Abstract
microscopia elettronica Cryo-scansione (SEM) di campioni freeze-fratturato permette di indagine delle strutture biologiche in condizioni vicine native. Qui, descriviamo una tecnica per studiare l'organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane (tilacoidali) all'interno di campioni di foglie. Ciò si ottiene alta pressione congelamento del tessuto fogliare, liofilizzazione fratturazione, rivestimento a doppio strato e infine l'imaging crio-SEM. L'utilizzo del metodo di rivestimento a doppio strato consente l'acquisizione di alto ingrandimento (> 100,000X) le immagini con danni raggio minimo per i campioni congelati idratata così come gli effetti di ricarica minimi. Usando le procedure descritte abbiamo studiato le alterazioni nella distribuzione del fotosistema supramolecolare e proteine antenna luce raccolta complessi che si svolgono durante la disidratazione della pianta risurrezione Craterostigma pumilum, in situ.
Introduction
la fotosintesi Oxygenic, originari di antica cianobatteri, fu ereditato da alghe e piante terrestri da eventi endosimbiontica che hanno portato allo sviluppo del organello cloroplasto. In tutti i fototrofi Oxygenic moderni, di trasporto degli elettroni fotosintetica e la generazione di forza proton-motrice e potere riducente sono svolte all'interno di vescicole sac-come appiattite denominati membrane 'tilacoidali. Queste membrane ospitano complessi proteici che effettuano le reazioni luce-driven di fotosintesi e forniscono un mezzo per la trasduzione di energia. Le membrane tilacoidi di piante e di (alcuni) alghe si differenziano in due domini morfologiche distinte: le regioni di membrana strettamente appressed chiamati 'grana' e membrane unstacked che interconnettono la grana, chiamati 'stroma lamelle' 1. sono stati condotti diversi studi freeze-frattura degli impianti e delle membrane tilacoidi algali, a partire dai primi anni 1970. Quando freeze-fratturato, membraneraggruppati lungo il loro core idrofobico 2, generando una faccia exoplasmic (EF) e una faccia protoplasmatico (PF), a seconda del compartimento cellulare cui i confini semi-membrana, come originariamente coniato da Branton et al. . nel 1975 3 Impianti e tilacoidi alghe hanno quattro diverse facce della frattura: EF, EFU, FP e PFU, con 's' e che denotano e regioni 'u' '' 'impilati unstacked' membrana, rispettivamente. I complessi di proteine di membrana, che non sono tagliati o rotti, hanno la tendenza a rimanere sia con la E o laterale P della membrana. Le osservazioni iniziali che le diverse facce della frattura dei tilacoidi contengono particelle di diverse dimensioni e densità 4, e le numerose indagini che seguirono, ha portato all'identificazione e correlazione tra le particelle osservate ed i complessi proteici di membrana che svolgono le reazioni luce 5-13 (vedi anche 14,15).
freesperimenti di Eze-frattura delle membrane tilacoidi sono in genere effettuate su preparazioni di cloroplasti o isolate membrane tilacoidi (ma si veda 16,17), con il rischio di ogni cambiamento di / organizzazione strutturale e supramolecolare o che possono verificarsi durante la procedura di isolamento. A seguito della frattura, repliche sono preparati mediante evaporazione del platino / carbonio (Pt / C), poi da uno spesso strato di carbonio (C), ed infine la digestione del materiale biologico 18. Repliche vengono visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). La tecnica di congelamento-frattura-replica tradizionale continua a servire come un importante strumento per lo studio della organizzazione supramolecolare delle membrane fotosintetiche e il loro adattamento al diverso, ad esempio., La luce, le condizioni di 19-23.
