Abstract
Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in de menselijke bloedsomloop en worden snel aangeworven om inflammatoire sites. Priming is een situatie voordoet die de fagocytische functionaliteit van neutrofielen verhoogt. Hoewel uitgebreide studies van het bestaan en het belang van neutrofielen priming tijdens infectie en schade hebben onthuld, betekent visualiseren dit proces in vivo zijn niet beschikbaar geweest. De geleverde protocol maakt bewaking van het dynamische proces van neutrofiel priming in levende dieren door de combinatie van drie methoden: 1) DsRed reporter signaal - gebruikt als maat voor priming 2) in vivo neutrofiel labeling - bereikt door injectie van fluorescentie-geconjugeerd anti-lymfocyt antigen 6G (Ly6G) monoklonaal antilichaam (mAb) en 3) intravitale confocale beeldvorming. Verschillende kritische stappen zijn betrokken bij dit protocol:-oxazolon geïnduceerde muis oor ontsteking van de huid, geschikte sedatie van de dieren, herhaalde injecties van anti-Ly6G mAb en prevention focus drift tijdens de beeldvorming. Hoewel enkele beperkingen waargenomen, zoals de grens van continue beeldvorming tijd (~ 8 uur) in een muis en het lekken van fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran van bloedvaten in de ontstekingstoestand Dit protocol verschaft een basiskader voor intravitale beeldvorming van geprimede neutrofiel gedrag en functie, die gemakkelijk kan worden uitgebreid tot het onderzoek van andere immuuncellen in muizen inflammatiemodellen.
Introduction
Neutrofielen zijn de meest voorkomende en kortstondige leukocyten in omloop. Ze zijn snel aangeworven om de sites van de infectie of letsel, waar ze dienen als professionele fagocyten door de afgifte van reactieve zuurstof en stikstof tussenproducten, samen met korrels die antimicrobiële peptiden en proteasen 1. Bij rekrutering, neutrofielen worden "geprimed" door verschillende middelen waaronder microbiële producten, chemoattractanten en inflammatoire cytokines, wat resulteert in sterk verhoogde fagocyt-functionaliteit bij aankomst op de plaats van de ontsteking 2. De mechanismen van neutrofiel priming zijn uitgebreid bestudeerd in vitro 3,4; echter, heeft dynamische controle van het proces in vivo niet mogelijk geweest tot nu toe.
Recent is intravitale imaging een belangrijke techniek voor het visualiseren en kwantificeren van de dynamica van cellulaire biologische processen in levende organismen worden. Intravital beeldvorming kan worden uitgevoerd via conventionele foton excitatie microscopie (bijvoorbeeld, confocale) of multifoton microscopie benaderingen 5. Na verloop van tijd, zijn substantiële verbeteringen gerealiseerd in deze techniek waardoor verhoogde beeldresolutie, betere beeldvorming diepte, verminderde weefsel photodamage en verbeterde beeldstabilisatie 6,7. Gezien de unieke mogelijkheid om dynamische visualisatie van cellulaire migratie en interactie in de tijd mogelijk te maken, is intravitale microscopie is uitgebreid toegepast op diverse gebieden van onderzoek in de immunologie 8. Intravitale beeldvorming maakt immunologen beter te begrijpen en contextualiseren immuunreacties op zowel het cellulair en moleculair niveau in levende diermodellen.
Recente ontwikkelingen in de transgene als knock-in reporter muizen hebben verstrekt handige tools voor het bewaken van het dynamische gedrag van neutrofielen in levende dieren. Lysozym M promoter aangestuurde versterkt groen fluorescent proteïne knock-inmuizen werden breed gebruikt om beweeglijkheid van neutrofielen, monocyten en macrofagen karakteriseren in verschillende ontstekingsprocessen zoals extravasatie, bacteriële infecties en steriele ontstekingen 9-15. Verder zijn transgene muizen die een cytoplasmatische fluorescentie-energieoverdracht biosensor toegepast bij het bestuderen van de activiteiten van neutrofielen extracellulair gereguleerde kinase mitogen en proteïne kinase A in ontstoken darm 16. Een muizenmodel met hoge specificiteit voor fluorescentie expressie in neutrofielen is de Catchup knock-in muizen, waarin Cre recombinase produceert en het fluorescerende eiwit tdTomato, die zelf is gekoppeld om expressie van lymfocyt antigen 6G (Ly6G) 17. Visualisatie van Ly6G-deficiënte neutrofielen via dit model heeft aangetoond dat deze cellen uitoefenen normale functioneren met steriele of infectieuze ontstekingen in vivo context. Transgene muizen die de DsRed fluorescerende pProtein gen onder controle van de muis interleuikin-1β (IL-1β) promoter (pIL1-DsRed) werden gebruikt om de beweeglijke gedrag van IL-1β cellen zichtbaar - vermoedelijk neutrofielen, inflammatoire monocyten en geactiveerde macrofagen omvatten - opkomende in ontstoken huid 18.
