Abstract
Nötrofiller, insan kan dolaşımında en bol lökositlerdir ve hızlı bir şekilde enflamatuar sitelere alınırlar. Astar nötrofillerin fagositik işlevselliğini artıran önemli bir olaydır. Kapsamlı çalışmalar, H. pylori ve yaralanma içinde mevcut ve nötrofil priming önemini meydana gelmiş olsa da, yok olmuştur, in vivo olarak bu işlemi görselleştirme anlamına gelir. Floresan-konjuge anti-limfosit antijen enjeksiyonu ile elde 2 -) 'de in vivo nötrofil etiketleme emişli bir ölçüsü olarak kullanılır - 1) DsRed reporter sinyalini: Resim protokolü üç yöntemleri birleştirerek yaşayan hayvanlarda priming nötrofil dinamik işlem izlenmesini sağlar 6G (Ly6G) monoklonal antikoru (mAb) ve 3) intravital konfokal görüntüleme. Birkaç kritik adımlar bu protokol katılmaktadırlar: oksazolon kaynaklı fare kulak deri iltihabı, hayvanların uygun sedasyon, anti-Ly6G mAb'nin tekrarlanan enjeksiyonları ve prevgörüntüleme sırasında odak kayması ention. Bir kaç sınırlamalar gibi bir fare sürekli görüntüleme süresi (~ 8 saat) sınırı ve floresein izotiosiyanat-dekstran inflamatuar durumda kan damarlarından sızıntısı olarak, gözlenmemiş olmasına karşın, bu protokolü intravital görüntüleme için temel bir çerçeve sağlar kolayca fare inflamasyon modellerinde diğer bağışıklık hücrelerinin incelenmesi genişletilebilir prime nötrofil davranış ve işlev.
Introduction
Nötrofiller dolaşımda en bol ve kısa ömürlü lökositler bulunmaktadır. Onlar hızla de antimikrobiyal peptidler ve proteazlar 1 içeren granüller ile birlikte reaktif oksijen ve nitrojen ara serbest bırakılması yoluyla profesyonel fagositler hizmet enfeksiyon veya yaralanma sitelerine işe alınırlar. Onların işe sırasında, nötrofiller inflamasyon 2 bir yerinde girişte belirgin gelişmiş fagosit işlevselliği ile sonuçlanan mikrobiyal ürünler, chemoattractants ve inflamatuar sitokinler dahil olmak üzere çeşitli ajanlar tarafından "prime" vardır. Nötrofil hazırlığını mekanizmaları yoğun vitro 3,4 çalışılmıştır; Bununla birlikte, in vivo koşullarında işlemin dinamik kontrolü tarihi mümkün olmamıştır.
Son zamanlarda, intravital görüntüleme görselleştirilmesi ve canlı organizmalarda biyolojik süreçlerin hücresel dinamiklerini miktarının belirlenmesi için önemli bir teknik haline gelmiştir. Intravital görüntüleme geleneksel tek foton uyarma mikroskobu ile (örneğin, konfokal) gerçekleştirilen veya multiphoton mikroskopi 5 yaklaşımlar olabilir. Zamanla, önemli gelişmeler artan görüntü çözünürlüğü, gelişmiş görüntüleme derinliği sağlayan bu teknikle elde edilmiştir, doku fotohasar ve gelişmiş görüntü sabitleme 6,7 azalmıştır. Zamanla hücresel göç ve etkileşim dinamik görselleştirme etkinleştirmek için eşsiz yeteneği göz önüne alındığında, intravital mikroskopi yoğun immünoloji 8 çalışmanın çeşitli alanlarda uygulanmıştır. Intravital görüntüleme daha iyi anlamak ve hayvan modelleri yaşayan hem hücresel ve moleküler düzeyde bağışıklık yanıtlarını contextualize İmmünologlar sağlar.