Nel nostro recente studio della pianta risurrezione homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, abbiamo voluto indagare i cambiamenti nell'organizzazione o supramolecolaremembrane tilacoidi f, nonché in grado di organizzazione cellulare, durante la disidratazione e reidratazione. L'unicità di specie resurrezione homoiochlorophyllous è che sono in grado di sopravvivere in condizioni di disidratazione nelle loro tessuti vegetativi (foglie), pur mantenendo la loro fotosintetico. Una volta che l'acqua è disponibile, queste piante recuperare e riprendere l'attività fotosintetica in poche ore ad alcuni giorni 25. Per questo studio, crio-scanning EM (SEM) per immagini di campioni di foglie freeze-fratturato è stato combinato con alta pressione congelamento per il campione crio-immobilizzazione. Queste procedure forniscono un mezzo per visualizzare campioni biologici congelati idratati in uno stato vicino al loro stato nativo 26. Un vantaggio principale è che i campioni vengono esaminati direttamente dopo freeze-frattura e rivestimento senza passaggi successivi. Ciò è particolarmente rilevante per l'indagine di piante a diversi contenuti di acqua relativi (RWC), come il loro stato di idratazione viene mantenuto durante la preparazione. Comemai, uno svantaggio fondamentale è che i campioni congelati-idratato possono soffrire di danni fascio durante l'imaging, soprattutto quando scansione ad alti ingrandimenti, necessari per la misurazione accurata delle dimensioni di complessi fotosintetici. Per ovviare a questo, un metodo chiamato 'rivestimento a doppio strato' (DLC) 27,28 combinata con state utilizzate condizioni specifiche di imaging crio-SEM. Questi hanno portato in campioni che sono significativamente meno-fascio sensibile e ha permesso per la delucidazione delle preziose informazioni sulla proteina fotosintetica organizzazione supramolecolare e di altri costituenti cellulari della pianta risurrezione C. pumilum ad alti ingrandimenti in situ.
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Protocol
1. Cryo-fissaggio di Leaf tessuti per congelamento ad alta pressione
Nota: Questa sezione descrive come effettuare ad alta pressione congelamento dei tessuti fogliari per un esperimento di congelamento-frattura. Per considerazioni relative ai campioni di piante vedere 29. Questo può essere adattato per altri tipi di tessuti o campioni con alcune modifiche.
- Utilizzando l'angolo di una lama di rasoio, graffiare il fondo della cavità 0.1 mm di una piastrina di alluminio di 0,1 / 0,2 mm (Figura 1). Preparare almeno una dozzina di piastrine (6 campioni). Fare attenzione a non creare marchi coltello sulla circonferenza del disco.
- Dopo graffi, lavare i dischi in etanolo assoluto, lasciarli asciugare e conservare in un piatto pulito.
- Preparare la macchina di congelamento ad alta pressione secondo le istruzioni del produttore. Riempire camera di alcol della macchina di congelamento ad alta pressione con isopropanolo.
- Preparare un vacuum-assisted infiltratio fatta in casan dispositivo per sostituire il gas che si trova nel tessuto fogliare di liquido.
- Strettamente collegare un puntale 200 microlitri al fine di una siringa da 10 ml. Tagliare ~ 1 cm dalla punta. Fare un foro nel tappo di una provetta da 1,5 ml a stretto misura la punta tagliata. Vuoto può essere creato all'interno del tubo tirando lo stantuffo della siringa.
- Tagliare un piccolo pezzo di foglia dalla pianta utilizzando una lama di rasoio e con le pinzette posizionare la foglia all'interno di una provetta riempito a metà con 1-esadecene. Infiltrati spazi intercellulari della foglia con il liquido tirando delicatamente lo stantuffo per creare il vuoto, tenere premuto per circa 30 secondi, quindi rilasciare lentamente lo stantuffo.
- Rimuovere il pezzo foglia dal tubo con una pinzetta. Tagliare il foglio con una lama di rasoio in caso è più spesso di 0,2 mm e tagliare un piccolo pezzo che si inserisce in una delle piastrine.
- Mettere una piastrina pulita con il lato graffiato fino nel supporto della macchina di congelamento e quindi inserire il pezzo tagliato di leaf in piastrine. Riempire lo spazio rimanente che circonda la foglia con 1-esadecene. Chiudere il sandwich utilizzando un altro piastrinica, con i graffi di fronte al foglio.
- Chiudere e serrare il supporto e inserirlo nella camera della macchina. Quindi premere il pulsante 'Jet' di congelare (~ 2.100 bar per 300-500 msec), e trasferire rapidamente il supporto in azoto liquido. Rimuovere con attenzione il panino congelato dal supporto con una pinzetta pre-raffreddamento, facendo attenzione a non fratturare il panino.
Nota: i panini surgelati chiuso può essere congelamento fratturato immediatamente o conservato in azoto liquido per un uso successivo. Usare indumenti protettivi e occhiali durante la manipolazione di azoto liquido.
