Abstract
Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion als auch quantitative PCR (q-PCR) bekannt, ist ein weit verbreitetes Werkzeug in mikrobiellen Ökologie Gen Abundanzen taxonomischen und funktionellen Gruppen in Umweltproben zu quantifizieren. Eingesetzt in Kombination mit einem Reverse-Transkriptase-Reaktion (RT-q-PCR), kann es auch Gentranskripte zu quantifizieren eingesetzt werden. q-PCR nutzt hochempfindliche Fluoreszenzdetektion Chemien, die während der exponentiellen Phase der Reaktion Quantifizierung von PCR-Amplicons ermöglichen. Daher werden die Verzerrungen im Zusammenhang mit "end-point 'PCR nachgewiesen in der Plateauphase der PCR-Reaktion vermieden. Ein Protokoll, um bakterielle 16S-rRNA-Gene und Transkripte von Küstensedimenten über Echtzeit-PCR-Quantifizierung vorgesehen ist. Zuerst wird ein Verfahren für die Co-Extraktion von DNA und RNA aus Küstensedimenten, einschließlich der zusätzlichen Schritte zur Herstellung von DNA-freien RNA erforderlich ist, wird beschrieben. Zweitens ist ein Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und transcripts aus den extrahierten Nukleinsäuren über q-PCR und RT-PCR-q skizziert. Dazu gehören Details für den Aufbau von DNA- und RNA-Standardkurven. Wichtige Überlegungen für die Verwendung von RT-q-PCR-Assays in der mikrobiellen Ökologie sind enthalten.
Introduction
Mikroorganismen sind der Eckstein des Ökosystems Funktion Biosphäre Fahren. Die Mehrzahl der Mikroorganismen bleiben unkultivierten 1. Daher Molekular basierte Ansätze sind von grundlegender Bedeutung unser Verständnis der Vielfalt und Funktion von Mikroorganismen in der Umwelt zu fördern. Im Mittelpunkt dieser Ansätze ist die Extraktion von Nukleinsäuren aus Umweltproben und die nachfolgende Amplifikation von Zielgenen, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet wird.
Der erste Schritt der DNA / RNA - Extraktion zielt darauf ab , die Zellwände der mikrobiellen Gemeinschaft vorhanden, entfernen Sie unerwünschte nicht - Nukleinsäure-Moleküle (zB organische und anorganische Substanzen) einsetzen und DNA / RNA in Lösung für Downstream - Analyse zu lysieren. Unter den verschiedenen Optionen , die in der Literatur 2,3,4,5, einschließlich einer Reihe von kommerziellen Extraktion Kits wird die Griffiths Methode 6 7,8,9 weithin eingesetzt. Es ist kostengünstig und particularly gut Sedimenten geeignet, da es eine sicken Mahlschritt verwendet Zellen zu lysieren und enthält Schritte, um die Co-Extraktion von PCR-Inhibitoren, wie beispielsweise Huminsäuren, zu minimieren, während die DNA und RNA gleichzeitig gewonnen wird.
Der zweite Schritt verwendet die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Zielgene, wie beispielsweise die 16S-rRNA taxonomische Marker zu amplifizieren, aus den extrahierten Nucleinsäuren. Dieser Ansatz hat und weiterhin die Erforschung des uncharacterized mikrobiellen Black Box 10,11 zu erleichtern. Allerdings Endpunkt PCR-basierten Methoden leiden unter verschiedenen Einschränkungen , die verzerren können die Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften 12. Um genau Gen / Transkript Abundanz, real-time PCR, auch bekannt als quantitative PCR (qPCR) Quantifizierung verwendet werden. qPCR nutzt fluoreszierenden Reporterfarbstoff-Systeme, die Amplicon Akkumulation nach jedem Zyklus der PCR verfolgen. Dies ist signifikant, da es bedeutet, dass die Quantifizierung während des frühen exponentiellen Phase auftreten kann, eherals der Endpunkt, Phase der PCR-Reaktion, wenn das Amplicon Ausbeute auf den Anfangsfluss des Zielgens noch direkt proportional ist.
Zwei Reportersysteme werden üblicherweise verwendet: eine interkalierende Nukleinsäure Fleck 13 und der 5 '3' Exonuklease - Aktivität der DNA - Polymerase 14. Da der ehemalige Reportersystem unterschiedslos auf alle doppelsträngige DNA bindet, kann es zu einer Überschätzung der Zielsequenz führen, wenn unerwünschte unspezifische Amplifikate oder Primerdimeren von Produkten auftreten. Um dies umfangreiche Optimierung der Amplifikation zu umgehen, kann erforderlich sein. Im letzteren System wird template - Amplifikation unter Verwendung einer Kombination aus einer 5' - Nukleaseaktivität der Taq - Polymerase, spaltet ein Fluorophor von einer internen Sonde verfolgt. Dieses Merkmal erhöht die Spezifität des Assays durch die Verwendung einer fluorogenen Sonde, die nur mit dem komplementären zielspezifischen Sequenc bindete zwischen dem Primerpaar. Mit beiden Chemien ist Quantifizierung durch Bestimmung der Übergangsstelle (Cp), wobei die Akkumulation des PCR-Amplikons erreicht, wie durch eine Zunahme der Fluoreszenz gemessen wird, deutlich über Fluoreszenzhintergrund ist.
qPCR wurde in der mikrobiellen Ökologie , um zu bestimmen Gen Abundanzen in verschiedenen Umgebungen 15 ausgiebig genutzt. Außerdem reverse Transkription von RNA in cDNA mit qPCR und RT-qPCR kombiniert Genexpression zu quantifizieren. Daher qPCR und RT-qPCR stellen schnelle, wirksame Methoden zur Quantifizierung von Gen und / oder Transkript Zahlen innerhalb Umweltproben.
