Abstract
Real-time PCR ook bekend als kwantitatieve PCR (Q-PCR) is een veel gebruikt instrument microbiële ecologie gen abundanties van taxonomische en functionele groepen in milieumonsters te kwantificeren. Gebruikt in combinatie met een reverse transcriptase reactie (RT-Q-PCR) kan ook worden gebruikt om gentranscripten kwantificeren. Q-PCR maakt gebruik van zeer gevoelige fluorescentiedetectie chemie die kwantificatie van PCR amplicons mogelijk te maken tijdens de exponentiële fase van de reactie. Daarom is de vooroordelen geassocieerd met "eindpunt" PCR gedetecteerd in de plateaufase van de PCR-reactie worden vermeden. Een protocol om bacteriële 16S rRNA genen en transcripten kustsedimenten kwantificeren via real-time PCR is aangebracht. Eerst wordt een werkwijze voor de co-extractie van DNA en RNA uit kustsedimenten, inclusief de aanvullende stappen voor de bereiding van DNA-vrije RNA wordt geschetst. Ten tweede, een stap-voor-stap voor de kwantificering van 16S rRNA genen en transcripts van de geëxtraheerde nucleïnezuren via Q-PCR en RT-Q-PCR is beschreven. Dit omvat informatie voor de constructie van DNA en RNA standaard curves. Essentiële aspecten voor het gebruik van RT-Q-PCR assays microbiële ecologie opgenomen.
Introduction
Micro-organismen zijn de hoeksteen van de biosfeer rijden ecosysteemfunctie. De meeste micro-organismen blijven uncultured 1. Daarom moleculaire gebaseerde benaderingen zijn fundamenteel voor ons begrip van de diversiteit en de functie van micro-organismen in het milieu te bevorderen. Centraal in deze werkwijzen het extraheren van nucleïnezuren uit milieumonsters en de daaropvolgende amplificatie van doelgenen met behulp van de Polymerase Chain Reaction (PCR).
De eerste stap van DNA / RNA-extractie beoogt de celwanden van de microbiële gemeenschap onderhavige lyseren verwijderen ongewenste niet-nucleïne- zuurmoleculen (bijvoorbeeld organische en anorganische stoffen) en bewaar DNA / RNA in oplossing stroomafwaarts analyse. Tussen verschillende opties beschikbaar in de literatuur 2,3,4,5, waaronder diverse commerciële extractie kits wordt de werkwijze Griffiths 6 wijd toegepast 7,8,9. Het is kosteneffectief en particularly zeer geschikt voor sedimenten gebruikt een kraal slaan stap lyseren en neemt maatregelen om de co-extractie van PCR remmers, zoals humuszuren minimaliseren en tegelijkertijd terugwinnen van DNA en RNA.
De tweede stap maakt gebruik van de polymerasekettingreactie (PCR) om doelwitgenen, zoals de 16S rRNA taxonomische marker amplificeren, uit de geëxtraheerde nucleïnezuren. Deze aanpak heeft en blijft de verkenning van de uncharacterized microbiële black box 10,11 vergemakkelijken. Echter eindpunt PCR-gebaseerde methoden lijden aan verschillende beperkingen die kunnen vertekening van de karakterisering van microbiële gemeenschappen 12. Exact te kwantificeren gen / transcript abundanties moet real-time PCR, ook bekend als kwantitatieve PCR (qPCR) worden gebruikt. qPCR exploiteert fluorescente reporter kleurstof systemen amplicon accumulatie volgen na iedere cyclus van de PCR. Dit is belangrijk omdat daaruit kwantificering kan optreden tijdens de vroege exponentiële fase plaatsdan het eindpunt, fase van de PCR reactie, wanneer het amplicon opbrengst nog recht evenredig met de aanvankelijke overvloed van het doelwitgen.
Twee reportersystemen worden gewoonlijk gebruikt: een intercalerende nucleïnezuur vlek 13 en de 5 '3' exonuclease activiteit van het DNA polymerase 14. Aangezien de eerste reporter systeem indistinctively bindt aan alle dubbelstrengs DNA, kan dit leiden tot een overschatting van de doelsequentie als ongewenste niet-specifieke amplicons of primer dimeren bijproducten ontstaan. Om dit te omzeilen, kunnen uitgebreide optimalisering van amplificatie vereist. In het laatste systeem is sjabloon amplificatie gevolgd door een combinatie van een 5 'nuclease activiteit van Taq polymerase die splitst een fluorofoor vanuit een interne probe. Deze eigenschap verhoogt de specificiteit van de assay door het gebruik van een fluorogene sonde dat alleen bindt aan het complementaire doelwit-specifieke sequencere tussen het primerpaar. Met beide soorten verbindingen kwantificering wordt bereikt door het bepalen kruising punt (Cp) indien de accumulatie van PCR amplicons, zoals gemeten door een toename in fluorescentie, aanzienlijk boven achtergrondfluorescentie.
qPCR is uitgebreid gebruikt in microbiële ecologie gen abondantie bepalen in verschillende omgevingen 15. Bovendien wordt reverse transcriptie van RNA in cDNA gecombineerd met qPCR en RT-qPCR genexpressie te kwantificeren. Vandaar qPCR en RT-qPCR geven snelle, effectieve werkwijzen voor de kwantificering van genen en / of transcript nummers binnen milieumonsters.