2. Fermo-frattura e doppio strato di rivestimento 27,28
- Preparare la macchina frattura congelamento per l'uso, tra cui entrambe le pistole per evaporazione del platino / carbonio (Pt / C) e carbonio, secondo le istruzioni del produttore. Posizionare la pistola Pt / C a 45 gradi unnd la pistola di carbonio a 90 gradi.
- Pre-programma di un ciclo di uno strato di 2 nm di Pt / C (tasso di rivestimento 0.02 - 0.04 nm / sec) e uno strato 6 nm di carbonio (a ~ 0.1 nm / sec).
- Inserisci il setup sullo schermo della macchina freeze-frattura. Selezionare un numero utente in cui verrà salvato il sistema di rivestimento.
- Scegli Pt / C per 'livello 1'. Selezionare un intervallo di tempo, ad esempio., 5 min (per superare il tempo necessario necessario per completare il rivestimento). Utilizzare le frecce su-giù per definire uno spessore di 2 nm.
- Premere il pulsante 'Layer' per passare al livello 2. Ripetere il punto 2.1.1.2, tranne selezionare carbonio e definire uno spessore di 6 nm.
- Testare e regolare il funzionamento della pistola.
- Seleziona 'livello 1'. Selezionare la pistola Pt / C premendo il pulsante 'GUN1' e premere il pulsante 'ON' sull'unità di controllo di evaporazione della macchina freeze-frattura. Monitorare la velocità di evaporazione e regolare utilizzando le manopole di tensione e di emissioni until raggiungimento di un tasso di 0,02 - 0.04 nm / sec. Premere 'OFF' per spegnere la pistola Pt / C.
- Seleziona 'livello 2'. Ripetere 2.1.2.1, tranne selezionare 'GUN2' e regolare per un tasso di evaporazione del ~ 0.1 nm / sec.
- Pre-programma di un ciclo di uno strato di 2 nm di Pt / C (tasso di rivestimento 0.02 - 0.04 nm / sec) e uno strato 6 nm di carbonio (a ~ 0.1 nm / sec).
- Raffreddare la fase di sistema di fratture congelamento a -140 C o -160 C (per le foglie idratati o disidratati, rispettivamente). Fissare la navetta di trasferimento vacuum crio alla macchina e riempire la sua camera con azoto liquido. Pressione nella camera di congelamento-frattura raffreddato è generalmente fra 1 - 8 x 10 -7 mbar.
- Inserire un supporto esemplare congelamento fratturazione (adatto per le piastrine 3 mm) nella stazione di carico. Inondare la camera di stazione di carico con azoto liquido.
- Caricare due panini congelate destinate al titolare uno ad uno con alta precisione pinzette grade. Serrare il primo panino nel supporto e poi capovolgere il supporto a controllare che si adatta saldamente in posizione. Ripetere l'operazione per il secondo panino.
- Detach la navetta raffreddato dalla macchina frattura congelamento e collegarlo alla stazione di carico. Aprire la valvola shuttle, introdurre il braccio retrattile nel supporto e bloccarlo in posizione. Reintrodurre il braccio con il supporto nella navetta e chiudere la valvola a navetta con la manopola stazione di carico. Fissare la navetta per la macchina di congelamento-frattura e introdurre il supporto nella camera con il braccio retrattile. Staccare la navetta dalla macchina.
- Allineare il coltello microtomo frattura congelamento ad un'altezza tale che possa staccare le prime piastrine dei panini.
- Con il coltello microtomo, rompere rapidamente i panini, e poi subito sollevarla per evitare la contaminazione dei campioni da detriti aggrappato al coltello, e ruotare l'otturatore raffreddata sopra del piano appena esposto per proteggere i campioni da eventuali contaminazioni da molecole di acqua la Camera.
- Cappotto i campioni con il platino e carbonio.
- Inserire 'livello 1' sul scReen. Accendere la pistola Pt / C premendo il pulsante 'GUN1' seguito dal tasto 'ON'. Esaminate la velocità di evaporazione e, una volta raggiunta 0.02 - 0.04 nm / sec, esporre contemporaneamente i campioni e premere il tasto 'Measure' per controllare lo spessore dello strato depositato.
Nota: Gun si spegne automaticamente quando lo spessore raggiunge il valore pre-selezionato. - Coprire i campioni con l'otturatore quando Pt / C evaporazione è completata.
