Abstract
또한, 정량적 PCR (Q-PCR)으로 알려진 실시간 중합 효소 연쇄 반응은 환경 시료 분류학 및 관능기 유전자 존재비 정량화 미생물 생태에서 널리 사용되는 도구이다. 역전사 반응 (RT-Q-PCR)와 병용되는, 또한 유전자 전 사체를 정량화하는데 이용 될 수있다. Q-PCR 반응의 지수 적 단계의 PCR 증폭 산물의 정량을 허용 고감도 화학 형광 검출을 사용한다. 따라서, PCR 반응의 고원 위상 검출 '끝점'PCR과 관련된 편향 방지된다. 프로토콜은 PCR이 제공되는 실시간 통해 해안 퇴적물에서 세균의 16S rRNA의 유전자와 성적 증명서를 정량화한다. 첫째, DNA가없는 RNA의 제조를 위해 요구되는 추가 단계를 포함 해안 퇴적물에서 DNA와 RNA의 동시 추출을위한 방법은, 설명한다. 둘째, 16S rRNA의 유전자와 TR의 정량화를위한 단계별 가이드Q-PCR 및 RT-Q-PCR을 통해 추출 된 핵산에서 anscripts이 설명되어 있습니다. 이것은 DNA와 RNA 표준 곡선의 건설을위한 세부 사항을 포함한다. 미생물 생태학에서 RT-Q-PCR 분석의 사용에 대한 주요 고려 사항이 포함되어 있습니다.
Introduction
미생물 생물권 구동 생태계 기능의 모퉁이 돌입니다. 미생물의 대부분은 한 교양 남아있다. 따라서 분자 기반의 접근 방식은 환경에서 미생물의 다양성과 기능에 대한 우리의 이해를 발전의 기초입니다. 이러한 방법으로 중앙 환경 시료로부터 핵산을 추출하고 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 표적 유전자의 후속 증폭이다.
DNA / RNA 추출의 제 1 단계는 미생물 군집 존재하는 세포벽을 용균 원하지 않는 핵산 분자 (예를 들어, 유기 및 무기 물질)를 제거하고 상기 다운 스트림 분석 용 용액 DNA / RNA를 유지하는 것이다. 상용 추출 키트의 범위를 포함 문헌 2,3,4,5에서 사용할 수있는 몇 가지 옵션, 중, 그리피스 방법 6 널리 7,8,9를 사용한다. 이는 경제적 인 및 PA이 세포를 용균하는 비드 치는 공정을 사용하여 동시에 DNA 및 RNA를 회수하는 동안, 이러한 부식 산과 같은 PCR 억제제의 동시 추출을 최소화하는 단계를 포함로 rticularly 잘 퇴적물에 적합한.
두 번째 단계는 상기 추출 된 핵산에서, 예컨대 16S rRNA의 분류 학적 마커로서 표적 유전자를 증폭하는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용한다. 이 방법은 보유하고지지 않은 미생물 블랙 박스 10, 11의 탐사를 촉진하고 있습니다. 그러나, 엔드 포인트 PCR 기반의 방법은 여러 가지 제한으로 고통 그 수는 바이어스 미생물 군집 (12)의 특성을. 정확하게 유전자 / 사체 존재비를 정량화하기 위해, 정량적 PCR (qPCR에)라고도 실시간 PCR이 사용되어야한다. qPCR에는 PCR의 매 사이클 후 앰플 리콘 축적을 추적 형광 리포터 염료 시스템을 이용한다. 이 정량화가 아니라, 초기 지수 단계에서 발생할 수 있다는 것을 의미한다 이것은 중요하다앰플 리콘 수율 여전히 표적 유전자의 최초 풍부 정비례 종점은 PCR 반응의 위상보다.
두 리포터 시스템은 일반적으로 사용된다 :는 인터 핵산 얼룩 (13) 및 DNA 폴리머 라 아제 (14)의 5 '3'엑소 뉴 클레아 제 활성. 전 리포터 시스템은 모든 이중 가닥 DNA에 결합하기 때문에 불필요한 indistinctively 비특이적 증폭 산물 또는 부산물 프라이머 다이머가 발생할 경우에는 표적 서열의 과대 추정을 초래할 수도있다. 이것을 회피하기 위해, 증폭 광범위한 최적화가 요구 될 수있다. 후자의 시스템에서, 템플릿 증폭은 절단 내부에서 형광 프로브를 Taq 중합 효소의 5 '뉴 클레아 제 활성의 조합을 사용하여 추적된다. 이 기능으로 인해 보완적인 목표 별 sequenc에만 결합하는 형광 프로브의 이용에 분석의 특이성을 증가프라이머 쌍의 전자. 화학 양으로 정량 형광의 증가에 의해 측정 된 PCR 증폭 산물의 축적이 현저히 배경 형광 위에 교차 포인트 (CP)를 결정함으로써 달성된다.
qPCR에 광범위하게 다른 환경 15 유전자 존재비를 결정하는 미생물 생태에 사용되어왔다. 또한, cDNA를 RNA로 역전사는 유전자 발현을 qPCR의 정량화 및 RT-qPCR에 결합된다. 따라서, qPCR에와 RT-qPCR에 환경 시료 내 유전자 및 / 또는 성적 증명서 수의 정량 빠르고 효과적인 방법을 나타냅니다.