Mikroorganismen , die in Küstensedimenten fahren verschiedene Ökosystemprozesse, einschließlich der Mineralisierung der organischen Substanz, die den Abbau von Schadstoffen und der biogeochemischen Kreisläufe von macronutrients wie Stickstoff 16,17,18. Der Anspruch auf Vollständigkeit Verständnis dieser Transformationen erfordert ein umfassendes account der beitragenden mikrobiellen Populationen, einschließlich quantitative Daten über Gen und Transkript Abundanzen. Hier stellen wir eine Reihe von Herz und Nieren geprüft, optimierte und standardisierte Protokolle für die Quantifizierung von bakteriellen 16S-rRNA-Gens und Transkript Abundanzen in Küstensedimenten. Das Protokoll beschreibt die Probenentnahme gleichzeitige DNA- und RNA-Extraktion, DNA-frei-RNA-Präparation, die Qualitätsprüfung der extrahierten Nukleinsäuren, die Erzeugung von 16S rRNA-DNA und -RNA Standards und Quantifizierung von Umweltproben. Quantitative Daten aus den Verfahren abgeleitet werden hier beschrieben benötigt Licht auf mikrobielle Gemeinschaften zu vergießen treibende Küstenökosysteme.
Protocol
1. DNA & RNA Extraktion von Marine Coastal Sediments
- Herstellung von Ribonuklease (RNase) -freie Material und Arbeitsbereich
- Bereiten Sie RNAse-freiem destilliertem Wasser (dH 2 O) , indem sie mit 0,1% Diethylpyrocarbonat Behandlung (DEPC) und Inkubation bei 37 ° CO / N. Entfernung von restlichem DEPC durch Autoklavieren dH 2 O bei 121 ° C für 15 min. Verwenden Sie DEPC behandelt dH 2 O , um alle Lösungen zu machen.
- Backen Sie alle Glaswaren bei 180 ° CO / N. Entfernen Sie die Plastikdeckel und Felgen, genießen sie in einer Lösung von 2 M NaOH O / N, und spülen Sie sie mit DEPC behandelt dH 2 O vor dem Gebrauch.
- Bereiten Sie eine CTAB-Phosphat - Pufferlösung gemäß Tabelle 1.
- Bereiten Sie die PEG-NaCl Fällungslösung gemäß Tabelle 2.
- Reinigen Sie alle Arbeitsflächen (dh Bank, Mikro, Dunstabzugshaube) und Mikropipetten mit RNAse-Dekontaminationslösung vor dem Start. Tragen Sie Handschuhe während des gesamten Verfahrens. Verwenden Sie RNAse-freie Kunststoffgeschirr zusammen mit Mikrofilterspitzen Probe eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
- Umweltprobensammlung und -speicherung
- Sammeln Küsten Sediment bei Ebbe ein steriles 50 ml-Falcon-Röhrchen aus den oberen 2,5 cm verwendet wird. Sammeln Sie ca. 15-20 g Sedimenten. Schließen Sie vorsichtig den Deckel nach der Probensammlung. Transport sofort in das Labor in einem Kühler bei 4 ° C zur sofortigen Verarbeitung.
- Homogenisieren der Probe mit einem sterilen Spatel und Aliquote von 0,5 g Naßgewicht Sediments in eine 2 ml bead schlagendes Mischrohr. Aliquotieren zusätzliche Replikate, flash-freeze von in flüssigem Stickstoff platzieren. Shop Aliquots bei -80 ° C. Achtung: Schutzhandschuhe und Schutzbrille, wenn Umgang mit flüssigem Stickstoff.
Hinweis: Wenn das Feld Website ist nicht in der Nähe zu einem Labor, aliquote 0,5 g Sediment in 2 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen auf der Wiese. Blitz gefrieren die Rohre von ihnen sofort in li setzenquid Stickstoff und Transport ins Labor. Proben bei -80 ° C bis zur Verarbeitung.
- Co-Extraktion von DNA und RNA aus sediment
Hinweis: Das folgende Protokoll ist eine modifizierte Version des Verfahrens Griffiths 6.- Hinzufügen 500 ul CTAB-Phosphatpuffer und 500 & mgr; l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) auf die 2 ml sicken Lysieren Röhrchen mit 0,5 g des Sediments und invertieren die Röhre 5-10 mal die Probe zu homogenisieren.
Achtung: Führen Sie diesen Schritt in einer Abzugshaube eine geeignete Schutzausrüstung tragen (dh Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille) zu allen Zeiten. - Vortex bei voller Geschwindigkeit für 2,5 min. Zentrifuge bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C.
