için 30 satır - 20 N değerini ayarlayın. Kırık hücreler ve kloroplastların (Şekil 2A ve 2B) ile bölgeler aramak için (klavyedeki Kontrol sekmesine basarak) 'Merkezi Noktası' fonksiyonunu kullanarak örnek taşıyın.
- (- 70 kX 50) (Şekil 2C ve 2D) düşük büyütmelerde kırık kloroplast görüntü kazanır. Ilginç kloroplast kırık yüzleri yakınlaştırmak ve yüksek büyütme görüntüler elde etmek için (klavyedeki kontrol-shift-sekmesine basarak) 'Merkezi Özelliği' fonksiyonunu kullanın (100-200 Kx, 3 Şekiller ve 4). Görüntü elde etmek için adım 3.6 ile aynı parametreleri kullanın, ancak gürültü azaltma 30 N> 100 Line Ort değerini değiştirin.
- Ana mikroskop kontrol ünitesindeki veya 'Tarama' sekmesine basın Freeze Taramayı durdurmak ve kaydetmek için'Kaydet TIFF' düğmesine basarak resim.
4. Görüntü Analizi
Not: Bu bölüm Fiji 31 açık kaynak paketi kullanarak dondurarak kırık SEM görüntüleri zar parçacıklarının segmentasyon için kısa yordam açıklanır. Benzer sonuçlar diğer görüntü analiz yazılımı ile elde edilebilir.
- Ana program penceresinin içine resim dosyasını sürükleyerek Fiji Açık görüntüsü. Görüntü Türü / / 8-bit seçerek 8-bit görüntü dönüştürmek. Resim Seç / / Parlaklık / Kontrast ayarlama ve gerektiğinde (Şekil 5A) ayarlayın.
- Düz Çizgi aracını kullanarak, bir çizgi gömülü görüntü ölçek çubuğunun boyutunu çizin. / Set Scale Analiz seçin. Doğru ölçek bilgisi (uzunluk Bilinen mesafe ve Birim) girin ve Tamam'a tıklayın. Bu düzeltilmiş ölçekli görüntü kaydetme.
- Seçin Süreci / Filtreler / Gauss bulanıklığı (1.5 nm çapında) ve OK (Şekil 5B) tıklayın.
- Resim Seç / / Aut ayarlayıno Yerel Eşik (Niblack yöntemini kullanarak) ve OK (Şekil 5C) tıklayın.
- Düzen / Invert ve Süreç seçin / Binary / Havza (Şekil 5D).
- Serbest Seçim aracıyla faiz (ROI) bölgenin etrafında bir sınır çizin. / Seçerek Düzenleme / Seçime Göre ROI yöneticisi seçimi ekleyin Manager veya 'T' tıklayarak ekleyin.
- Dış Düzen / Temizle (Şekil 5E) seçin.
- , / Set Ölçümleri Analiz seçin uygun parametreler (örneğin, alan, uygun elips) seçin.
- Analiz seçin / Parçacıklar analiz edin. seçeneği 'kenarlarında hariç tut' ve Tamam'a tıklayın gerekirse, 'Yöneticisi Ekle' ve partiküllerin boyutu için uygun bir aralık girin ve 'sonuçlarını görüntüle' işaretleyin. Sonuç Şekil 5F'de gösterilmektedir.
- Kaydedilen ölçekli görüntülü dosyayı (adım 4.2) açın. 'Göster Tüm seçin ve ROI Yöneticisi' Etiketler 'kaldırın. Seçilen seçe gözdenles Orijinal görüntünün üzerine koydu ve elle ekleyebilir veya YG Müdürü düğmeleri 'Ekle' veya 'Sil' kullanarak seçimleri kaldırın. Serbest Seçim aracını ve ROI Yöneticisi (Şekil 5G ve 5H) ve 'Update' düğmesini kullanarak gerekli her türlü seçimleri düzeltin.