해안 퇴적물의 미생물은 유기물의 광물, 오염 물질의 분해 및 질소 16,17,18 등의 다량 영양소의 생지 화학 순환 등 다양한 생태계 프로세스를 구동한다. 이러한 변환의 철저한 이해는 포괄적 인 accoun이 필요합니다유전자 및 성적 증명서 존재비에 대한 정량적 인 데이터를 포함 기여하는 미생물 집단의 t. 여기에서 우리는 해안 퇴적물의 세균의 16S rRNA 유전자 및 성적 증명서 존재비의 정량화를 위해 철저하게 테스트, 간소화 및 표준화 된 프로토콜의 시리즈를 소개합니다. 프로토콜은 시료 채취 동시 DNA 및 RNA 추출, DNA-RNA 프리 전처리, 추출 된 핵산의 품질 검사, 16S rRNA의-DNA와 -RNA 표준 환경 시료의 정량의 생성을 설명합니다. 여기에 기술 된 방법에서 파생 된 정량적 데이터는 연안 생태계를 구동 미생물 지역 사회에 빛을 흘렸다 필요하다.
Protocol
해양 해안 퇴적물 1. DNA 및 RNA 추출
- 리보 뉴 클레아 제 (의 RNAse) - 무료 재료와 작업 공간의 준비
- 0.1 % 디 에틸 피로 카보 (DEPC)로 처리하여 RNAse가없는 증류수 (DH 2 O)를 준비하고 37 ° CO / N에 품어. 15 분 동안 121 ° C에서 DH 2 O 고온 가압 멸균에 의해 잔류 DEPC를 제거합니다. 사용 DEPC 모든 솔루션을 만들기 위해 DH 2 O 처리 하였다.
- 180 ° CO / N의 모든 유리를 굽는다. 플라스틱 뚜껑과 테두리를 제거 2 M NaOH를 O / N의 용액을 흡수하고, 사용하기 전에 DH 2 O 처리 DEPC로 씻어.
- 표 1에서와 같이 CTAB 포스페이트 버퍼 용액을 제조 하였다.
- 표 2에 따라, PEG-NaCl을 침전 솔루션을 준비합니다.
- 모든 작업 표면 (즉, 벤치, 마이크로 원심, 흄 후드) 및 시작하기 전에 솔루션의 RNAse가-오염 제거 사용 가능한 Micropipette를 청소합니다. 전체 절차를 수행하는 동안 장갑을 착용 할 것. 샘플 교차 오염을 방지하기 위해 마이크로 피펫 필터 팁과 함께 RNAse가없는 plasticware를 사용합니다.
- 환경 시료 채취 및 보관
- 상단 2.5 cm에서 멸균 50 ㎖ 팔콘 튜브를 사용하여 간조시 해안 퇴적물를 수집합니다. 퇴적물의 약 15-20g를 수집합니다. 조심스럽게 샘플 수집 후 뚜껑을 닫습니다. 즉각적인 처리를 위해 4 ° C에서 쿨러의 실험실로 즉시 전송.
- 2 ml의 비드 박동 튜브에 멸균 주걱과 나누어과 습 중량 퇴적물의 0.5 g을 혼합하여 시료를 균질화. 나누어지는 추가 복제, 액체 질소에 배치하여 플래시 동결. -80 ° C에서 보관 씩. 주의 : 액체 질소를 처리 할 때 보호 장갑과 보안경을 착용 할 것.
참고 : 필드 사이트가 필드 사이트에서 2 ml의 멸균의 microcentrifuge 튜브에 실험실, 나누어지는 침전물 0.5 g에 가까운 위치하지 않은 경우. 리튬에 즉시 넣어 튜브를 플래시 동결실험실에 파운드 질소 및 전송. 처리까지 -80 ° C에서 보관 샘플.
- 퇴적물에서 DNA의 공동 추출 및 RNA
주 : 다음 프로토콜 그리피스 방법 (6)의 수정 된 버전이다.- 클로로포름 : 500 μL CTAB-인산 완충액 500 ㎕의 페놀 추가 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1) 퇴적물 0.5 g을 함유하는 2 ml의 비드 용균 튜브와 상기 튜브를 50-10 시간 반전 샘플을 균질화.
주의 : 항상 적절한 보호 장비 (즉, 실험실 코트, 장갑, 안전 고글)을 착용 흄 후드에서이 단계를 수행합니다. - 2.5 분 동안 전속력으로 소용돌이. 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기.
- 흄 후드에서 정상 수성 층을 추출하여 새로운 1.5 ml의 멸균 microcentrifuge 관에 전송할 수 있습니다. 빙냉 클로로포름 500 μL를 추가하고, 얼음 위에 시료를 유지 : 이소 아밀 알코올 (24 : 1).
- 에멀젼은 visib 때까지 여러 번 전환르. 4 ° C에서 16,000 XG에 10 분 동안 원심 분리기.
- 흄 후드에서 정상 수성 층을 추출하여 새로운 1.5 ml의 멸균 튜브에 넣습니다. 30 % NaCl 용액 PEG- 두 볼륨을 첨가하여 핵산을 침전 잘 섞는다.
- 2 시간 동안 얼음에 품어 4 ° CO / N에서 샘플을 둡니다.