Micro-organismen in kustsedimenten rijden diverse ecosysteem processen, met inbegrip van de mineralisatie van organische stof, de afbraak van verontreinigende stoffen en de biogeochemische cycli van macronutriënten zoals stikstof 16,17,18. Het volledige begrip van deze transformaties vereist een uitgebreide account van de bijdragende microbiële populaties, met inbegrip van kwantitatieve gegevens over gen en transcript abundanties. Hier introduceren we een reeks grondig getest, gestroomlijnde en gestandaardiseerde protocollen voor het kwantificeren van bacteriële 16S rRNA-gen en transcript abundanties in kustsedimenten. Het protocol beschrijft monstername, gelijktijdige DNA en RNA-extractie, DNA-RNA vrij voorbereiding, kwaliteitscontrole van de afgezogen nucleïnezuren, het genereren van 16S rRNA-DNA en RNA normen en kwantificering van milieu-monsters. Kwantitatieve gegevens afkomstig van de hier beschreven methoden nodig om licht te werpen op de microbiële gemeenschappen rijden kustecosystemen.
Protocol
1. DNA en RNA-extractie van Marine kustsedimenten
- Voorbereiding van de ribonuclease (RNAse) -vrij materiaal en werkruimte
- Bereid RNAse-vrij gedistilleerd water (dH 2 O) door behandeling met 0,1% diethylpyrocarbonaat (DEPC) en incubeer bij 37 ° CO / N. Resten DEPC autoclaaf dH 2 O bij 121 ° C gedurende 15 minuten. Gebruik DEPC behandeld dH 2 O om alle oplossingen te maken.
- Bak al het glaswerk op 180 ° CO / N. Verwijder plastic deksels en velgen drenken in een oplossing van 2 M NaOH O / N en afspoelen met DEPC behandeld dH 2 O voor gebruik.
- Bereid een CTAB-fosfaat bufferoplossing volgens tabel 1.
- Bereid de PEG-NaCl neerslag oplossing per tabel 2.
- Reinig alle werkvlakken (dat wil zeggen, bank, microcentrifuge, fume-kap) en micropipetten met behulp van RNAse-ontsmetten oplossing alvorens te beginnen. Draag handschoenen tijdens de gehele procedure. Gebruik RNAse-vrij plasticware samen met micropipet filter tips om monster kruisbesmetting te voorkomen.
- Milieu monstername en opslag
- Verzamel de kust sediment tijdens eb met een steriele 50 ml falcon buis vanaf de top 2,5 cm. Verzamel ongeveer 15-20 g sedimenten. Voorzichtig sluit het deksel na de monsterneming. Onmiddellijk naar het laboratorium in een koeler bij 4 ° C voor onmiddellijke verwerking.
- Homogeniseren van het monster door het mengen met een steriele spatel en portie 0,5 g nat gewicht sediment in een 2 ml kraal kloppend buis. Aliquot extra replica's, flash-vries door het plaatsen in vloeibare stikstof. WINKEL aliquots bij -80 ° C. Let op: Draag beschermende handschoenen en een veiligheidsbril bij het hanteren van vloeibare stikstof.
Let op: Als het veld site is niet dicht bij een laboratorium, portie 0,5 g sediment in 2 ml steriele microcentrifugebuizen op het veld plaats. Flash-bevriezing van de buizen door te zetten onmiddellijk in liquid stikstof en transport naar het laboratorium. WINKEL monsters bij -80 ° C tot bewerking.
- Co-extractie van DNA en RNA uit sediment
Opmerking: Het volgende protocol is een gemodificeerde versie van de werkwijze Griffiths 6.- Voeg 500 ul CTAB-fosfaat buffer en 500 pl fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) aan de 2 ml hiel-lyserende buis met 0,5 g sediment en keer de buis 5-10 keer het monster gehomogeniseerd.
Let op: Voer deze stap in een rook-hood het dragen van beschermende kleding (dat wil zeggen, laboratorium jas, handschoenen en een veiligheidsbril) te allen tijde. - Vortex op volle snelheid gedurende 2,5 min. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- In een rook-hood te extraheren de bovenste waterlaag en over te dragen aan een nieuwe 1,5 ml steriel microcentrifugebuis. Het houden van de monsters op ijs, voeg 500 ul ijskoude chloroform: isoamylalcohol (24: 1).
- Omdraaien meerdere keren totdat een emulsie is visible. Centrifugeer 10 minuten bij 16.000 xg bij 4 ° C.
- In een rook-hood te extraheren de bovenste waterlaag en plaats deze in een nieuwe 1,5 ml steriele buis. Precipitaat de nucleïnezuren door twee volumes van 30% PEG-NaCl-oplossing en meng goed.
- Incubeer op ijs gedurende 2 uur en laat monsters bij 4 ° CO / N.