- Premere il pulsante 'Layer' per passare a 'livello 2'. Ripetere i punti 2.8.1 e 2.8.2, con l'eccezione di selezionare 'GUN2' (per il carbonio) e un tasso di evaporazione di ~ 0,1 nm / sec.
- Inserire 'livello 1' sul scReen. Accendere la pistola Pt / C premendo il pulsante 'GUN1' seguito dal tasto 'ON'. Esaminate la velocità di evaporazione e, una volta raggiunta 0.02 - 0.04 nm / sec, esporre contemporaneamente i campioni e premere il tasto 'Measure' per controllare lo spessore dello strato depositato.
- Scaldare la fase di sistema di fratture congelamento a -120 ° C.
3. Cryo-microscopia elettronica a scansione
- Preparare il microscopio elettronico a scansione per il lavoro crio.
- Selezionare Fase / Fase di inizializzazione dal menu principale e confermare.
- Selezionare Strumenti / Goto pannello, e aprire il pannello 'Airlock' selezionandolo dalla lista. Fare clic sul pulsante 'Chiudi Colonna camera della valvola'. Ventilare la camera microscopio facendo clic sul pulsante Vent nella scheda 'vuoto'.
- Selezionare Strumenti / Goto Panel, e aprire il pannello 'punti tappa List'. Selezionare la posizione di crio-scambio per spostare il palco per le coordinate appropriate per l'accettazione supporto del campione. Nota: La 'posizione di crio-scambio' è preimpostata per essere in allineamento con la posizione dell'unità di trasferimento a vuoto.
- Aprire la camera campione con un pulito paio di guanti e inserire il crio-stage sul palco principale del microscopio. Chiudere la camera e fare clic sul pulsante della pompa sotto la 'scheda del vuoto'.
- Raffreddare il microscopio a -120 ° C. Riempire il microscopio Dewar con azoto liquido. Attivare la funzione di calore sull'unità di controllo crio-transfer a -120 C una volta la temperatura della fase scende sotto -120 ° C.
- Attach la navetta crio-trasferimento al microscopio e trasferire il supporto del campione usando il braccio retrattile in fase di microscopio crio (come nel passaggio 2.5). Staccare la navetta dal microscopio.
- Fare clic sul pulsante 'Open Colonna camera della valvola' nel Pannello Airlock.
- muoversi con cautela il titolare del campione vicino alla lente dell'obiettivo (distanza di lavoro 1 - 2 mm) utilizzando il joystick. Selezionare un'apertura di 10 micron nella scheda 'aperture'. Fare doppio clic sul campo EHT nella scheda 'Gun'. Inserire 10 (kV) per il target EHT e fare clic su OK. Fare clic sulla scheda EHT basso e selezionare 'EHT On'.
- Seleziona 'InLens' dall'elenco a discesa rivelatori nella scheda 'rivelatori'. Ottimizzare le condizioni di imaging (messa a fuoco, luminosità e contrasto, allineamento del fascio, astigmatismo) a seconda dei casi.
- Fare clic sulla scheda 'Scansione'. Scegliere una scansione veloce ( 'Scan Speed = 1', corrispondente ad un tempo di permanenza di 100 nsec per pixel) per minimizzare i danni del fascio, euna 'risoluzione Store' di 1.024 x 768 pixel. Seleziona 'Linea Avg' nel menu a discesa la 'riduzione del rumore'. Regolare il valore di N per 20 - 30 linee per la ricerca. Spostare il campione utilizzando la funzione 'Centre Point' (premendo Ctrl-Tab sulla tastiera) per cercare per le regioni con le cellule fratturate e cloroplasti (figure 2a e 2b).
- Acquisire le immagini di cloroplasti fratturati a basso ingrandimento (50 - 70 kX) (Figura 2C e 2D). Utilizzare la funzione di 'Centro Feature' (premendo Control-Shift-Tab sulla tastiera) per ingrandire in interessanti volti della frattura cloroplasto e acquisire immagini ad alti ingrandimenti (100-200 kX, figure 3 e 4). Utilizzare gli stessi parametri come al punto 3.6 per l'acquisizione delle immagini, ma cambiare la linea del valore medio per N> 100 per la riduzione del rumore 30.
- Premere FREEZE sull'unità di controllo del microscopio principale o nella scheda 'Scansione' per fermare la scansione e salvarel'immagine premendo il pulsante 'Salva TIFF'.