Son transgenik gelişmeler de knock-in muhabiri fare gibi yaşayan hayvanlarda nötrofil dinamik davranışları izlemek için yararlı araçlar sağlamıştır. Lizozim M organizatörü odaklı gelişmiş yeşil floresan protein knock-infarenin genel ekstravazasyonu, bakteriyel enfeksiyon ve steril bir iltihap 9-15 de dahil olmak üzere çeşitli enflamatuvar süreçlerde nötrofiller, monositler ve makrofajlar hareketliliğini karakterize etmek için kullanılmaktadır. Bundan başka, bir sitoplazmik flüoresan rezonans enerji transferi biyosensör ifade eden transgenik fareler, iltihaplı bağırsak 16 içinde nötrofil hücre dışı düzenlenmiş bir mitojen kinaz ve protein kinaz A aktivitelerini inceleyerek içinde kullanılmaktadır. Nötrofillerde floresans ifadesi için yüksek bir özgüllüğü olan bir fare modeli kendisi lenfosit antijen 6G (Ly6G) 17 sentezlenmesi kuple edilir floresan protein tdTomato, hem de Cre rekombinazı üreten Catchup knock-in fare,. Bu modelde aracılığıyla Ly6G eksikliği nötrofil Görselleştirme bu hücrelerin steril ya da bulaşıcı in vivo enflamatuar bağlamlarda çeşitli normal işlevlerini uygulamak olduğunu göstermiştir. DsRed flüoresan s ifade eden transjenik fareninnötrofiller, iltihabik monositler ve aktive makrofajlar içerdiğine inanılmaktadır - - (IL-1β) promoteri (pIL1-DsRed), IL-1β üreten hücrelerin hareketsiz davranışları görselleştirmek için kullanılmıştır interleuikin-1 p fare kontrolü altında genin rotein çıkan iltihaplı cilt 18.
İn vivo markalama iltihaplı dokuların nötrofil hücresel ve moleküler davranışları izlemek için alternatif bir yaklaşım olarak görev yapabilir. Anti-Gr-1 monoklonal antikoru (mAb) floresan etiketli düşük dozlarda intravenöz enjeksiyon, Gr-1 + nötrofillerin ilerlemesini kaskad sonra Staphylococcus aureus 19 ile enfekte edilmiş farenin deri lezyonlarında görselleştirilmiştir. Streptavidin içeren konjugatlarının in vivo uygulama konjuge 705 nm kuantum noktaları ve biyotinile anti-Ly6G mAb özellikle dolaşan nötrofillerin 20 etiket. neutroph bu tür konjugatların Ayrıca, endositozIL veziküller interstisyuma göç nötrofillerde yüksek hızlı vezikül taşıma izleme sağlar. in vivo P-selektin karşı floresans-konjuge antikor Branşman integrin ligand-1 (PSGL-1), L-selektin (CD62L) glikoproteini ile markalama (CD11b bir TNFa kaynaklı inflamatuar modelinde) ve kemokin (CXC motifi) reseptör 2 (CXCR2) erken inflamasyon 21 döneminde oynayan düzenleyici mekanizmalar açığa çıkartılmıştır. Polarize nötrofiller CD11b ve CXCR2, nötrofil göçünü sürücü ve inflamasyonu başlatan reseptörlerinin dağıtılması sonuçlanan aktive trombositler üzerinde CD62L mevcut ile etkileşim uropods PSGL-1-zenginleştirilmiş çıkıntı.
IL-1β hazırlanmış nötrofillerin 22 yükselir imza genlerin biridir. PIL1-DsRed muhabiri farelerde, DsRed floresan sinyalleri (yani., IL-1β promotörünün aktivasyonu) olumlu mRNA ifadesi ve IL-1β protein üretimi, IL-1β ile bağlantılıdır. <sup> 18 nötrofil astarlama işlemi izlemek için, intravital mikroskopik bir yöntemi floresans konjuge edilmiş anti-Ly6G mAb ile nötrofillerin in vivo etiketlemeden sonra pIL1-DsRed fare modelinde oksazolon (OX) deri iltihabı indüksiyonu dahil geliştirilmiştir. Bu model ile, çeşitli hastalıkların ve rahatsızlıkların hayvan modellerinde astar nötrofillerin davranış ve işlevini incelemek mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes göre yapılan ve Toledo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
pIL1-DsRed 1. Farelerin fenotipleme
Not: Yavrular, vahşi tip (WT) C57BL6 fare ile heterozigot pIL1-DsRed fareler üreme tarafından oluşturulur. Üç hafta, dört eski yavrular fenotipleme hazır olarak kabul edilir. Farelerin Submandibuler kanama küçük değişiklikler 23 ile kurulmuş bir protokol izler.
- Fare Pups Whole Kan Beyaz kan hücrelerinin izolasyonu
- Her 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne heparin 20 ul ekleyin.
- kafesten bir yavru kazanır. yavru kimlik etiketi kaydetmek. Submandibuler venden kan toplama önce yavrular uyutmak için gerekli değildir.
- Boyun berduş tarafından yavru tutun ve th submandibuler ven delmek5 mm neşter kullanarak e yanak kese. Kan damlaları penetrasyon açısından terlemek, böylece küçük bir delik oluşturmak için yeterli kuvvet uygulamayın. Her yavru için yeni bir iğne kullanın.
