Abstract
Real Time Polymerase Chain Reaction også kendt som kvantitativ PCR (q-PCR) er et meget anvendt værktøj i mikrobiel økologi at kvantificere gen mængderne af taksonomiske og funktionelle grupper i miljøprøver. Anvendes i kombination med en revers transkriptase reaktion (RT-Q-PCR), kan det også anvendes til at kvantificere gentranskripter. q-PCR gør brug af meget følsomme fluorescerende påvisningsmetoder kemier, der tillader kvantificering af PCR amplikoner under den eksponentielle fase af reaktionen. Derfor er fordomme forbundet med 'end-point' PCR detekteret i plateau fase af PCR-reaktionen undgås. En protokol til at kvantificere bakterielle 16S rRNA-generne og udskrifter fra kystsedimenter via real-time PCR er tilvejebragt. Først en fremgangsmåde til co-ekstraktion af DNA og RNA fra kystsedimenter, herunder de yderligere trin, der kræves til fremstilling af DNA-fri RNA, er skitseret. For det andet, en trin-for-trin guide til kvantificering af 16S rRNA-gener og transcripts fra de ekstraherede nukleinsyrer via q-PCR og RT-q-PCR er skitseret. Dette omfatter oplysninger om konstruktion af DNA og RNA standard kurver. Vigtige overvejelser for brug af RT-Q-PCR-analyser i mikrobiel økologi er inkluderet.
Introduction
Mikroorganismer er hjørnestenen i biosfæren kørsel økosystem funktion. Størstedelen af mikroorganismer fortsat uncultured 1. molekylære tilgange er derfor grundlæggende for at fremme vores forståelse af mangfoldighed og funktion af mikroorganismer i miljøet. Centralt for disse fremgangsmåder er udvinding af nukleinsyrer fra miljøprøver og den efterfølgende amplifikation af målgener ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR).
Det første trin af DNA / RNA-ekstraktion formål at lysere cellevæggene i det mikrobielle samfund stede, fjerne uønskede ikke-nukleinsyre-molekyler (fx organiske og uorganiske stoffer) og fastholde DNA / RNA i opløsning til længere nedstrøms analyse. Blandt flere muligheder i litteraturen 2,3,4,5, herunder en række kommercielle udvinding kits er Griffiths metode 6 bredt ansat 7,8,9. Det er omkostningseffektivt og particularly velegnet til sedimenter, som det anvender en perle-bankende trin at lysere celler og inkorporerer skridt til at minimere co-ekstraktion af PCR-inhibitorer, såsom humussyrer, og samtidig udvinding af DNA og RNA.
Det andet trin anvender polymerasekædereaktion (PCR) til at amplificere mål-gener, såsom 16S rRNA taksonomiske markering, fra de ekstraherede nukleinsyrer. Denne fremgangsmåde har og fortsætter med at gøre det lettere at udforskning af karakteriseret mikrobielle sorte boks 10,11. Imidlertid lider end-point PCR-baserede metoder fra forskellige begrænsninger, kan bias karakterisering af mikrobielle samfund 12. Til præcist at kvantificere genet / transcript mængderne skal realtids-PCR, også kendt som kvantitativ PCR (qPCR) anvendes. qPCR udnytter fluorescerende reporter farvestof systemer, der sporer amplicon akkumulation efter hver cyklus af PCR. Dette er væsentligt, da det betyder, at kvantificering kan forekomme under den tidlige eksponentielle fase, snarereend endepunkt, fase af PCR-reaktionen, når amplicon Udbyttet er stadig direkte proportional med den oprindelige overflod af målgenet.
To reportersystemer er almindeligt anvendt: en interkalaterende nukleinsyre pletten 13 og 5 '3' exonukleaseaktivitet af DNA-polymerasen 14. Da den tidligere reporter-system binder indistinctively til alle dobbeltstrenget DNA, kan det føre til en overvurdering af målsekvensen, hvis der opstår uønskede ikke-specifikke amplikoner eller primerdimerer af produkter. For at omgå dette, kan det være nødvendigt omfattende optimering af forstærkning. I sidstnævnte system er template amplifikation spores ved hjælp af en kombination af en 5'-nukleaseaktivitet af Taq-polymerase, som spalter en fluorofor fra en intern probe. Dette træk øger specificiteten af assayet på grund af anvendelsen af et fluorogent probe, som kun binder til det komplementære mål-specifikke sequence mellem primerparret. Med begge kemier kvantificering opnås ved at bestemme grænseovergang (Cp) når akkumuleringen af PCR amplikoner, som målt ved en stigning i fluorescens, er signifikant over baggrund fluorescens.
qPCR har været udbredt hos mikrobiel økologi til bestemmelse gen mængderne i forskellige miljøer 15. Endvidere er revers transkription af RNA til cDNA kombineret med qPCR og RT-qPCR at kvantificere genekspression. Derfor qPCR og RT-qPCR repræsenterer hurtige, effektive metoder til kvantificering af gen og / eller udskrift numre inden miljøprøver.