In vivo kan de etikettering dienen als een alternatieve aanpak voor het traceren van de cellulaire en moleculaire gedrag van neutrofielen in ontstoken weefsel. Na intraveneuze injectie van lage doses van fluorescent gemerkt anti-Gr-1 monoklonaal antilichaam (mAb), de werving cascade van Gr-1 + neutrofielen werd gevisualiseerd in de muis huidletsels die besmet zijn met Staphylococcus aureus 19. In vivo toediening van conjugaten met streptavidine geconjugeerd 705 nm quantum dots en gebiotinyleerd anti-Ly6G mAb specifiek label circulerende neutrofielen 20. Bovendien endocytose van dergelijke conjugaten in neutrophil vesicles maakt het volgen van snelle vesicle transport in neutrofielen migreren in het interstitium. In vivo labeling met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen tegen P-selectine glycoproteïne ligand-1 (PSGL-1), L-selectine (CD62L), integrine αM (CD11b ) en chemokine (CXC motief) receptor 2 (CXCR2) in een TNFa-geïnduceerde inflammatoire model heeft de regulerende mechanismen in het spel toegelicht tijdens de vroege ontsteking 21. Gepolariseerde neutrofielen uitsteken PSGL-1 verrijkte uropods om met CD62L aanwezig op geactiveerde bloedplaatjes, waardoor de herverdeling van CD11b en CXCR2, receptoren die neutrofielen migratie rijden en initiëren van de ontsteking.
IL-1β is een van de handtekening genen die verhoogd is geprimed 22 neutrofielen. In pIL1-DsRed reportermuizen, DsRed fluorescentiesignalen (bijv. Activering van IL-1β promoter) positief correleren met IL-1β mRNA expressie en IL-1β eiwitproductie. <sup> 18 Om het proces van neutrofiel priming controleren, werd een intravitale microscopie methode ontwikkeld waarbij inductie van huidontsteking met oxazolon (OX) in pIL1-DsRed muismodel na in vivo labeling van neutrofielen met fluorescentie-geconjugeerd anti-Ly6G mAb. Via dit model is het mogelijk om het gedrag en functie van geprimede neutrofielen in diermodellen van verschillende ziekten en aandoeningen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen en door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de University of Toledo goedgekeurd.
1. fenotypering van pIL1-DsRed Muizen
LET OP: Offspring worden gegenereerd door heterozygote pIL1-DsRed muizen fokken met wild-type (WT) C57BL6 muizen. Drie tot vier weken oude pups worden beschouwd als klaar voor fenotypering. Submandibulaire bloeden muizen volgt een gevestigde protocol met kleine aanpassingen 23.
- Isolatie van witte bloedcellen uit het bloed in zijn geheel van de Muis Pups
- Voeg 20 ul heparine elk 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Verwerven van een pup uit de kooi. Noteer het identificatielabel van de pup. Het is niet verplicht om pups voor bloedafname verdoven van de submandibulaire ader.
- Houd de pup bij de hals nekvel en doorboren de submandibulaire ader in the wang zakje met behulp van een 5 mm lancet. Toepassen voldoende kracht om een kleine punctie te creëren, zodat druppels bloed stralen vanaf het punt van penetratie. Gebruik een nieuwe naald voor elke pup.
- Verzamel 3-5 druppels bloed per pup in een heparine bevat microcentrifugebuis. Reinig de prikplaats en toe te passen druk om hemostase te vergemakkelijken.