- Bir heparin içeren mikrosantrifüj tüp yavru başına kan 5 damla - 3 toplayın. Delinen bölgeyi temizleyin ve hemostaz kolaylaştırmak için basınç uygulayın.
- Yeni kafese yavru koyun ve hayvan tesis kafesi dönmeden önce 30 dakika boyunca gözlemleyin.
- Pozitif ve negatif kontroller olarak, bilinen bir fenotip yetişkin farelerden kan toplamak.
- Her bir tüp, girdap tüplerine kırmızı kan hücresi lize tampon 500 ul ekle ve 5 inkübe edin - buz üzerinde 10 dakika.
- Her bir tüp içinde hücre süspansiyonları altında fetal sığır serumu (FBS), 500 ul - yavaş yavaş 400 ekleyin. Net bir arayüz üst katman hücre süspansiyonu ve FBS alt tabaka arasında gözlemlenebilir.
- Cap tüpleri ve santrifüj örnekleri 5 dakika boyunca 1,500 x g'de.
- kürk 1.1.9 - Tekrar 1.1.7 adımlarıther kırmızı kan hücreleri çıkarmak. lizis ilk kez yeterli olup olmadığını tekrar etmeyin. taneleri santrifüjleme sonrası ayırt etmek zor olması gerekir.
- Lipopolisakarid (LPS) uyarılması ve Kültür
- Tam Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamı içinde 200 ul içinde süspanse hücreleri.
- tüp sitometri bir akış hücre süspansiyonu aktarın.
- tam RPMI 1640 ortamı içinde 990 ul LPS stok çözeltisinin 10 ul (1 mg / ml) karıştırarak çalışma çözeltisi LPS sağlayın.
- Hücre süspansiyonunun 200 ul çalışma çözeltisi 10 ug / ml LPS 20 ul ekle.
- Kapak borular gevşek ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 4 saat örnekleri inkübe edin.
- Akım Sitometri Analizi
- flow sitometri için veri toplama programını açın. edinimi örnek öncesinde satın alma şablonu ayarlayın.
- araç paletinde Dot-Plot aracını tıklatın. Bir fo çizinyan dağılım (SSC) arsa vs rward dağılım (FSC). Doğrusal ölçeğine FSC ve SSC gerilim parametreleri ayarlayın.
- sitometresinin izin FSC ve SSC düşük eşik seçin. sırasıyla, FSC ve SSC için barajı 200 ve 50 uygulayın.
- SSC arsa vs FSC içinde, enkaz, kırmızı kan hücreleri ve lenfositler monositler, granülositler ve dendritik hücreleri içerir ve dışlayan bir kapı G1 çizin.
- araç paletinde Histogram aracını tıklatın. Bir FL2 (kırmızı floresan kanalı) histogram çizin. Tüm DsRed pozitif olayları kapsar bir kapı çizmek için FL2 sinyallerinin taban çizgisi ve pozitif kontrol örneği ayarlamak için bir negatif kontrol örneği kullanın.
- sitometresinin ve Sıvıları Kontrol panelinde, sıvı moduna "RUN" ve akış hızını "HI" (yaklaşık 60 ul / dak) olarak ayarlayın. Her numune için 10.000 olayları edinin.
- G1 kapısından DsRed pozitif hücrelerin yüzdesi ölçerek yavru fenotip belirleyin.
- 100 mg / kg ketamin 10 mg / kg ksilazin ve 1 mg / kg asepromazin ihtiva eden bir anestezik kokteyl intraperitonal (İP) enjeksiyon ile fare anestezisi. Yeterli anestezi fareler ayak tutam arka pençe çekme görünmüyor.
- Farenin her iki kulağın arka yüzeyine saç kaldırma krem uygulayın. 1 dakika 30 saniye bekleyin. Su-ıslatılmış pamuk ile kulak yüzeyini silin ve kurumaya bırakın.
- mikrometre ile kulak kalınlığını ölçmek ve ayrı bir kafes içinde fare değiştirin. (- 30 dakika ~ 15) anestezi kurtarma kadar gözlemleyin. Epilasyon ürünün neden olduğu deri iltihabı gidermek için daha fazla deney yapılmadan önce fare 3 gün dinlenmeye bırakın.
- 1 ml aseton içinde OX 16.7 mg eritilmesi ve zeytin yağı 250 ul OX / aseton çözeltisi 750 ul karıştırarak 1.25% (w / v) oks hazırlayın. 250 & ile aseton 750 ul karıştırılarak araç çözüm hazırlayın# 181; zeytinyağı l.
- anestezik kokteyl (2.1) ip enjeksiyon yoluyla fare yeniden uyutmak. daha önce olduğu gibi kulak kalınlığını ölçün.