Mikroorganismer i kystnære sedimenter drive forskellige økosystemprocesser, herunder mineralisering af organisk stof, nedbrydningen af forurenende stoffer, og det biogeokemiske kredsløb af makronæringsstoffer som kvælstof 16,17,18. Den udtømmende forståelse af disse transformationer kræver en omfattende regnskabst af de medvirkende mikrobielle populationer, herunder kvantitative data om gen- og transcript mængderne. Her introducerer vi en række gennemtestede, strømlinede og standardiserede protokoller til kvantificering af bakterielle 16S rRNA-genet og afskrift mængderne i kystnære sedimenter. Protokollen skitserer prøveindsamling, samtidig DNA og RNA-ekstraktion, DNA-fri RNA-præparat, kvalitet kontrol af ekstraherede nukleinsyrer, generering af 16S rRNA-DNA og -RNA standarder og kvantificering af miljøprøver. Kvantitative data fra de metoder, der er beskrevet her, er der behov for at kaste lys over mikrobielle samfund kørsel kystnære økosystemer.
Protocol
1. DNA & RNA ekstraktion fra Marine kystsedimenter
- Fremstilling af ribonuklease (RNAse) -fri materiale og arbejdsområde
- Forbered RNAse-frit destilleret vand (dH 2 O) ved behandling med 0,1% diethylpyrocarbonat (DEPC) og inkuberes ved 37 ° CO / N. Fjerne resterende DEPC ved autoklavering dH2O ved 121 ° C i 15 min. Brug DEPC behandlet dH 2 O at gøre alle løsninger.
- Bag alle glasvarer ved 180 ° CO / N. Fjern plastlåg og fælge, suge dem i en opløsning af 2 M NaOH O / N, og skyl dem med DEPC behandlet dH 2 O før brug.
- Forbered en CTAB-Phosphatbufferopløsning som pr tabel 1.
- Forbered PEG-NaCl nedbør løsning som pr tabel 2.
- Rengør alle arbejdsflader (dvs. bænk, mikrocentrifuge, røg-hætte) og mikropipetter hjælp RNAse-dekontaminering løsning inden start. Brug handsker under hele proceduren. Brug RNAse-fri plastvarer sammen med mikropipette filter tips til at undgå prøve krydskontaminering.
- Miljø indsamling og opbevaring prøve
- Indsamle kystnære sedimenter under lavvande anvendelse af en steril 50 ml Falcon-rør fra de øverste 2,5 cm. Saml ca 15-20 g af sedimenter. Luk forsigtigt låget efter prøvetagningen. Transport straks til laboratoriet i en køler ved 4 ° C til øjeblikkelig behandling.
- Homogenisere prøven ved blanding med en steril spatel og alikvot 0,5 g vådvægt sediment i en 2 ml bead beating rør. Alikvote yderligere gentagelser, flash-freeze ved at placere i flydende kvælstof. Opbevar portioner ved -80 ° C. Forsigtig: Brug beskyttelseshandsker og beskyttelsesbriller ved håndtering af flydende nitrogen.
Bemærk: Hvis feltet webstedet ikke er placeret tæt på et laboratorium, portion 0,5 g sediment i 2 ml sterile mikrocentrifugerør på marken webstedet. Flash-fryse rørene ved at sætte dem straks i liquid nitrogen og transport til laboratoriet. Opbevar prøver ved -80 ° C indtil bearbejdning.
- Co-Ekstraktion af DNA og RNA fra sediment
Bemærk: Den følgende protokol er en modificeret version af Griffiths metode 6.- Tilføj 500 pi CTAB-phosphatpuffer og 500 pi phenol: chloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) til 2 ml perle-lyserende rør indeholdende 0,5 g sediment og vend røret 5-10 gange for at homogenisere prøven.
Advarsel: Udfør dette trin i en røg-hætte iført passende beskyttelsesudstyr (dvs., laboratoriekittel, handsker og beskyttelsesbriller) på alle tidspunkter. - Vortex ved fuld hastighed i 2,5 min. Centrifuger ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- I en røg-hætte udtrække det øverste vandige lag og overførsel til en ny 1,5 ml sterilt mikrocentrifugerør. Holde prøverne på is, tilsæt 500 pi iskold chloroform: isoamylalkohol (24: 1).
- Invert flere gange, indtil en emulsion er visible. Centrifuger i 10 minutter ved 16.000 xg ved 4 ° C.
- I en røg-hætte udtrække det øverste vandige lag og læg den i en ny 1,5 ml sterilt rør. Præcipitere nukleinsyrerne ved at tilføje to volumener 30% PEG NaCl-opløsning og bland godt.
- Der inkuberes på is i 2 timer eller lade prøver ved 4 ° CO / N.
- Ved slutningen af inkubering Centrifugér prøver ved 16.000 xg i 20 min ved 4 ° C.