- In einer Abzugshaube extrahieren Sie die obere wässrige Schicht und Transfer in ein neues 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Proben auf Eis, 500 & mgr; l eiskaltem Chloroform: Isoamylalkohol (24: 1).
- Invert mehrmals, bis eine Emulsion Visib istle. Zentrifuge für 10 min bei 16000 × g bei 4 ° C.
- In einer Dunstabzugshaube die obere wässrige Schicht zu extrahieren und sie in einem neuen 1,5 ml sterilen Röhrchen platzieren. Man fällt die Nukleinsäuren durch Zugabe von zwei Volumen 30% PEG- NaCl-Lösung und gut mischen.
- Inkubieren auf Eis für 2 Stunden oder lassen Sie Proben bei 4 ° CO / N.
- Am Ende der Inkubation Zentrifuge Proben bei 16.000 xg für 20 min bei 4 ° C.
Hinweis: Ein Pellet am Boden des Röhrchens sichtbar sein können. - Den Überstand vorsichtig entfernen mit einer Mikropipette, stellen Sie sicher, nicht das Pellet zu stören. Etwa 10 ul PEG-Lösung in dem Rohr und 1 ml eiskaltem 70% Ethanol.
- Zentrifuge für 20 min bei 16000 × g bei 4 ° C. Entfernen Sie langsam Ethanol mit einer Mikropipette zu berühren nicht das Pellet zu kümmern.
- Zentrifuge für 5 Sekunden und entfernen restliche Ethanol mit einer Mikropipette. Lassen Sie das Pellet für ca. 5 min an der Luft trocknen.
- Resuspendieren des Pellets in 50 & mgr; l DEPC-behandeltemH 2 O. Untersuchen der Qualität und Ausbeute der DNA / RNA durch Agarose - Gelelektrophorese laufen 5 ul auf einem 1% Agarose - Gel 19. Teilen Sie die Nukleinsäuren in zwei Aliquots, 15 & mgr; l für DNA und 30 & mgr; l für RNA.
- Lagern Sie die DNA bei -80 ° C bis benötigt. Isolieren RNA, wie im nächsten Abschnitt beschrieben.
- Hinzufügen 500 ul CTAB-Phosphatpuffer und 500 & mgr; l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) auf die 2 ml sicken Lysieren Röhrchen mit 0,5 g des Sediments und invertieren die Röhre 5-10 mal die Probe zu homogenisieren.
2. Herstellung von RNA und Qualitätsprüfung von DNA-freie RNA
- Die Verdauung von DNA
- Hinzufügen 3 ul DNAse I Puffer und 1,5 ul DNAse I bis 30 & mgr; l Volumen von Nukleinsäuren, für 30 min bei 37 ° C inkubieren.
- Mischen Sie die DNAse Inaktivierung Reagenz durch Vortexen für 30 Sekunden. Hinzufügen, 4,8 & mgr; l der Lösung zu der Probe. bei RT inkubieren 5 min, den Boden der Röhren gelegentlich tippen Sie auf die Lösung zu mischen.
- Zentrifuge bei 10.000 g für 90 s bei RT, den Überstand (RNA) in ein neues Röhrchen, dabei nicht Niederschlag zu übertragen, die Folgereaktionen hemmen können.
- RNA Qualitätsprüfung
- Hinzufügen , 2 ul RNA und 18 ul sterilem RNAse-freie dH 2 O bis 1:10 verdünnen.
- In getrennten PCR-Reaktionen, fügen 1 ul unverdünnt oder 1:10 Verdünnung von RNA in ein steriles 0,5 ml PCR-Röhrchen. In PCR - Reaktionskomponenten des 16S - rRNA - Gen gemäß Tabelle 3 zu verstärken. Fügen Sie eine "positive" (z. B. DNA , die aus einer reinen Bakterienkultur gewonnen wird ), eine "PCR - Inhibitor" Kontrolle (dh 1 ul positive Reinkultur DNA und 1 ul ordentlich extrahierter RNA) und eine "negative" Kontrolle von sterilen RNAse-frei dH 2 O.
- Stellen Sie den Thermocycler mit den folgenden Amplifizierungsparameter: 95 ° C 5 min (95 ° C 30 Sekunden, 57 ° C 30 Sekunden, 72 ° C 1 min) x 35 Zyklen, 72 ° C 10 min.
- Laufen 10% des PCR-Produkts auf einem 1% igen Agarosegel bei 85 V für 40 min. Wiederholen Sie die DNAse I Behandlung, wenn ein PCR-Produkt in der Umwelt RN gebildet wirdA-Proben.
- Hinzufügen , 2 ul RNA und 18 ul sterilem RNAse-freie dH 2 O bis 1:10 verdünnen.
3. Erzeugung von First Strand cDNA aus RNA
- Fügen Sie die Reagenzien gemäß Tabelle 4 zu einem RNAse / DNAse frei 0,2 ml PCR - Röhrchen.
- Inkubieren der Probe bei 65 ° C 5 min. Auf Eis für mindestens 1 min und dann inkubiert bei 25 ° C für 10 min.