- Zet pup in de nieuwe kooi en te observeren gedurende 30 minuten alvorens terug te keren de kooi om het dier faciliteit.
- Verzamel bloed van volwassen muizen van een bekend fenotype als positieve en negatieve controles.
- Voeg 500 pl rode bloedcellen lyserende buffer aan elke buis, vortex buizen en incubeer gedurende 5-10 min op ijs.
- Voeg langzaam 400-500 ul foetaal runderserum (FBS) onder de celsuspensies in elke buis. Een duidelijke interface kan worden waargenomen tussen de bovenlaag celsuspensie en de onderste laag van FBS.
- Dop en centrifugeer monsters bij 1500 x g gedurende 5 min.
- Herhaal stap 1.1.7 - 1.1.9 naar bontther verwijderen rode bloedcellen. Niet herhalen als lysis voldoende is de eerste keer. De pellet zou moeilijk te onderscheiden zijn na centrifugeren.
- Lipopolysaccharide (LPS) stimulatie en cultuur
- Resuspendeer cellen in 200 ul van complete Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium.
- Breng de celsuspensie een flowcytometrie buis.
- Voeg LPS werkoplossing door 10 gl LPS stockoplossing (1 mg / ml) met 990 ul volledig RPMI 1640 medium.
- Voeg 20 ul van 10 ug / ml LPS werkoplossing 200 gl celsuspensie.
- Cap buizen los en incubeer de monsters gedurende 4 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
- Flowcytometrieanalyse
- Open het data acquisitie programma voor flowcytometrie. Opzetten overname sjabloon voorafgaand aan de overname te proeven.
- Klik op de Dot-Plot gereedschap in het palet tool. Teken een forward verstrooiing (FSC) versus zijwaartse verstrooiing (SSC) plot. Stel de FSC en SSC spanning parameters lineaire schaal.
- Selecteer de laagste drempel van FSC en SSC toegestaan door de cytometer. Solliciteer drempels 200 en 50 voor FSC en SSC, respectievelijk.
- Binnen het FSC vs SSC plot, trekken een poort G1 die monocyten, granulocyten en dendritische cellen bevat, en sluit puin, rode bloedcellen en lymfocyten.
- Klik op de Histogram functie in het palet tool. Teken een FL2 (rode fluorescentie kanaal) histogram. Gebruik een negatieve controle monster naar de basislijn van FL2 signalen en een positieve controle sample ingesteld op een poort te vestigen op alle DsRed positieve gebeurtenissen bevatten.
- Op het paneel Fluidics controle van de cytometer, zet de vloeistof in op "RUN" en het debiet "HI" (ongeveer 60 pl / min). Acquire 10.000 events voor elk monster.
- Bepaal pup fenotype door meting van het percentage DsRed positieve cellen van de poort G1.
- Verdoven muizen door intraperitoneale (ip) injectie van een anestheticum cocktail bevattende 100 mg / kg ketamine, 10 mg / kg xylazine en 1 mg / kg acepromazine. Adequaat verdoofde muizen niet laten zien achterpoot terugtrekking tot teen knijpen.
- Toepassen ontharingsmiddelen crème op het dorsale oppervlak van beide oren van de muis. Wacht 30 sec tot 1 min. Veeg oor oppervlak met water bevochtigde katoen en laat aan de lucht drogen.
- Meet de dikte van het oor met behulp van micrometer en de muis te vervangen in een aparte kooi. Observeren tot herstel van de anesthesie (~ 15-30 min). Om ontsteking van de huid veroorzaakt door de ontharing product te verhelpen, laat de muis om te rusten voor 3 dagen voordat verdere experimenten wordt uitgevoerd.
- Bereid 1,25% (w / v) OX door het oplossen van 16,7 mg van OX in 1 ml aceton en mengen van 750 ui OX / acetonoplossing met 250 ui olijfolie. Bereid drageroplossing door het mengen van 750 ui aceton en 250# 181; l olijfolie.
- Re-verdoven de muis door ip injectie van anesthesie cocktail (2.1). Meet de oordikte als voorheen.
- Solliciteer 12,5 ul van 1,25% OX op elke zijde van rechteroor. Solliciteer 12,5 ul van aceton / olijfolie oplossing olie voertuig op elke zijde van de linker oor.