Bemærk: En pellet kan være synlige ved bunden af røret. - Fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af en mikropipette, sørg for ikke at forstyrre bundfaldet. Efterlad omkring 10 pi PEG-opløsning i røret, og der tilsættes 1 ml iskold 70% ethanol.
- Centrifuger i 20 minutter ved 16.000 xg ved 4 ° C. Fjern langsomt ethanol med en mikropipette pas på ikke at røre pillen.
- Centrifuger i 5 sek og fjerne resterende ethanol ved hjælp af en mikropipette. Efterlad pelleten at lufttørre i ca. 5 min.
- Resuspender pellet i 50 pi DEPC-behandletH 2 O. Undersøge kvaliteten og udbyttet af DNA / RNA ved agarosegelelektroforese løber 5 pi på en 1% agarosegel 19. Opdel nukleinsyrer i to portioner, 15 pi til DNA og 30 pi for RNA.
- Opbevar DNA ved -80 ° C indtil brug. Isoler RNA som beskrevet i næste afsnit.
- Tilføj 500 pi CTAB-phosphatpuffer og 500 pi phenol: chloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) til 2 ml perle-lyserende rør indeholdende 0,5 g sediment og vend røret 5-10 gange for at homogenisere prøven.
2. Udarbejdelse af RNA og kvalitetskontrol af DNA-fri RNA
- Fordøjelse af DNA
- Tilsæt 3 pi DNAse I puffer og 1,5 pi DNAse I til 30 pi volumen af nukleinsyrer, inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
- Bland DNAse Inaktivering reagens ved hvirvelbehandling i 30 sek. Tilføj 4,8 ul af løsningen på prøven. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter, lejlighedsvis trykke bunden af rørene for at blande opløsningen.
- Centrifuger ved 10.000 xg i 90 sek ved RT, overføres supernatanten (RNA) i et nyt rør, pas på ikke at overføre bundfald, som kan hæmme efterfølgende reaktioner.
- kontrol RNA kvalitet
- Tilsæt 2 pi RNA til 18 pi sterilt RNAse-fri dH2O at fortynde 1:10.
- I separate PCR-reaktioner, tilsættes 1 ml af ublandet eller 1:10 fortynding af RNA til en steril 0,5 ml PCR-rør. Tilføj PCR reaktionskomponenter til amplifikation af 16S rRNA-genet som pr tabel 3. Omfatte en "positiv" (f.eks., DNA ekstraheret fra en ren bakteriekultur), en "PCR-inhibitor" kontrol (dvs. 1 pi positiv ren kultur DNA og 1 pi neat ekstraherede RNA) og en "negativ" kontrol med sterilt RNAse-fri dH 2 O.
- Indstil thermocycler med følgende amplifikation parametre: 95 ° C 5 min, (95 ° C 30 sek, 57 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min) x 35 cykler, 72 ° C 10 min.
- Kør 10% af PCR-produktet på en 1% agarosegel ved 85 V i 40 min. Gentag DNAse I behandling, hvis et PCR-produkt dannes i den miljømæssige RNA prøver.
- Tilsæt 2 pi RNA til 18 pi sterilt RNAse-fri dH2O at fortynde 1:10.
3. Frembringelse af første streng cDNA fra RNA
- Tilsæt reagenser som pr tabel 4 til en RNAse / DNAse fri 0,2 ml PCR-rør.
- Prøven inkuberes ved 65 ° C 5 min. Anbring på is i mindst 1 minut og derefter inkuberes ved 25 ° C i 10 minutter.
- Til det samme rør tilføje reagenserne er anført i tabel 5.
- Prøven inkuberes ved 55 ° C i 50 min. Inaktivere reaktionen ved 72 ° C i 10 min.
- Store cDNA ved -20 ° C indtil anvendelse.
4. Kvantitativ PCR
- Frembringelse af DNA standarder for qPCR
- Amplificere bakteriel 16S rRNA-sekvens 20 (eller enhver anden sekvens af interesse) fra genomisk DNA ekstraheret fra ren kultur med q-PCR-primere (1369F & 1492R 21).
- Oprens PCR-produkt under anvendelse af et kommercielt kit ifølge producentens instruktioner.
- Klon det oprensede PCRprodukt til en 3'-T overhæng kloningsvektor ifølge producentens anvisninger.
- Omdan vektoren indeholdende PCR indsætte i Escherichia coli JM109 kompetente celler ifølge producentens instruktioner.
- Plade 50 pi transformation onto ampicillin (100 ug / ml), X-gal (20 ug / ml) og IPTG (0,5 mM) Luria Bertani agar plader (trypton 10 g / l, gærekstrakt 5 g / l, NaCl 10 g / l, agar 15 g / l). Inkuber O / N ved 37 ° C.
- Vælg en enkelt positiv hvid transformant fra pladen. Inokulering af positive transformant i 50 ml LB-medium indeholdende 100 ug / ml ampicillin og inkuberes O / N rystning ved 250 rpm ved 37 ° C.