- Um das gleiche Rohr fügen Sie die aufgeführten Reagenzien , die in Tabelle 5.
- Inkubieren der Probe bei 55 ° C für 50 min. Inaktivieren der Reaktion bei 72 ° C für 10 min.
- Store cDNA bei -20 ° C bis zur Verwendung.
4. Quantitative PCR
- Erzeugung von DNA-Standards für qPCR
- Amplify bakteriellen 16S - rRNA - Sequenz 20 (oder irgendeine andere Sequenz von Interesse) aus genomischer DNA aus Reinkultur extrahiert mit q-PCR - Primer (1369F & 1492r 21).
- Man reinige das PCR-Produkt einen kommerziellen Kits nach den Anweisungen des Herstellers.
- Klonen Sie das gereinigte PCRProdukt in einen 3'-T Überhang Vektorsystem Klonieren gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Wandeln Sie den Vektor der PCR Einfügen in Escherichia coli JM109 kompetente Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers enthält.
- Platte 50 ul Transformation auf Ampicillin (100 ug / ml), X-gal (20 ug / ml) und IPTG (0,5 mM) Luria Bertani-Agarplatten (Trypton 10 g / L, Hefeextrakt 5 g / l, NaCl 10 g / l, Agar 15 g / L). Inkubieren O / N bei 37 ° C.
- Wählen Sie eine einzelne positive weißen Trans von der Platte. Impfen die positive Trans in 50 ml LB-Brühe, die 100 ug / ml Ampicillin und Inkubieren O / N bei 37 ° C bei 250 rpm schütteln.
- Vom O / N-Kultur, zu isolieren und zu reinigen, die das Plasmid Anweisungen Kommerzielle Kits nach Hersteller.
- Linearisieren des Plasmids ein geeignetes Restriktionsenzym verwendet , das einmal zum Schneiden des Plasmids fähig ist (beispielsweise EcoRI).
- Bestimmung der Konzentration von Plasmid - DNA durch Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers 19.
Hinweis: Alternativ kann die Genauigkeit der Quantifizierung durch Verwendung eines fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff in Verbindung mit einem Fluorometer verwendet, verbessert werden. - Sequenz das Plasmid legen Sie die Größe des Ziels in Basen zu bestätigen. Berechnen der Menge (dh percentage) Insert - DNA in dem Plasmid (beispielsweise in einem 3000 bp Vektor, ein 123 bp DNA - Fragment ist 3,9% der Gesamt - DNA) und multipliziert es mit der Konzentration in 4.1.10 erhalten wird , um zu bestimmen , der DNA Konzentration des Targets (insert).
- Verwenden Sie die folgende Gleichung die Kopien der Ziel pro ul zu berechnen:
Last / 54067 / 54067eq1.jpg "/> - Berechnen des Zielmolekulargewicht (TMW), indem die Anzahl der Basenpaare der Ziel-DNA durch die mittleren Molekulargewicht von Doppelstrang-DNA Multiplizieren (dsDNA, 660 Daltons pro Basenpaar).
- Verdünne die Ziel - DNA in einem Bereich von 10. Oktober - 2. Oktober Kopien unter Verwendung von 2 & mgr; l DNA und 18 ul sterilem dH 2 O. Mischen Sie jede Verdünnung gut und Spin-down kurz bevor die nächste Verdünnung zu machen.
- Die Erzeugung von RNA-Standardkurve für qPCR
- Von dem Schritt 4.1.5 Bildschirm eine Reihe von weißen Kolonien (etwa 5) durch Kolonie - PCR - 19 das Ziel Reverse - Primer (dh R1492) und die Vorwärts Vektorplasmid Primer M13F verwenden.
Anmerkung: Diese Kombination von Primern amplifiziert werden stromaufwärts in der richtigen Sinn-Orientierung klonierten Inserts mit einem T7 Promotorstelle. - Man reinige das PCR-Produkt eines kommerziellen Kits folgenden Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Quantifizieren des gereinigten PCR-produkt bei 260 nm mit einem Spektralphotometer.
- Mit 200 ng des PCR - Produkts in einem Endvolumen von 20 ul mit 7,5 mM jedes Ribonukleotid, 1 T7 - Reaktionspuffer und 1 T7 - Polymerase - Enzym für die in vitro - Transkriptionsreaktion.
- Inkubieren der Reaktion für 4 h bei 37 ° C. 1 Einheit RNase-freie DNase I der Reaktion, Inkubation: 15 min bei 37 ° C DNA-Matrize zu entfernen.
- Wiederherstellen der in vitro transkribierten RNA durch Ethanolfällung und 19 RNA - Ausbeuten unter Verwendung eines Fluorimeters oder durch Absorption bei 260 nm quantifiziert.
- Berechnen Transkript Zahl pro ul RNA. Fügen Sie die Anzahl von Basenpaaren in der Ziel - RNA (beispielsweise 123 Basen) , die der Länge des T7 - Promotors (153 Basen) und multiplizieren mit dem mittleren Molekulargewicht von RNA, 340 Daltons pro Basis.
