Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

तटीय तलछट और -16 की मात्रा rRNA जीन और टेप से एक साथ डीएनए शाही सेना निकालना वास्तविक समय पीसीआर द्वारा

Published: June 11, 2016 doi: 10.3791/54067
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Microbiology, School of Natural Sciences, National University of Ireland Galway, 2School of Biological Sciences, University of Essex

Abstract

रीयल टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन भी मात्रात्मक पीसीआर (क्यू पीसीआर) के रूप में जाना जाता है माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया उपकरण पर्यावरण के नमूनों में वर्गीकरण और कार्य समूहों के जीन प्रचुरता यों की है। एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस रिएक्शन (आरटी-क्यू पीसीआर) के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया, यह भी जीन टेप यों को नियोजित किया जा सकता है। क्यू पीसीआर अत्यधिक संवेदनशील फ्लोरोसेंट का पता लगाने chemistries कि प्रतिक्रिया का तेजी के चरण के दौरान पीसीआर amplicons की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देने का उपयोग करता है। इसलिए, 'अंत बिंदु' पीसीआर के साथ जुड़े पूर्वाग्रहों पीसीआर प्रतिक्रिया के पठार चरण में पता चला परहेज कर रहे हैं। एक प्रोटोकॉल वास्तविक समय पीसीआर के माध्यम से प्रदान की जाती है तटीय अवसादों से बैक्टीरियल -16 rRNA जीन और टेप यों की। सबसे पहले, डीएनए और डीएनए से मुक्त शाही सेना की तैयारी के लिए आवश्यक अतिरिक्त कदम सहित तटीय अवसादों से शाही सेना के सह निकासी के लिए एक विधि है, उल्लिखित है। दूसरा, -16 rRNA जीन और टीआर की मात्रा का ठहराव के लिए एक कदम दर कदम गाइडक्यू पीसीआर और आरटी-क्यू पीसीआर के माध्यम से निकाले न्यूक्लिक एसिड से anscripts उल्लिखित है। यह डीएनए और आरएनए मानक घटता के निर्माण के लिए विवरण शामिल हैं। माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में आर टी-क्यू पीसीआर assays के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण विचार शामिल किए गए हैं।

Introduction

सूक्ष्मजीवों बायोस्फीयर ड्राइविंग पारिस्थितिकी तंत्र समारोह के कोने-पत्थर हैं। सूक्ष्मजीवों के बहुमत असभ्य 1 रहते हैं। इसलिए आणविक आधारित दृष्टिकोण विविधता और पर्यावरण में सूक्ष्मजीवों के समारोह के बारे में हमारी समझ को अग्रिम करने के लिए मौलिक हैं। इन तरीकों को केन्द्रीय पर्यावरण के नमूनों से न्यूक्लिक एसिड की निकासी और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग कर लक्ष्य जीन के बाद प्रवर्धन है।

डीएनए / आरएनए निकासी का पहला कदम है, माइक्रोबियल समुदाय वर्तमान की सेल दीवारों lyse अवांछित गैर न्यूक्लिक एसिड अणु (जैसे, कार्बनिक और अकार्बनिक पदार्थ) को हटाने और आगे बहाव के विश्लेषण के लिए समाधान में बनाए रखने के डीएनए / आरएनए करना है। कई वाणिज्यिक निकासी किट की एक सीमा सहित साहित्य 2,3,4,5 में उपलब्ध विकल्पों के अलावा, ग्रीफिथ विधि 6 व्यापक रूप से 7,8,9 कार्यरत है। यह लागत प्रभावी और देहात हैrticularly अच्छी तरह से अवसादों के लिए अनुकूल के रूप में यह कोशिकाओं lyse करने के लिए एक मनका पिटाई कदम का उपयोग करता है और इस तरह के humic एसिड के रूप में पीसीआर अवरोधकों के सह निकासी को कम करने whilst एक साथ डीएनए और आरएनए उबरने के कदम शामिल हैं।

दूसरे चरण के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करता है ऐसे -16 rRNA वर्गीकरण मार्कर के रूप में लक्ष्य जीन, बढ़ाना, निकाले न्यूक्लिक एसिड से। यह दृष्टिकोण है और uncharacterized माइक्रोबियल ब्लैक बॉक्स 10,11 के अन्वेषण की सुविधा के लिए जारी है। हालांकि, अंत बिंदु पीसीआर आधारित विधियों विभिन्न सीमाओं से ग्रस्त है कि पूर्वाग्रह कर सकते हैं माइक्रोबियल समुदायों 12 की विशेषता। सही जीन / प्रतिलेख प्रचुरता यों, वास्तविक समय पीसीआर भी मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) के रूप में जाना जाता इस्तेमाल किया जाना चाहिए। qPCR फ्लोरोसेंट रिपोर्टर डाई प्रणाली है कि पीसीआर के हर चक्र के बाद amplicon संचय ट्रैक का लाभ उठाते। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह मतलब है कि मात्रा का ठहराव जल्दी घातीय चरण के दौरान हो सकता है, बल्किअंत बिंदु, पीसीआर प्रतिक्रिया के चरण, जब amplicon उपज अभी भी सीधे लक्ष्य जीन की प्रारंभिक बहुतायत के लिए आनुपातिक है की तुलना में।

दो रिपोर्टर प्रणालियों आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं: एक intercalating न्यूक्लिक एसिड दाग 13 और डीएनए पोलीमरेज़ 14 के 5 '3' exonuclease गतिविधि। चूंकि पूर्व संवाददाता प्रणाली सभी डबल असहाय डीएनए के लिए indistinctively बांधता है, यह लक्ष्य अनुक्रम का एक overestimation को जन्म दे सकती है, तो अवांछित गैर विशिष्ट amplicons या उत्पादों से प्राइमर dimers होते हैं। आदेश में इस को नाकाम करने के लिए, प्रवर्धन के व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। उत्तरार्द्ध प्रणाली में, टेम्पलेट प्रवर्धन Taq पोलीमरेज़ कि cleaves एक आंतरिक जांच से एक fluorophore की एक 5 'nuclease गतिविधि का एक संयोजन का उपयोग कर लगाया जाता है। यह सुविधा एक fluorogenic जांच के उपयोग कि पूरक लक्ष्य विशिष्ट sequenc करने के लिए केवल बांधता के कारण परख की विशिष्टता बढ़ जाती हैप्राइमर जोड़ी के बीच ई। दोनों chemistries के साथ मात्रा का ठहराव क्रासिंग सूत्रीय (सीपी) जहां पीसीआर amplicons के संचय, के रूप में प्रतिदीप्ति में वृद्धि के द्वारा मापा जाता है, काफी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति ऊपर है निर्धारित करने से हासिल की है।

qPCR बड़े पैमाने पर अलग अलग वातावरण में 15 में जीन की प्रचुरता निर्धारित करने के लिए माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, सीडीएनए को शाही सेना के रिवर्स प्रतिलेखन qPCR और RT-qPCR के साथ संयुक्त है जीन अभिव्यक्ति यों की। इसलिए, qPCR और RT-qPCR पर्यावरण के नमूनों के भीतर जीन और / या प्रतिलिपि संख्या की मात्रा का ठहराव के लिए तेजी से, प्रभावी तरीकों में प्रतिनिधित्व करते हैं।