- Fra O / N-kulturen, isolere og oprense plasmidet under anvendelse af et kommercielt kit ifølge producentens instruktioner.
- Linearisere plasmidet under anvendelse af et passende restriktionsenzym, som kan skære plasmidet én gang (fx EcoRI).
- Bestemme koncentrationen af plasmid-DNA ved absorbans ved 260 nm ved anvendelse af et spektrofotometer 19.
Bemærkning: Alternativt kan nøjagtigheden af kvantificeringen forbedres ved anvendelse af et fluorescerende DNA-bindende farvestof anvendes i forbindelse med et fluorometer. - Sekvens plasmidet indsætte for at bekræfte størrelsen af målet i baser. Beregn mængden (dvs. procentdel) af insert-DNA i plasmidet (fx i en 3.000 bp vektor, en 123 bp DNA-fragment er 3,9% af den samlede DNA) og gange det med koncentrationen opnået i 4.1.10, for at bestemme DNA-koncentrationen af målet (indsæt).
- Brug følgende ligning til at beregne kopier af mål pr pi:
belastning / 54067 / 54067eq1.jpg "/> - Beregn Target Molekylvægt (TMW) ved at multiplicere antallet af basepar af mål-DNA ved gennemsnitlige molekylvægt af dobbeltstrenget DNA (dsDNA, 660 Dalton pr basepar).
- Fortynd mål-DNA'et i et område fra 10 10 til 10 2 kopier med 2 pi DNA og 18 pi sterilt dH 2 O. Bland hver fortynding godt og spin ned kortvarigt, før den næste fortynding.
- Dannelse af RNA standardkurve for qPCR
- Fra trin 4.1.5, screene et antal hvide kolonier (ca. 5) af koloni-PCR 19 under anvendelse af mål-reverse primer (dvs. R1492) og den forreste vektorplasmid primer M13F.
Bemærk: Denne kombination af primere vil amplificere inserter klonet i den korrekte sense-orientering med en T7-promotor opstrøms. - Oprens PCR-produkt under anvendelse af et kommercielt kit efter producentens anvisninger. Kvantificer det oprensede PCR-pRODUKTINFORMATION ved 260 nm ved anvendelse af et spektrofotometer.
- Tilsæt 200 ng PCR-produkt i et endeligt volumen på 20 pi med 7,5 mM af hver ribonukleotid, 1 T7 reaktionsbuffer og 1 T7 polymerase enzym til in vitro transcription reaktionen.
- Inkubér reaktionen i 4 timer ved 37 ° C. Tilsæt 1 enhed af RNase-fri DNase I til reaktionen, inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C for at fjerne DNA-templaten.
- Opsaml in vitro transskriberede RNA ved ethanoludfældning 19 og kvantificere RNA udbytter ved anvendelse af et fluorimeter eller ved absorbans ved 260 nm.
- Beregn transkript antal pr pi RNA. Tilsæt antal basepar i mål-RNA (fx 123 baser) til længden af T7-promotoren (153 baser) og ganges med den gennemsnitlige molekylvægt af RNA, 340 Dalton pr base.
- Tilføj 500 ng kvantificerede mål RNA til en revers transkriptase (RT) reaktion som beskrevet i afsnit 3. Serielt fortynde cDNA som beskrevet i 4.1.13 til brugsom standardkurven.
- Fra trin 4.1.5, screene et antal hvide kolonier (ca. 5) af koloni-PCR 19 under anvendelse af mål-reverse primer (dvs. R1492) og den forreste vektorplasmid primer M13F.
- Real-Time PCR
- Thaw miljømæssige DNA / cDNA prøver, standarder og qPCR reagenser på is. Beskytte det fluorogene probe mod lys.
- Fortynd standarderne for standardkurven som skitseret i 4.1.14. Lav 1:10 fortyndinger af den miljømæssige DNA / cDNA fra pæn til 10 -3 ved tilsætning af 2 pi prøve til 18 ul sterilt dH 2 O.
- Foretag en master mix reaktion til det samlede antal reaktioner plus 10% som pr tabel 6 (primere og probe) og tabel 7 (reaktionsblanding). Bland godt og kortvarigt centrifuge.
- Tilføj 19 pi mastermix og 1 pi template (standard, miljømæssig prøve eller vand til negativ kontrol) til hver brønd i en 96-brønds optiske qPCR plade. Udfør hver reaktion (standarder, miljøprøver og negative kontroller) i tre eksemplarer.
- Dæk 96-brønds plade med en Q-PCR optisk dækning. Centrifugeres pladen kortvarigt. Lægplade ind i varme- blok af qPCR maskinen og luk låget.
- Åbn qPCR Manager software. Klik på "protokol fanebladet", klik på "opret ny", tilføje følgende amplifikationsbetingelserne: 3 min 95 ° C, (10 sek 95 ° C, 30 sek 60 ° C) x 40 cykler. Indstil prøvevolumen til 20 pi, klik på "OK" og gemme protokollen.