- 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 × g으로 원심 분리에 배양 시료의 끝에.
참고 : 펠렛은 튜브의 하단에 표시 될 수 있습니다. - 조심스럽게 마이크로 피펫을 이용하여 상층 액을 제거 펠렛을 방해하지 않도록합니다. 튜브에 PEG 용액의 약 10 μl를두고 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 1 ㎖를 추가합니다.
- 4 ° C에서 16,000 XG에 20 분 동안 원심 분리기. 천천히 마이크로 피펫는 펠렛을 건드리지 않도록주의하면서 에탄올을 제거합니다.
- 5 초 동안 원심 분리기 및 마이크로 피펫을 사용하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 약 5 분 동안 공기 건조에 펠렛을 둡니다.
- 다시 일시 중지 (50)의 펠렛을 μL DEPC를 처리H 2 O 1 % 아가 로스 겔 19 5 μl를 실행하는 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 품질 및 DNA / RNA 수율을 조사한다. 이 분취, DNA 15 μL와 RNA 30 μL로 핵산을 나눈다.
- 필요할 때까지 -80 ° C에서 DNA를 저장합니다. 다음 섹션에 설명 된대로 RNA를 분리합니다.
- 클로로포름 : 500 μL CTAB-인산 완충액 500 ㎕의 페놀 추가 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1) 퇴적물 0.5 g을 함유하는 2 ml의 비드 용균 튜브와 상기 튜브를 50-10 시간 반전 샘플을 균질화.
DNA가없는 RNA의 RNA 및 품질 확인 2. 준비
- DNA의 소화
- 내가 핵산의 30 μl의 볼륨에, 30 분 동안 37 ° C에서 부화의 DNase I 버퍼의 3 μL와 DNase의 1.5 μl를 추가합니다.
- 30 초 동안 볼 텍싱하여 DNase의 불 활성화 시약을 섞는다. 샘플에 대한 해결책의 4.8 μl를 추가합니다. 때때로 용액을 혼합하여 튜브의 하단을 탭을 5 분 동안 실온에서 인큐베이션.
- , RT에서 90 초 동안 10,000 XG에 원심 분리기 하류 반응을 억제 할 수 침전물을 전송하지 않도록주의하면서 새로운 튜브에 뜨는 (RNA)을 전송합니다.
- RNA의 품질 검사
- 1:10 희석 멸균 RNAse가없는 DH 2 O 18 μL에 RNA의 2 μl를 추가합니다.
- 별도의 PCR 반응에서, 멸균 0.5 ㎖의 PCR 튜브에 RNA의 깔끔한 1:10 희석 1 μl를 추가합니다. . 표 3 당으로 16S rRNA 유전자를 증폭하는 PCR 반응 구성 요소를 추가 "긍정적"(예., 순수한 세균성 문화에서 추출한 DNA)는 "PCR 억제제"컨트롤을 포함합니다 (즉, 긍정적 인 순수 문화의 DNA 1 μL와 1 깔끔한 추출 된 RNA의 μL) 및 멸균 RNAse가없는 DH 2 O.의 "부정적"제어
- 95 ° C 5 분 (95 ° C 30 초, 57 ° C 30 초, 72 ℃에서 1 분) 35주기를 X, 72 ° C에서 10 분 다음 증폭 매개 변수를 사용하여 열 순환기를 설정합니다.
- 40 분 85 V에서 1 % 아가 로스 겔에 PCR 제품의 10 %를 실행합니다. PCR 산물은 환경 RN에 형성되는 경우의 DNase I 처리를 반복샘플.
- 1:10 희석 멸균 RNAse가없는 DH 2 O 18 μL에 RNA의 2 μl를 추가합니다.
RNA에서 첫 번째 가닥의 cDNA의 3 세대
- 의 RNAse / DNase를 무료로 0.2 ml의 PCR 튜브에 표 4에 따라 시약을 추가합니다.
- 65 ° C 5 분에서 샘플을 품어. 적어도 1 분 동안 얼음에 위치하게 한 후, 10 분간 25 ℃에서 배양한다.
- 같은 튜브에 표 5에 나와있는 시약을 추가합니다.
- 50 분 동안 55 ° C에서 샘플을 품어. 10 분 동안 72 ℃에서 반응을 비활성화한다.
- 사용할 때까지 -20 ° C에서 보관 된 cDNA.
4. 정량적 PCR
- qPCR에 대한 DNA 표준의 생성
- Q-PCR 프라이머 (1369F 및 1492R 21)와 순수 배양에서 추출한 게놈 DNA로부터 세균의 16S rRNA의 순서 (20) (또는 관심의 다른 시퀀스)를 증폭.
- 제조업체의 지시에 따라 상업용 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다.
- 정제 된 PCR을 복제제조업체의 지시에 따라 벡터 시스템을 복제 3'-T 오버행으로 제품.
- 이 PCR을 제조자의 지시에 따라 대장균 JM109 적격 세포에 삽입 함유 변환 벡터.
- 플레이트 암피실린 (100 μg의 / ㎖), X-여자 (20 μg의 / ㎖) 및 IPTG 상 변환의 50 μL (0.5 mM)을 루리아 베르 타니 플레이트 (트립 톤 10g / L, 효모 추출물 5g / L, 염화나트륨 10g, 한천 / L, 한천 15g의 / 리터). 37 ° C에서 O / N을 품어.