- sağ kulak her iki yüzüne% 1.25 OX 12.5 ul uygulayın. sol kulak her iki yüzüne aseton / zeytin yağı araç solüsyonu 12.5 ul uygulayın.
- Tam o, diğer farelerin tarafından kulakları hakaret önlemek orijinal kafeste fare yerini ve hayvan barınağı tesisi dönmek için iyileşene kadar fare kafes arkadaşları ayrı tutun.
NOT: Epilasyon kulak kalınlığı değişikliği aşağıdaki küçük deri iltihabı neden olabilir. Bu küçük inflamasyon 3 gün sonra çözüldü, normal kulak kalınlığı tarafından teyit edilecektir. 24 saat süre ile topikal uygulama sonrası, OX-muamele edilmiş kulaklar önemli (p <0.01) kıyasla araç çözeltisi, tek başına tedavi edilen kulakları şişme göstermektedir.
pIL1-DsRed Farelerde nötrofil 3. Etiketleme
Not: düşük doz f nötrofillerin in vivo etiketlenmesindeluorescence-konjuge nötrofil özgü mAb yeni geliştirilmiş bir protokol 19 izler. Retro-orbital enjeksiyonları birkaç modifikasyon 24 ile kurulmuş bir protokole göre gerçekleştirilir.
- fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 90 ul, 0.5 mg / ml ve Alexa Fluor 647-bağlı anti-Ly6G mAb (klon 1A8) 10 ul seyreltilmesi anti-Ly6G mAb çalışma çözeltisi hazırlayın.
- 28 ölçü bir iğne ile, U-100 insülin şırıngaya anti-Ly6G mAb çalışma çözeltisi (50 ug / ml) 100 ul aktarın.
- daha önce tarif edilen anestezi kokteyl (2.1) IP enjeksiyonu ile bir yetişkin pIL1-DsRed fare anestezisi. Temiz bir çalışma gemide anestezi fare karın aşağı gelecek şekilde yerleştirin.
- Kısmen soketten göz küresinin çıkıntı bir fare göze hafifçe aşağı doğru cilt dorsal basınç ve ventral uygulayın.
- Dikkatle retroorbital medial kantus yaklaşık 30 ° 'lik bir açı ile aşağı konik, iğne yersinüs.
NOT: Operatör sinüse iğne ekler kez baskı, nüfuz ve rahatlamış direnci hissedebilirsiniz. - Yavaş ve yumuşak fare içine solüsyonu (5 ug mAb / fare / enjeksiyon) çalışan anti-Ly6G mAb 100 ul enjekte edilir. iğneyi hızla sökün. kanama az miktarda başarılı bir enjeksiyon göstermektedir.
- Hemen sağ ve sol fare kulakları üzerine% 1.25 OX ve araç çözümü uygulayın.
- 8 saat sonra, aynı fareye retroorbital enjeksiyon yoluyla taze hazırlanmış anti-Ly6G mAb çalışma çözeltisi (5 ug mAb / fare / enjeksiyon) 100 ul yönetmek.
- Hemen görüntüleme önce, kan damarları görselleştirmek 30 mg / ml flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile 100 ul yönetmek için retroorbital enjeksiyon yoluyla dekstran (150 kDa) ile konjüge edilmiş.
pIL-1 DsRed Farelerde Nötrofil Hazırlama 4. intravital Görüntüleme
- anestezik kokteyl (2.1) ip enjeksiyonu ile fare anestezisi.0; iken görüntüleme için anestezi altında kuruluğunu önlemek için fare gözlerine veteriner merhem sürün.
- PBS eşit hacimde orijinal anestezi kokteyl 500 ul seyreltilmesi ile 1 ml yarım doz anestezi kokteyli hazırlanır.
- Bir kelebek 27 gauge iğne ile 1 ml şırınga yarım doz anestezik kokteyl aktarın.
- intraperitoneal fare karın içine kelebeğin iğne takın ve bantlama ile karın kelebek kanat düzeltmek.
- Görüntüleme aşamasında merkezinde bir cam lamel. yerinde tutmak için lamel kenarlarında bantlayın.
- Fare kulağı ventral yüzeyi üzerinde hem de lamel PBS damla yerleştirin.
- Pozisyon lamel üzerindeki kulak ile fare anestezi. Ayrıca bant aracılığıyla yerinde tutulan lamel ve bir cam slayt arasındaki kulak sandviç ile, aşağı kulak ucu, dorsal yüzü monte edin.
- Çok lazer floresan konfokal mikroskop ve ilgili tüm e-açmaquipment. Ortam ışığı maruziyeti en aza indirmek için oda ışıkları kapatın.