- Elde edilen ölçümler kullanarak verileri analiz edin. Sonuçları penceresinde, / Sonuçlar tıklayın elde etmek özetler, örneğin, ortalama Alanı ve Binbaşı ve ROI Yöneticisi'nde listelenen parçacıkların küçük eksenlerini anlamına gelir. Sonuçları / Dağıtım tıklayın (örneğin Alan gibi) Parametre seçmek ve bu parametre için bir histogram görüntülemek için Tamam'a tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 yüksek basınçlı dondurulmuş, donma-kırık Craterostigma pumilum yaprak parçalarını içeren trombosit cryo-SEM görüntüleri gösterir. Bazı örneklerde ise, kırık hücrelerin büyük bölgeleri (Şekil 1A) elde edilir. Diğerlerinde, yaprak parçası sıkıca üst diske bağlı kalır ve onunla (Şekil 1B) boyunca çaldı edilir. Ancak, hatta ikinci durumda, bazı yaprak dokusu hala yaprak "kalıntılarını" görüntüleme suretiyle de tahsil edilebilir trombosit (Şekil 1B, ok başları) ve veri adil bir miktar üzerinde bıçak oluklar takılı kalabilir, onlar kırıldı sağladı. Başarılı kırık bulunduktan sonra, hücrelerin düşük büyütme görüntüleri bu durumda kloroplastlar (Şekil 2), ilgi alanları belirlemek için elde edilir.
C. tilakoit membranların yüksek büyütmeli görüntü pumilum Yaprakları Şekil 3 ve 4'te gösterilmiştir. Dört farklı kırılma yüzler, EF'lerine, EFU, Proje Fişleri ve PFu, (Şekil 3) ayırt edilebilir. zarlarında bulunan en büyük protein kompleksi, fotosistem II (PSII), EF (grana) ve efu (stroma lameller) her ikisi de yer almaktadır. Hidratlanmış şartlarda, PSII yoğunluğu efu (~ 1.550 kompleksleri um -2 genel ~ 550 kompleksleri um -2, Şekil 3) daha EFS ~ 3 kat daha yüksektir. Bu durum, bu iki sürekli yüzler arasında ayırım için bir temel oluşturur. Başka onların arka planda farktır. EF'lerine arka plan pürüzsüz görünür iken, EFU yüzü pürüzlü ve müstakil PSI kompleksleri, tamamlayıcı yüzüne kırık, PFu 10 (Şekil 3) ayak izi olan delikler içerir. Tilakoid zarının EFS yüzünden PSII kompleksleri bölümleme bir örneği Şekil 5'te gösterilmektedir.
"fo: keep-together.within-page =" ove_content C pumilum, grana zarlarında PSU'nın yoğunluğu (EFS) dehidrasyonu sırasında 1 "> giderek ~ 15 kabaca yarısı (~ 700 kompleksleri mikron -2 ulaşan azalır hidratlı koşullarında (% 100 RWC, Şekil 4A) kendi yoğunluğu% OSK, Şekil 4C) Özellikle, ileri dehidrasyon sırasında, 5 -.% 10 RWC, PSII kompleksleri satır ve diziler halinde organize (oklar) 4D ve 4E Rakamlar. Veri kümesinin tamamı, 24 bkz. böyle PSII dizilerin oluşumu onların bağlı anten kompleksleri bazı LHCII, PSU'nın ayırmak gerektirmektedir. EF organize PSII kompleksleri tamamlayıcı olacağını Proje Fişlerinde satırlar halinde düzenlenmiş LHCII kompleksleri için bir örnek ( ) Şekil 4E (ok başı) gösterilir. dizilerde PSII kompleksleri yanı sıra müstakil LHCII, bir fotokimyasal söndürüldü durumda olması muhtemeldir, bir foto-koruyucu rolü hizmet. Bu yapısal yeniden düzenlemeler vardır tekrar hayata gelen bitki C kullandığı mekanizmaların parçası susuz halde 24 kendini korumak için pumilum.