- Aan het einde van de incubatie centrifuge monsters bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
Opmerking: Een tablet kan zichtbaar zijn op de bodem van de buis. - Verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een micropipet, zorg ervoor dat de pellet niet te verstoren. Laat ongeveer 10 pl PEG-oplossing in de buis en voeg 1 ml ijskoude 70% ethanol.
- Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 16.000 xg bij 4 ° C. Verwijder langzaam ethanol met een micropipet verzorgen de pellet niet aan te raken.
- Centrifugeren gedurende 5 seconden en verwijder de resterende ethanol met behulp van een micropipet. Laat de pellet aan de lucht drogen gedurende ongeveer 5 min.
- Resuspendeer de pellet in 50 pl DEPC-behandeldH 2 O. Onderzoek de kwaliteit en opbrengst van DNA / RNA door agarosegelelektroforese draait 5 ui op een 1% agarosegel 19. Verdeel de nucleïnezuren in twee porties, 15 ul voor DNA en 30 ul van RNA.
- Bewaar de DNA bij -80 ° C totdat het nodig is. Isoleer RNA zoals beschreven in het volgende gedeelte.
- Voeg 500 ul CTAB-fosfaat buffer en 500 pl fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) aan de 2 ml hiel-lyserende buis met 0,5 g sediment en keer de buis 5-10 keer het monster gehomogeniseerd.
2. Voorbereiding van RNA en kwaliteitscontrole van DNA-vrij RNA
- Vertering van DNA
- Voeg 3 ul van DNAse I buffer en 1,5 ul DNAse I 30 gl volume van nucleïnezuren, incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Meng de DNAse inactivatie reagens door vortexen gedurende 30 sec. Voeg 4,8 ul van de oplossing van het monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min, tikt af de bodem van de buizen om de oplossing te mengen.
- Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 90 seconden bij kamertemperatuur, breng de supernatant (RNA) in een nieuwe buis, zonder hierbij neerslag stroomafwaartse reacties kunnen remmen overbrengen.
- RNA kwaliteitscontrole
- Voeg 2 pl RNA tot 18 ui steriel RNAse-vrij dH 2 O verdund 1:10.
- In afzonderlijke PCR-reacties, voeg 1 pl onverdund of 1:10 verdunning van RNA naar een steriele 0,5 ml PCR buis. Voeg PCR reactiecomponenten het 16S rRNA-gen amplificeren volgens Tabel 3. Neem een "positieve" (bijv., DNA geëxtraheerd uit een zuivere bacteriecultuur), een "PCR inhibitor" control (dwz, 1 ui positieve reincultuur DNA en 1 pl nette geëxtraheerde RNA) en een 'negatieve' controle van de steriele RNAse-vrij dH 2 O.
- Stel de thermocycler met de volgende amplificatie parameters: 95 ° C 5 min (95 ° C 30 sec, 57 ° C 30 sec, 72 ° C 1 minuut) x 35 cycli, 72 ° C 10 min.
- Run 10% van het PCR product op een 1% agarose gel bij 85 V gedurende 40 min. Herhaal de DNAse I behandeld als een PCR product wordt gevormd in het milieu RNEen samples.
- Voeg 2 pl RNA tot 18 ui steriel RNAse-vrij dH 2 O verdund 1:10.
3. Productie van First Strand cDNA uit RNA
- Voeg de reagentia volgens tabel 4 een RNAse / DNase vrij 0,2 ml PCR buis.
- Incubeer het monster bij 65 ° C 5 min. Plaats op ijs gedurende ten minste 1 minuut en vervolgens geïncubeerd bij 25 ° C gedurende 10 minuten.
- Om dezelfde buis voeg de in tabel 5 genoemde reagentia.
- Incubeer het monster bij 55 ° C gedurende 50 min. Inactiveren de reactie bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
- cDNA bewaar bij -20 ° C tot gebruik.
4. Kwantitatieve PCR
- Vorming van DNA standaarden voor qPCR
- Amplify bacteriële 16S rRNA sequentie 20 (of een andere sequentie van belang) uit genomisch DNA geëxtraheerd uit reincultuur met Q-PCR-primers (1369F en 1492R 21).
- Zuiver het PCR product met een commerciële kit volgens instructies van de fabrikant.
- Kloon het gezuiverde PCRproduct in een 3'-T overhang kloneringsvector volgens instructies van de fabrikant.
- Transformeer de vector die het PCR voegen in Escherichia coli JM109 competente cellen volgens de instructies van de fabrikant.
- Plaat 50 pl transformatie op ampicilline (100 ug / ml), X-gal (20 ug / ml) en IPTG (0,5 mM) Luria Bertani agar platen (trypton 10 g / l, gistextract 5 g / l, NaCl 10 g / L, agar 15 g / l). Incubeer O / N bij 37 ° C.
- Selecteer een enkele positieve witte transformant van de plaat. Beënt de positieve transformant in 50 ml LB-bouillon die 100 ug / ml ampicilline en geïncubeerd O / N schudden bij 250 rpm bij 37 ° C.