- görüntü elde etme yazılımını açın. Boya Listesi menüsünde floresan boyaların tespiti için lazer kanalları seçin.
- Mercek aracılığıyla DsRed + hücrelerden kan damarları ve kırmızı sinyaller yeşil sinyallerin gözlem iltihaplı kulak cilt üzerinde odağı ayarlayın.
- Tarama 2 us / piksel hızı ve 512 × 512 piksel çözünürlüğe sahip bir hızlı tarama gerçekleştirin. Canlı Görünüm menüsünde her kanal için bir Pseudocolor seçin. sonunu ayarlamak ve tarama konumunu başlatmak için odak düğmesini ayarlayın.
- 8 mikro-sn / piksel ve 800 × 800 veya 1024 × 1024 piksel çözünürlük - tarama 4 hızı yavaş taramalar yapar. , Yüksek gerilim ayarlayın kazanç ve doygunluk (kırmızı piksel) kaçınarak sinyallerin yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için her kanalda ofset. Her bir kanalda, sadece birkaç kırmızı piksel olmalıdır.
- th tarayarak üç boyutlu görüntü kümeleri oluşturmae kulak cilt, 635 mikron x 635 mikron × 30 mikron (20X objektif), ya da 1270 mikron × stratum korneum yüzeysel başlayan ve x, y, 317 mikron × 30 mikron (40X objektif) × 317 mikron z hacimleri ile aşağıya doğru ilerliyor 2 mikron z-adımlarda 1270 mikron × 50 mikron (10X objektif).
NOT: stratum korneum epidermisin en dış tabakası olan ve hali hazırda güçlü otofloresan sinyaline göre lokalize edilebilir. - zaman atlamalı görüntüleme deneylerde, kayıt üç boyutlu görüntüler en fazla 8 saat süre ile, her 2 ya da 4 dak.
- kelebek iğne ile yarım doz anestezi kokteyl 10 ul - fare anestezi kurtarmak için başlar Aralıklı, seğirmesi bıyıkları gözleme dayalı kaydetti, 5 yönetmek.
NOT: Anestezi doz dikkatli olun - aşırı doz fare ölüme neden olabilir. Seçenek olarak ise, bir kavanoza inhalasyon anestezisi kısa süreli anestezi ve farenin tatbik edilebilirburun konisi, uzun vadeli görüntüleme için kullanılabilir. - görüntüleme tamamlandığında aşamasından anestezi fareyi çıkarın. Kaseti çıkarın ve farenin karın kelebek iğne çıkarılır. hayvan barınağı tesisi ayrı bir kafes fare dönün.
NOT: - 3 saat kısa süreli görüntüleme (<1 saat), fareler tamamen 1 hızlı anestezi kurtarmak. 16 saat - Uzun süreli görüntüleme (~ 8 saat), fareler 12 tipik geri kazanım süresi ile yavaşça iyileşir. Böylece, oral su idaresi şiddetli su kaybını önlemek için iyileşme döneminde en az birkaç kez tavsiye edilir. - Süreç görüntüleme veri setleri, tek tek hücrelerin izlemek göç yolları üretmek ve görüntü analiz yazılımı 25 kullanılarak hücre göçü yönünü ve hızını hesaplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
pIL1-DsRed farelerin tarama akış sitometrisi kullanılarak periferal kan lökositleri tarafından üretilen fenotipik DsRed floresan sinyali göre gerçekleştirilir. LPS uyarımı nötrofiller, monositler ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere 26-28 miyeloid hücrelerinde IL-1β üretimini indüklediği bilinmektedir. Bu durumda, izole edilmiş bir lökosit akış sitometri analizine önce 4 saat LPS ile inkübe edilir. Daha sonra, yolluk bu kapı popülasyonda ölçülür hücre boyutu (FSC) ve iç karmaşıklığı (SSC) (Şekil 1A) 29 ve DsRed sinyaline dayalı miyeloid hücrelerin dolaşım için ayarlanır. PIL1-DsRed farelerden aynı hücreler ayırt DsRed sinyallerini (Şekil 1B) ifade ederken WT farelerden Sirkülasyon miyeloid hücreleri, minimal DsRed ifade eder. Bu fenotipleme metodu ile belirlenmiştir pIL1-DsRed farenin daha sonraki deneyler için kullanılır. Tam fenotipleme işlemi sadece birkaç alır unutulmamalıdırsaat - doku hasat, enzimatik sindirim, DNA izolasyonu, PCR ve elektroforez gibi geleneksel genotiplendirme yöntemlere göre çok daha kısa.