- Houd de muis los van kooi-mates tot volledig hersteld om belediging aan zijn oren te voorkomen door andere muizen, vervang dan de muis in zijn oorspronkelijke kooi en terug te keren naar huis dier faciliteit.
OPMERKING: verwijdering van het haar kan leiden tot lichte ontsteking van de huid gevolgd door verandering van de dikte van het oor. Deze minor ontsteking zal 3 dagen later opgelost worden bevestigd door de normale dikte van het oor. Na topische toediening voor 24 uur, OX-behandelde oren tonen significante (p <0,01) vergeleken zwelling drageroplossing alleen behandelde oren.
3. Etikettering van neutrofielen in pIL1-DsRed Muizen
LET OP: In vivo labeling van neutrofielen door lage dosis f-luorescence geconjugeerd neutrofielen-specifieke mAb volgt op een recent ontwikkelde protocol 19. Retro-orbitale injecties worden uitgevoerd volgens een vastgesteld protocol met een paar wijzigingen 24.
- Bereid anti-Ly6G mAb werkoplossing door verdunnen van 10 pl 0,5 mg / ml Alexa Fluor 647-geconjugeerd anti-Ly6G mAb (kloon 1A8) in 90 pl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Transfer 100 ul anti-Ly6G mAb werkoplossing (50 ug / ml) in een U-100 insulinespuit met 28 gauge naald.
- Verdoven volwassen pIL1-DsRed muis door ip injectie van het eerder beschreven anestheticum cocktail (2,1). Plaats de verdoofde muis buik naar beneden op een schone werkende board.
- Pas lichte neerwaartse druk op de huid dorsale en ventrale een muis oog op de oogbol uit het stopcontact gedeeltelijk uitsteken.
- Plaats het naald, afschuinen beneden onder een hoek van ongeveer 30 ° bij de binnenste ooghoek in de retro-orbitalesinus.
LET OP: De operator kan de druk, de penetratie en opgelucht weerstand zodra de naald inserts in de sinus voelen. - Langzaam en vloeiend Injecteer 100 ui van anti-Ly6G mAb werkoplossing (5 ug mAb / muis / injectie) in de muis. Verwijder de naald snel. Een kleine hoeveelheid bloeden suggereert een succesvolle injectie.
- Onmiddellijk van toepassing 1,25% OX en oplossing voertuig op de rechter en linker muisknop oren.
- Na 8 uur, het beheer van 100 ul van vers bereide anti-Ly6G mAb werkende oplossing (5 ug mAb / muis / injectie) via retro-orbitale injectie in dezelfde muis.
- De bloedvaten te visualiseren, onmiddellijk voor beeldvorming, bestuurt 100 pl 30 mg / ml fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd dextran (150 kDa) door middel van retro-orbitale injectie.
4. Intravitale Imaging van neutrofielen Priming in PIL-1-DsRed Muizen
- Verdoven muis met ip injectie van anesthesie cocktail (2.1).0; Breng veterinaire zalf om de muis ogen om uitdroging te voorkomen, terwijl onder verdoving voor de beeldvorming.
- Bereid 1 ml halve dosis anestheticum cocktail van verdunning 500 ul originele anestheticum cocktail met een gelijk volume PBS.
- Transfer halve dosis verdoving cocktail tot 1 ml spuit met een naald vlinder 27.
- Breng de naald van de vlinder in de muis buik intraperitoneaal en bevestig de vlinder vleugel aan de buik van tapen.
- Plaats een glazen dekglaasje in het midden van de afbeeldeenheid. Tape de randen van het dekglaasje om het te houden op zijn plaats.
- Een druppel PBS op het ventrale oppervlak van de muis oor en op het dekglaasje.
- Positie verdoofd muis met haar oor over het dekglaasje. Monteer de punt van het oor, dorsale zijde naar beneden, door daartussen het oor tussen het dekglaasje en een glasplaatje, ook op zijn plaats gehouden via tape.
- Schakel een multi-laser fluorescentie confocale microscoop en alle daarmee verband equipment. Schakel de kamer lichten aan het omgevingslicht blootstelling te minimaliseren.
- Open de afbeelding acquisitie software. Selecteer de laser kanalen voor de detectie van fluorescerende kleurstoffen in het menu Dye List.