- 플레이트에서 하나의 긍정적 인 흰색 형질 전환 체를 선택합니다. 100 ㎍ / ml 암피실린 50 ㎖의 LB 배지에서 양성 형질 전환 체를 접종하고, 37 ℃에서 O / N은 250 rpm에서 진탕을 배양한다.
- 오 / N 배양에서 분리하고 제조자의 지시에 따른 상업용 키트를 사용하여 플라스미드를 정제.
- (예를 EcoRI) 일단 플라스미드를 절단 할 수있는 적절한 제한 효소를 이용하여 플라스미드를 선형화.
- 분광 광도계 (19)를 이용하여 260 nm에서 흡광도에 의해 플라스미드 DNA의 농도를 결정한다.
참고 : 또는 정량화의 정확도가 형광과 함께 사용되는 형광 DNA 결합 염료의 사용에 의해 개선 될 수있다. - 플라스미드 서열은 기지의 타깃의 크기를 확인하기 위해 삽입한다. 양 플라스미드에 삽입 된 DNA의 (즉, 비율)를 계산 (3000 염기쌍 벡터의 예를, 123 염기쌍의 DNA 단편은 총 DNA의 3.9 %이다)과를 결정하기 4.1.10에서 얻어진 농도 곱 대상 (삽입)의 DNA 농도.
- μL 당 대상의 카피를 계산하는 다음 수학 식을 사용하여
로드 / 54067 / 54067eq1.jpg "/> - 이중 가닥 DNA의 평균 분자량 (dsDNA, 염기쌍 당 660 달톤)에 의해 상기 타겟 DNA의 염기쌍의 수를 곱함으로써 목표 분자량 (TMW)를 계산한다.
- DNA 2㎕의 멸균 DH 2 O. 18 μL를 사용하여 10 10 10 행이 복사의 범위에서 표적 DNA 희석 각 희석 잘 혼합하고 다음 희석하기 전에 잠시 스핀 다운.
- qPCR에 대한 RNA 표준 곡선의 발생
- 단계 4.1.5에서 목표 역방향 프라이머 (즉, R1492) 및 순방향 벡터 플라스미드 M13F 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR (19)에 의해 백색 콜로니 (약 5)의 수를 선별.
참고 : 프라이머의 조합은 상류 T7 프로모터 사이트와 정확한 감지 방향으로 복제 된 삽입을 증폭됩니다. - 제조자의 지시에 따라 상업용 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다. 정제 된 PCR 피를 정량화분광 광도계를 사용하여 260 nm에서는 roduct.
- 시험 관내 전사 반응에 각 리보 1 T7 반응 완충액 1 T7 중합 효소 7.5 mm의 20 ㎕의 최종 부피에서 PCR 산물의 200 ng의 추가.
- 37 ° C에서 4 시간 동안 반응을 품어. 나는 DNA 템플릿을 제거하기 위해 37 ℃에서 15 분 동안 품어 반응에의 RNase없는 DNase의 1 단위를 추가합니다.
- 에탄올 침전 (19)에 의한 시험 관내 전사의 RNA를 복구하고 260 nm에서 형광 계 또는 흡광도로를 사용하여 RNA 수율을 정량화.
- RNA의 μL 당 사본의 수를 계산합니다. T7 프로모터 (153 염기)의 길이 표적 RNA (예, 123 염기)에서 염기쌍의 수를 추가하고 RNA의 평균 분자량 기지국 당 340 달톤 곱한다.
- 사용 4.1.13에 설명 된대로 직렬 섹션 3. cDNA를 희석에 설명 된대로 역전사 효소 (RT) 반응을 정량화 된 목표 RNA의 500 NG 추가표준 곡선있다.
- 단계 4.1.5에서 목표 역방향 프라이머 (즉, R1492) 및 순방향 벡터 플라스미드 M13F 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR (19)에 의해 백색 콜로니 (약 5)의 수를 선별.
- 실시간 PCR
- 해동 환경 DNA / cDNA를 샘플, 표준 및 얼음에 qPCR에 시약. 빛에서 형광 프로브를 보호합니다.
- 4.1.14에 설명 된대로 표준 곡선에 대한 기준을 희석. / 깔끔한에서 10-3로 cDNA를 멸균 DH 2 O 18 μL로 샘플 2 μl를 추가하여 환경 DNA 1:10 희석합니다
- 총 반응의 수를 더한 표 6 (프라이머 및 프로브) 및 표 7 (반응 혼합물)에 따라 10 %에 대한 마스터 믹스 반응을 확인합니다. 잘 간단히 원심 분리기 섞는다.
- 96 웰 광학 qPCR에 플레이트에 각 웰에 마스터 믹스 19 μL 및 템플릿 1 μL (표준, 음성 대조군에 대한 환경 시료 또는 물)를 추가합니다. 세중의 각 반응 (표준, 환경 시료 및 음성 대조군)을 수행합니다.
- A Q-PCR 광학 커버 96 웰 플레이트를 커버. 잠시 접시를 원심 분리기. 로드qPCR에 기계의 가열 블록에 접시와 뚜껑을 닫습니다.