IL-1β hızlandırıcı aktivasyonu en son nötrofil bir göstergesi 22 astar olarak tanımlanmıştır. Böylece, nötrofil hazırlığını dinamik bir süreçtir görüntülendi ve pIL1-DsRed fareler kullanılarak yaşayan hayvanlarda tespit edilebilir. deri inflamasyonunu indüklemek amacıyla, cilt hassaslaştırıcı OX topik, tek başına aynı hayvanın sol kulak üzerine uygulanır pIL1-DsRed fareler ve aracın sağ kulak üzerine uygulanır. canlı hayvanlarda nötrofilleri etiketlemek için, son zamanlarda geliştirilen bir protokol küçük hemen önce floresan etiketli anti-Ly6G mAb'nin miktarı ve OX uygulandıktan sonra 8 saat uygulanması ile gerçekleştirilir. kan damarları bulmak için, FITC-dekstran görüntüleme hemen önce enjekte edilir.
OX uygulaması, 24 saat sonraDsRed sayıda + / Ly6G + hücreleri damar dışı alana (Şekil 2A) bulunmaktadır ve nötrofillerin astarlanmış temsil eder. Az sayıda DsRed / Ly6G + hücreleri aynı zamanda en büyük olasılıkla dinlenme nötrofilleri temsil eder, bulunur. Ayrıca, DsRed + / Ly6G küçük bir popülasyon - hücre gözlenmiştir, iltihabik monositler ve aktive makrofajlar içerebilir. 40 dk time-lapse video, inflamatuvar bir deri lezyonu olan gelişmekte olan Ly6G + nötrofiller tipik amip benzeri tarama hareketi (Ek Film 1) sergiler. / Ly6G + nötrofil popülasyonları (Şekil 2B) - Hücre göç yolları DsRed + / Ly6G + ve DsRed ve hareketli davranışları karşılaştırmak için izlenir. Izlemek arsa dışı alan (Şekil 2C) girildikten sonra hem nötrofil popülasyonları görüntülemesini "rastgele" göç açığa analiz eder. İlginç bir şekilde,/ Ly6G + meslektaşları (Şekil 2B) - kendi DsRed ile karşılaştırıldığında DsRed + / Ly6G + nötrofiller sergi anlamlı olarak daha yüksek hız. Bu inflamatuar lezyonlarda nötrofil astarlama ve hızlandırılmış motilite arasında bir ilişki göstermektedir.
OX tedavisi (- 4 Yan Filmler 2) Aşağıdaki farklı zamanlarda başlayan kaydedildi nötrofil astar, time-lapse videoları bir dizi zamanlamasını izlemek için. DsRed - OX uygulamadan sonra 12 saat ve sayıları (Şekil 2E, Yan Film 3, 4) daha sonra nispeten düşük kalması - / Ly6G + hücreler, dinlenme nötrofiller, hem erken 8 damar dışı alana saptanabilir hale gelir. OX uygulamadan sonra 16 saat - Aksine, DsRed + / Ly6G + hücrelerinin sayısı, astarlanmış nötrofiller, 14 başlayarak, daha sonraki zaman noktalarında kademeli artar. Bazı DsRed
Şekil 1:. PIL1-DsRed Fare Fenotiplendirme (A) Flow sitometri FSC ve SSC parametrelere dayalı miyeloid hücreler (G1) dolaşımdaki bir nüfusa göstermek analiz eder. FL2 kanalında (B) Histogramlar pIL-DsRed fareler (kırmızı) hücreleri G1 kapısı olan DsRed + hücrelerinin yüzdesini gösterir veya WT farelerden (mavi). Veriler le de temsilcisi vardırüç bağımsız deneyler ast. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. İltihaplı Döküntüyle DsRed + / Ly6G + Nötrofiller ve Hareketli Faaliyetleri Görselleştirme (A) Statik konfokal mikroskobu görüntüleri yani ekstravasküler uzayda OX tedavi gösteriden sonra üç lökosit popülasyonları 24 saat kaydetti DsRed + / Ly6G + hücreler. (yıldız), DsRed - / Ly6G + hücreler (üçgenler), ve DsRed + / Ly6G - hücreleri (oklar). Çubuk = 20 um. DsRed + / Ly6G + hücreleri (kırmızı) ve DsRed - / Ly6G + hücreler (mavi) migrato karşılaştırılmıştırÖKÜZ uygulama (Ek Film 1) 24 saat sonra başlayarak konfokal mikroskobu ile kaydedilen bir 40 dk time-lapse film ry yolları (B) iz araziler (C) ve hız (D). (D) Barlar hız ortalama değerleri göstermektedir. *** P <0,001. (E) DsRed + / Ly6G + hücreleri ve sayıları DsRed - / Ly6G + hücreler ÖKÜZ uygulama (Yan Filmler 2 ile 4) sonra farklı zaman noktalarında kaydedilen time-lapse film bir dizi sayılır. Gösterilen veriler üç ardışık görüntülerden hesaplanan hücre sayısı / mm2 (± SD) vardır. (F) Statik görüntüler OX boyama (Ek Film 5) sonra 14.5 saat 11'den kaydedilmiş bir time-lapse film oluşturulur. Ok gözlem döneminde ekstravasküler alanda DsRed ifadesini kazanır bir Ly6G + hücreyi gösterir.