- Hinzufügen 500 ng quantifizierter Ziel-RNA mit einer reversen Transkriptase (RT) Reaktion wie in Abschnitt beschrieben 3. Abwechselnd verdünnen cDNA wie in 4.1.13 zur Verwendung umrissenenwie die Standardkurve.
- Von dem Schritt 4.1.5 Bildschirm eine Reihe von weißen Kolonien (etwa 5) durch Kolonie - PCR - 19 das Ziel Reverse - Primer (dh R1492) und die Vorwärts Vektorplasmid Primer M13F verwenden.
- Real-Time PCR
- Thaw Umwelt-DNA / cDNA-Proben, Standards und qPCR Reagenzien auf Eis. Schützen Sie die fluorogene Sonde aus Licht.
- Verdünnen Sie die Standards für die Standardkurve wie in 4.1.14 beschrieben. Machen 01.10 Verdünnungen der Umwelt - DNA / cDNA von ordentlich bis 10 -3 durch Zugabe von 2 ul Probe zu 18 ul sterilem dH 2 O.
- Führe einen Mastermix Reaktion für die Gesamtzahl der Reaktionen plus 10% gemäß Tabelle 6 (Primer und Sonde) und Tabelle 7 (Reaktionsmischung). Gut mischen und kurz zentrifugieren.
- In 19 ul Master-Mix und 1 ul-Vorlage (Standard, Umweltprobe oder Wasser für die Negativkontrolle) zu jeder Vertiefung in einer 96-Well optischen qPCR Platte. Führen Sie jede Reaktion (Standards, Umweltproben und negative Kontrollen) in dreifacher Ausfertigung.
- Decken Sie die 96-Well-Platte mit einem q-PCR optische Abdeckung. Zentrifugieren Sie die Platte kurz. Laden Sie dasPlatte in den Heizblock der qPCR-Maschine und den Deckel schließen.
- Öffnen Sie die qPCR-Manager-Software. Klicken Sie auf das "Protokoll Reiter", klicken Sie auf "Neu erstellen", fügen Sie die folgenden Amplifikationsbedingungen: 3 min 95 ° C, (10 sec 95 ° C, 30 sec 60 ° C) x 40 Zyklen. Stellen Probenvolumen auf 20 ul, klicken Sie auf "OK" und das Protokoll zu speichern.
- Klicken Sie auf die "Platte" aus. Unter den Bericht Farbstoff für geeignete Sonde "bearbeiten ausgewählt" klicken Sie auf "Wählen Sie Fluorophor", hinzufügen, zum Beispiel Fluorescein. Klicken Sie auf "OK".
- Highlight Vertiefungen, die die Normen enthält, wählen Sie "Standard" aus dem "Sample-Typ" Menü. Klicken Sie auf "replizieren Serie" zu ändern "replizieren Größe" bis 3, klicken Sie auf "Übernehmen". Klicken Sie auf "Verdünnungsreihe" zu berechneten Ausgangskonzentration für Standard 1, geben Sie den Verdünnungsfaktor (10), wählen Sie "abnehmend" oder "erhöhen" add auf der Bestellung wurde die Standardkurve in Abhängigkeit hinzugefügtauf der Platte. Klicken Sie auf "Übernehmen".
- Markieren Sie auch Positionen, um die unbekannten Proben enthält, wählen Sie "unbekannt" aus dem "Sample-Typ" Drop-Down-Menü. Klicken Sie auf "replizieren Serie", und ändern "replizieren Größe" auf 3. Klicken Sie auf "Übernehmen". Bearbeiten Beispielnamen unter "Beispielnamen". Wiederholen Sie die Prozedur für No Template-Kontrollen (NTC) Brunnen.
- Klicken Sie auf "OK" auf dem Editorfenster Platte und Datei speichern. Klicken Sie auf "Start run".
- Nach Abschluss des Laufs wird die Datenanalysefenster öffnen. Klicken Sie auf die "Quantifizierung Registerkarte" die Standardkurve zu zeigen, Standardkurve Deskriptoren (Tabelle 8) und Verstärkung Plots.
- Klicken Sie auf die "Quantifizierung Daten" für Cp-Werte und entsprechende Ausgangsmenge von Gen (SQ) von unbekannten Proben. Export-Tabelle Tabellenkalkulations-Software, falls erforderlich.
- Multiplizieren Gen Abundanz von unbekannten Proben mit dem Verdünnungsfaktor, die Menge an Sediment extracted aus und die gesamten Nukleinsäuren wurden eluierte in Genkopien pro Gramm Frischgewicht Sediment zu erhalten.
Hinweis: Eluieren der DNA von 0,5 g Sediment in 50 & mgr; l, verdünnt 1/10, fügen 1 ul als Vorlage zu einer q-PCR-Reaktion; Genkopien g -1 Sediment berechnen durch Multiplikation: Genkopien ul DNA x Verdünnungsfaktor x Elutionsvolumen x 2.