- qPCR에 관리자 소프트웨어를 엽니 다. 은 "프로토콜 탭을"클릭 "새로 만들기"를 클릭, 다음 증폭 조건을 추가 : 3 분 95 ° C (10 초 95 ° C, 30 초 60 ° C)를 40주기를 X. 20 μL로 설정 샘플 볼륨, "OK"버튼을 클릭 프로토콜을 저장합니다.
- 은 "판"탭을 클릭합니다. "선택 편집"에서 "형광을 선택"을 클릭 적절한 프로브, 예를 들어, 형광에 대한 보고서 염료를 추가합니다. "OK"를 클릭합니다.
- "샘플 유형"메뉴에서 "표준"선택 기준을 포함하는 우물을 선택합니다. 변경 3 "크기를 복제", "적용"을 클릭합니다 "시리즈를 복제"를 클릭합니다. 표준 1 계산 시작 농도를 추가 할 "희석 시리즈"를 클릭하여 표준 곡선이 추가 된 희석 배수 (10), 선택 "감소"또는 순서에 따라 "증가"를 표시판에. "적용"을 클릭합니다.
- 잘 알려지지 않은 샘플을 포함하는 위치를 강조 표시 "샘플 유형"에서 "알"을 선택 드롭 다운 메뉴. "시리즈를 복제"를 클릭하고 "적용"3.에 "크기를 복제"로 변경합니다. "샘플 이름"에서 샘플 이름을 편집합니다. 아니 템플릿 컨트롤 (NTC) 우물 반복 절차.
- 판 에디터 박스에 "OK"를 클릭하고 파일을 저장합니다. "실행을 시작합니다"를 클릭합니다.
- 실행 완료시, 데이터 분석 창이 열립니다. 표준 곡선, 표준 곡선 기술자 (표 8)과 증폭 플롯을 표시합니다 "정량 탭 '을 클릭합니다.
- CP 값에 대해 "정량 데이터"탭을 클릭하고 미지 시료의 유전자 (SQ)의 양을 시작 대응. 스프레드 시트 소프트웨어로 내보내기 테이블은 경우에 필요합니다.
- 희석 요인에 의해 미지 시료에서 곱하기 유전자 존재비, 퇴적물 extrac의 양테드 전량 핵산 습윤 중량 침전물 그램 당 유전자 사본을 얻기 위해 용출 하였다.
A Q-PCR 반응에 템플릿으로 1 μl를 추가, 50 μL에 침전물 0.5 g에서 용출 DNA를 1/10 희석; 참고 : 유전자 사본을 DNA X 희석 계수 X 용출 볼륨 × 2의 μL : 곱하여 유전자 복사 g -1 침전물을 계산합니다.
Representative Results
퇴적물에서 좋은 품질의 DNA와 RNA의 추출은 유전자 및 성적 증명서 존재비를 정량의 첫 번째 단계입니다. 성공적인 추출 수율 날카로운 23S 및 16S rRNA의 대역은 고 분자량의 게놈 DNA 밴드 이외에 볼 수 시료 AC에 대한도 1에 나타낸 바와 같이 명확한 DNA 및 RNA 밴드.
그림 1. DNA / RNA 추출. 세중에서 DNA / RNA 추출에서 전형적인 결과 (ABC) 0.5 g 해안 퇴적물. DNA / RNA의 5 ㎕를 40 분 동안 85 V에서 1.4 % 아가로 오스에서 실행되었다. 10,037-200 bp의 범위에있는 분자 마커를 사용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
qPCR의 반응 프로토콜은 16S rRNA의 DNA를 표적 개략되어있다. 16S를 들어 rRNA의 성적은 표준 세제곱 대체cDNA로 RVE 및 템플릿. 미지 시료가 표준 곡선에 대해 정량화되고,도 2. 표준 곡선은 양질 인 것을 보장하기 위해 필수적이다 (A)의 표준 곡선과 환경 DNA 희석액 (B)의 표준 곡선의 증폭의 제조를 나타낸다 유전자 카피 수의 선형 회귀 계산 표준 곡선 및 환경 시료 (C) 전환. 10 배 희석 범위는 정확하게 준비하고, 본 각 표준 희석액 사이에 3.3 사이클의 차이를 증폭 할 때 (도 2Bi) (이것은 100 % 증폭 효율 템플릿에서 10 배 증가를 3.3 사이클을 소요). 90 ~ 110 %의 범위 (도 2C) 내에서 0.99의 R 값이 PCR 효율을 포함하여 표준 곡선 디스크립터가 바람직하다. 어떤 템플릿 컨트롤 (NTC) 존재하는 경우에서 CP 값을보고하는 것이 중요하다. 이것은 <표준 및 미지 시료 3.3주기 (CP에 대한 차단이 발생하면EM> 즉, 로그 배) (20) (그림 2Cii를 부과하는 NTC의 CP 값)보다 높다. 침전물 DNA 추출 알 수없는 템플릿, 깔끔한에서 10-1, 10-2 및 10-3 희석 (B)를 정량 하였다. 깔끔한 샘플은 10 -1 -3 (10)에 희석의 CP 값이 각각 24.12, 26.02 및 28.40이었다 증폭하지 않았다. NTC CP는 27.2의 NCT 차단 부과하고, 30.5이었다. g에 유전자 존재비를 변환 -1 습 중량 침전물은 10 -1 10 × 10 (7) 2.5 및 7.1 × 10 (7) 결과 -2 각각 희석 범위. 10-3 희석 CP는 NTC 차단 이하이고, 따라서 사용되지 않았다. 이 경우 10-2 최적 희석 템플릿으로서 선택 하였다.