Freeze-kırık C ile Trombositler Şekil 1. Düşük Büyütme Cryo-SEM Görüntüleri pumilum Yaprak Adet. (A) kırık hücrelerin büyük bir bölge (kesik anahat) bir C. pumilum yaprağı. Alt trombosit de bıçak işaretleri (B) yaprak parçası üst trombosit kapalı çaldı, ancak bazı yaprak dokusu bağlı kaldı (ok başları bunlardan bazıları işaretlemek). yaprak parçalarını çevreleyen bölgeler 1-heksadekanda (yıldız) dondurulur. Ölçek çubukları:. 200 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. kloroplast içine Yakınlaştırma. (A) sulandırılmış yaprak dokusunun kırık fotosentetik (mezofil) hücreleri (yıldız) bir grup. Hücre hacminin en dar bir şerit halinde çarpıtma çevresindeki tüm sitoplazmik bileşenleri ile, büyük bir merkezi vakuol oluşmaktadır. (B) İki komşu kırık hücreler - hücre duvarı (cw) hücreler arasındaki sınırı işaretler. Beş kloroplast (c) (ok ile işaretlenmiş parçalanmış düzlemi) kırık edilmiş sadece biri, görüntü belirgindir. Hidratlanmış (C) den, tek kırık kloroplast için (C ve D) örnekleri, ve kurutulmuş (D, 15% bağıl su içeriği: [RWC]) bitkisi. Küçük beyaz noktalar (örneğin, ok başları) kloroplastın tilakoit membranlarda içinde bulunan membran protein kompleksleri bulunmaktadır. masif vezikülasyon SURR NotSusuz yaprak (D) 'de bulunan kloroplast ounding. Ölçek çubukları: 10 um (A); 1 uM (B); 200 nm (C ve D). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Bitkisel Dokular içinde Thylakoid'in Membranlarının Supramoleküler Örgütü farklı tilakoit kırık yüzleri görülebilir hangi bir kırık kloroplast. Exoplasmic kırık yüzleri (EF), hem (EFS) yığılmış ve istiflenmemiş (EFU) membran bölgelerin fotosistem II ihtiva (PSII) kompleksleri; yığılmış bölgelerin protoplazmik kırık yüzü (PFS) PSU'nın, LHCII periferik ışık hasat anten kompleksleri içerir; istiflenmemiş bölgelerin protoplazmik kırık yüzü (PFu) için Fotosistem I (PSI) ve ATP sentaz kırığı; Sitokrom b 6 f bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
C. Dehidrasyon sırasında Fotosistem II Teşkilatı 4. Değişiklikleri Şekil pumilum EF'lerini Farklı RWC bitkilerin tilakoit membran yüzleri (A) 100% (B) '~% 40 (C), yaklaşık% 15, ve (D ve E) 5-10%.. Dehidrasyon sırasında, EFS PSII yoğunluğu tedricen azalır yüz 1.500 ~ komplekslerin um -2 (A) ~ 700 kompleksleri um -2 (~% 15 RWC C). Özellikle, kurutucu koşullarda (5-10% OSK), bazı PSII kompleksleri satır ve diziler (D ve E, oklar) içine düzenliyoruz. ok (E) LHCII anten de PSII satırlar tamamlayıcı EF bulunan edileceği arasında, sıralar halinde düzenlenecek görünen ile, Proje Fişleri yüz işaretler. Bu verilere ek bilgi için 24 bakın. Ölçek çubukları:. 100 nm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Bir Örnek Fotosistem II Parçacıkların segmentasyonu. Fiji açık kaynak paketi Kullanımı, protein kompleksleri birkaç adım (Protokol bölümünün parçası 4 bulunan detaylı prosedürü tamamlamak) ile görüntüleri segmente edilebilir. Görüntüler (A, orijinal görüntü) Gauss filtre (B) bulanık; görüntü otomatik yerel th kullanılarak eşiklenirreshold aracı (° C); Görüntü ters çevrilir ve havza algoritması yakın temas (D) bulunan ayrı nesneler için uygulanır; ilgi bölgesi (E) seçilir ve dış temizlenir; (Kullanıcı tanımlı bir boyut aralığı içinde) partikülleri partikül analizörü fonksiyonu kullanılarak seçilir. Elde edilen maskesi (F) 'de gösterilmiştir. Parçacıklar ROI Manager eklendi ve hatalar için veya hatalı veya cevapsız parçacıkların kontrol etmek için orijinal resmin (G) üzerine üst üste. ROI listesi elle uygun olarak, yerine silme veya yeni ROI'leri ekleyerek düzenlenebilir. Nihai kullanıcı Düzenlenen seçimi (H) gösterilir. Ölçek çubuğu:. 