Representative Results
Die Extraktion von guter Qualität DNA und RNA aus Sedimenten ist der erste Schritt in Abundanz-Gen und Transkript zu quantifizieren. Eine erfolgreiche Extraktionsausbeuten klare DNA und RNA - Banden wie in Abbildung 1 für Probe AC angegeben, wobei scharfe 23S und 16S rRNA - Banden zusätzlich zu der hochmolekularen Bande genomischer DNA sichtbar sind.
Abbildung 1. DNA / RNA - Extraktion. Typische Ergebnisse von DNA / RNA - Extraktion aus dreifacher Ausfertigung (ABC) 0,5 g Küstensedimenten. 5 ul der DNA / RNA für 40 min bei 85 V auf einem 1,4% Agarose ausgeführt. Ein molekularer Marker in der 10,037-200 bp Bereich verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ein qPCR Reaktionsprotokoll skizzierte Targeting-16S-rRNA-DNA. Für 16S-rRNA-Transkripte ersetzen die Standard-cuRVE und Vorlage mit cDNA. Als unbekannte Proben gegen die Standardkurve quantifiziert werden, ist es zwingend notwendig , dass die Standardkurve ist von guter Qualität zu gewährleisten. Abbildung 2 zeigt die Herstellung von (A), Standardkurven und Umwelt - DNA - Verdünnungen, (B), Verstärkung der Standardkurve und Umweltproben (C) Umwandlung von Standardkurve zu einer linearen Regression und die Berechnung der Genkopie Zahlen. Wenn eine 10-fache Verdünnungsbereich richtig vorbereitet ist , und verstärkt einen Zyklus 3,3 Differenz zwischen jedem Standardverdünnungs gesehen (es dauert 3,3 Zyklen für eine zehnfache Erhöhung der Vorlage auf 100% Amplifikationseffizienz) (Abbildung 2Bi). Standardkurven Deskriptoren, einschließlich der R & sub2 ; -Werte von 0,99 und PCR - Effizienzen im Bereich von 90 bis 110% (2C) sind erwünscht. Es ist wichtig, Cp-Werte aus der Leerwert-Kontrolle (NTC), falls vorhanden zu melden. Wenn dies der Fall ist eine Cp Cutoff für Standards und unbekannten Proben 3,3 Zyklen (<em> dh eine log - fach) höher ist als der Cp - Wert des NTC auferlegt wird , 20 (2Cii). Unbekannte Vorlage aus Sediment DNA extrahiert wurde aus ordentlich quantifiziert, 10 -1, 10 -2 und 10 -3 Verdünnungen (B). Die saubere Probe hatte verstärken nicht, die Cp - Werte von 10 -1 bis 10 -3 Verdünnungen waren 24.12, 26.02 und 28.40 sind. Der NTC-Cp betrug 30,5, ein NCT Cutoff von 27,2 auferlegt wurde. Konvertieren von Gen Abundanzen zu g -1 Nassgewicht Sediment resultierte in 2,5 x 10 7 und 7,1 x 10 7 für 10 -1 und 10 -2 jeweils für den Verdünnungsbereich. 10 -3 Verdünnungs Cp lag unterhalb der NTC cutoff und wurde deshalb nicht verwendet. In diesem Fall wurde die 10 -2 als die optimale Schablone Verdünnung ausgewählt.
Abbildung 2. 16S rRNA - Gen qPCR Verstärkung von Standards und Umwelt - DNA von Küstensedimenten extrahiert. Herstellung von (A) i) DNA - Standardkurve und ii) Umgebungs DNA - Verdünnungen für qPCR Verstärkung, (B) qPCR Amplifizierung von i) DNA - Standardkurve und ii) Umweltproben, Cp für jede Probe gezeigt. (C) i) Die lineare Regression der Standardkurve mit Standardkurve Deskriptoren, ii) Berechnung von Gen Abundanz aus Umweltproben. NTC:. Negative-Kontrolle Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Reagens | Menge |
| CTAB | 5 g |
| K 2 HPO 4 x3H 2 O | 2,58 g |
| KH 2 PO 4 | 0,1 g |
| NaCl | 2,05 g |
| dH 2 O | bis zu 100 ml |
Tabelle 1. Herstellung von CTAB-Phosphatpuffer.
| Reagens | Menge |
| PEG 6000 | 30 g |
| NaCl | 9,35 g |
| dH 2 O | bis zu 100 ml |
| Hinweis: fügen PEG 6000 langsam unter mäßigem Erhitzen und Rühren von 50 ml dH 2 O. | |
Tabelle 2. Herstellung von PEG-NaCl Fällungslösung.
| Reagens | Menge |
| Das unverwässerte RNA / 1:10 RNA | 1,0 ul |
| 10x PCR-Puffer | 5,0 ul |
| 10 mM dNTPs | 1,0 ul |
| 63F Vorwärtsprimer | 1,0 ul |
| CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC | |
| 518R Reverse-Primer | 1,0 ul |
| ATT ACC GCG GCT GCT GG | |
| Taq-Polymerase | 0,4 ul |
| RNAse-frei dH 2 O | 40,6 ul |
Tabelle 3. DNA-freie RNA Qualitätsprüfung PCR Master - Mix.