Çubuk = 50 um. Görüntüler izni (Telif 2015 immünolojistler Amerikan Derneği, Inc.) ile referans 22 yeniden üretilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Ek Film 1: - / Ly6G + hücreler (mavi) olarak (OX boyama 24 saat sonra) İnflamatuar Döküntüyle DsRed + Nötrofiller ve Hareketli Davranış mikroskopisi görüntüleri DsRed + / Ly6G + hücreler (pembe) ve DsRed hareketliliğini gösterir ekstravasküler boşluk. Kan damarları yeşil görülür. Çubuk = 20 um. Video izni (Telif hakkı 2015 immünolojistler Amerikan Derneği, Inc.) ile referans 22 çoğaltılamaz. Cl LütfenBu videoyu görmek için buraya ick.
. Ek Film 2: - ekstravasküler alanda / Ly6G + hücreler (mavi) (OX boyama sonra 4 saatte) İnflamatuar Döküntüyle DsRed + Nötrofiller ve Hareketli Davranış mikroskopisi görüntüleri DsRed + / Ly6G + hücreler (pembe) ve DsRed göstermek . Kan damarları yeşil görülür. Otoflöresans mevcut ve saç foliküllerinin ile ilişkilidir. Çubuk = 100 um. Video izni (Telif 2015 immünolojistler Amerikan Derneği, Inc.) ile referans 22 çoğaltılamaz. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Film 3: Inf DsRed + Nötrofiller ve Hareketli Davranış. ekstravasküler alanda / Ly6G + hücreleri (mavi) - lammatory Cilt lezyonları (OX boyama sonra 8 saatte) mikroskopisi görüntüleri (pembe) DsRed + / Ly6G + hücreleri ve DsRed göstermektedir. Kan damarları yeşil görülür. Otoflöresans mevcut ve saç foliküllerinin ile ilişkilidir. Çubuk = 100 um. Video izni (Telif 2015 immünolojistler Amerikan Derneği, Inc.) ile referans 22 çoğaltılamaz. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Film 4: Hareketli inflamatuar Döküntüyle DsRed + Nötrofiller Davranışı (11 at - OX boyama sonrası 19 saat) mikroskopisi görüntüleri (pembe) DsRed + / Ly6G + hücreler gösterir ve DsRed - de / Ly6G + hücreleri (mavi). extravascular alanı. Kan damarları yeşil görülür. Otoflöresans mevcut ve saç foliküllerinin ile ilişkilidir. Çubuk = 100 um. Video izni (Telif 2015 immünolojistler Amerikan Derneği, Inc.) ile referans 22 çoğaltılamaz. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Film 5: Ly6G + Nötrofiller DsRed Sinyallerin kazanılması, bu yüksek büyütme Video (bir okla gösterilir) Ly6G + hücre ekstravasküler DsRed ifadesini elde ettiği süreci gösterir ek video 4'te gösterilen time-lapse filmden. gözlem periyodu (OX boyama sonrası 11-14,5 saat) boyunca yer. Çubuk = 50 um. Video izni (Telif hakkı 2015 Im Amerikan Derneği ile referans 22 çoğaltılamazmunologists, Inc.). Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmanın amacı, henüz mevcut tekniklerle yerine olmamıştır yaşayan hayvanların, nötrofil astarlama işlemi izlenmesi için bir teknoloji geliştirmektir. Bu amaca ulaşmak için, üç kurulan yöntemler gerçekleştirilir: deri iltihabı 1) İndüksiyon, IL-1β promotör-tahrikli DsRed raportör farelerde astarlama bir ölçüsü, flüoresan-konjuge anti-Ly6G düşük doz nötrofillerin 2) in vivo olarak etiketleme mAb, ve 3) intravital konfokal mikroskopi görüntüleme. Bu üç yöntemin kombine inflamatuar deri lezyonlarında prime nötrofil (DsRed + / Ly6G +) ve hareketli faaliyetleri görselleştirme sağlar. prime nötrofillerin göç yönü ve hızı daha da göç yolu izleme yoluyla ölçülür. Time-lapse videoları bir dizi kaydederek, astar nötrofil çıkmasının gerçek zamanlı kinetiği i inflamatuar site ve DsRed ifade edinme izlenirndividual nötrofiller, damar dışı alana görülmektedir. Böylece, nötrofil priming dinamik süreci başarıyla Burada sunulan teknoloji kullanılarak ilk kez yaşayan hayvanlar içinde görüntülenmiştir edilmiştir.