200 nm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda anlatılan teknik cryo-tarama elektron mikroskobu ile iyi korunmuş yüksek basınçlı donmuş bitki dokularının kapsamında dondurularak kırık membranların soruşturma sağlar. Bu prosedürler kullanılarak en büyük avantajı, numune hazırlama tamamen fiziksel olmasıdır; kimyasallar veya dehidratasyon içeren hiçbir adım gereklidir. Bu nedenle, yakın bir Yerli durumda 26,32 biyolojik yapılar üzerinde çalışma sağlar. Yaprak dokuları kullanmanın yararı bir kloroplast içinde, yani kendi ana fizyolojik bağlamda, içinde, genel hücresel organizasyonun bilgi, yanı sıra tilakoit membranlarda olarak çalışma belirli membranlar elde olmasıdır. C okuyan zorunludur başka avantajı, Farklı nispi su içeriği (RWC) de pumilum bitkiler, hidrasyon durumu hazırlanması sırasında değişmez olmasıdır. Bu, başlangıç materyali olarak izole kloroplast ya tilakoit zarların kullanıldığı karşı olduğu gibibir dondurarak kırma deney için. İkinci olarak, bir de bazı yapısal ve / veya supramoleküler değişiklikler büyük olasılıkla organel / zar izolasyonu sırasında gerçekleşecek dikkate almak zorundadır.
nispeten kalın olduğu için, bitki dokusu numuneleri, çalışma [> 50-100 um, ve doku ve tür türüne bağlı olarak önemli ölçüde daha kalın olabilir], örnek vitrifikasyonu için (HPF) donma, yüksek basınç kullanımı belirler. su erime sıcaklığı yaklaşık -22 ° C olan yüksek basınç [2100 bar], uygulama buz kristal oluşumu oranını yavaşlatır şekilde suyun hidrojen bağı ağı etkiler. Bu nedenle, bir vitrifiye örnek alma şansı bile nispeten yavaş soğutma hızlarında yüksek. HPF şu anda henüz 200 mikron, örnekleri geçmeyen kalın vitrifikasyon için kullanılabilen tek yöntemdir. Bitki dokularının HPF için kritik bir adım inert ile arası hava boşluklarının infiltrasyon4;. Dondurmadan önce yer doldurucu ", yüksek basınç altında doku çökmesini engellemek için kalınlığı 1 mm'ye kadar olabilir C'de pumilum yaprak durumunda, (yorumlar 29,33 bakınız), yaprakları kesilmiş gerekir veya HPF öncesinde inceltilerek.
Esas olarak, çoğaltma Preparasyon 18'deki teknik de uygulanabilir yaprak dokuları dondurarak kırık. kopyaları genellikle küçük parçalara parçalara Bununla birlikte, deneyimlerimiz, bozulmamış kırık alanların yeterli verimi elde değildi. Ayrıca, bu tür kloroplast gibi ilgi belirli bir bölge ararken bitki dokularının parçalanmış kopyaları içinde pratik olabilir. Mezofil (fotosentez) hücreleri çekirdeğini, kloroplast ve diğer tüm organelleri içeren dar bir sitoplazmik şerit (Şekil 2A), çevrili geniş bir merkezi vakuol oluşmaktadır Bunun başlıca nedeni olduğunu. Bu nedenle, kloroplast toplam kırık alanı sadece çok küçük bir bölümünü temsil etmektedirmezofil dokular. Numuneler doğrudan kırık (ve kaplama / gölgeleme) Aşağıdaki görüntülenmiştir beri dondurularak kırık numunelerin Cryo-SEM görüntüleme bu soruna bir çözüm sunuyor. Ancak, bu yöntem dondurulmuş sulu numuneler yüksek büyütme kolayca zarar ilk taramada örnek kiriş duyarlı ve böylece tarama vardır sınırlama muzdarip. Çift katmanlı kaplama (DLC) 27,28 bu ciddi dezavantajı bir çözüm sunuyor.