- Van de O / N kweek, isoleren en zuiveren het plasmide met behulp van een commerciële kit volgens instructies van de fabrikant.
- Lineariseren het plasmide met een geschikt restrictie-enzym dat in staat is te snijden zodra het plasmide (bijvoorbeeld EcoRI) is.
- Bepaal de concentratie van plasmide-DNA door absorptie bij 260 nm met een spectrofotometer 19.
Opmerking: Als alternatief kan de nauwkeurigheid van kwantificering worden verbeterd door toepassing van een fluorescerende DNA-bindende kleurstof in combinatie met een fluorometer. - Sequentie het plasmide in te voegen om de grootte van het doel bases bevestigen. Bereken de hoeveelheid (dat wil zeggen percentage) van insert-DNA in het plasmide (bijvoorbeeld in een 3000 bp vector, een 123 bp DNA-fragment 3,9% van totaal DNA) en vermenigvuldigen met de concentratie verkregen in 4.1.10, het bepalen DNA-concentratie van het doel (insert).
- Gebruik de volgende vergelijking om de kopieën van target per pi te berekenen:
load / 54067 / 54067eq1.jpg "/> - Bereken de Target molecuulgewicht (TMW) van het aantal basenparen van het doelwit DNA te vermenigvuldigen met het gemiddelde molecuulgewicht van dubbelstrengs DNA (dsDNA, 660 Daltons per basepaar).
- Verdun het doelwit DNA in een traject van 10 oktober-10 februari kopieën met 2 pl DNA en 18 pl steriel dH 2 O. Meng elke verdunning goed en spin down kort voordat de volgende verdunning.
- Genereren van RNA standaardcurve voor qPCR
- Van stap 4.1.5, het screenen van een aantal witte kolonies (ongeveer 5) door kolonie PCR 19 met behulp van het doel reverse primer (dwz R1492) en de voorwaartse vector plasmide primer M13F.
Opmerking: Deze combinatie van primers inserts gekloneerd in de juiste sense oriëntatie met een T7-promoter stroomopwaarts amplificeren. - Zuiver het PCR product met een commerciële kit volgende instructies van de fabrikant. Kwantificeren van de gezuiverde PCR product bij 260 nm met een spectrofotometer.
- Voeg 200 ng PCR-product in een eindvolume van 20 ui met 7,5 mM van elke ribonucleotide, 1 T7 reactiebuffer en 1 T7 polymerase enzym voor de in vitro transcriptiereactie.
- Incubeer de reactie gedurende 4 uur bij 37 ° C. Voeg 1 eenheid RNase-vrij DNase I bij de reactie incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C om DNA template te verwijderen.
- Herstel de in vitro getranscribeerde RNA door ethanolprecipitatie 19 en kwantificeren RNA opbrengst met behulp van een fluorimeter of door absorptie bij 260 nm.
- Bereken transcript aantal per ul van RNA. Voeg het aantal basenparen in het doel-RNA (bijvoorbeeld 123 basen) aan de lengte van de T7 promoter (153 basen) en te vermenigvuldigen met het gemiddelde molecuulgewicht van RNA, 340 Dalton per basisstation.
- Voeg 500 ng gekwantificeerde doel-RNA een reverse transcriptase (RT) reactie zoals beschreven in hoofdstuk 3 Serieel te verdunnen het cDNA zoals beschreven in 4.1.13 voor gebruikde standaardcurve.
- Van stap 4.1.5, het screenen van een aantal witte kolonies (ongeveer 5) door kolonie PCR 19 met behulp van het doel reverse primer (dwz R1492) en de voorwaartse vector plasmide primer M13F.
- Real-time PCR
- Dooi milieu DNA / cDNA monsters, normen en qPCR reagentia op ijs. Bescherm de fluorogene sonde tegen licht.
- Verdun de normen voor de standaardkromme zoals in 4.1.14. Voeg 1:10 verdunningen van het milieu DNA / cDNA uit netjes -3 10 door toevoeging van 2 pi monster 18 uit steriel dH 2 O.
- Voeg een master mix reactie voor het totale aantal reacties plus 10% volgens tabel 6 (primers en probe) en Tabel 7 (reactiemengsel). Meng goed en kort centrifuge.
- Voeg 19 ul van hoofdmengsel en 1 ul matrijs (standaard milieumonster of water negatieve controle) aan elk putje in een 96-well optische plaat qPCR. Voer elke reactie (normen, milieu-monsters en negatieve controles) in drievoud.
- Bedek de 96-well plaat met een Q-PCR Optiekkap. Centrifugeer kort de plaat. Laad deplaat in de verwarming blok van de qPCR machine en sluit het deksel.
- Open de qPCR manager software. Klik op het tabblad "protocol", klikt u op "nieuwe", voegt u de volgende voorwaarden versterking: 3 min 95 ° C, (10 sec 95 ° C, 30 sec 60 ° C) x 40 cycli. Stel monstervolume tot 20 pl, klikt u op "OK" en sla het protocol.