- Klik på fanen "Plade". Under "Rediger valgte" klik "vælg fluorofor", tilføjer rapporten farvestof for passende sonde, fx fluorescein. Klik på "OK".
- Fremhæv brønde indeholdende standarderne, skal du vælge "standard" fra menuen "prøve type". Klik på "kopiere serien" at ændre "kopiere størrelse" til 3, klik på "anvendelse." Klik på "fortyndingsrække" for at tilføje beregnede start koncentration for standard 1, angiver fortyndingsfaktoren (10), skal du vælge "faldende" eller "stigende", afhængigt af ordren standardkurven blev tilføjettil pladen. Klik på "anvendelse."
- Fremhæv godt positioner indeholder de ukendte prøver, skal du vælge "ukendt" fra "prøve type" drop down menu. Klik på "kopiere serien", og ændre "kopiere størrelse" til 3. Klik på "anvendelse." Rediger prøve navne under "prøve navn". Gentag proceduren for kontroller uden skabelon (NTC) brønde.
- Klik på "OK" på pladen editor boksen og gem filen. Klik "start run".
- Ved afslutningen af kørslen vil dataanalyse vindue. Klik på "kvantificering fanen" for at vise standardkurven, standard curve deskriptorer (tabel 8) og forstærkning plots.
- Klik på "kvantificering data" fanen for Cp værdier og tilsvarende start mængde gen (SQ) af ukendte prøver. Eksport tabel til regneark software, hvis det kræves.
- Formere gen mængderne fra ukendte prøver med fortyndingsfaktoren for, mængden af sediment udvindeted fra og det totale volumen nukleinsyrer blev elueret i at opnå gen kopier per gram vådvægt sediment.
Bemærk: Elute DNA fra 0,5 g sediment i 50 pi fortyndet 1/10, tilsættes 1 pi som template til en Q-PCR-reaktion; beregne genkopier g -1 sediment ved multiplikation: genkopier pi DNA x fortyndingsfaktor x elueringsvolumen x 2.
Representative Results
Udvindingen af god kvalitet DNA og RNA fra sedimenter er det første skridt i at kvantificere gen og transcript mængderne. En vellykket ekstraktionsudbytterne klare DNA- og RNA bands som angivet i figur 1 for prøve AC, hvor skarpe 23S og 16S rRNA-båndene er synlige foruden det højmolekylære genomisk DNA-bånd.
Figur 1. DNA / RNA-ekstraktion. Typiske resultater fra DNA / RNA-ekstraktion fra tre eksemplarer (ABC) 0,5 g kystsedimenter. 5 pi DNA / RNA blev kørt på en 1,4% agarose ved 85 V i 40 min. En molekylær markør i 10,037-200 bp område blev brugt. Klik her for at se en større version af dette tal.
En qPCR reaktion protokol er skitseret målretning 16S rRNA-DNA. For 16S rRNA-transkripter erstatte standard cuRVE og skabelon med cDNA. Som ukendte prøver kvantificeres mod standardkurven, er det bydende nødvendigt at sikre, at standardkurven er af god kvalitet. Figur 2 viser fremstillingen af (A), standardkurver og miljømæssige DNA fortyndinger, (B), amplifikation af standardkurven og miljøprøver (C) omdannelse af standardkurve til en lineær regression og beregning af gen kopiantal. Når en 10 ganges fortynding serien er korrekt forberedt og forstærkes en 3,3 cyklus forskel mellem hver standard fortynding ses (det tager 3,3 cyklusser for en ti-dobling i skabelon på 100% forstærkning effektivitet) (figur 2Bi). Standardkurver deskriptorer, herunder R 2 værdier på 0,99 og PCR effektivitet inden for området fra 90 til 110% (figur 2C) er ønskede. Det er vigtigt at rapportere Cp værdier fra ingen skabelon kontrol (NTC), hvis tilstede. Hvis dette sker en Cp cutoff for standarder og ukendte prøver 3.3 cyklusser (<em> dvs en log fold) højere end Cp værdien af NTC pålægges 20 (figur 2Cii). Ukendt skabelon ekstraheret fra sediment DNA blev kvantificeret fra pæne, 10 -1, 10 -2 og 10 -3 fortyndinger (B). Den pæne prøve ikke uddybe, Cp værdier på 10 -1 til 10 -3 fortyndinger var 24,12, 26,02 og 28,40 henholdsvis. NTC Cp var 30,5, en NCT cutoff på 27,2 blev pålagt. Konvertering gen mængderne til g -1 våd vægt sediment resulterede i 2,5 x 10 7 og 7,1 x 10 7 til 10 -1 og 10 -2 henholdsvis fortyndingsområdet. 10 -3 fortynding Cp lå under NTC cutoff, og blev derfor ikke brugt. I dette tilfælde blev 10 -2 valgt som den optimale skabelon fortynding.