तटीय अवसादों में सूक्ष्मजीवों कार्बनिक पदार्थ की खनिज, प्रदूषण की गिरावट और जैसे नाइट्रोजन 16,17,18 के रूप में macronutrients के biogeochemical साइकिल चालन सहित विभिन्न पारिस्थितिकी तंत्र प्रक्रियाओं, ड्राइव। इन परिवर्तनों का व्यापक समझ के लिए एक व्यापक लेखा और लेखा की आवश्यकता हैजीन और प्रतिलेख प्रचुरता पर मात्रात्मक डेटा सहित योगदान माइक्रोबियल आबादी, टी। यहाँ हम तटीय अवसादों में बैक्टीरिया -16 rRNA जीन और प्रतिलेख प्रचुरता की मात्रा का ठहराव के लिए अच्छी तरह से परीक्षण, सुव्यवस्थित और मानकीकृत प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला शुरू। प्रोटोकॉल नमूना संग्रह, एक साथ डीएनए और आरएनए निकासी, डीएनए से मुक्त आरएनए तैयारी, निकाले न्यूक्लिक एसिड की गुणवत्ता की जाँच, -16 rRNA-डीएनए और -RNA मानकों और पर्यावरण के नमूनों की मात्रा का ठहराव की पीढ़ी की रूपरेखा। यहाँ वर्णित विधि से निकाली गई मात्रात्मक डेटा तटीय पारिस्थितिक तंत्र ड्राइविंग माइक्रोबियल समुदायों पर प्रकाश डाला करने की जरूरत है।

Protocol

1. समुद्री तटीय अवसादों से डीएनए और आरएनए निष्कर्षण

  1. ribonuclease (RNase) मुक्त सामग्री और कार्यक्षेत्र की तैयारी
    1. 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) के साथ इलाज से RNase मुक्त आसुत जल (DH 2 हे) तैयार है और 37 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं। 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर DH 2 हे autoclaving द्वारा अवशिष्ट DEPC निकालें। उपयोग DEPC सभी समाधान बनाने के लिए DH 2 हे इलाज किया।
    2. 180 डिग्री सीओ / एन सब पर कांच के बने पदार्थ सेंकना। प्लास्टिक lids और रिम्स निकालें, उन्हें 2 एम NaOH हे / एन की एक समाधान में लेना, और उन्हें इलाज DH 2 हे उपयोग करने से पहले DEPC से कुल्ला।
    3. प्रति 1 टेबल के रूप में एक CTAB-फॉस्फेट बफर समाधान तैयार है।
    4. प्रति 2 टेबल के रूप में खूंटी NaCl वर्षा समाधान तैयार है।
    5. स्वच्छ सभी काम कर सतहों (यानी, बेंच, microcentrifuge, धूआं हुड) और शुरू करने से पहले RNAse-decontaminating समाधान का उपयोग micropipettes। पूरी प्रक्रिया के दौरान दस्ताने पहनें। micropipette फिल्टर सुझावों के साथ साथ RNase मुक्त plasticware का प्रयोग नमूना पार संक्रमण से बचने के लिए।
  2. पर्यावरण नमूना संग्रहण और भंडारण
    1. शीर्ष 2.5 सेमी से एक बाँझ 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब का उपयोग कम ज्वार के दौरान तटीय तलछट ले लीजिए। अवसादों के लगभग 15-20 ग्राम लीजिए। ध्यान से नमूना संग्रह के बाद ढक्कन बंद कर दें। तत्काल प्रसंस्करण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कूलर में प्रयोगशाला के लिए तुरंत परिवहन।
    2. एक 2 मिलीलीटर मनका पिटाई ट्यूब में गीला वजन तलछट की 0.5 ग्राम एक बाँझ रंग और विभाज्य के साथ मिश्रण से नमूना homogenize। अशेष अतिरिक्त प्रतिकृति, फ्लैश फ्रीज तरल नाइट्रोजन में रखकर। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots। सावधानी: सुरक्षात्मक दस्ताने और सुरक्षा चश्मे पहन जब तरल नाइट्रोजन से निपटने।
      नोट: क्षेत्र साइट क्षेत्र स्थल पर 2 मिलीलीटर बाँझ microcentrifuge ट्यूब में एक प्रयोगशाला, विभाज्य तलछट की 0.5 ग्राम के पास स्थित नहीं है। नलियों फ्लैश फ्रीज उन्हें ली में तुरंत डाल द्वारारुपये नाइट्रोजन और प्रयोगशाला के लिए परिवहन। -80 डिग्री सेल्सियस तक प्रसंस्करण पर स्टोर नमूने हैं।
  3. डीएनए के सह-निष्कर्षण और आरएनए तलछट से
    नोट: निम्न प्रोटोकॉल ग्रीफिथ विधि 6 का एक संशोधित संस्करण है।
    1. क्लोरोफॉर्म: 500 μl CTAB-फॉस्फेट बफर और 500 μl फिनोल जोड़े isoamyl शराब (25: 24: 1) तलछट की 0.5 ग्राम युक्त 2 मिलीलीटर मनका lysing ट्यूब के लिए और ट्यूब पलटना 5-10 बार नमूना homogenize करने के लिए।
      सावधानी: एक धूआं हुड सभी समय पर उचित सुरक्षा गियर (यानी, प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और सुरक्षा चश्मे) पहनने में इस कदम को पूरा करें।
    2. 2.5 मिनट के लिए पूरी गति से भंवर। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    3. एक धूआं हुड में शीर्ष जलीय परत निकालने के लिए और एक नया 1.5 मिलीलीटर बाँझ microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण। बर्फ पर नमूने रखते हुए ठंडा क्लोरोफॉर्म के 500 μl जोड़ें: isoamyl शराब (24: 1)।
    4. कई बार पलटना जब तक एक पायस visib हैle। 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    5. एक धूआं हुड में शीर्ष जलीय परत निकालने के लिए और एक नया 1.5 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में जगह है। 30% PEG- NaCl समाधान के दो संस्करणों जोड़कर न्यूक्लिक एसिड वेग और अच्छी तरह मिलाएँ।
    6. 2 घंटे के लिए बर्फ पर सेते हैं या 4 डिग्री सीओ / एन पर नमूने छोड़ दें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 XG पर ऊष्मायन सेंट्रीफ्यूज नमूने के अंत में।
      नोट: एक गोली ट्यूब के नीचे दिखाई दे रहा हो सकता है।
    8. धीरे सतह पर तैरनेवाला एक micropipette का उपयोग हटाने, गोली परेशान नहीं सुनिश्चित करें। ट्यूब में खूंटी समाधान के लगभग 10 μl छोड़ दें और ठंडा 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 XG पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। धीरे-धीरे एक micropipette ख्याल रखने गोली छूने के लिए नहीं के साथ इथेनॉल को हटा दें।
    10. 5 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र और एक micropipette का उपयोग अवशिष्ट इथेनॉल को हटा दें। लगभग 5 मिनट के लिए शुष्क हवा गोली छोड़ दें।
    11. पुनः निलंबित 50 में गोली μl DEPC इलाजएच 2 ओ गुणवत्ता और डीएनए / आरएनए की उपज agarose जेल एक 1% agarose जेल 19 पर 5 μl चल वैद्युतकणसंचलन द्वारा जांच करते हैं। दो aliquots, डीएनए के लिए 15 μl और शाही सेना के लिए 30 μl में न्यूक्लिक एसिड फूट डालो।
    12. -80 में डीएनए की दुकान डिग्री सेल्सियस तक की जरूरत है। पृथक आरएनए के रूप में अगले खंड में दिए गए।