| Reagens | Menge |
| RNA | 0,5-5 & mgr; g |
| 10 mM dNTPs | 1 ul |
| Reverse-Primer 10 uM / Zufallshexameren 50 uM | 1 ul |
| DEPC-H 2 O | Bis zu 13 & mgr; l |
Tabelle 4. cDNA - Synthese - Reaktionsmischung A.
| Reagens | Menge |
| Buffer 5x | 4 ul |
| DTT | 1 ul |
| RNAse Inhibitor | 1 ul |
| Umgekehrte Transkriptase | 1 ul |
Tabelle 5. cDNA - Synthese - Reaktionsmischung B.
| Ziel | Primer Name | Sequenz | Annealing T (° C) | Referenz |
| 16S-rRNA-Bakterien | Bact1369F | CGG TGA ATA CGT TKE CGG | 56 | Suzuki et al. , 2000 19 |
| Prok1492R | GGW TAC CTT GTT ACG ACT T | |||
| TM1389F (Sonde) | CTT GTA CAC ACC GCC CGT C |
| Reagens | Menge |
| 2x Master Mix | 10 ul |
| Forward-Primer (10 uM) | 0,8 ul |
| Reverse-Primer (10 uM) | 0,8 ul |
| Probe (10 & mgr; M) | 0,4 ul |
| Wasser | 7,0 ul |
| Das endgültige Volumen | 19 & mgr; l |
Tabelle 7. Echtzeit - PCR - Reaktionsmischung.
| Descriptor | Bedeutung |
| Korrelationskoeffizient (R 2) | Ein Maß für die Linearität der Standardkurve. Im Idealfall sollte es R 2 = 1 sein. Wert von R 2 = 0,98 bis 0,99 sind akzeptabel. |
| Slope (α) | Ein Maß für die Reaktionseffizienz. Im Idealfall sollte es entspricht -3,32 sein. Wert im Bereich zwischen -3,58 und -3,1. |
| Effizienz (= 10 (-1 / Steigung) -1) | Wenn es 100% ist, verdoppelt sich die Vorlagen nach jeder thermischen Zyklus während des exponentiellen Verstärkung. Ein guter Wirkungsgrad Bereich liegt zwischen 90 und 110%. |
| Y Intercept (β) | Die theoretische Grenze der Detektion der Reaktion. Obwohl es nicht zu quantifizieren Reaktionsempfindlichkeit verwendet wird, ist es wichtig, wenn verschiedene Standardkurven des gleichen Ziels verglichen werden. |
Tabelle 8. qPCR Reaktion Deskriptoren.
Discussion
Die Kombination von DNA / RNA-Extraktion mit qPCR stellt eine schnelle, genaue, relativ kostengünstiges Verfahren für die empfindliche Quantifizierung des Gens und transcript Abundanzen aus einer Reihe von Umweltproben, wie Küsten Sedimenten.
Die anfängliche Extraktion von Nukleinsäuren ist der kritische Schritt eine repräsentative Ansicht der mikrobiellen Gemeinschaft vorhanden , um sicherzustellen , 22 erreicht. Eine Anzahl von Beschränkungen müssen für das Extraktionsprotokoll berücksichtigt werden: a) die Leistung der gesamten Zell - Lyse, b) Co-Extraktion von inhibitorischen Verbindungen (beispielsweise Huminsäuren oder Polyphenole), c) kontaminierende DNA in der RNA - Fraktion, d) einen schnellen Abbau der extrahierten Nukleinsäuren, wenn gespeichert. Es müssen Vorkehrungen, um diese Einschränkungen zu umgehen genommen werden. Zum Beispiel weist insbesondere darauf geachtet werden , dass die Extraktion von Nukleinsäuren , die für den Probentyp optimiert ist (beispielsweise, Sedimente, Boden, Abwasser usw.). Signifikante Verbesserungen in der Nukleinsäure-Ausbeute und Qualität sowohl für DNA und RNA kann durch Durchführung von Vorversuchen 23 erreicht werden. Um die Wirkung der inhibitorischen Verbindungen auf PCR-basierte Anwendungen 24, testen eine Reihe von Verdünnungen aus der extrahierten DNA und RNA minimieren. Um den schnellen Abbau der extrahierten DNA / RNA aus mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen zu umgehen und einen möglichen Verlust der genetischen Information, speichern mehrere kleine Volumen Aliquots bei -80 ° C zu vermeiden.
Wenn sorgfältig entworfen, qPCR ist eine robuste, hoch reproduzierbare und empfindliche Methode. Bemerkenswerterweise Konstruktion die Verfahren zur Amplifikation und Standardkurve in diesem Protokoll umrissenen kann für jedes Gen Ziel von Interesse angepasst werden, einschließlich anderer phylogenetische Marker (dh archaeal 16S rRNA, Pilz 18S rRNA) oder in wichtigen Funktionen in der Umgebung beteiligten Gene. Bekannte Einschränkungen bei der Verwendung von qPCR sind: a) die Erzeugung reproduzierbarer hoher Qualität standard Kurve für die absolute Quantifizierung, b) die Wahl der Primer / Sonden und Optimierung von q-PCR-Assay-Bedingungen, c) die Verwendung von geringer Qualität / geschert Nukleinsäuren, d) die Wahl der Arbeitsverdünnung von DNA / RNA-Hemmung zu vermeiden . Darüber hinaus ist es in Betracht gezogen werden muss, dass qPCR Technik Gen / transcript Abundanzen liefert, die nicht Zählwerte können gleichzusetzen Zelle: dies ist insbesondere der Fall, wenn 16S und 18S rRNA-Genen gerichtet sind, als Mikroorganismen unterschiedlicher Kopienzahl des ribosomalen Gen in ihrem Genom haben, 25.