- Klik op het tabblad "Plate". Onder "Edit geselecteerd" klik "te selecteren fluorofoor", voegt het rapport kleurstof voor een passende sonde, bijvoorbeeld, fluoresceïne. Klik op "OK".
- Markeer putjes die de normen, selecteer "standaard" in het menu "type sample". Klik op "repliceren serie" te veranderen "repliceren size" tot en met 3, klikt u op "toepassen". Klik op "verdunningsreeks" naar berekende startpunt concentratie voor standaard 1 toe te voegen, geven de verdunningsfactor (10), selecteer "afnemende" of "steeds meer", afhankelijk van de volgorde waarin de standaard curve werd toegevoegdaan de plaat. Klik op "Apply".
- Markeer ook posities die de onbekende monsters, selecteer "onbekende" van het "type sample" drop down menu. Klik op "repliceren series", en verander "repliceren size" naar 3. Klik op "toepassen". Bewerk sample namen onder "sample name". Herhaal deze procedure voor No Template Controls (NTC) putten.
- Klik op "OK" op het bord editor doos en save file. Klik op "start run".
- Na afloop van de termijn, zal de data-analyse te openen. Klik "kwantificering tab" met de standaardkromme, standaardcurve descriptors (Tabel 8) en amplificatie plots weergegeven.
- Klik op het tabblad "kwantificering data" voor Cp waarden en de bijbehorende start hoeveelheid gen (SQ) van onbekende monsters. Export tabel naar spreadsheet software, indien nodig.
- Vermenigvuldigen gen abundanties van onbekende monsters met de verdunningsfactor, de hoeveelheid sediment winningted van de totale nucleïnezuren werden geëlueerd bij genkopieën per gram natgewicht sediment verkrijgen.
Opmerking: Elueer DNA van 0,5 g sediment in 50 gl verdund 1/10, voeg 1 pl als matrijs een Q-PCR reactie; berekenen gen kopieën g -1 sediment door vermenigvuldiging van: gen kopieën pl DNA x verdunningsfactor x elutievolume x 2.
Representative Results
De extractie van goede kwaliteit DNA en RNA van sedimenten is de eerste stap bij het kwantificeren gen en transcript abundanties. Een succesvolle uitmaling duidelijk DNA en RNA banden zoals in figuur 1 voor monster AC, waarbij scherpe 23S en 16S rRNA banden zichtbaar bovenop de hoogmoleculair genomisch DNA moleculaire band.
Figuur 1. DNA / RNA-extractie. Typische resultaten van DNA / RNA-extractie uit drievoud (ABC) 0,5 g kustsedimenten. 5 pl DNA / RNA werd op een 1,4% agarose bij 85 V gedurende 40 min. Een moleculaire marker in de 10,037-200 bp assortiment werd gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een qPCR reactie protocol geschetst gericht 16S rRNA DNA. Voor 16S rRNA transcripten vervangen standaard curve en sjabloon met cDNA. Onbekende monsters gekwantificeerd met de standaard curve, is het noodzakelijk dat de standaardcurve van goede kwaliteit. Figuur 2 toont de bereiding van (A), standaard curves en milieu DNA verdunningen, (B) amplificatie van de standaardcurve en milieumonsters (C) omzetting van standaardcurve een lineaire regressie en berekening van genkopie getallen. Wanneer een 10-voudige verdunningsreeks correct bereid en geamplificeerd een 3,3 cyclus verschil tussen elke standaardverdunning wordt gezien (duurt 3,3 cycli een tienvoudige toename van template op 100% amplificatie-efficiëntie) (figuur 2BI). Standaardcurven descriptoren, waaronder de R 2-waarden van 0,99 en PCR efficiëntie in het traject van 90-110% (figuur 2C) gewenst. Het is belangrijk te melden Cp waarden van de template- control (NTC) indien aanwezig. Als dit gebeurt een Cp cutoff voor normen en onbekende monsters 3,3 cycli (<em> dwz een log maal) hoger dan de Cp waarde van de NTC wordt opgelegd 20 (figuur 2Cii). Onbekend template geëxtraheerd uit sediment DNA werd gekwantificeerd uit nette, 10 -1, -2 10 en 10 -3 verdunningen (B). De nette monster niet te versterken, de Cp waarden van 10 -1 tot 10 -3 verdunningen waren respectievelijk 24,12, 26,02 en 28,40. De NTC Cp was 30,5, een NCT cutoff van 27,2 werd opgelegd. Het omzetten van gen abundances om g -1 vers gewicht sediment resulteerde in 2,5 x 10 7 en 7,1 x 10 7 voor 10 -1 en -2 10 respectievelijk voor de verdunning range. 10 -3 verdunning Cp lager was dan de NTC cutoff, en werd daarom niet gebruikt. In dit geval 10 -2 werd gekozen als de optimale verdunning matrijs.