2. के डीएनए से मुक्त आरएनए की शाही सेना और गुणवत्ता की जांच तैयारी

  1. डीएनए के पाचन
    1. DNase मैं बफर के 3 μl और DNase के 1.5 μl मैं न्यूक्लिक एसिड के 30 μl मात्रा करने के लिए, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते जोड़ें।
    2. 30 सेकंड के लिए vortexing द्वारा DNase निष्क्रियता अभिकर्मक मिक्स। नमूने के लिए समाधान के 4.8 μl जोड़ें। 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं, कभी कभी समाधान मिश्रण करने के लिए ट्यूबों के नीचे नल।
    3. आरटी पर 90 सेकंड के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र, एक नया ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला (आरएनए) हस्तांतरण, देखभाल करने के वेग जो नीचे की ओर प्रतिक्रियाओं को बाधित कर सकते हैं हस्तांतरण करने के लिए नहीं।
    4. आरएनए गुणवत्ता की जांच
      1. बाँझ RNase मुक्त DH 2 हे के 18 μl को शाही सेना के 2 μl जोड़े 1:10 कमजोर करने के लिए।
        1. अलग पीसीआर प्रतिक्रियाओं में, एक बाँझ 0.5 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब को शाही सेना के स्वच्छ या 1:10 कमजोर पड़ने की 1 μl जोड़ें। पीसीआर प्रतिक्रिया घटकों प्रति 3 टेबल के रूप -16 rRNA जीन बढ़ाना जोड़ें। एक "सकारात्मक" (जैसे।, डीएनए एक शुद्ध जीवाणु संस्कृति से निकाली), एक "पीसीआर अवरोध" नियंत्रण शामिल है (यानी, सकारात्मक शुद्ध संस्कृति डीएनए के 1 μl और साफ निकाले शाही सेना के 1 μl) और एक "नकारात्मक" बाँझ RNase मुक्त DH 2 ओ का नियंत्रण
      2. 95 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट, (95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 57 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट) x 35 चक्र, 72 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट: निम्नलिखित मानकों के साथ प्रवर्धन thermocycler सेट करें।
      3. 40 मिनट के लिए 85 वी में एक 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद का 10% चलाएँ। DNase मैं उपचार दोहराने अगर एक पीसीआर उत्पाद पर्यावरण आर.एन. में बनाई हैएक नमूने हैं।

    3. शाही सेना से पहले Strand सीडीएनए की पीढ़ी

    1. एक RNAse / DNase मुक्त 0.2 मिलीग्राम पीसीआर ट्यूब के प्रति तालिका 4 के रूप में अभिकर्मकों जोड़ें।
    2. 65 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट पर नमूना सेते हैं। बर्फ पर कम से कम 1 मिनट के लिए रखें और फिर 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. एक ही ट्यूब करने के लिए 5 तालिका में सूचीबद्ध अभिकर्मकों जोड़ें।
    4. 50 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं। 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया निष्क्रिय।
    5. -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर स्टोर सीडीएनए।