도 2의 16S rRNA 유전자 QPCR 표준의 증폭 및 해안 퇴적물에서 추출 된 환경 DNA. (A) ⅰ) DNA 표준 곡선의 준비 및 qPCR의 증폭 II) 환경 DNA 희석액 (B)의 I qPCR의 증폭) DNA 표준 곡선과 ⅱ) 환경 시료는 샘플마다 CP를 나타낸다. (C) ⅰ) 표준 곡선 기술자와 표준 곡선의 선형 회귀 분석, 환경 시료에서 유전자 존재비의 ⅱ) 계산. NTC :. 음 템플릿 컨트롤 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 양 |
| CTAB | 5g |
| K 2 HPO 4 x3H 2 O | 2.58 g |
| KH 2 PO 4 | 0.1 g |
| 염화나트륨 | 2.05 g |
| DH 2 O | 최대 100 ㎖ |
CTAB - 인산 완충 표 1. 준비.
| 시약 | 양 |
| PEG 6000 | 30g |
| 염화나트륨 | 9.35 g |
| DH 2 O | 최대 100 ㎖ |
| 참고 : 천천히 적당한 난방과 DH 2 O. 50 ㎖의 교반 PEG 6000를 추가 | |
PEG-NaCl을 침전 용액의 표 2. 준비.
| 시약 | 양 |
| 희석 RNA / 1시 10분 희석 RNA | 1.0 μL |
| 10 배 PCR 버퍼 | 5.0 μL |
| 10 밀리미터의 dNTPs | 1.0 μL |
| 63F 정방향 프라이머 | 1.0 μL |
| CAG GCC TAA CAC ATG의 CAA의 GTC | |
| 518R 역방향 프라이머 | 1.0 μL |
| ATT ACC GCG의 GCT GCT GG | |
| Taq 중합 효소 | 0.4 μL |
| RNAse가없는 DH 2 O | 40.6 μL |
표 3. DNA가없는 RNA 품질 검사 PCR 마스터 믹스.
| 시약 | 양 |
| RNA | 0.5 μg의 |
| 10 밀리미터의 dNTPs | 1 μL |
| 역방향 프라이머 10 μM / 랜덤 헥사 50 μM | 1 μL |
| DEPC-H 2 O | 최대 13 μL |
표 4의 cDNA 합성 반응 혼합 A.
| 시약 | 양 |
| 버퍼 5 배 | 4 μL |
| DTT | 1 μL |
| 의 RNAse 억제제 | 1 μL |
| 역전사 효소 | 1 μL |
표 5의 cDNA 합성 반응 혼합 B.
| 목표 | 프라이머 이름 | 순서 | 어닐링 T (° C) | 참고 |
| 16S rRNA의 박테리아 | Bact1369F | CGG TGA ATA CGT TCY CGG | (56) | 스즈키 외. 2000 19 |
| Prok1492R | GGW TAC CTT GTT ACG ACT T | |||
| TM1389F (프로브) | CTT GTA CAC ACC GCC CGT C |
| 시약 | 양 |
| 배 마스터 믹스 | 10 μL |
| 앞으로 프라이머 (10 μM) | 0.8 μL |
| 역방향 프라이머 (10 μM) | 0.8 μL |
| 프로브 (10 μM) | 0.4 μL |
| 물 | 7.0 μL |
| 최종 볼륨 | 19 μL |
표 7. 실시간 PCR 반응 혼합물.
| 설명 | 의미 |
| 상관 계수 (R 2) | 표준 곡선의 선형성의 측정 단위입니다. 이상적으로는 = 1 R 2 있어야합니다. R 2 = 0.98-0.99의 값이 허용됩니다. |
| 경사 (α) | 반응 효율의 측정. 이상적으로는 -3.32에 해당해야한다. -3.58과 -3.1 사이의 범위에있는 값입니다. |
| 효율 (= 10 (-1 / 경사) -1) | 100 % 인 경우, 템플릿은 지수 적 증폭 동안 각 열 사이클 후에 배가. 좋은 효율 범위는 90와 110 % 사이입니다. |
| Y 절편 (β) | 반응 검출의 이론적 한계. 반응 민감도를 정량화하는데 사용되지 않지만 동일한 대상의 다른 표준 곡선을 비교하면, 중요하다. |
표 8. QPCR 반응 디스크립터.
Discussion
qPCR을 가진 DNA / RNA 추출의 조합은 해안 퇴적물 등 환경 샘플의 범위에서 유전자 전 사체 존재비 민감한 정량 빠르고, 정확하고, 비교적 비용 효율적인 방법을 제공한다.