Analisi 4. Immagine
Nota: Questa sezione descrive una breve procedura per la segmentazione di particelle di membrana da immagini freeze-frattura SEM utilizzando il pacchetto open-source Fiji 31. Risultati simili possono essere ottenuti con altri software di analisi di immagine.
- Apri l'immagine con le Figi trascinando file immagine nella finestra principale del programma. Convertire l'immagine a 8 bit selezionando Immagine / Tipo / 8-bit. Seleziona Immagine / Regola / Luminosità / Contrasto e regolare come necessario (Figura 5A).
- Utilizzando lo strumento linea retta, tracciare una linea delle dimensioni della barra di scala immagine incorporata. Selezionare Analizza / Set Scala. Immettere le informazioni di scala adeguata (distanza nota e l'unità di lunghezza) e fare clic su OK. Salva questa immagine in scala regolata.
- Selezionare Processo / filtri / sfocatura gaussiana (1,5 raggio nm) e fare clic su OK (Figura 5B).
- Seleziona Immagine / Regola / AutO soglia locale (utilizzando il metodo Niblack) e fare clic su OK (Figura 5C).
- Selezionare Modifica / invertito e poi di processo / Binario / Watershed (Figura 5D).
- Disegna un bordo intorno alla regione di interesse (ROI) con lo strumento Selezione a mano libera. Aggiungere la selezione al gestore ROI selezionando Modifica / Selezione / Aggiungi al Manager o cliccando su 'T'.
- Selezionare Modifica / Liberata Esterno (Figura 5E).
- Selezionare Analizza / Set Misure, scegliere i parametri appropriati (ad esempio, area, ellisse in forma).
- Selezionare Analizza / Analyze particelle. Inserisci una gamma appropriata per la dimensione delle particelle e segnare 'Risultati', 'Aggiungi al Manager' e, se necessario, il 'Escludi sui bordi' opzione e fare clic su OK. Il risultato è mostrato in Figura 5F.
- Aprire il file ripreso in scala salvato (passo 4.2). Seleziona 'Mostra tutto' e deselezionare 'etichette' nella ROI Manager. Rivedere il partic selezionatoles posato sul immagine originale e aggiungere o rimuovere le selezioni utilizzando il 'Aggiungi' o 'Cancella' pulsanti del ROI Manager manualmente. Correggere eventuali selezioni necessarie utilizzando lo strumento Selezione a mano libera e il pulsante 'Aggiorna' del ROI Manager (figure 5G e 5H).
- Analizzare i dati utilizzando le misure ottenute. Nella finestra Risultati, fare clic su Risultati / Riassumere per ottenere, ad esempio, l'area media, e dire Maggiore e assi minori delle particelle elencati nel ROI Manager. Clicca Risultati / Distribuzione, selezionare un parametro (come Area) e fare clic su OK per visualizzare un istogramma per questo parametro.
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Representative Results
La figura 1 mostra le immagini crio-SEM di piastrine contenenti alta pressione congelati, freeze-fratturati Craterostigma pezzi di foglia pumilum. In alcuni campioni, ampie regioni di cellule fratturati sono ottenuti (Figura 1A). In altri, il pezzo foglio rimane strettamente legata al disco superiore e viene buttato giù con esso (Figura 1B). Tuttavia, anche nel secondo caso, un po 'di tessuto fogliare può rimanere attaccato alle scanalature coltello sul piastrinica (Figura 1B, punte di freccia) e una discreta quantità di dati possono ancora essere raccolti da l'imaging le foglie di "resti", a patto che erano fratturati. Dopo frattura successo viene trovato, immagini a basso ingrandimento di cellule sono acquisiti per identificare le regioni di interesse, in questo caso cloroplasti (Figura 2).