    4. मात्रात्मक पीसीआर

    1. qPCR के लिए डीएनए मानकों की पीढ़ी
      1. बढ़ाना क्यू पीसीआर प्राइमरों (1369F और 1492R 21) के साथ शुद्ध संस्कृति से निकाले जीनोमिक डीएनए से बैक्टीरियल -16 rRNA अनुक्रम 20 (या हित के किसी भी अन्य अनुक्रम)।
      2. पीसीआर उत्पाद निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर शुद्ध।
      3. शुद्ध पीसीआर क्लोनएक 3'-टी की अधिकता निर्माता के निर्देशों के अनुसार वेक्टर प्रणाली क्लोनिंग में उत्पाद।
      4. पीसीआर निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोलाई JM109 सक्षम कोशिकाओं में सम्मिलित युक्त वेक्टर रूपांतरण।
      5. प्लेट एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल), एक्स-लड़की (20 माइक्रोग्राम / एमएल) और IPTG पर परिवर्तन के 50 μl (0.5 मिमी) Luria Bertani अगर प्लेट (tryptone 10 जी / एल, खमीर निकालने 5 ग्राम / एल, सोडियम क्लोराइड 10 ग्राम / एल, आगर 15 ग्राम / एल)। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।
      6. थाली से एक भी सकारात्मक सफेद transformant का चयन करें। 50 मिलीलीटर लेग 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त शोरबा में सकारात्मक transformant टीका लगाना और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन 250 rpm पर मिलाते हुए सेते हैं।
      7. हे / एन संस्कृति से, अलग-थलग और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का उपयोग प्लाज्मिड शुद्ध।
      8. प्लाज्मिड एक उचित प्रतिबंध एंजाइम है कि एक बार प्लाज्मिड काटने (जैसे, EcoRI) करने में सक्षम है का उपयोग कर Linearize।
        9. > अवशोषण अनुपात एक 260/280 ए 19 को मापने के द्वारा प्लाज्मिड की पवित्रता का विश्लेषण। अनुपात 1.8 से नीचे है, फिनोल के क्लोरोफॉर्म 19 के साथ प्लाज्मिड फिर से निकाल सकते हैं। नोट: शुद्ध डीएनए एक 1.8 अनुपात है।
      9. 260 एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 19 का उपयोग कर एनएम पर absorbance द्वारा प्लास्मिड डीएनए की एकाग्रता का निर्धारण।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, मात्रा का ठहराव की सटीकता एक फ्लोरोसेंट डीएनए बाध्यकारी एक fluorometer साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल डाई का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है।
      10. अनुक्रम प्लाज्मिड अड्डों में लक्ष्य के आकार की पुष्टि करने के लिए डालें। राशि प्लाज्मिड में डालने के डीएनए के (यानी, प्रतिशत) की गणना (एक 3000 बीपी वेक्टर में जैसे, एक 123 बीपी डीएनए टुकड़ा कुल डीएनए का 3.9% है) और एकाग्रता 4.1.10 में प्राप्त से गुना, निर्धारित करने के लिए लक्ष्य (डालने) के डीएनए एकाग्रता।
      11. μl प्रति लक्ष्य की प्रतियां गणना करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
        लोड / 54067 / 54067eq1.jpg "/>
      12. डबल कतरा डीएनए की औसत आणविक वजन (dsDNA, आधार जोड़ी प्रति 660 Daltons) द्वारा लक्ष्य डीएनए के आधार जोड़े की संख्या से गुणा करके लक्ष्य आण्विक वजन (TMW) की गणना।
      13. डीएनए के 2 μl और बाँझ DH 2 ओ के 18 μl का उपयोग कर 10 10 10 करने के लिए 2 प्रतियां से एक रेंज में लक्ष्य डीएनए पतला प्रत्येक कमजोर पड़ने अच्छी तरह मिक्स और अगले कमजोर पड़ने करने से पहले नीचे संक्षेप में स्पिन।
    2. qPCR के लिए आरएनए मानक वक्र की पीढ़ी
      1. कदम 4.1.5 से, लक्ष्य रिवर्स प्राइमर (यानी, R1492) और आगे वेक्टर प्लाज्मिड प्राइमर M13F का उपयोग कर कॉलोनी पीसीआर 19 से सफेद कालोनियों (लगभग 5) के एक नंबर स्क्रीन।
        नोट: प्राइमरों के इस संयोजन नदी के ऊपर एक T7 प्रमोटर साइट के साथ सही अर्थों उन्मुखीकरण में क्लोन सम्मिलित बढ़ाना होगा।
      2. पीसीआर उत्पाद निर्माता के निर्देश के बाद एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर शुद्ध। शुद्ध पीसीआर पी यों260 एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एनएम पर roduct।
      3. पीसीआर उत्पाद के 200 एनजी प्रत्येक ribonucleotide, 1 T7 प्रतिक्रिया बफर और इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए 1 T7 पोलीमर्स एंजाइम की 7.5 मिमी के साथ 20 μl के अंतिम मात्रा में जोड़ें।
      4. 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं। प्रतिक्रिया के लिए RNase मुक्त DNase की 1 यूनिट जोड़े मैं, 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते डीएनए टेम्पलेट हटा दें।
      5. इथेनॉल वर्षा 19 से इन विट्रो लिखित शाही सेना को स्वस्थ और 260 एनएम पर एक fluorimeter या absorbance के द्वारा उपयोग करते हुए आरएनए पैदावार यों।
      6. शाही सेना के μl प्रति प्रतिलिपि संख्या की गणना। लक्ष्य शाही सेना (जैसे, 123 कुर्सियां) T7 प्रमोटर (153 कुर्सियां) की लंबाई के आधार में जोड़े की संख्या जोड़े और आरएनए की औसत आणविक वजन, आधार प्रति 340 Daltons से गुणा करें।
      7. मात्रा निर्धारित लक्ष्य शाही सेना के 500 एनजी एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) प्रतिक्रिया के रूप में जोड़ें धारा 3 Serially सीडीएनए पतला में उल्लिखित के रूप में उपयोग के लिए 4.1.13 में उल्लिखितमानक वक्र के रूप में।
    3. वास्तविक समय पीसीआर
      1. पिघलना पर्यावरण डीएनए / सीडीएनए नमूने, मानकों और बर्फ पर qPCR अभिकर्मकों। प्रकाश से fluorogenic जांच को सुरक्षित रखें।
      2. मानक वक्र के लिए मानकों पतला के रूप में 4.1.14 में उल्लिखित। / बाँझ DH 2 ओ के 18 μl के लिए नमूना के 2 μl जोड़कर स्वच्छ से 10 -3 के लिए सीडीएनए पर्यावरण डीएनए के 1:10 dilutions बनाओ
      3. प्रतिक्रियाओं की कुल संख्या और प्रति टेबल 6 (प्राइमरों और जांच) और टेबल 7 (प्रतिक्रिया मिश्रण) के रूप में 10% के लिए एक मास्टर मिश्रण प्रतिक्रिया करते हैं। अच्छी तरह से और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज मिक्स।
      4. एक 96 अच्छी तरह से ऑप्टिकल qPCR थाली में एक अच्छी तरह से मास्टर मिश्रण के 19 μl और टेम्पलेट के 1 μl (मानक, पर्यावरण नमूना या नकारात्मक नियंत्रण के लिए पानी) जोड़ें। तीन प्रतियों में प्रत्येक प्रतिक्रिया (मानक, पर्यावरण के नमूनों और नकारात्मक नियंत्रण) प्रदर्शन करना।
      5. एक क्यू पीसीआर ऑप्टिकल कवर के साथ 96 अच्छी तरह से थाली को कवर किया। प्लेट संक्षेप में अपकेंद्रित्र। लोडqPCR मशीन की हीटिंग ब्लॉक में थाली और ढक्कन बंद कर दें।
      6. qPCR प्रबंधक सॉफ्टवेयर खोलें। "प्रोटोकॉल टैब पर क्लिक करें" "नया बनाने के लिए" क्लिक करें, निम्न प्रवर्धन की स्थिति जोड़ें: 95 डिग्री सेल्सियस, (10 सेकंड में 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड 60 डिग्री सेल्सियस) 3 मिनट x 40 चक्र। 20 μl के लिए नमूना मात्रा सेट, "ठीक" क्लिक करें और प्रोटोकॉल बचाने के लिए।
      7. "थाली" टैब पर क्लिक करें। के तहत "चयनित संपादित करें" "fluorophore का चयन करें" क्लिक करें, उचित जांच, जैसे, fluorescein के लिए रिपोर्ट डाई जोड़ें। ओके पर क्लिक करें"।
      8. मानकों युक्त कुओं को हाइलाइट करें, "नमूना प्रकार" मेनू से "मानक" का चयन करें। "दोहराने श्रृंखला" बदलने से 3 "आकार को दोहराने", क्लिक करें "लागू" के लिए क्लिक करें। , मानक 1 के लिए गणना की प्रारंभिक एकाग्रता जोड़ने के लिए "कमजोर पड़ने श्रृंखला" पर क्लिक कमजोर पड़ने कारक (10), चयन "कम" या "बढ़ती" आदेश के आधार पर मानक वक्र जोड़ा गया है संकेत मिलता हैथाली करने के लिए। "लागू" पर क्लिक करें।
      9. अच्छी तरह हाइलाइट अज्ञात नमूने युक्त पदों, "नमूना प्रकार" से चुनें "अज्ञात" ड्रॉप डाउन मेनू। "दोहराने श्रृंखला" क्लिक करें और "लागू" 3. क्लिक करने के लिए बदल "आकार को दोहराने"। के तहत "नमूना नाम" नमूना नामों को संपादित करें। के लिए कोई खाका नियंत्रण (एनटीसी) कुओं प्रक्रिया दोहराएँ।
      10. क्लिक करें प्लेट संपादक बॉक्स पर "ठीक है" और फ़ाइल सहेजें। "रन शुरू" पर क्लिक करें।
      11. रन के पूरा होने पर, डेटा विश्लेषण विंडो खुलेगा। मानक वक्र, मानक वक्र वर्णनकर्ता (तालिका 8) और प्रवर्धन भूखंडों प्रदर्शित करने के लिए "मात्रा का ठहराव टैब" पर क्लिक करें।
      12. सी.पी. मूल्यों के लिए "मात्रा का ठहराव डेटा" टैब पर क्लिक करें और इसी जीन अज्ञात नमूनों की (वर्ग) की मात्रा शुरू। स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के लिए तालिका निर्यात अगर जरूरी है।
      13. कमजोर पड़ने कारक द्वारा अज्ञात के नमूनों से गुणा जीन प्रचुरता, तलछट extrac की मात्रासे टेड और कुल मात्रा न्यूक्लिक एसिड गीला वजन तलछट के ग्राम प्रति जीन प्रतियां प्राप्त करने के लिए eluted थे।
        नोट: Elute डीएनए तलछट की 0.5 ग्राम से 50 μl में, 1/10 पतला, एक क्यू की पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में 1 μl जोड़ने; जीन प्रतियां डीएनए एक्स कमजोर पड़ने कारक x क्षालन मात्रा एक्स 2 के μl: गुणा करके गणना जीन प्रतियां जी -1 तलछट।