- Stel de focus op de ontstoken oorhuid door waarneming van groene signalen van de bloedvaten en rode signalen van de DsRed + cellen door oculair.
- Voer een snelle scan met een scansnelheid van 2 ps / pixel en de resolutie van 512 × 512 pixels. Selecteer een pseudocolor voor elk kanaal in de Live View-menu. Pas de focus knop om het einde te stellen en start plaats van het scannen.
- Voer langzaam scans met een scansnelheid van 4-8 usec / pixel en de resolutie van 800 × 800 of 1024 × 1024 pixels. Regel de hoogspanning, gain en offset op elk kanaal om de intensiteit van de signalen te maximaliseren terwijl het vermijden van verzadiging (rode pixels). Er moeten enkele rode pixels in elk kanaal.
- Maak drie-dimensionaal beeld sets door het scannen van ee oorhuid beginnen oppervlakkig in het stratum corneum en verloopt naar beneden met x, y, z volumes van 317 um x 317 um x 30 urn (40X objectief), 635 um x 635 um x 30 urn (20X objectief) of 1270 micrometer x 1270 micrometer x 50 micrometer (10X objectief) bij 2 micrometer z-stappen.
OPMERKING: Het stratum corneum is de buitenste laag van de epidermis en gemakkelijk gelokaliseerde worden op de sterke autofluorescentie signaal. - In time-lapse imaging experimenten, opnemen driedimensionale beelden om de 2 of 4 min voor maximaal 8 uur.
- Tussenpozen, een muis begint te herstellen van de anesthesie, merkte op basis van waarneming van spiertrekkingen snorharen, beheren 5-10 ul van halve dosis verdoving cocktail met vlinder naald.
LET OP: Wees voorzichtig met de verdoving dosis - overdosering kunnen muis dood veroorzaken. Alternatief zou inhalatie-anesthesie in een pot worden toegepast op muis voor kortdurende anesthesie en eenneuskegel kan worden gebruikt voor lange termijn beeldvorming. - Verwijder de verdoofde muis van de fase beeldvorming is voltooid. Maak tape en verwijder de vlinder naald uit de buik van de muis. Breng de muis naar een aparte kooi in het huis dier faciliteit.
LET OP: Voor de korte termijn imaging (<1 uur), muizen volledig herstellen van de anesthesie snel in 1-3 uur. Voor langdurige imaging (~ 8 uur), muizen herstellen langzaam, met een typische herstelperiode van 12-16 uur. Zo wordt orale toediening water aangeraden na ten minste een paar keer tijdens de herstelperiode tot ernstige uitdroging te voorkomen. - Proces imaging datasets, volgen individuele cellen, het genereren van trekkende paden, en het berekenen van de richting en snelheid van celmigratie met behulp van software voor beeldanalyse 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Screening van pIL1 DsRed-muizen uitgevoerd op basis van de fenotypische DsRed fluorescentiesignaal door hun perifere bloed leukocyten middels flowcytometrie. LPS stimulatie is bekend dat IL-1β induceren in myeloïde cellen zoals neutrofielen, monocyten en dendritische cellen 26-28. Aldus worden geïsoleerde leukocyten geïncubeerd met LPS gedurende 4 uur voorafgaand aan flowcytometrie analyse. Vervolgens wordt gating ingesteld circulerende myeloïde cellen op basis van celgrootte (FSC) en interne complexiteit (SSC) (figuur 1A) 29 en DsRed signaal wordt op deze gated populatie. Circulerende myeloïde cellen van de WT-muizen minimaal te uiten DsRed, terwijl dezelfde cellen van pIL1-DsRed muizen brengen onderscheiden DsRed signalen (Figuur 1B). De pIL1-DsRed muizen geïdentificeerd door deze fenotypering methode worden gebruikt voor verdere experimenten. Opgemerkt wordt dat de volledige fenotypering duurt slechts enkeleuur - veel korter dan de traditionele genotyperingswerkwijzen zoals weefsel oogst, enzymatische digestie, DNA isolatie, PCR en elektroforese.