초기 핵산 추출은 22 달성 미생물 커뮤니티 본 대표 시야를 확보하기위한 중요한 공정이다. 억제 성 화합물 (예를 들면, 휴믹산이나 폴리 페놀의) 총 세포 용해의 달성, b) 공 추출)를 RNA 분획에있어서, c) 오염 DNA, d) : 많은 제한이 추출 프로토콜을 고려할 필요 저장 추출한 핵산 분해성. 주의 사항은 이러한 제한을 우회하기 위해주의해야한다. 예를 들어, 특별한주의 핵산 추출 시료 유형 (예를 들어, 퇴적물, 토양, 하수 등을 위해 최적화 될 수 있도록 수행되어야). DNA 및 RNA 모두 핵산의 수율 및 품질을 크게 향상 예비 실험 23을 실시함으로써 달성 될 수있다. PCR 기반 애플리케이션 (24)에서 억제 성 화합물의 효과를 최소화하기 위해, 추출 된 DNA와 RNA의 희석액 범위를 테스트한다. 여러 동결 해동 사이클에서 추출 된 DNA / RNA의 급속한 저하를 회피하고 -80 ° C에서 유전 정보의 손실 가능성, 저장 다수의 소량 씩을 방지 할 수 있습니다.
신중하게, qPCR에 설계 할 때 A, 강력한 높은 재현성 및 민감한 방법이다. 특히,이 프로토콜에 명시된 증폭 및 표준 곡선의 건설을위한 방법은 다른 계통 마커 (즉, 고세균 16S의 rRNA의, 곰팡이 18S의 rRNA의) 또는 환경에서 중요한 기능에 관여하는 유전자를 포함하는 관심의 유전자 대상에 대해 적용 할 수 있습니다. qPCR에 사용 알려진 한계가있다 : 재현성이 고품질 s의) 생성절대 정량 tandard 곡선, b) 프라이머 / 프로브의 선택 및 Q-PCR 분석 조건의 최적화, c) 저품질 / 전단 핵산, d) DNA / RNA의 작용 희석액의 선택의 사용 금지를 피하기 . 또한,이 qPCR의 기술은 수를 셀에 동등하지 않을 수도 유전자 / 사체 존재비를 제공하는 것이 고려되어야한다 : 미생물들이 게놈 리보솜 유전자의 다른 사본 번호가 이것은 16S 및 18S rRNA의 유전자를 표적으로하는 경우는, 특히 인 25.
품질이 낮은 표준 곡선은 관심있는 유전자의 부정확 한 정량화가 발생합니다. 신선한 표준 곡선이 만들어 질 수있는 작은 분량 씩 높은 농도 수준의 재고를 저장하는 것이 좋습니다. 표준 곡선을 보관하지 마십시오, 항상 가장 높은 농도마다의 재고에서 신선한 희석합니다. 환경 시료의 정확한 정량을 위해 스탠의 농도의 범위를 확인바 닥 곡선은 미지 시료의 예상 CP 값에 걸쳐있다. 성적 증명서를 정량화 할 때, 가닥 DNA를 두 번하지 RNA의 표준 곡선을 구성. 가능한 경우 직접 비교 될 샘플의 정량 분석 간 편차 20을 피하기 위해 하나의 분석 내에 완료되어야한다. 이것은 항상 가능하지 않을 수 있습니다. 따라서, 분석 사이에 발생 유전자 존재비를 비교하기는 분석간에 복제 샘플의 임의의 서브 세트를 가지고하는 것이 좋습니다. 프라이머 및 프로브 세트의 다양한 현재 qPCR에 미생물 분류군과 대상 그룹의 최대 범위와 특이도 모두를 위해 다음을 선택할 때 15주의 깊은 고려가 필요한 기능 그룹을 대상으로 사용할 수 있습니다. 의 qPCR 분석의 반응 효율이 만족스럽지 않은 경우, 문제는, 예를 들어, 및 / 또는 반응 조건 (열처리 시간 및 / 또는 온도가 같은) 다른 열 사이클링 조건 테스트 프라이머 프로브 농도를 변화 시작한다. 영형질문-PCR 분석 및 반응 조건을 최적화 NCE 항상 적절한 템플릿 농도를 결정하는 DNA / cDNA의 희석액 범위의 초기 테스트를 수행. 추가 분석을위한 최적의 템플릿 희석으로 가장 높은 카피 수의 결과로 희석 범위를 선택합니다.
현재 차세대 시퀀싱 기술을 효율적으로 환경 26,27,28의 과다에 미생물 군집 구조와 기능에 빛을 흘렸다. 그러나 이러한 데이터 세트는 종종 엔드 포인트 PCR 증폭 물 라이브러리를 기반으로하기 때문에 특정 분류군의 풍요의 반 정량적 평가를 제공합니다. 따라서, 리얼 타임 PCR 계 기술의 능력이 특정 분류 학적 마커를 타겟팅 (다운 균주 수준 높은 도메인부터) 차세대 시퀀싱 한 결과를 효율적으로 검증 할 수있다. 또한 qPCR에 성공적으로 안정한 ISO 다른 미생물 생태 분자 방법과 조합하여 사용 된술을 많이 마시다 프로빙 (SIP) 또는 계통 / 기능 마이크로 어레이. 전 공구와 결합 qPCR에의 대사 활성 지역 (29, 30)을 계량 할 수있다. 마이크로 어레이 분석과 함께 사용하면 qPCR에는 환경 (31, 32)의 계통 발생 학적 마커 기반 및 기능성 유전자 설문 조사의 주요 정량적 인 해석을 제공합니다.
따라서 여부를 단독으로 또는 생태계 기능의 다른 (종종 프로세스 기반) 평가와 함께 사용, 정량적 PCR은 미생물 군집 및 생태계 기능 사이의 애매 링크의 탐사 미생물 생태에 필수적인 도구입니다.