Representative Results

अवसादों से अच्छी गुणवत्ता वाले डीएनए और आरएनए की निकासी के जीन और प्रतिलेख प्रचुरता बढ़ाता में पहला कदम है। एक सफल निष्कर्षण पैदावार स्पष्ट डीएनए और आरएनए बैंड नमूना एसी, जहां तेज 23S और -16 rRNA बैंड उच्च आणविक वजन जीनोमिक डीएनए बैंड के अलावा दिखाई दे रहे हैं के लिए चित्रा 1 में संकेत के रूप में।

आकृति 1
चित्रा 1. डीएनए / आरएनए निष्कर्षण। तीन प्रतियों से डीएनए / आरएनए निष्कर्षण से ठेठ परिणाम (एबीसी) 0.5 ग्राम तटीय अवसादों। डीएनए / शाही सेना के 5 μl 40 मिनट के लिए 85 वी में एक 1.4% agarose पर चलाया गया था। 10,037-200 बीपी रेंज में एक आणविक मार्कर का इस्तेमाल किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक qPCR प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल -16 rRNA डीएनए को निशाना उल्लिखित है। -16 के लिए rRNA टेप मानक घन स्थानापन्नRVE और सीडीएनए के साथ टेम्पलेट। अज्ञात नमूने मानक वक्र के खिलाफ मात्रा निर्धारित कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए कि मानक वक्र अच्छी गुणवत्ता का है जरूरी है। चित्रा 2 (ए), मानक घटता है और पर्यावरण डीएनए dilutions, (बी), मानक वक्र के प्रवर्धन की तैयारी से पता चलता है और पर्यावरण के नमूनों (सी) एक रेखीय प्रतिगमन और जीन प्रतिलिपि संख्या की गणना करने के लिए मानक वक्र के रूपांतरण। जब एक 10 गुना कमजोर पड़ने रेंज सही ढंग से तैयार किया जाता है और प्रत्येक मानक कमजोर पड़ने के बीच एक 3.3 चक्र अंतर परिलक्षित देखा जाता है (चित्रा 2Bi) (यह 100% प्रवर्धन क्षमता पर टेम्पलेट में दस गुना वृद्धि के लिए 3.3 चक्र लेता है)। आर 2 110 90% तक की रेंज (चित्रा 2 सी) के भीतर 0.99 की पीसीआर क्षमता मूल्यों और सहित मानक घटता वर्णनकर्ता, वांछित हैं। यह कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) यदि वर्तमान से सी.पी. मूल्यों रिपोर्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस मानकों और अज्ञात नमूने 3.3 चक्र (के लिए एक वाणिज्यिक पत्र कटऑफ होती है, तो <उन्हें> यानी, एक लॉग गुना)) एनटीसी के सी.पी. मूल्य लगाया गया है 20 (चित्रा 2Cii से अधिक है। अज्ञात तलछट डीएनए से निकाले टेम्पलेट स्वच्छ से मात्रा निर्धारित किया गया था, 10 -1, 10 और 10 -2 -3 dilutions (बी)। साफ नमूना बढ़ाना नहीं था, 10 -1 10 -3 के लिए dilutions के सी.पी. मूल्यों में क्रमश: 24.12, 26.02 और 28.40 थे। एनटीसी सी.पी. 30.5 था, 27.2 के एक राष्ट्रीय राजधानी क्षेत्र कटऑफ लगाया गया था। जी के लिए जीन परिवर्तित प्रचुरता -1 गीला वजन तलछट कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए 10 -1 और 10 के लिए 2.5 10 x 7 और 7.1 x 10 7 में हुई -2 क्रमशः। 10 -3 कमजोर पड़ने सी.पी. एनटीसी कटऑफ नीचे था, और इसलिए इस्तेमाल नहीं किया गया था। इस मामले में 10 -2 इष्टतम टेम्पलेट कमजोर पड़ने के रूप में चयनित किया गया था।