DLC, kırılan numuneler çoğaltma hazırlanması için ne kadar benzer bir şekilde kaplanır. İlk olarak, ince bir tabaka - Pt / C (1 3 mil) kontrast ve iletkenlik sağlayan, numune üzerine buharlaştırılmıştır. - (10 nM 5) karbon koruyucu tabaka bu daha kalın bir izlemektedir. Yüksek bir ivmelendirici gerilim (10 kV) ile birleştirildi DLC geri-saçılmalı elektron (BSE) bir sinyal 28 kullanarak görüntü örnekleri için kullanıldı. platin tabakası gelen BSE sinyali, karbon yoluyla yüzey bilgilerin elde edilmesini sağlarve muhtemelen, (su kirliliği bile bu bile, bir vakum-cryo aktarma birimi kullanılmaz ve kırık yüzey atmosfere maruz kaldığı deneylerde biriken yüksek ivme gerilimlerinde BSE pratikte şeffaf su buharı kirletici tabakası, ) ikinci bir kısmı içindir. Buna ek olarak, BSE sinyal kullanarak görüntüleme ikincil elektron (SE) algılama 27 belirgindir etkileri şarj sorununu minimize. Pt / C 3 nm ve düşük hızlanan gerilimlerde görüntülü - Burada anlatılan mikroskop kurulumu, 10 kV In-lens SE dedektörü ile SE sinyalinin görüntüleme ile numuneleri 2 ile yalnızca kaplı edildiğinde elde edilen bilgi eşdeğer vermiştir. Fark tarif edildiği gibi DLC tarafından hazırlanan ve görüntülü örnekler önemli ölçüde daha az ışın duyarlı olmasıdır. Bu fotosentetik protein supramolecul değerli bilgiler elde bile defalarca yüksek büyütme oranlarında ve birçok durumda bunları taramak için etkin ve izinar organizasyonu ve diğer hücresel bileşenleri (Şekil 2-4) 24.
Son olarak, burada tarif edilen prosedürler Örneklerin diğer tipler, yapı ve / ya da zar proteini organizasyonuna incelemek için modifiye edilebilir. Biz başarıyla siyanobakteri ve alg hücrelerinde fotosentez membranların supramoleküler örgütü incelemek için teknik istihdam var (Shperberg-Avni ve ark. Yayınlanmamış veriler). Örnek Bozulmamışlık tutarken ana dikkate vitrifikasyon şansını artırmak için, mümkün olduğunca ince bir örnek olan arasındaki dengeyi bulmaktır. Süspansiyonlar veya hayvan / bitki dokuları olabilir numunelerin farklı tipleri için, farklı ambalaj (yüksek basınç dondurma için kullanılan platelet türü açısından, örneğin) kullanılmalıdır. Başarılı bir kriyo-immobilizasyon elde edilir, dondurularak kırılmış hali olduğundan, DLC ve kriyo-SEM görüntüleme kombinasyonu layan elde etmek için mükemmel bir araç sağlaren az kiriş hasar ile yüksek büyütmede membran proteini organizasyonuna bilgiler bulunacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz elektron mikroskobu görüntüleme tarayarak onun yararlı tavsiyeler için Andres KAECH (Zürih Üniversitesi) teşekkür ederim. Bu çalışma ABD-İsrail Binational Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Fonu (hayır verin. ABD-4334-10, ZR), İsrail Bilim Vakfı (hayır verin. 1034/12, ZR) ve İnsan Frontier Bilim Programı tarafından desteklenen (RGP0005 / 2013 ZR). elektron mikroskobu çalışmaları Weizmann Bilim Enstitüsü Irving ve Nano için Cherna Moskowitz Merkezi ve Bio-Nano Görüntüleme yürütülmüştür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| Isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 Platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| High-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| High-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| Freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| Cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| Specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| Vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| Cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| Image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| Image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
- Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
- Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
- Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
- Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
- Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
- Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
- Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
- Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
- Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
- Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
- Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
- Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
- Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
- Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
- Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
- Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).
- Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
- Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).
- Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
- Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
- Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
- Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
- Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. Schatten, H., Pawley, J. B. , Springer. New York. 245-261 (2008).
- Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
- Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).
- Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
- Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
- Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).