Figuur 2. 16S rRNA gen QPCR amplificatie van normen en milieu DNA geëxtraheerd uit kustsedimenten. Bereiding van (A) i) DNA standaardcurve en ii) milieu DNA verdunningen voor qPCR amplificatie (B) amplificatie van qPCR i) DNA standaardcurve en ii) milieumonsters, Cp voor elk monster zijn weergegeven. (C) i) lineaire regressie van standaardcurve met standaardkromme beschrijvende ii) berekening van gen dichtheden van milieumonsters. NTC:. Negatieve Template controle Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagens | Bedrag |
| CTAB | 5 g |
| K 2 HPO 4 x3H 2 O | 2,58 g |
| KH 2 PO 4 | 0,1 g |
| NaCl | 2,05 g |
| dH 2 O | tot 100 ml |
Tabel 1. Bereiding van CTAB-fosfaatbuffer.
| Reagens | Bedrag |
| PEG 6000 | 30 g |
| NaCl | 9.35 g |
| dH 2 O | tot 100 ml |
| Opmerking: voeg PEG 6000 langzaam onder matig verwarmen en roeren van 50 ml dH 2 O. | |
Tabel 2. Bereiding van PEG-precipitatie NaCl oplossing.
| Reagens | Bedrag |
| Onverdund RNA / 1:10 verdund RNA | 1,0 gl |
| 10x PCR Buffer | 5,0 pl |
| 10 mM dNTP's | 1,0 gl |
| 63F voorwaartse primer | 1,0 gl |
| CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC | |
| 518R reverse primer | 1,0 gl |
| ATT ACC GCG GCT GCT GG | |
| Taq-polymerase | 0,4 pl |
| RNAse-vrij dH 2 O | 40,6 pl |
Tabel 3. DNA-vrije RNA kwaliteit te controleren PCR master mix.
| Reagens | Bedrag |
| RNA | 0,5-5 ug |
| 10 mM dNTP's | 1 pi |
| Reverse primer 10 uM / willekeurige hexameren 50 uM | 1 pi |
| DEPC-H 2 O | Tot 13 gl |
Tabel 4. cDNA synthese reactiemengsel A.
| Reagens | Bedrag |
| buffer 5x | 4 gl |
| DTT | 1 pi |
| RNAse Inhibitor | 1 pi |
| Reverse Transcriptase | 1 pi |
Tabel 5. cDNA synthese reactiemengsel B.
| Doel | primer naam | Volgorde | Gloeien T (° C) | Referentie |
| 16S rRNA bacteriën | Bact1369F | CGG TGA ATA CGT TCY CGG | 56 | Suzuki et al. 2000 19 |
| Prok1492R | GGW TAC CTT GTT ACG ACT T | |||
| TM1389F (sonde) | CTT GTA CAC ACC GCC CGT C |
| Reagens | Bedrag |
| 2x Master Mix | 10 gl |
| Voorwaartse primer (10 uM) | 0,8 pl |
| Reverse primer (10 uM) | 0,8 pl |
| Sonde (10 uM) | 0,4 pl |
| Water | 7,0 pl |
| eindvolume | 19 ul |
Tabel 7. Real time PCR-reactiemengsel.
| descriptor | Betekenis |
| Correlatiecoëfficiënt (R2) | Een maat voor de lineariteit van de standaardcurve. Liefst moet zijn R 2 = 1. Waarde van R 2 = 0,98-0,99 aanvaardbaar zijn. |
| Helling (α) | Een maat voor de reactie-efficiëntie. Idealiter moet dan ook dezelfde -3,32 worden. Waarde in het gebied tussen -3,58 en -3,1. |
| Efficiëntie (= 10 (-1 / helling) -1) | Als het 100%, de sjablonen verdubbelt na elke thermale cyclus in exponentiële amplificatie. Een goede efficiëntie bereik ligt tussen 90 en 110%. |
| Y Intercept (β) | De theoretische limiet van detectie van de reactie. Hoewel niet gebruikt reactiegevoeligheid kwantificeren, is het van belang bij het vergelijken van verschillende standaard curven van hetzelfde doel. |
Tabel 8. QPCR reactie omschrijvingen.
Discussion
De combinatie van DNA / RNA extractie met qPCR verschaft een snelle, nauwkeurige en relatief kosteneffectieve methode voor de kwantificering van gevoelige gen en transcript abundanties van verschillende milieumonsters zoals kustsedimenten.
De eerste nucleïnezuur extractie is de kritische stap een representatief beeld van het onderhavige microbiële bereikt 22 waarborgen. Een aantal beperkingen moeten worden voor de extractie protocol: a) het bereiken van totale cellyse, b) co-extractie van remmende verbindingen (bijvoorbeeld humuszuren of polyfenolen), c) verontreinigend DNA in het RNA fractie, d) snelle afbraak van geëxtraheerde nucleïnezuren wanneer ze worden bewaard. Er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om deze beperkingen te omzeilen. Bijvoorbeeld bijzondere aandacht moet worden gezorgd dat de extractie van nucleïnezuren is geoptimaliseerd voor het type monster (bijvoorbeeld, sediment, grond, afvalwater, etc.). Significante verbeteringen in de nucleïnezuursynthese opbrengst en kwaliteit van zowel DNA als RNA kunnen worden bereikt door het uitvoeren van voorlopige experimenten 23. Om het effect van remmende verbindingen op PCR-gebaseerde toepassingen 24 minimaliseren, test een reeks verdunningen van het geëxtraheerde DNA en RNA. Om de snelle afbraak van het geëxtraheerde DNA / RNA van meerdere vries-dooicycli omzeilen en bij -80 ° C vermijden mogelijk verlies van genetische informatie, opslag meerdere kleine porties volume.
Bij zorgvuldig ontworpen, qPCR is een robuuste, zeer reproduceerbare en gevoelige methode. Met name kunnen de werkwijzen voor amplificatie en standaardcurve constructie die in dit protocol worden aangepast voor elk gen doelwit van belang, met inbegrip van andere fylogenetische markers (bijv Archaea 16S rRNA, 18S rRNA schimmel) of genen betrokken bij belangrijke functies in het milieu. Bekende beperkingen in het gebruik van qPCR zijn: a) de productie van reproduceerbare hoge-kwaliteit standard curve voor absolute kwantificering b) De keuze van primer / probes en optimalisatie van Q-PCR omstandigheden, c) het gebruik van lage kwaliteit / afgeschoven nucleïnezuren, d) De keuze van de werkverdunning van DNA / RNA inhibitie voorkomen . Bovendien moet worden overwogen dat qPCR techniek verschaft gen / transcript abundanties die niet gelijk kunnen stellen tellingen cel: Dit is vooral het geval wanneer 16S en 18S rRNA genen zijn gericht, zoals micro-organismen hebben verschillende kopie-aantallen van het ribosomale gen in hun genoom 25.
Slechte kwaliteit standaardcurven veroorzaakt onzuiver kwantificatie van het gen van belang. Het is een goede gewoonte om een voorraad van hoge concentratie normen in kleine porties waarvan het verse standaard curves kunnen worden gemaakt op te slaan. Niet standaard curves te slaan, altijd vers verdunningen van een voorraad van de hoogste concentratie per keer. Voor een nauwkeurige kwantificering van de milieu-monsters zorgen voor de reeks van concentraties van de standaard kromme overspant de verwachte Cp waarden van de onbekende monsters. Bij het kwantificeren van transcripten, de bouw van de standaard curve van RNA DNA niet verdubbelen. Als het mogelijk is, moet kwantificering van de monsters direct worden vergeleken binnen een enkele test worden voltooid om inter-assay variatie 20 vermijden. Dit kan niet altijd mogelijk zijn. Derhalve gen abundanties gegenereerd tussen assays vergelijken raadzaam om een willekeurige subset van monsters gerepliceerd tussen assays hebben. Een brede selectie van primer en probe sets zijn momenteel beschikbaar voor qPCR targeting microbiële taxa en functionele groepen 15. Een zorgvuldige afweging is nodig bij de keuze van deze voor zowel de maximale dekking en specificiteit voor de doelgroep te garanderen. Als de reactie-efficiëntie van een qPCR assay is niet bevredigend oplossen begint met het testen van verschillende thermale cycli condities (zoals annealing tijd en / of temperatuur) en / of reactieomstandigheden, bijvoorbeeld variërende primer-probe-concentraties. Once de Q-PCR-test en de reactieomstandigheden zijn geoptimaliseerd, altijd een eerste test van diverse DNA / cDNA verdunningen voeren om de juiste matrijsconcentratie bepalen. Selecteer de verdunningsreeks die het hoogste aantal kopieën als de optimale sjabloon verdunning voor verdere assays.
Op dit moment, next-generation sequencing technologieën efficiënt licht werpen op de microbiële gemeenschap structuur en functies in een overvloed aan omgevingen 26,27,28. Echter, deze datasets vaak gebaseerd op end-point PCR amplicon bibliotheken en daarom bieden enige semi-kwantitatieve beoordeling van de overvloed van bepaalde taxa. Vandaar dat de mogelijkheid van real time PCR-gebaseerde techniek om specifieke taxonomische markers richten (van hogere domein omlaag naar stamniveau) maakt een efficiënte validatie van de verkregen door next-generation sequencing resultaten. Bovendien qPCR is met succes gebruikt in combinatie met andere microbiële ecologie moleculaire technieken zoals iso stabieltope indringende (SIP) of historisch fenomeen / functionele microarrays. In combinatie met de voormalige tool kan qPCR worden gebruikt om het metabolisch actieve gemeenschap 29,30 kwantificeren. In combinatie met microarray-analyse, qPCR biedt belangrijke kwantitatieve interpretatie van fylogenetische-marker-based en functioneel gen enquêtes omgevingen 31,32.
Daarom, alleen of in combinatie met andere (vaak procesmatige) evaluaties van het ecosysteem van de functie gebruikt, kwantitatieve PCR is een essentieel instrument voor microbiële ecologen in de exploratie van de ongrijpbare band tussen microbiële gemeenschappen en ecosysteemfuncties.
Acknowledgments
Deze publicatie is voortgekomen uit onderzoek uitgevoerd met de financiële steun van de Natural Environment Research Council (NERC) onder licentienummer NERC NE / JO11959 / 1 en Science Foundation Ierland en de Marie-Curie-actie COFUND onder Grant Number 11 / SIRG / B2159awarded naar CJS en de Oost-Academic Research Consortium (Oost-ARC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
| cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
| Chloroform : Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
| sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
| polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
| Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
| Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
| Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
| Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
| SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
| RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
| SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
| pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
| E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
| Tryptone | Sigma | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
| Ampicillin | Sigma | 59349 | |
| X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
| IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
| Agar | VWR | 20768.235 | |
| Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
| Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
| Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
| MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
| TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
| qPCR machine |
References
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Curr. Opin. Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).
- Zhou, J., Bruns, M. A., Tiedje, J. M. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 62, 316-322 (1996).
- Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., Ghiorse, W. C. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures from soil and sediments samples. Appl. Environ. Microbiol. 65 (11), 4715-4724 (1999).
- Burgmann, H., Pesaro, M., Widmer, F., Zeyer, J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods. 45 (1), 7-20 (2001).
- Hurt, R. A., et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4495-4503 (2001).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Martins, G., et al. Structure and activity of lacustrine sediment bacteria involved in nutrient and iron cycles. FEMS Microbiol. Ecol. 77 (3), 666-679 (2011).
- Kuffner, M., et al. Effects of season and experimental warming on the bacterial community in a temperate mountain forest soil assessed by 16S rRNA gene pyrosequencing. FEMS Microbiol. Ecol. 82 (3), 551-562 (2011).
- Tatti, E., et al. Influences of over winter conditions on denitrification and nitrous oxide-producing microorganism abundance and structure in an agricultural soil amended with different nitrogen sources. Agric. Ecosyst . Environ. 183, 47-59 (2014).
- Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L., Field, K. G. Genetic diversity in the Sargasso Sea bacterioplankton. Nature. 345, 60-62 (1990).
- Ward, D. W., Weller, R., Bateson, M. M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms a natural community. Nature. 345, 63-65 (1990).
- Suzuki, M. T., Giovannoni, S. J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixture of 16S rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62, 625-630 (1996).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22, 130-138 (1997).
- Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H. Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5' 3' Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase. PNAS. 88, 7276-7280 (1991).
- Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 2-20 (2009).
- Park, S. J., Park, B. J., Rhee, S. K. Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments. Extremphiles. 12 (4), (2008).
- Urakawa, H., Yoshida, T., Nishimura, M., Ohwada, K. Characterization of depth-related population variation in microbial communities of a coastal marine sediment using 16S rDNA-based approaches and quinone profiling. Environ. Microbiol. 2, 542-554 (2008).
- Smith, C. J., Dong, L. F., Wilson, J., Stott, A., Osborn, A. M., Nedwell, D. B. Seasonal variation in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia process rates and corresponding key functional genes along an estuarine nitrate gradient. Front. Microbiol. 6, 542 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. 205 (2001).
- Smith, C. J., Nedwell, D. B., Dong, L. F., Osborn, A. M. Evaluation of Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR) based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples. Environ. Microbiol. 8 (5), 804-815 (2006).
- Suzuki, M. T., Taylor, L. T. DeLong E.F., Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial population via 5'-nuclease assays. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4605-4614 (2000).
- Luna, G. M., Dell'Anno, A., Danovaro, R. DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments. Environ. Microbiol. 8 (2), 308-320 (2005).
- Lever, M. A., Torti, A., Eickenbursch, P., Michaud, A. B., Šantl-Temkiv, T., Jørgensen, B. B. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front. Microbiol. 6, 476 (2015).
- Lloyd, K. G., MacGregor, B. J., Teske, A. Quantitative PCR methods for RNA and DNA in marine sediments: maximizing yield while overcoming inhibition. FEMS Microbol. Ecol. 72, 144-151 (2010).
- Klappenbach, J. A., Dumbar, J. M., Schmidt, T. M. rRNA Operon copy number reflects ecological strategies of bacteria. App. Environ. Microbiol. 66 (4), 1328-1333 (2000).
- Shi, Y., Tyson, G. W., Eppley, J. M., DeLong, E. F. Integrated metatrascriptomic and metagenomics analyses of stratified microbial assemblages in the open ocean. ISME J. 5, 999-1013 (2011).
- Howe, A. C., Jansson, J. K., Malfatti, S. A. Tringe S.G., Tiedje J.M., & Brown C.T. Tackling soil diversity with the assembly of large, complex metagenomes. PNAS. 111 (13), 4904-4909 (2014).
- Klaedtke, S., et al. Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages. Environ. Microbiol. , (2015).
- Lueders, T., Wagner, B., Claus, P., Friedrich MW, Stable isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi and protozoa in oxic rice field soil). Environ. Microbiol. 6, 60-72 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Bürgmann, H., et al. Transcriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate (DMSP). Environ. Microbiol. 9 (11), 2742-2755 (2007).
- He, J. Z., et al. Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes. ISME J. 1, 67-77 (2007).