चित्र 2
चित्रा 2. -16 rRNA जीन QPCमानकों के आर प्रवर्धन और पर्यावरण डीएनए तटीय अवसादों से निकाली गई। (ए) i) डीएनए मानक वक्र की तैयारी और ii) qPCR प्रवर्धन के लिए पर्यावरण डीएनए dilutions, (ख) मैं की qPCR प्रवर्धन) डीएनए मानक वक्र और ii) पर्यावरण के नमूनों, प्रत्येक नमूने के लिए वाणिज्यिक पत्र दिखाए जाते हैं। (सी) i) मानक वक्र वर्णनकर्ता के साथ मानक वक्र के रेखीय प्रतिगमन ii) पर्यावरण के नमूनों से जीन प्रचुरता की गणना। एनटीसी:। नकारात्मक खाका नियंत्रण यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक रकम
CTAB 5 ग्राम
कश्मीर 2 4 HPO x3H 2 ओ 2.58 छ
के.एच. 2 4 पीओ 0.1 ग्राम
NaCl 2.05 छ
DH 2 हे अप करने के लिए 100 मिलीलीटर

तालिका 1 CTAB-फॉस्फेट बफर की तैयारी।

अभिकर्मक रकम
खूंटी 6000 30 ग्राम
NaCl 9.35 छ
DH 2 हे अप करने के लिए 100 मिलीलीटर
नोट: धीरे-धीरे मध्यम हीटिंग और DH 2 ओ की 50 मिलीलीटर की क्रियाशीलता के तहत खूंटी 6000 को जोड़ने

तालिका 2 खूंटी NaCl वर्षा समाधान की तैयारी।

अभिकर्मक रकम
Undiluted आरएनए / पतला 1:10 आरएनए 1.0 μl
10x पीसीआर बफर 5.0 μl
10 मिमी dNTPs 1.0 μl
63F आगे प्राइमर 1.0 μl
कैग जीसीसी TAA सीएसी ATG CAA जीटीसी
518R रिवर्स प्राइमर 1.0 μl
एटीटी एसीसी GCG GCT GCT जी जी
Taq पोलीमरेज़ 0.4 μl
RNase मुक्त DH 2 हे 40.6 μl

तालिका 3. डीएनए मुक्त आरएनए गुणवत्ता की जांच पीसीआर मास्टर मिश्रण।

अभिकर्मक रकम
आरएनए 0.5-5 माइक्रोग्राम
10 मिमी dNTPs 1 μl
रिवर्स प्राइमर 10 माइक्रोन / रैंडम hexamers 50 माइक्रोन के 1 μl
DEPC-एच 2 ओ अप करने के लिए 13 μl

तालिका 4. सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया मिश्रण ए

अभिकर्मक रकम
बफर 5x 4 μl
डीटीटी 1 μl
RNAse अवरोध करनेवाला 1 μl
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस 1 μl

सारणी 5. सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया मिश्रण बी

लक्ष्य प्राइमर नाम अनुक्रम एनीलिंग टी (डिग्री सेल्सियस) संदर्भ
-16 RRNA बैक्टीरिया Bact1369F CGG TGA अता CGT TCY CGG 56 सुजुकी एट अल। 2000 19
Prok1492R GGW टीएसी सीटीटी GTT ACG अधिनियम टी
TM1389F (जांच) सीटीटी जीटीए सीएसी एसीसी जीसीसी CGT सी
ove_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> 6 तालिका प्राइमर और क्यू -16 rRNA पीसीआर परख के लिए जांच।

अभिकर्मक रकम
2x मास्टर मिक्स 10 μl
आगे प्राइमर (10 माइक्रोन) के 0.8 μl
रिवर्स प्राइमर (10 माइक्रोन) के 0.8 μl
जांच (10 माइक्रोन) के 0.4 μl
पानी 7.0 μl
अंतिम मात्रा 19 μl

टेबल 7. वास्तविक समय पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण।

डिस्क्रिप्टर महत्व
सहसंबंध गुणांक (आर 2) मानक वक्र के linearity का एक उपाय। आदर्श रूप में यह 2 आर = 1 होना चाहिए। आर 2 = 0.98-0.99 का मूल्य स्वीकार्य हैं।
ढलान (α) प्रतिक्रिया दक्षता का एक उपाय। आदर्श रूप में यह -3.32 करने के लिए बराबर होना चाहिए। -3.58 और -3.1 के बीच सीमा में मान।
क्षमता (= 10 (-1 / ढलान) -1) यह 100% है, टेम्पलेट्स घातीय प्रवर्धन के दौरान प्रत्येक थर्मल चक्र के बाद डबल्स। एक अच्छा दक्षता सीमा 90 और 110% के बीच है।
Y अवरोधन (β) प्रतिक्रिया का पता लगाने के सैद्धांतिक सीमा। हालांकि प्रतिक्रिया संवेदनशीलता यों इस्तेमाल नहीं है, यह महत्वपूर्ण है जब एक ही लक्ष्य के विभिन्न मानक घटता की तुलना है।

8 तालिका QPCआर प्रतिक्रिया वर्णनकर्ता।

Discussion

qPCR के साथ डीएनए / आरएनए निष्कर्षण के संयोजन एक तेजी से, सही, अपेक्षाकृत लागत प्रभावी ऐसे तटीय तलछट के रूप में पर्यावरण के नमूने, की एक सीमा से जीन और प्रतिलेख प्रचुरता के संवेदनशील मात्रा का ठहराव के लिए तरीका प्रदान करता है।

प्रारंभिक न्यूक्लिक एसिड निकासी माइक्रोबियल समुदाय की एक प्रतिनिधि दृश्य 22 हासिल की है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम है। क) कुल सेल की उपलब्धि, ख) निरोधात्मक यौगिकों (जैसे, humic एसिड या polyphenolics के सह निकासी), ग) आरएनए अंश में दूषित डीएनए, घ): सीमाओं के एक नंबर निकासी प्रोटोकॉल के लिए विचार किया जाना चाहिए निकाले न्यूक्लिक एसिड का तेजी से क्षरण जब संग्रहीत। सावधानियां आदेश में इन सीमाओं को नाकाम करने में लिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, विशेष रूप से देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि न्यूक्लिक एसिड की निकासी नमूना प्रकार (जैसे, तलछट, मिट्टी, अपशिष्ट, आदि के लिए अनुकूलित है लिया जाना है)। न्यूक्लिक एसिड उपज और दोनों डीएनए और आरएनए के लिए गुणवत्ता में महत्वपूर्ण सुधार प्रारंभिक प्रयोगों 23 से बाहर ले जाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। पीसीआर आधारित अनुप्रयोगों 24 पर निरोधात्मक यौगिकों के प्रभाव को कम करने के लिए, निकाले डीएनए और आरएनए से dilutions की एक श्रृंखला का परीक्षण करें। कई फ्रीज पिघलना चक्र से निकाले गए डीएनए / आरएनए का तेजी से क्षरण को नाकाम और -80 डिग्री सेल्सियस पर आनुवंशिक जानकारी के संभावित नुकसान, स्टोर कई छोटी मात्रा aliquots से बचने के लिए।