Immagini Superiore ingrandimento delle membrane tilacoidi in C. pumilum le foglie sono mostrati nelle figure 3 e 4. Le quattro facce diverse fratture, EF, EFU, FP e PFU, possono essere distinti (Figura 3). Fotosistema II (PSII), che è il complesso proteico più trovato nelle membrane, è situato in entrambe le EF (grana) e EFU (stroma lamelle). Alle condizioni idrate, densità PSII è ~ 3 volte superiore a EF rispetto EFU (~ 1.550 complessi micron -2 vs ~ 550 micron complessi -2, Figura 3). Questa è una base per distinguere tra queste due facce continue. Un altro è la differenza nel loro background. Mentre lo sfondo EF appare liscia, il volto EFU è ruvida e contiene i fori che sono le impronte di complessi PSI staccati, che la frattura al volto complementare, PFU 10 (Figura 3). Un esempio per la segmentazione di complessi PSII dalla faccia EF della membrana tilacoidi è mostrato in Figura 5.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Durante la disidratazione di C. pumilum, la densità di PSII nelle membrane Grana (EFS) diminuisce gradualmente, raggiungendo circa la metà (~ 700 micron complessi -2 a 15 ~ % RWC, Figura 4C) della loro densità a condizioni di idrati (100% RWC, figura 4a) in particolare, dopo ulteriori disidratazione, a 5 -. 10% RWC, complessi PSII organizzare in righe e matrici (frecce, Figure 4D e 4E). per una completa serie di dati, vedere 24. la formazione di tali matrici PSII richiede che alcuni dei loro complessi antenna rilegati, LHCII, staccano dal PSII. Un esempio per complessi LHCII organizzati in righe nelle FP che sarebbe complementare a complessi PSII organizzati (in EF ) è mostrato in Figura 4E (freccia). complessi PSII nelle matrici, nonché la LHCII distaccata, sono suscettibili di essere in uno stato fotochimicamente temprato, che serve un ruolo fotoprotettiva. Questi riarrangiamenti strutturali parte dei meccanismi utilizzati dalla pianta risurrezione C. pumilum per proteggere se stessa nello stato disidratato 24.
Figura 1. Basso ingrandimento Cryo-SEM Immagini di placchette con Fermo-fratturato C. Pezzi pumilum Leaf. (A) Una grande regione di celle fratturati (profilo tratteggiato) di C. foglia pumilum. (B) Il pezzo foglia è stato buttato fuori con la piastrinica superiore, ma alcuni tessuto fogliare rimasta attaccata ai marchi coltello alla piastrinica inferiore (frecce indicano alcuni di questi). Le regioni che circondano le parti del foglio sono congelati 1-esadecene (asterischi). Barre di scala:. 200 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Zoom in cloroplasti. (A) Un gruppo di fotosintetico fratturato (mesophyll) cellule (asterischi) del tessuto fogliare idratato. La maggior parte del volume cellulare è composto da un grande vacuolo centrale, con tutti i componenti citoplasmatici che circondano il vacuolo in una stretta striscia. (B) Due vicini cellule fratturati - la parete cellulare (CW) segna il confine tra le cellule. Cinque cloroplasti (c) sono evidenti nell'immagine, uno solo dei quali è stato fratturato (piano fratturato contrassegnata dalla freccia). (C e D) Esempi di singoli cloroplasti fratturate da idratata (C) e (D, ~ contenuto di acqua relativa del 15% [] RWC) vegetali disidratati. I piccoli puntini bianchi (ad esempio, punte di freccia) sono i complessi proteici di membrana trovati all'interno delle membrane tilacoidi del cloroplasto. Si noti la massiccia SURR vescicolazioneounding cloroplasto trovato nella foglia disidratato (D). Barre di scala: 10 micron (A); 1 micron (B); 200 nm (C e D). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. L'organizzazione supramolecolare di tilacoidale membrane all'interno di tessuti vegetali Un cloroplasto fratturato in cui le diverse facce della frattura tilacoidali possono essere visti:. Le facce della frattura exoplasmic (EF) di entrambi (EFU) regioni membrana impilati (EF) e unstacked contengono fotosistema II (PSII) complessi; La frattura volto protoplasmico delle regioni impilate (PFS) contiene le periferiche complessi antenna luce-raccolta di PSII, LHCII; Fotosistema I (PSI) e frattura ATP sintasi al volto frattura protoplasmica delle regioni unstacked (PFU); Citocromo b 6 f Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Variazioni fotosistema II Organizzazione durante la disidratazione di C. pumilum EF facce delle membrane tilacoidi di piante a diversi RWC: (A) 100%, (B) ~ 40%, (C) ~ 15%, e (D ed E) 5 - 10%.. Durante la disidratazione, la densità di PSII in EF faccia diminuisce gradualmente da ~ 1.500 complessi micron -2 (A) a ~ 700 micron complessi -2 (~ 15% RWC, C). In particolare, in condizioni asciutte (5 - 10% RWC), un po 'di PSII complessi organizzano in righe e matrici (D ed E, frecce). La freccia (E) segna il volto FP, con antenna LHCII che sembra essere organizzate anche in file, tra cui le righe PSII sarebbero stati trovati nei EF complementari. Per ulteriori informazioni su questi dati vedere 24. Barre di scala:. 