Bu teknoloji, bir çok önemli adımda kullanılır. İlk olarak, cilt dokularının intravital görüntüleme için en uygun vücut parçaları vardır. Fare kulağa OX topikal uygulama konfokal mikroskobu altında iltihaplı deride bağışıklık hücre davranışlarının doğrudan görselleştirme izin verir. İkincisi, fare anestezik tekrar enjeksiyonları gerektiren görüntüleme sırasında sürekli sedasyon gerekir. Ancak, aşırı sedasyon görüntüleme sırasında fare kalıp neden olabilir. doz aşımı önlemek için, anestezi (yarım veya tam dozun üçte) düşük dozlarda uzun süreli görüntüleme için tavsiye edilir. Üçüncü olarak, floresan konjuge nötrofil özgü mAb dolayı kemirgen nötrofillerinin, (8-10 saat 30 yarı ömrü) kısa ömürlü kesintili enjekte edilmelidir. Son, odak drift sıcaklık değişimleri, fare vücut hareketi, kulak zamanla şişlik ve enstrüman 31 işletmeciliğinden doğan titreşimler de dahil olmak üzere birçok faktörün neden olabilir time-lapse görüntüleme sırasında önemli bir konudur. Çeşitli yöntemler sedated oksijen ve sıcaklık sağlamak için bir kazanı yükleme, sahnede üzerinde bir cam slayt bantlama yerinde fare kulağı sabitleme gibi görüntüleme sırasında sedasyon sabit bir dozunun uygulanmasından olarak, sürüklenmesini önlemek için geliştirilmiştir organizma yanı sıra manuel olarak yeniden odaklama kapsamı gerekli 32,33.
Protokolün sınırlarını belirtmek eşit derecede önemlidir. İlk olarak, yavaş fare kazanım - uzunluğunda bir görüntüleme periyodu 8 saat sonra, (12 16 saat) Bu protokol, uzun deneyler için uygun olmayabilir belirten nedeniyle sürekli sedasyon görülmektedir. Alternatif bir yaklaşım u yerine görüntüleme dönemi boyunca sırayla birkaç fareler kullanmaktırtek şarkı. İkinci olarak, dolaşımdaki FITC-dekstran kademeli sızıntısı büyük olasılıkla enflamatuar durum 34 cilt kan damarlarının artan permeabilitesinin neden olduğu zaman görüntüleme sırasında gözlenir. Böylece, kan damarlarının görüntülenmesi belirgin görüntüleme ileriki aşamalarında dolaşımda azalmış floresan verilmiştir tehlikeye düşer. Alternatif olarak, kimse bu damar endotel hücreleri 35 uymak olarak kan damarlarını işaretlemek için böyle isolectin B4 olarak floresan konjuge lektinler kullanabilir.
Deri enflamatuar lezyonlar nötrofil priming işleminin görselleştirme ek olarak, burada açıklanan teknoloji, aynı zamanda pek çok diğer deney ortamlarında uygulanabilir. Son zamanlarda geliştirilen görüntüleme pencereleri ile birlikte, astar nötrofil davranışlarını belirleyen Intravital mikroskopi beyin, meme bezlerinin, akciğerler ve karın organlarının 36-39 olmak üzere derin dokulara ve organlara değerlendirilebilir. prim ve dahası, görselleştirmeBu monositler ve makrofajlar gibi diğer hücre tipleri ing / aktivasyon yoluyla in vivo olarak etiketleme ile birlikte pIL1-DsRed fareler kullanılarak elde edilebilir floresan konjuge ilgi hücre tipine özgü mAb. Birlikte ele alındığında, sadece bu teknoloji yaşayan hayvanların nötrofil hazırlama işleminin intravital görüntüleme için temel bir çerçeve, aynı zamanda, farklı dokularda açılma, çeşitli enflamatuar durumlarda diğer bağışıklık hücrelerinin davranışını ve fonksiyon çalışmak için yeni yaklaşımlar meydana çıkarır etmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 kDa | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
- El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
- Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
- Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
- Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
- Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
- Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
- Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
- Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
- Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
- Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
- Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
- Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
- Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
- Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
- Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
- Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