Schlechte Qualität Standardkurven werden in ungenauen Quantifizierung des Gens von Interesse führen. Es ist gute Praxis, eine Aktie mit einer hohen Konzentration Standards in kleinen Portionen zu speichern, aus dem frischen Standardkurven vorgenommen werden können. Machen Sie keine Standardkurven speichern, immer frische Verdünnungen von einem Lager der höchsten Konzentration jedes Mal. Für eine genaue Quantifizierung von Umweltproben den Bereich der Konzentrationen des stan gewährleistendard Kurve erstreckt sich über die erwarteten Cp-Werte der unbekannten Proben. Wenn Transkripte zu quantifizieren, konstruieren die Standardkurve von RNA nicht DNA verdoppeln. Wenn möglich, Quantifizierung von Proben direkt sollten verglichen werden , in einem einzigen Assay abgeschlossen sein Inter-Assay - Variation 20 zu vermeiden. Dies mag nicht immer möglich sein. Daher Gen Häufigkeiten zwischen Assays erzeugt zu vergleichen, ist es ratsam, eine zufällige Teilmenge von Proben zwischen Assays repliziert haben. Eine große Auswahl an Primer und Sondensätze sind derzeit für qPCR mikrobiellen Taxa und funktionelle Gruppen 15. Die sorgfältige Abwägung erforderlich Targeting wird , wenn diese Auswahl sowohl eine maximale Abdeckung und Spezifität für die Zielgruppe zu gewährleisten. Wenn die Reaktionseffizienz eines qPCR Assay nicht zufriedenstellend ist, beginnt Fehlersuche mit unterschiedlichen thermischen Zyklusbedingungen zu testen (wie Glühzeit und / oder Temperatur) und / oder Reaktionsbedingungen, beispielsweise Primer-Sondenkonzentrationen variiert. Once die q-PCR-Assays und die Reaktionsbedingungen optimiert werden, immer einen ersten Test einer Reihe von DNA / cDNA-Verdünnungen führen die entsprechende Vorlage Konzentration zu bestimmen. Wählen Sie den Verdünnungsbereich, was zu der höchsten Kopienzahl als die optimale Vorlage Verdünnung für weitere Tests.
Derzeit Schuppen der nächsten Generation Sequenzierungstechnologien effizient Licht auf die mikrobielle Gemeinschaft Struktur und Funktionen in einer Vielzahl von Umgebungen 26,27,28. Allerdings sind diese Datensätze oft basierend auf Endpunkt PCR Amplikon Bibliotheken und bieten daher nur semi-quantitative Einschätzungen der Fülle einzelner Taxa. Daher ermöglicht es die Fähigkeit, Echtzeit-PCR-basierte Technik spezifische taxonomische Marker auf Ziel (von höheren Domäne bis auf Stammebene) für eine effiziente Validierung der von der nächsten Generation Sequenzierung erhaltenen Ergebnisse. Außerdem wurde qPCR erfolgreich in Kombination mit anderen mikrobiellen Ökologie molekularen Methoden wie stabile iso verwendetTope Sondierung (SIP) oder phylogenetischen / functional Microarrays. In Kombination mit dem ehemaligen Tool können qPCR verwendet werden , die metabolisch aktive Community 29,30 zu quantifizieren. Wenn sie mit Microarray - Analyse kombiniert wird , liefert qPCR Schlüssel quantitative Interpretation der phylogenetischen Marker-basierte und funktionale Gen Befragungen von Umgebungen 31,32.
Deshalb, ob allein oder in Kombination mit anderen (oft prozessbasierten) Beurteilungen der Ökosystem-Funktion verwendet, quantitative PCR ist ein wichtiges Instrument für mikrobiellen Ökologen in der Erforschung des flüchtigen Verbindung zwischen mikrobiellen Lebensgemeinschaften und Ökosystemfunktionen.
Acknowledgments
Diese Publikation wurde von der Forschung mit der finanziellen Unterstützung des Natural Environment Research Council (NERC) unter dem Förderkennzeichen NERC NE / JO11959 / 1 und Science Foundation Ireland & Marie-Curie-Maßnahme COFUND unter Grantnummer 11 / SIRG / B2159awarded zu CJS geleitet ausging und die östliche Academic Research Consortium (Eastern ARC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
| cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
| Chloroform : Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
| sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
| polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
| Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
| Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
| Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
| Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
| SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
| RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
| SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
| pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
| E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
| Tryptone | Sigma | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
| Ampicillin | Sigma | 59349 | |
| X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
| IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
| Agar | VWR | 20768.235 | |
| Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
| Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
| Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
| MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
| TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
| qPCR machine |
References
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