सावधानी से तैयार है, qPCR एक मजबूत, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और संवेदनशील तरीका है। विशेष रूप से, प्रवर्धन और मानक वक्र निर्माण के लिए तरीकों इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित हित के किसी भी जीन लक्ष्य, अन्य वंशावली मार्कर (यानी, अर्चेअल -16 rRNA, फंगल 18S rRNA) या वातावरण में महत्वपूर्ण कार्यों में शामिल जीन सहित के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। qPCR के उपयोग में ज्ञात सीमाएं हैं: एक) प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उच्च गुणवत्ता रों की पीढ़ीपूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए tandard वक्र, ख) प्राइमर / जांच के चुनाव और क्यू पीसीआर परख शर्तों के अनुकूलन, ग) कम गुणवत्ता / sheared न्यूक्लिक एसिड, घ) डीएनए / आरएनए का काम कर रहे कमजोर पड़ने की पसंद का उपयोग निषेध से बचने के लिए । इसके अलावा, यह है कि qPCR तकनीक जीन / प्रतिलेख प्रचुरता है जो मायने रखता है सेल के लिए समानता नहीं कर सकते हैं प्रदान करता है पर विचार किया जाना है: यह विशेष रूप से मामला है जब 16S और 18S rRNA जीन को निशाना बनाया जाता है, के रूप में सूक्ष्मजीवों उनके जीनोम में ribosomal जीन के विभिन्न प्रतिलिपि संख्या है 25।

खराब गुणवत्ता मानक घटता हित के जीन की गलत मात्रा का ठहराव में परिणाम होगा। यह छोटे aliquots में उच्च एकाग्रता के मानकों से ताजा मानक घटता बनाया जा सकता है के एक शेयर की दुकान के लिए अच्छा अभ्यास है। मानक घटता दुकान नहीं है, हमेशा सर्वोच्च एकाग्रता हर बार के एक शेयर से ताजा dilutions बनाओ। पर्यावरण के नमूनों की सही मात्रा का ठहराव के लिए स्टेन की सांद्रता की सीमा सुनिश्चितदर्द की अवस्था अज्ञात नमूनों की उम्मीद सी.पी. मूल्यों तक फैला है। जब टेप बढ़ाता, आरएनए फंसे डीएनए डबल नहीं से मानक वक्र का निर्माण। जब संभव हो, नमूने सीधे तुलना में किया जा करने के लिए की मात्रा का ठहराव अंतर-परख भिन्नता 20 से बचने के लिए एक एकल परख के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। यह हमेशा संभव नहीं हो सकता है। इसलिए, assays के बीच उत्पन्न जीन प्रचुरता तुलना करने के लिए यह assays के बीच दोहराया नमूनों की एक यादृच्छिक उप-सेट करने के लिए सलाह दी जाती है। प्राइमर और जांच सेट की एक विस्तृत चयन वर्तमान में qPCR माइक्रोबियल taxa और कार्य समूहों जब इन लक्ष्य समूह के लिए दोनों अधिक से अधिक कवरेज और विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए का चयन 15. सावधानी से विचार की जरूरत है लक्षित करने के लिए उपलब्ध हैं। यदि एक qPCR परख की प्रतिक्रिया दक्षता संतोषजनक नहीं है, समस्या निवारण विभिन्न थर्मल साइकिल चालन की स्थिति, परीक्षण और / या प्रतिक्रिया की स्थिति, जैसे (annealing समय और / या तापमान के रूप में) प्राइमर जांच सांद्रता के साथ अलग से शुरू होता है। हेnce क्यू पीसीआर परख और प्रतिक्रिया की स्थिति अनुकूलित कर रहे हैं, हमेशा उचित टेम्पलेट एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए डीएनए / सीडीएनए dilutions की एक श्रृंखला के एक प्रारंभिक परीक्षा का आयोजन करेगा। कमजोर पड़ने रेंज आगे assays के लिए इष्टतम टेम्पलेट कमजोर पड़ने के रूप में उच्चतम प्रतिलिपि संख्या में जिसके परिणामस्वरूप का चयन करें।

वर्तमान में, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों कुशलता से वातावरण 26,27,28 के ढेर में माइक्रोबियल समुदाय संरचना और कार्यों पर प्रकाश डाला। हालांकि, इन डेटासेट अक्सर अंत बिंदु पीसीआर amplicon पुस्तकालयों के आधार पर कर रहे हैं और इसलिए विशेष taxa की बहुतायत के केवल अर्द्ध मात्रात्मक आकलन प्रदान करते हैं। इसलिए, वास्तविक समय पीसीआर आधारित तकनीक की क्षमता विशिष्ट वर्गीकरण मार्कर निशाना बनाने के लिए (तनाव के स्तर तक नीचे उच्च डोमेन से) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा प्राप्त परिणामों के कुशल सत्यापन की अनुमति देता है। इसके अलावा, qPCR सफलतापूर्वक स्थिर आईएसओ के रूप में अन्य माइक्रोबियल पारिस्थितिकी आणविक विधियों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया हैटोपे की जांच कर रही (एसआईपी) या वंशावली / कार्यात्मक प्रोटीन। पूर्व उपकरण के साथ संयुक्त, qPCR पाचन सक्रिय समुदाय 29,30 यों इस्तेमाल किया जा सकता है। जब माइक्रोएरे विश्लेषण के साथ संयुक्त, qPCR वातावरण 31,32 की वंशावली मार्कर आधारित और कार्यात्मक जीन सर्वेक्षण के प्रमुख मात्रात्मक व्याख्या प्रदान करता है।

इसलिए, चाहे अकेले या अन्य (अक्सर प्रक्रिया आधारित) पारिस्थितिकी तंत्र समारोह के आकलन के साथ संयोजन में उपयोग किया, मात्रात्मक पीसीआर माइक्रोबियल समुदायों और पारिस्थितिकी तंत्र के कार्यों के बीच मायावी लिंक के अन्वेषण में माइक्रोबियल परिस्थिति के लिए एक अनिवार्य उपकरण है।