IL-1β promoter activatie is onlangs geïdentificeerd als een merker van neutrofiel priming 22. Aldus kan het dynamische proces van neutrofiel priming worden gevisualiseerd en beoordeeld in levende dieren met behulp pIL1 DsRed-muizen. Huidontsteking veroorzaken, wordt de huid sensibilisator OX topisch aangebracht op het rechteroor van pIL1 DsRed-muizen en alleen drager wordt aangebracht op het linkeroor van hetzelfde dier. Neutrofielen label in levende dieren, is een recent ontwikkeld protocol uitgevoerd door toediening van een kleine hoeveelheid fluorescent gelabelde anti-Ly6G mAb onmiddellijk vóór en 8 uur na OX toepassing. Bloedvaten te lokaliseren, wordt FITC-dextran geïnjecteerd onmiddellijk voorafgaand aan beeldvorming.
Op 24 uur na OX toepassing, eengroot aantal DsRed + / Ly6G + cellen worden aangetroffen in de extravasculaire ruimte (Figuur 2A) en vertegenwoordigen primer neutrofielen. Een klein aantal DsRed / Ly6G + cellen zijn ook te vinden, die de grootste kans vertegenwoordigen rusten neutrofielen. Bovendien, een kleine populatie van DsRed + / Ly6G - cellen waargenomen, hetgeen inflammatoire monocyten en geactiveerde macrofagen kan omvatten. In een 40 minuten time-lapse video, Ly6G + neutrofielen opkomende binnen een ontsteking van de huid laesie vertonen typisch amoebe-achtige kruipen beweging (brief Movie 1). Cell trekkende paden worden gevolgd om beweeglijke gedrag van de DsRed + / Ly6G + en DsRed vergelijken - / + Ly6G neutrofielen populatie (Figuur 2B). De track plot analyses tonen aan dat zowel neutrofielen bevolking weer te geven "random" migratie zodra de extracellulaire ruimte is ingevoerd (figuur 2C). Interessant,DsRed + / + Ly6G neutrofielen vertonen een significant hogere snelheid in vergelijking met hun DsRed - / + Ly6G tegenhangers (figuur 2D). Dit suggereert een verband tussen neutrofielen priming en versnelde beweeglijkheid in ontstekingshaarden.
Om de timing van neutrofielen priming, een reeks van time-lapse video's te bewaken werden opgenomen vanaf verschillende tijdstippen na OX behandeling (Aanvullende Movies 2-4). DsRed - / Ly6G + cellen, de rustende neutrofielen, worden gedetecteerd in de extravasculaire ruimte al 8-12 uur na OX toepassing en hun aantal relatief laag blijven daarna (figuur 2E, Hulp films 3, 4). Integendeel, het aantal DsRed + / + cellen Ly6G, het gegronde neutrofielen, verhoogd wordt op latere tijdstippen, vanaf 14-16 uur na OX toepassing. sommige DsRed
Figuur 1:. Fenotypering van pIL1-DsRed Muizen (A) Flowcytometrie analyses aantonen dat er een populatie van circulerende myeloïde cellen (G1) op basis van FSC en SSC parameters. (B) Histogrammen in het FL2-kanaal tonen het percentage van DsRed + cellen in G1 poort van de cellen van PIL-DsRed muizen (rood) of uit WT muizen (blauw). De gegevens zijn representatief voor ten least drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Visualisatie van Motile Activiteiten van DsRed + / Ly6G + neutrofielen in Inflammatory huidletsels (A) Statische confocale microscopie beelden die zijn opgenomen 24 uur na OX behandeling tonen drie leukocyten populaties in de extravasculaire ruimte, dat wil zeggen, DsRed + / Ly6G + cellen. (sterretjes), DsRed - / Ly6G + cellen (driehoeken), en DsRed + / Ly6G - cellen (pijlen). Bar = 20 urn. DsRed + / Ly6G + cellen (rood) en DsRed - / Ly6G + cellen (blauw) worden vergeleken voor migratory paden (B), spoor percelen (C), en de snelheid (D) van een 40 min time-lapse film opgenomen door confocale microscopie te beginnen 24 uur na OX applicatie (Aanvullende Movie 1). (D) Bars geven betekenen velocity waarden. *** P <0,001. (E) De nummers van DsRed + / Ly6G + cellen en DsRed - / Ly6G + cellen worden geteld uit een reeks van time-lapse filmpjes opgenomen op verschillende tijdstippen na OX applicatie (Aanvullende Movies 2 tot en met 4). De getoonde gegevens zijn het aantal cellen / mm2 (gemiddelde ± SD) berekend uit drie opeenvolgende afbeeldingen. (F) statische beelden worden gemaakt op basis van een time-lapse film opgenomen 11-14,5 uur na OX schilderij (Aanvullende Movie 5). De pijl geeft een Ly6G + cel die DsRed expressie verkrijgt in de extravasculaire ruimte tijdens de observatieperiode.Bar = 50 urn. Beelden worden overgenomen uit referentie 22 met toestemming (Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc.). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Aanvullende Movie 1: Motile Gedrag van DsRed + neutrofielen in Inflammatory huidletsels (bij 24 uur na OX schilderen) confocale microscopie beelden tonen de beweeglijkheid van DsRed + / Ly6G + cellen (roze) en DsRed - / Ly6G + cellen (blauw) in de extravasculaire ruimte. Bloedvaten worden gezien in het groen. Bar = 20 urn. De video is overgenomen uit referentie 22 met toestemming (Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc.). Gelieve click hier om deze video te bekijken.
. Aanvullende Movie 2: Motile Gedrag van DsRed + neutrofielen in Inflammatory huidletsels (bij 4 uur na OX schilderen) confocale microscopie beelden tonen DsRed + / Ly6G + cellen (roze) en DsRed - / Ly6G + cellen (blauw) in de extravasculaire ruimte . Bloedvaten worden gezien in het groen. Autofluorescentie is aanwezig en in verband met haarfollikels. Bar = 100 urn. De video is overgenomen uit referentie 22 met toestemming (Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc.). Klik hier om deze video te bekijken.
Aanvullende Movie 3: Motile Gedrag van DsRed + neutrofielen in Inf. lammatory huidletsels (8 uur na OX schilderen) confocale microscopie beelden tonen DsRed + / Ly6G + cellen (roze) en DsRed - / Ly6G + cellen (blauw) in de extravasculaire ruimte. Bloedvaten worden gezien in het groen. Autofluorescentie is aanwezig en in verband met haarfollikels. Bar = 100 urn. De video is overgenomen uit referentie 22 met toestemming (Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc.). Klik hier om deze video te bekijken.
Aanvullende Movie 4: Motile Gedrag van DsRed + neutrofielen in Inflammatory huidletsels (bij 11-19 uur na OX schilderen) confocale microscopie beelden tonen DsRed + / Ly6G + cellen (roze) en DsRed - / Ly6G + cellen (blauw) in de. extravascular ruimte. Bloedvaten worden gezien in het groen. Autofluorescentie is aanwezig en in verband met haarfollikels. Bar = 100 urn. De video is overgenomen uit referentie 22 met toestemming (Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van immunologen, Inc.). Klik hier om deze video te bekijken.
Aanvullende Movie 5: Verwerving van DsRed Signalen door Ly6G + neutrofielen uit de time-lapse film getoond in aanvullende Video 4, deze hogere vergroting video toont het proces waarin een Ly6G + cel (aangeduid met een pijl) verwerft DsRed meningsuiting in de extravasculaire. ruimte gedurende de observatieperiode (11-14,5 uur na OX schilderen). Bar = 50 urn. De video is overgenomen uit referentie 22 met toestemming (Copyright 2015. De Amerikaanse Vereniging van Immunologists, Inc.). Klik hier om deze video te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van deze studie is om een technologie te ontwikkelen voor het monitoren van het proces van neutrofiel priming in levende dieren, die nog niet is vervuld door de huidige beschikbare technieken. Om dit doel te bereiken, worden drie gevestigde methoden uitgevoerd: 1) inductie van huidontsteking in IL-1β-promoter gedreven DsRed reportermuizen als maat voor priming, 2) in vivo labeling van neutrofielen met lage doses van fluorescentie-geconjugeerd anti-Ly6G mAb, en 3) intravitale microscopie confocale beeldvorming. De combinatie van deze drie methoden maakt visualisatie van de beweeglijke activiteiten van neutrofielen primer (DsRed + / + Ly6G) in inflammatoire huidletsels. De migratie richting en snelheid van het gegronde neutrofielen verder gekwantificeerd via trekvogels volgen pad. Door het opnemen van een reeks van time-lapse video's, is het real-time kinetiek van primer neutrofielen opkomst gecontroleerd op inflammatoire plaats en de verwerving van DsRed expressie door individuele neutrofielen wordt ook waargenomen in de extravasculaire ruimte. Dus het dynamische proces van neutrofiel priming met succes gevisualiseerd in levende dieren voor het eerst gebruik van de technologie hier gepresenteerd.
Deze technologie wordt gebruikt in een aantal kritische stappen. Ten eerste, de huid weefsels zijn de meest handige lichaamsdelen voor intravitale beeldvorming. Actuele toepassing van OX op de muis oor maakt directe visualisatie van immuuncel gedrag in ontstoken huid onder confocale microscopie. Ten tweede moet het voortdurend muis verdoofd tijdens het belichten die herhaalde injecties van verdoving vereist. Echter, over-sedatie muis sterven veroorzaken tijdens de beeldvorming. Om overdosering te vermijden, worden lage doses anestheticum (een helft of een derde van de volledige dosis) aanbevolen voor langdurige beeldvorming. Derde fluorescentie-geconjugeerd neutrofiel-specifieke mAb moeten periodiek worden geïnjecteerd door de korte levensduur van muizen neutrofielen (halfwaardetijd van 8-10 uur 30). Last, aandacht drIFT is een belangrijk onderwerp tijdens de time-lapse imaging, die kunnen worden veroorzaakt door meerdere factoren, zoals temperatuurschommelingen, muis beweging van het lichaam, oor zwelling in de tijd, en trillingen als gevolg van de werking van het instrument 31. Verschillende werkwijzen zijn ontwikkeld om drift te voorkomen, zoals toediening van een constante dosis sedatie tijdens beeldvorming, vaststelling van de muis oor plaats door taping een glasplaatje over op het podium, het installeren van een klimaatkamer zuurstof en warmte leveren aan het verdoofd organisme als door handmatig opnieuw richten van de scope wanneer dat nodig is 32,33.
Het is even belangrijk om de beperkingen van dit protocol te vermelden. Ten eerste, een langzaam herstel muis - wordt (12 16 uur) na een beeldvormende periode 8 uur lang waargenomen door continue sedatie, wat aangeeft dat dit protocol niet geschikt voor dergelijke langdurige experimenten mogelijk. Een andere benadering bestaat erin meerdere muizen hebben achtereenvolgens via beeldvormende periode plaats uzingen slechts één. Ten tweede wordt een geleidelijke lekkage van circulerende FITC-dextran waargenomen tijdens beeldvorming tijd, die waarschijnlijk wordt veroorzaakt door verhoogde permeabiliteit van de huid bloedvaten in de inflammatoire toestand 34. Aldus wordt visualisatie van bloedvaten aanzienlijk aangetast gegeven verlaagde fluorescentie in omloop latere stadia van beeldvorming. Als alternatief kan een fluorescent geconjugeerde lectinen zoals isolectin B4 om bloedvaten te markeren als deze zich aan vasculaire endotheelcellen 35.
Naast visualisatie van het proces van neutrofiel priming in de huid inflammatoire laesies, kan de hier beschreven technologie ook worden toegepast in vele andere experimentele instellingen. In combinatie met de recent ontwikkelde beeldvormende ramen kan intravitale microscopie afbakening van het gedrag van geprimede neutrofielen in diepe weefsels en organen, inclusief de hersenen, borstklieren, longen en buikorganen 36-39 worden beoordeeld. Bovendien, visualisatie van priming / activering van andere celtypen, zoals monocyten en macrofagen kan worden bereikt met pIL1 DsRed-muizen met in vivo labeling via fluorescentie-geconjugeerd mAb specifiek voor het celtype. tezamen niet alleen deze technologie een basiskader voor intravitale beeldvorming van het vulproces van neutrofielen in levende dieren, maar onthult ook nieuwe benaderingen voor het bestuderen van het gedrag en functie van andere immuuncellen in diverse ontstekingstoestanden ontvouwen in verschillende weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 kDa | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
- El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
- Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
- Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
- Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
- Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
- Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
- Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
- Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
- Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
- Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
- Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
- Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
- Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
- Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
- Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
- Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