Figur 2. 16S rRNA-genet qPCR amplifikation af standarder og miljømæssige DNA ekstraheret fra kystsedimenter. Fremstilling af (A) i) DNA standardkurve og ii) miljømæssige DNA fortyndinger for qPCR amplifikation, (B) qPCR Amplifikation af i) DNA standardkurve og ii) miljøprøver, Cp for hver prøve er vist. (C) i) Lineær regression af standardkurve med standardkurve deskriptorer ii) beregning af gen forekomster fra miljøprøver. NTC:. Negativ Template Kontrol Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Beløb |
| CTAB | 5 g |
| K 2 HPO 4 x3H 2 O | 2,58 g |
| KH 2 PO 4 | 0,1 g |
| NaCl | 2,05 g |
| dH2O | op til 100 ml |
Tabel 1. Fremstilling af CTAB-phosphatpuffer.
| Reagens | Beløb |
| PEG 6000 | 30 g |
| NaCl | 9,35 g |
| dH2O | op til 100 ml |
| Bemærk: tilføj PEG 6000 langsomt under moderat opvarmning og omrøring af 50 ml dH 2 O. | |
Tabel 2. Fremstilling af PEG-NaCl udfældning opløsning.
| Reagens | Beløb |
| Ufortyndet RNA / 1:10 fortyndet RNA | 1,0 pi |
| 10x PCR-buffer | 5,0 pi |
| dNTP'er 10 mM | 1,0 pi |
| 63F fremadrettet primer | 1,0 pi |
| CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC | |
| 518R revers primer | 1,0 pi |
| ATT ACC GCG GCT GCT GG | |
| Taq-polymerase | 0,4 pi |
| RNAse-fri dH2O | 40,6 pi |
Tabel 3. DNA-fri RNA kvalitetskontrol PCR mester mix.
| Reagens | Beløb |
| RNA | 0,5-5 ug |
| dNTP'er 10 mM | 1 pi |
| Reverse primer 10 pM / vilkårlige hexamerer 50 uM | 1 pi |
| DEPC-H2O | Op til 13 pi |
Tabel 4. cDNA syntese reaktionsblanding A.
| Reagens | Beløb |
| Buffer 5x | 4 pi |
| DTT | 1 pi |
| RNAse Inhibitor | 1 pi |
| revers transkriptase | 1 pi |
Tabel 5. cDNA syntese reaktionsblanding B.
| Mål | Primer navn | sekvens | Annealing T (° C) | Reference |
| 16S rRNA bakterier | Bact1369F | CGG TGA ATA CGT TCY CGG | 56 | Suzuki et al. 2000 19. |
| Prok1492R | GGW TAC CTT GTT ACG ACT T | |||
| TM1389F (probe) | CTT GTA CAC ACC GCC CGT C |
| Reagens | Beløb |
| 2x Master Mix | 10 pi |
| Forward primer (10 uM) | 0,8 pi |
| Reverse primer (10 uM) | 0,8 pi |
| Probe (10 uM) | 0,4 pi |
| Vand | 7,0 pi |
| slutvolumen | 19 pi |
Tabel 7. Real time PCR-reaktionsblandingen.
| deskriptor | Betydning |
| Korrelationskoefficient (R 2) | Et mål for linearitet af standardkurven. Ideelt set bør det være R2 = 1. Værdi af R2 = 0,98-0,99 er acceptable. |
| Slope (α) | Et mål for reaktionseffektiviteten. Ideelt set skulle det svare til -3,32. Værdi i området mellem -3,58 og -3,1. |
| Effektivitet (= 10 (-1 / hældning) -1) | Hvis det er 100%, skabelonerne fordobles efter hver termisk cyklus under eksponentiel forstærkning. En god effektivitet er mellem 90 og 110%. |
| Y Intercept (β) | Den teoretiske grænse for påvisning af reaktionen. Selv om det ikke anvendes til at kvantificere reaktionen følsomhed, er det vigtigt, når man sammenligner forskellige standard kurver af det samme mål. |
Tabel 8. qPCR reaktion deskriptorer.
Discussion
Kombinationen af DNA / RNA-ekstraktion med qPCR tilbyder en hurtig, nøjagtig, relativt omkostningseffektiv fremgangsmåde til følsom kvantificering af gen- og transkript mængderne fra en række miljømæssige prøver, såsom kystsedimenter.
Den oprindelige nukleinsyre ekstraktion er det kritiske trin for at sikre en repræsentativ afbildning af den mikrobielle samfund foreliggende opnås 22. Skal overvejes til ekstraktionen protokol En række begrænsninger: a) opnåelse af total cellelyse, b) co-ekstraktion af inhibitoriske forbindelser (f.eks huminsyrer eller polyphenoler), c) kontaminerende DNA i RNA-fraktion, d) hurtig nedbrydning af ekstraherede nukleinsyrer ved opbevaring. Der skal træffes forholdsregler med henblik på at omgå disse begrænsninger. For eksempel, særlig omhu skal træffes for at sikre, at udvindingen af nukleinsyrer er optimeret til prøven (f.eks, sedimenter, jord, spildevand, etc.). Signifikante forbedringer i nukleinsyre udbytte og kvalitet til både DNA og RNA kan opnås ved at udføre indledende forsøg 23. For at minimere virkningen af inhibitoriske forbindelser på PCR-baserede applikationer 24, teste en række fortyndinger fra det ekstraherede DNA og RNA. For at omgå den hurtige nedbrydning af det ekstraherede DNA / RNA fra flere fryse-tø-cykler og undgå eventuelt tab af genetisk information, gemme flere små volumen alikvoter ved -80 ° C.
Når omhyggeligt designet, qPCR er en robust, meget reproducerbar og følsom metode. Især kan metoderne til forstærkning og standardkurve konstruktion er skitseret i denne protokol tilpasses til enhver gen mål af interesse, herunder andre fylogenetiske markører (dvs. arke 16S rRNA, svampe- 18S rRNA) eller gener involveret i vigtige funktioner i miljøet. Kendte begrænsninger i brugen af qPCR er: a) generering af reproducerbar høj kvalitet standard kurve for absolut kvantificering, b) valg af primer / sonder og optimering af q-PCR assay betingelser, c) brug af lav kvalitet / klippet nukleinsyrer, d) valget af den fortynding af DNA / RNA for at undgå hæmning . Desuden skal det overvejes, at qPCR teknik giver gen / udskrift mængderne, som ikke kan svare til celletal: Dette er især tilfældet, når 16S og 18S rRNA-generne er målrettet, da mikroorganismer har forskellige kopi numre af ribosomale gen i deres genom 25.
Dårlig kvalitet standardkurver vil resultere i unøjagtig kvantificering af genet af interesse. Det er god praksis at gemme et lager af høje koncentrationsstandarder i små portioner, hvorfra friske standardkurver kan gøres. Må ikke opbevares standardkurver, altid friske fortyndinger fra en bestand af den højeste koncentration hver gang. For nøjagtig kvantificering af miljøprøver sikrer række koncentrationer af den standard kurve spænder de forventede Cp værdier af de ukendte prøver. Når kvantificering transkripter, konstruere standardkurven fra RNA ikke dobbeltstrenget DNA. Når det er muligt, bør kvantificering af prøver, der skal direkte sammenlignes være afsluttet inden for et enkelt assay for at undgå inter-assay variation 20. Dette kan ikke altid være muligt. Derfor, for at sammenligne gen-mængderne genereret mellem analyser er det tilrådeligt at have en tilfældig delmængde af prøver replikeres mellem analyser. Et bredt udvalg af primer og probe sæt er i øjeblikket tilgængelig for qPCR målrette mikrobiel taxa og funktionelle grupper 15. Omhyggelig overvejelse er nødvendig, når du vælger disse for at sikre både maksimal dækning og specificitet for målgruppen. Hvis reaktionen effektiviteten af en qPCR assay er ikke tilfredsstillende, starter fejlfinding med at teste forskellige termisk cykling forhold (annealing tid og / eller temperatur) og / eller reaktionsbetingelser, fx varierende primer-probe-koncentrationer. Once Q-PCR assay og reaktionsbetingelserne optimeres, altid foretage en indledende test af en række DNA / cDNA fortyndinger at fastsætte en passende skabelon koncentration. Vælg fortyndingsområdet resulterer i den højeste kopiantal som den optimale skabelon fortynding for yderligere assays.
I øjeblikket, næste generation sekventering teknologier effektivt belyse mikrobielle samfund struktur og funktioner i et væld af miljøer 26,27,28. Men disse datasæt ofte baseret på end-point PCR amplicon biblioteker og giver derfor kun semi-kvantitative vurderinger af den overflod af særlig taxa. Derfor til evnen til real time PCR-baserede teknik målrette specifikke taksonomiske markører (fra højere domænet ned til stamme) giver mulighed for effektiv validering af de opnåede resultater ved næste generations sekventering. Desuden qPCR held har været anvendt i kombination med andre mikrobielle økologi molekylære metoder såsom stabil isoTope sondering (SIP) eller fylogenetiske / funktionelle mikroarrays. Kombineret med den tidligere værktøj, kan qPCR bruges til at kvantificere metabolisk aktive samfund 29,30. Når det kombineres med microarray analyse, qPCR giver nøglen kvantitativ fortolkning af fylogenetiske markør-baserede og funktionelle gen undersøgelser af miljøer 31,32.
Derfor anvendes enten alene eller i kombination med andre (ofte proces-baseret) vurderinger af økosystemets funktion, kvantitativ PCR er et vigtigt redskab for mikrobielle økologer i udforskningen af den undvigende forbindelse mellem mikrobielle samfund og økosystemfunktioner.
Acknowledgments
Denne publikation udgik fra forskning gennemført med økonomisk støtte fra Natural Environment Research Council (NERC) under tilskud nummer NERC NE / JO11959 / 1 og Science Foundation Ireland & Marie-Curie Action COFUND under Grant Number 11 / SIRG / B2159awarded til CJS og den østlige Academic Research Consortium (Eastern ARC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
| cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
| Chloroform : Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
| sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
| polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
| Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
| Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
| Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
| Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
| SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
| RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
| SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
| pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
| E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
| Tryptone | Sigma | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
| Ampicillin | Sigma | 59349 | |
| X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
| IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
| Agar | VWR | 20768.235 | |
| Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
| Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
| Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
| MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
| TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
| qPCR machine |
References
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Curr. Opin. Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).
- Zhou, J., Bruns, M. A., Tiedje, J. M. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 62, 316-322 (1996).
- Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., Ghiorse, W. C. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures from soil and sediments samples. Appl. Environ. Microbiol. 65 (11), 4715-4724 (1999).
- Burgmann, H., Pesaro, M., Widmer, F., Zeyer, J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods. 45 (1), 7-20 (2001).
- Hurt, R. A., et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4495-4503 (2001).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Martins, G., et al. Structure and activity of lacustrine sediment bacteria involved in nutrient and iron cycles. FEMS Microbiol. Ecol. 77 (3), 666-679 (2011).
- Kuffner, M., et al. Effects of season and experimental warming on the bacterial community in a temperate mountain forest soil assessed by 16S rRNA gene pyrosequencing. FEMS Microbiol. Ecol. 82 (3), 551-562 (2011).
- Tatti, E., et al. Influences of over winter conditions on denitrification and nitrous oxide-producing microorganism abundance and structure in an agricultural soil amended with different nitrogen sources. Agric. Ecosyst . Environ. 183, 47-59 (2014).
- Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L., Field, K. G. Genetic diversity in the Sargasso Sea bacterioplankton. Nature. 345, 60-62 (1990).
- Ward, D. W., Weller, R., Bateson, M. M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms a natural community. Nature. 345, 63-65 (1990).
- Suzuki, M. T., Giovannoni, S. J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixture of 16S rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62, 625-630 (1996).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22, 130-138 (1997).
- Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H. Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5' 3' Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase. PNAS. 88, 7276-7280 (1991).
- Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 2-20 (2009).
- Park, S. J., Park, B. J., Rhee, S. K. Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments. Extremphiles. 12 (4), (2008).
- Urakawa, H., Yoshida, T., Nishimura, M., Ohwada, K. Characterization of depth-related population variation in microbial communities of a coastal marine sediment using 16S rDNA-based approaches and quinone profiling. Environ. Microbiol. 2, 542-554 (2008).
- Smith, C. J., Dong, L. F., Wilson, J., Stott, A., Osborn, A. M., Nedwell, D. B. Seasonal variation in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia process rates and corresponding key functional genes along an estuarine nitrate gradient. Front. Microbiol. 6, 542 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. 205 (2001).
- Smith, C. J., Nedwell, D. B., Dong, L. F., Osborn, A. M. Evaluation of Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR) based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples. Environ. Microbiol. 8 (5), 804-815 (2006).
- Suzuki, M. T., Taylor, L. T. DeLong E.F., Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial population via 5'-nuclease assays. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4605-4614 (2000).
- Luna, G. M., Dell'Anno, A., Danovaro, R. DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments. Environ. Microbiol. 8 (2), 308-320 (2005).
- Lever, M. A., Torti, A., Eickenbursch, P., Michaud, A. B., Šantl-Temkiv, T., Jørgensen, B. B. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front. Microbiol. 6, 476 (2015).
- Lloyd, K. G., MacGregor, B. J., Teske, A. Quantitative PCR methods for RNA and DNA in marine sediments: maximizing yield while overcoming inhibition. FEMS Microbol. Ecol. 72, 144-151 (2010).
- Klappenbach, J. A., Dumbar, J. M., Schmidt, T. M. rRNA Operon copy number reflects ecological strategies of bacteria. App. Environ. Microbiol. 66 (4), 1328-1333 (2000).
- Shi, Y., Tyson, G. W., Eppley, J. M., DeLong, E. F. Integrated metatrascriptomic and metagenomics analyses of stratified microbial assemblages in the open ocean. ISME J. 5, 999-1013 (2011).
- Howe, A. C., Jansson, J. K., Malfatti, S. A. Tringe S.G., Tiedje J.M., & Brown C.T. Tackling soil diversity with the assembly of large, complex metagenomes. PNAS. 111 (13), 4904-4909 (2014).
- Klaedtke, S., et al. Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages. Environ. Microbiol. , (2015).
- Lueders, T., Wagner, B., Claus, P., Friedrich MW, Stable isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi and protozoa in oxic rice field soil). Environ. Microbiol. 6, 60-72 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Bürgmann, H., et al. Transcriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate (DMSP). Environ. Microbiol. 9 (11), 2742-2755 (2007).
- He, J. Z., et al. Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes. ISME J. 1, 67-77 (2007).