Acknowledgments
이 책은 허가 번호 NERC NE / JO11959 / 1 과학 재단 아일랜드 및 CJS에 허가 번호 11 / SIRG / B2159awarded에서 마리 퀴리 액션 COFUND 아래에있는 자연 환경 연구위원회 (NERC)의 재정 지원으로 수행 연구에서 발산했다 및 동부 학술 연구 컨소시엄 (동부 ARC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
| cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
| Chloroform : Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
| sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
| polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
| Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
| Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
| Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
| Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
| SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
| RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
| SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
| pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
| E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
| Tryptone | Sigma | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
| Ampicillin | Sigma | 59349 | |
| X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
| IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
| Agar | VWR | 20768.235 | |
| Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
| Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
| Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
| MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
| TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
| qPCR machine |
References
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Curr. Opin. Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).
- Zhou, J., Bruns, M. A., Tiedje, J. M. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 62, 316-322 (1996).
- Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., Ghiorse, W. C. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures from soil and sediments samples. Appl. Environ. Microbiol. 65 (11), 4715-4724 (1999).
- Burgmann, H., Pesaro, M., Widmer, F., Zeyer, J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods. 45 (1), 7-20 (2001).
- Hurt, R. A., et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4495-4503 (2001).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Martins, G., et al. Structure and activity of lacustrine sediment bacteria involved in nutrient and iron cycles. FEMS Microbiol. Ecol. 77 (3), 666-679 (2011).
- Kuffner, M., et al. Effects of season and experimental warming on the bacterial community in a temperate mountain forest soil assessed by 16S rRNA gene pyrosequencing. FEMS Microbiol. Ecol. 82 (3), 551-562 (2011).
- Tatti, E., et al. Influences of over winter conditions on denitrification and nitrous oxide-producing microorganism abundance and structure in an agricultural soil amended with different nitrogen sources. Agric. Ecosyst . Environ. 183, 47-59 (2014).
- Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L., Field, K. G. Genetic diversity in the Sargasso Sea bacterioplankton. Nature. 345, 60-62 (1990).
- Ward, D. W., Weller, R., Bateson, M. M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms a natural community. Nature. 345, 63-65 (1990).
- Suzuki, M. T., Giovannoni, S. J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixture of 16S rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62, 625-630 (1996).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22, 130-138 (1997).
- Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H. Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5' 3' Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase. PNAS. 88, 7276-7280 (1991).
- Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 2-20 (2009).
- Park, S. J., Park, B. J., Rhee, S. K. Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments. Extremphiles. 12 (4), (2008).
- Urakawa, H., Yoshida, T., Nishimura, M., Ohwada, K. Characterization of depth-related population variation in microbial communities of a coastal marine sediment using 16S rDNA-based approaches and quinone profiling. Environ. Microbiol. 2, 542-554 (2008).
- Smith, C. J., Dong, L. F., Wilson, J., Stott, A., Osborn, A. M., Nedwell, D. B. Seasonal variation in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia process rates and corresponding key functional genes along an estuarine nitrate gradient. Front. Microbiol. 6, 542 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. 205 (2001).
- Smith, C. J., Nedwell, D. B., Dong, L. F., Osborn, A. M. Evaluation of Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR) based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples. Environ. Microbiol. 8 (5), 804-815 (2006).
- Suzuki, M. T., Taylor, L. T. DeLong E.F., Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial population via 5'-nuclease assays. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4605-4614 (2000).
- Luna, G. M., Dell'Anno, A., Danovaro, R. DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments. Environ. Microbiol. 8 (2), 308-320 (2005).
- Lever, M. A., Torti, A., Eickenbursch, P., Michaud, A. B., Šantl-Temkiv, T., Jørgensen, B. B. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front. Microbiol. 6, 476 (2015).
- Lloyd, K. G., MacGregor, B. J., Teske, A. Quantitative PCR methods for RNA and DNA in marine sediments: maximizing yield while overcoming inhibition. FEMS Microbol. Ecol. 72, 144-151 (2010).
- Klappenbach, J. A., Dumbar, J. M., Schmidt, T. M. rRNA Operon copy number reflects ecological strategies of bacteria. App. Environ. Microbiol. 66 (4), 1328-1333 (2000).
- Shi, Y., Tyson, G. W., Eppley, J. M., DeLong, E. F. Integrated metatrascriptomic and metagenomics analyses of stratified microbial assemblages in the open ocean. ISME J. 5, 999-1013 (2011).
- Howe, A. C., Jansson, J. K., Malfatti, S. A. Tringe S.G., Tiedje J.M., & Brown C.T. Tackling soil diversity with the assembly of large, complex metagenomes. PNAS. 111 (13), 4904-4909 (2014).
- Klaedtke, S., et al. Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages. Environ. Microbiol. , (2015).
- Lueders, T., Wagner, B., Claus, P., Friedrich MW, Stable isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi and protozoa in oxic rice field soil). Environ. Microbiol. 6, 60-72 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Bürgmann, H., et al. Transcriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate (DMSP). Environ. Microbiol. 9 (11), 2742-2755 (2007).
- He, J. Z., et al. Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes. ISME J. 1, 67-77 (2007).