100 nm Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Un esempio per la segmentazione del fotosistema II particelle. Usando il pacchetto open-source Fiji, complessi proteici possono essere segmentato dalle immagini con pochi passi (completare la procedura dettagliata trovato nella parte 4 della sezione Protocol). Immagini (A, immagine originale) sono sfocate con il filtro gaussiano (B); l'immagine viene thresholded utilizzando un auto esimo localestrumento reshold (C); l'immagine viene invertita e l'algoritmo bacino viene applicato per oggetti separati disponibili a stretto contatto (D); una regione di interesse viene selezionato e l'esterno è azzerato (E); particelle (all'interno di una gamma di dimensioni definito dall'utente) sono selezionati utilizzando la funzione di analizzatore di particelle. La maschera risultante è mostrato in (F). Le particelle vengono aggiunti al ROI Manager e sovrapposti su l'immagine originale (G) per verificare la presenza di errori o per le particelle difettosi o mancanti. L'elenco delle ROI può essere modificato manualmente, la sostituzione, la cancellazione o l'aggiunta di nuovi ROI, a seconda dei casi. La selezione finale utente modificato è mostrato in (H). Barra di scala:. 200 nm Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La tecnica descritta in questo documento permette di indagine di membrane freeze-fratturato nel contesto dei tessuti vegetali congelati alta pressione ben conservate mediante microscopia elettronica crio-scansione. Il principale vantaggio di utilizzare queste procedure è che la preparazione del campione è puramente fisica; non sono necessarie operazioni che coinvolgono sostanze chimiche o disidratazione. Quindi, consente lo studio delle strutture biologiche in uno stato quasi native 26,32. Il vantaggio di utilizzare tessuto fogliare è che si possono ottenere informazioni sulla organizzazione cellulare complessiva, così come membrane specifici studio, quali le membrane tilacoidi, nel loro contesto fisiologico nativo, cioè, nel cloroplasto. Un altro vantaggio, indispensabile per studiare C. piante pumilum a diversi contenuti di acqua relativi (RWC), è che il loro stato di idratazione non è alterato durante la preparazione. Questo è in contrasto con l'utilizzo cloroplasti isolati o membrane tilacoidi come materiale di partenzaper un esperimento di congelamento-frattura. In quest'ultimo, si deve anche tener conto che alcune alterazioni strutturali e / o supramolecolari probabilmente avvengono durante l'isolamento organello / membrana.
Utilizzo di campioni di tessuti vegetali, che sono relativamente spessa [> 50 - 100 micron, e può essere significativamente più spesso a seconda del tipo di tessuto e specie], impone l'uso di alta pressione congelamento (HPF) per vetrificazione campione. Applicazione di alta pressione [2.100 bar], in cui la temperatura di fusione dell'acqua è di circa -22 ° C, colpisce la rete di legami idrogeno dell'acqua tale che rallenta la velocità di formazione di cristalli di ghiaccio. Pertanto, la possibilità di ottenere un campione vetrificata è elevata anche a velocità di raffreddamento relativamente lente. HPF è attualmente l'unico metodo disponibile per la vetrificazione di spessore, ma non superiore a 200 micron, campioni. Un passo fondamentale per HPF dei tessuti vegetali è l'infiltrazione dei loro spazi aerei intercellulari con inerte4;. Riempimento dello spazio "prima del congelamento, per prevenire il collasso dei tessuti sotto la pressione alta (vedi recensioni 29,33) Nel caso di C. foglie pumilum, il cui spessore può essere fino a 1 mm, le foglie devono anche essere tagliato o diluito prima HPF.
In sostanza, la tecnica di preparazione replica 18 può essere applicato anche a congelare-fratturato tessuti fogliari. Tuttavia, nella nostra esperienza, rendimento sufficiente di aree fratturate intatte non è stato ottenuto, dal momento che le repliche spesso frammento piccoli pezzi. Inoltre, la ricerca di una regione specifica di interesse come cloroplasti può essere impraticabile entro repliche frammentata dei tessuti vegetali. Questo è principalmente perché mesofillo (fotosintesi) celle sono costituite da un grande vacuolo centrale circondata da una stretta striscia citoplasmatica (Figura 2A), che comprende il nucleo, cloroplasti e tutti gli altri organelli. Così, cloroplasti rappresentano solo una piccola frazione della superficie totale di fratturatatessuti mesofilo. Crio-SEM imaging campioni liofilizzati fratturato offre una soluzione a questo problema, poiché i campioni vengono visualizzati direttamente dopo frattura (e rivestimento / shadowing). Tuttavia, questo metodo soffre della limitazione che campioni congelati-idrato sono sensibili fascio e quindi la scansione ad alti ingrandimenti prontamente danneggia il campione alla prima scansione. Rivestimento a doppio strato (DLC) 27,28 offre una soluzione a questo grave inconveniente.
In DLC, campioni fratturati sono rivestiti in modo simile a come sono per la preparazione replica. Innanzitutto, uno strato sottile (1 - 3 nm) di Pt / C viene evaporato sul campione, fornendo contrasto e conducibilità. Questa è seguita da una spessa (5 - 10 nm), strato protettivo di carbonio. DLC combinata con una elevata tensione di accelerazione (10 kV) è stato usato per campioni dell'immagine utilizzando il segnale 28 elettroni retrodiffusi (BSE). Il segnale BSE, proveniente dallo strato di platino consente di ottenere informazioni superficie attraverso il carbonioe, eventualmente, strato contaminante vapore acqueo, che sono praticamente trasparente alla BSE con tensioni elevate accelerazioni (contaminazione dell'acqua accumula in esperimenti in cui una unità di trasferimento vuoto crio non viene utilizzato e la superficie fratturata è esposta all'atmosfera, anche se questo è per una frazione di secondo). Inoltre, l'imaging utilizzando il segnale BSE minimizzato il problema degli effetti che sono evidenti in secondaria rilevamento 27 elettroni (SE) ricarica. Con la messa a punto del microscopio qui descritto, l'imaging del segnale SE con l'In-lens detector SE a 10 kV fornito informazioni equivalente a quella che si ottiene quando i campioni sono stati rivestiti esclusivamente 2-3 nm di Pt / C e ripreso a basse tensioni di accelerazione. La differenza è che i campioni preparati da DLC e ripreso come descritto erano notevolmente meno fascio sensibile. Questo ci ha permesso di eseguire la scansione di loro ad alti ingrandimenti e in molti casi anche più volte, e ha permesso di ottenere informazioni preziose su supramolecul proteina fotosinteticaorganizzazione ar e altri costituenti cellulari (figure 2 - 4) 24.
Infine, le procedure qui descritte possono essere modificate per studiare l'organizzazione di strutture proteiche e / o membrana in altri tipi di campioni. Abbiamo impiegato con successo la tecnica per studiare l'organizzazione supramolecolare delle membrane fotosintetiche nelle cellule di cianobatteri e alghe (Shperberg-Avni et al. Dati non pubblicati). La considerazione principale è trovare l'equilibrio tra l'avere un campione più sottile possibile, al fine di aumentare la probabilità di vetrificazione, mantenendo integrità del campione. Per i diversi tipi di campioni, che possono essere sospensioni o tessuti animali / vegetali, di confezione deve essere utilizzato (ad esempio, in termini di tipo di piastrine utilizzate per alta pressione congelamento). Una volta riuscita crio-immobilizzazione è raggiunto, la combinazione di freeze-frattura, DLC e l'imaging crio-SEM offre un mezzo eccellente per ottenere informazioni sull'organizzazione proteina di membrana ad alto ingrandimento con danni fascio minimi.
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Acknowledgments
Ringraziamo Andres Kaech (Università di Zurigo) per i suoi consigli utili sulla scansione di immagini al microscopio elettronico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo Stati Uniti-Israele binazionale di ricerca agricola e lo sviluppo (concessione n. US-4334-10, ZR), la Israel Science Foundation (Grant n. 1034/12, ZR), e la Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013 ZR). Gli studi di microscopia elettronica sono stati condotti presso l'Irving e Cherna Moskowitz Center for Nano e Bio-Nano Imaging presso il Weizmann Institute of Science.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| Isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 Platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| High-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| High-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| Freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| Cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| Specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| Vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| Cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| Image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| Image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
References
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