Acknowledgments

इस प्रकाशन अनुदान संख्या NERC पूर्वोत्तर / JO11959 / 1 और विज्ञान फाउंडेशन आयरलैंड और CJS करने के लिए अनुदान संख्या 11 / SIRG / B2159awarded तहत मैरी क्यूरी कार्रवाई COFUND के तहत प्राकृतिक पर्यावरण अनुसंधान परिषद (NERC) की वित्तीय सहायता के साथ किए गए शोध से emanated गया है और पूर्वी शैक्षिक अनुसंधान कंसोर्टियम (पूर्वी एआरसी)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethylpyrocarbonate Sigma 40718 Toxic, open under chemical hood
cetrimonium bromide (CTAB) Sigma 52365 Irritant, open under chemical hood
potassium phosphate dibasic  Sigma RES20765
potassium phosphate monobasic  Sigma P9791
Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8 Sigma P2069 Equilibrate at pH 8 before using
Chloroform : Isoamylalcohol Sigma 25666
sodium chloride VWR 1.06404.0500
polyethylenglycol 6000  VWR 528877-100
Ethanol Molecular Grade Sigma E7148
Lysing Matrix E tubes MP Biomedical 116914050 
Turbo DNAse  Ambion AM1907
Taq polymerase Sigma D1806
dNTPs Bioline BIO-39028
SuperScript III Life Technologies 18080044
Rnase Inhibitor Life Technologies 10777019
RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes Sarstedt 72.985.002
SureCleanPlus Bioline BIO-37047
pGEM Easy T Vector Promega A1360
E. coli JM109 competent cells Promega L2005
Tryptone Sigma T7293
Yeast Extract Sigma 70161
Ampicillin Sigma 59349
X-Gal Bioline BIO-37035
IPTG Bioline BIO-37036
Agar VWR 20768.235
Plasmid Midi Kit Qiagen 12143
Qubit Life Technologies Q33216
Quant-IT DNA HS Assay Life Technologies Q-33120
Quant-IT RNA HS Assay Life Technologies Q32855
MEGAshortscript kit Ambion AM1354
TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit Bioline BIO-84002
qPCR machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Curr. Opin. Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).
  2. Zhou, J., Bruns, M. A., Tiedje, J. M. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 62, 316-322 (1996).
  3. Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., Ghiorse, W. C. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures from soil and sediments samples. Appl. Environ. Microbiol. 65 (11), 4715-4724 (1999).
  4. Burgmann, H., Pesaro, M., Widmer, F., Zeyer, J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods. 45 (1), 7-20 (2001).
  5. Hurt, R. A., et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4495-4503 (2001).
  6. Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
  7. Martins, G., et al. Structure and activity of lacustrine sediment bacteria involved in nutrient and iron cycles. FEMS Microbiol. Ecol. 77 (3), 666-679 (2011).
  8. Kuffner, M., et al. Effects of season and experimental warming on the bacterial community in a temperate mountain forest soil assessed by 16S rRNA gene pyrosequencing. FEMS Microbiol. Ecol. 82 (3), 551-562 (2011).
  9. Tatti, E., et al. Influences of over winter conditions on denitrification and nitrous oxide-producing microorganism abundance and structure in an agricultural soil amended with different nitrogen sources. Agric. Ecosyst . Environ. 183, 47-59 (2014).
  10. Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L., Field, K. G. Genetic diversity in the Sargasso Sea bacterioplankton. Nature. 345, 60-62 (1990).
  11. Ward, D. W., Weller, R., Bateson, M. M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms a natural community. Nature. 345, 63-65 (1990).
  12. Suzuki, M. T., Giovannoni, S. J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixture of 16S rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62, 625-630 (1996).
  13. Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22, 130-138 (1997).
  14. Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H. Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5' 3' Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase. PNAS. 88, 7276-7280 (1991).
  15. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 2-20 (2009).
  16. Park, S. J., Park, B. J., Rhee, S. K. Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments. Extremphiles. 12 (4), (2008).
  17. Urakawa, H., Yoshida, T., Nishimura, M., Ohwada, K. Characterization of depth-related population variation in microbial communities of a coastal marine sediment using 16S rDNA-based approaches and quinone profiling. Environ. Microbiol. 2, 542-554 (2008).
  18. Smith, C. J., Dong, L. F., Wilson, J., Stott, A., Osborn, A. M., Nedwell, D. B. Seasonal variation in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia process rates and corresponding key functional genes along an estuarine nitrate gradient. Front. Microbiol. 6, 542 (2015).
  19. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. 205 (2001).
  20. Smith, C. J., Nedwell, D. B., Dong, L. F., Osborn, A. M. Evaluation of Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR) based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples. Environ. Microbiol. 8 (5), 804-815 (2006).
  21. Suzuki, M. T., Taylor, L. T. DeLong E.F., Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial population via 5'-nuclease assays. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4605-4614 (2000).
  22. Luna, G. M., Dell'Anno, A., Danovaro, R. DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments. Environ. Microbiol. 8 (2), 308-320 (2005).
  23. Lever, M. A., Torti, A., Eickenbursch, P., Michaud, A. B., Šantl-Temkiv, T., Jørgensen, B. B. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front. Microbiol. 6, 476 (2015).
  24. Lloyd, K. G., MacGregor, B. J., Teske, A. Quantitative PCR methods for RNA and DNA in marine sediments: maximizing yield while overcoming inhibition. FEMS Microbol. Ecol. 72, 144-151 (2010).
  25. Klappenbach, J. A., Dumbar, J. M., Schmidt, T. M. rRNA Operon copy number reflects ecological strategies of bacteria. App. Environ. Microbiol. 66 (4), 1328-1333 (2000).
  26. Shi, Y., Tyson, G. W., Eppley, J. M., DeLong, E. F. Integrated metatrascriptomic and metagenomics analyses of stratified microbial assemblages in the open ocean. ISME J. 5, 999-1013 (2011).
  27. Howe, A. C., Jansson, J. K., Malfatti, S. A. Tringe S.G., Tiedje J.M., & Brown C.T. Tackling soil diversity with the assembly of large, complex metagenomes. PNAS. 111 (13), 4904-4909 (2014).
  28. Klaedtke, S., et al. Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages. Environ. Microbiol. , (2015).
  29. Lueders, T., Wagner, B., Claus, P., Friedrich MW, Stable isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi and protozoa in oxic rice field soil). Environ. Microbiol. 6, 60-72 (2004).
  30. Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
  31. Bürgmann, H., et al. Transcriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate (DMSP). Environ. Microbiol. 9 (11), 2742-2755 (2007).
  32. He, J. Z., et al. Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes. ISME J. 1, 67-77 (2007).

Tags

पर्यावरण विज्ञान अंक 112 डीएनए शाही सेना के सह-निष्कर्षण शाही सेना की तैयारी तलछट -16 rRNA जीन -16 rRNA टेप क्यू पीसीआर आर टी-क्यू पीसीआर वास्तविक समय पीसीआर।
तटीय तलछट और -16 की मात्रा rRNA जीन और टेप से एक साथ डीएनए शाही सेना निकालना वास्तविक समय पीसीआर द्वारा
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tatti, E., McKew, B. A., Whitby, C., … More

Tatti, E., McKew, B. A., Whitby, C., Smith, C. J. Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR. J. Vis. Exp. (112), e54067, doi:10.3791/54067 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter