Abstract
好中球は人間の血液循環中で最も豊富な白血球であるとすぐに炎症部位に補充されます。プライミングは、好中球の貪食機能を強化し、重要なイベントです。広範な研究は、感染や傷害の間に好中球のプライミングの存在と重要性を発表しているが、 生体内でこのプロセスを可視化する手段が使用できなくなっています。蛍光結合抗リンパ球抗原の注入によって達成- 2）in vivoでの好中球の標識をプライミングの尺度として使用- 1）のDsRedレポーターシグナル：提供されたプロトコールは、3の方法論を組み合わせることにより、生きている動物にプライミング好中球のダイナミックなプロセスの監視が可能6G（Ly6G）モノクローナル抗体（mAb）、3）生体内共焦点画像化。いくつかの重要なステップは、このプロトコルに関与している：オキサゾロン誘発性マウス耳皮膚の炎症、動物の適切な鎮静、抗Ly6G mAbの反復注射、および前へ撮影時の焦点ドリフトのention。いくつかの制限は、1つのマウスでの連続撮影時間（〜8時間）の限界とフルオレセインイソチオシアネート - デキストラン炎症状態の血管からの漏出として、観察されているが、このプロトコルは、生体内イメージングのための基本的なフレームワークを提供します簡単にマウス炎症モデルにおける他の免疫細胞の検査に拡大することができる下塗りされた好中球の挙動と機能、。
Introduction
好中球は、循環中で最も豊富で短命白血球です。彼らは急速に彼らは抗菌ペプチドおよびプロテアーゼ1を含有する顆粒と一緒に活性酸素の放出および窒素中間体を介してプロの食細胞として機能し、感染または損傷の部位に動員されます。彼らの募集時には、好中球は炎症2の部位での到着時に顕著に強化された食細胞の機能で、その結果、微生物製品、化学誘引物質、および炎症性サイトカインを含む種々の薬剤によって「プライミングされた"されています。好中球のプライミングのメカニズムが広く試験管 3,4 に研究されています。しかしながら、 インビボでのプロセスの動的監視は、これまで不可能でした。
近年、生体内イメージングは、生体内の生物学的プロセスの細胞動態を可視化し、定量化するための重要な技術となっています。 Intraviタル画像は、従来の一光子励起顕微鏡（ 例えば、共焦点）を介して行うことができ、または多顕微鏡5に近づきます。時間が経つにつれて、かなりの改善が増加画像解像度、改善されたイメージング深さを可能にするこの技術で達成された、組織の光損傷、および強化された防振6,7を減少させました 。時間をかけて細胞移動および相互作用の動的可視化を可能にする独自の能力を考えると、生体顕微鏡は広く免疫学8に研究の多様な分野に適用されています。生体内イメージングは、よりよい生きている動物モデルの両方の細胞および分子レベルでの免疫応答を理解し、文脈する免疫学者を可能にします。
最近のトランスジェニックの進歩だけでなく、ノックインレポーターマウスは、生きている動物に好中球の動的挙動を監視するための有用なツールを提供してきました。リゾチームMプロモーター駆動強化緑色蛍光タンパク質ノックインマウスは広く溢出、細菌感染、および無菌性炎症9-15を含む種々の炎症性プロセスの間、好中球、単球、およびマクロファージの運動性を特徴づけるために使用されています。さらに、細胞質の蛍光共鳴エネルギー転移のバイオセンサーを発現するトランスジェニックマウスは、炎症性腸16内の好中球細胞外調節さマイトジェンキナーゼおよびプロテインキナーゼAの 活性を研究に使用されています。好中球における蛍光発現のための高い特異性を有するマウスモデルは、それ自体がリンパ球抗原6G（Ly6G）17の発現に結合された蛍光タンパク質tdTomato、ならびにCreリコンビナーゼを生成キャッチアップノックインマウス、です。このモデルを介したLy6G欠損好中球の可視化は、これらの細胞が生体内の炎症のコンテキストでの滅菌または感染の様々な通常の機能を発揮することが実証されています。 DsRedの蛍光Pを発現するトランスジェニックマウス好中球、炎症性単球、および活性化マクロファージを含むと考え - - （IL-1β）プロモーター（pIL1-DsRedの）はIL-1β産生細胞の運動性挙動を可視化するために利用されているinterleuikin-1βマウスの制御下に遺伝子をrotein新興炎症を起こした皮膚の18インチ
in vivoでの標識は、炎症を起こした組織中の好中球の細胞および分子の挙動を追跡するための代替的なアプローチとして機能することができます。蛍光標識した抗GR-1モノクローナル抗体（mAb）の低用量の静脈内注射した後、GR-1 +好中球の動員カスケードは、 黄色ブドウ球菌 19を感染させたマウスの皮膚病変で可視化されてきた。ストレプトアビジンを含む結合体のインビボ投与コンジュゲートさ705 nmの量子ドットおよびビオチン化抗Ly6G mAbが特異的に循環好中球20にラベルを付けます。 neutrophへのそのようなコンジュゲートのまた、エンドサイトーシスIL小胞間質への移行の好中球で高速小胞輸送の追跡を可能にする。P-セレクチン糖タンパク質リガンド-1（PSGL-1）、L-セレクチン（CD62L）に対する蛍光標識抗体とのin vivo標識、インテグリンαM（CD11bのTNFα誘導性炎症モデルにおける）およびケモカイン（CXCモチーフ）受容体2（CXCR2）は、初期の炎症の21時に遊んで調節機構を解明しました。偏好中球は、CD11bおよびCXCR2の再分配が生じ、活性化血小板上のCD62Lの存在と対話するためのPSGL-1に富んだuropods、好中球遊走を駆動し、炎症を開始する受容体を突出しています。
IL-1βは、下塗りされた好中球22に上昇しているシグネチャー遺伝子の一つです。 pIL1-DsRedのレポーターマウスにおいて、DsRedの蛍光シグナル（ すなわち 、IL-1βプロモーターの活性化）正にIL-1βmRNAの発現及びIL-1βタンパク質産生と相関します。<SUP> 18は、好中球のプライミングのプロセスを監視するには、生体顕微鏡法は、蛍光結合抗Ly6G mAbによる好中球のin vivo標識次pIL1-DsRedのマウスモデルにおけるオキサゾロン（OX）で皮膚の炎症の誘導を伴う開発されました。このモデルを介して、様々な疾患および障害の動物モデルにおいて好中球プライミングの動作及び機能を研究することが可能です。
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Protocol
全ての動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実行し、トレドの大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。
pIL1-DsRedをマウスの1表現型
注：子孫は、野生型（WT）C57BL6マウスとヘテロ接合pIL1-DsRedのマウスを交配することによって生成されます。 3〜4週齢の仔は、表現型の準備と考えられています。マウスの顎下出血は、わずかな修正23で確立されたプロトコルに準拠しています。
- マウス子犬の全血からの白血球の分離
- 各1.5ミリリットルマイクロチューブにヘパリン20μlのを追加します。
- ケージから1子犬を取得します。子犬の識別タグを記録します。顎下静脈から採血する前に子犬を麻酔するために必要とされていません。
- 首の首筋によって子犬を持ち、目に顎下静脈を貫通5ミリメートルのランセットを使用して電子の頬袋。血の滴が浸透の点から発散するように、小さな穿刺を作成するために十分な力を適用します。各子犬のための新しい針を使用してください。
- ヘパリン含有マイクロチューブに子犬あたりの血液の5滴 - 3を収集します。穿刺部位をきれいにし、止血を容易にするための圧力を適用します。
- 新しいケージに子犬を入れて、動物施設にケージを返す前に30分間観察します。
- 正および負の対照として知られている表現型の成体マウスから血液を採取します。
- 各チューブ、ボルテックスチューブに赤血球溶解緩衝液500μlを追加し、5インキュベート - 氷の上で10分。
- 各管中の細胞懸濁液の下にウシ胎児血清（FBS）を500μl - ゆっくりと400を追加します。明確なインターフェースは、上位層の細胞懸濁液及びFBSの下位層との間に観察することができます。
- 5分間1500×gでキャップチューブと遠心分離機サンプル。
- 毛皮に1.1.9 - を繰り返して、1.1.7の手順THER赤血球を除去。溶解が初めて十分であれば繰り返さないでください。ペレットを遠心分離した後に識別することは困難であるべきです。
- リポポリサッカライド（LPS）刺激と文化
- 完全なロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地200μlで細胞を再懸濁し。
- フローサイトメトリーチューブに細胞懸濁液を転送します。
- 完全RPMI 1640培地の990μlのLPSストック溶液10μl（1mg / ml）を混合して使用液をLPSを行います。
- 細胞懸濁液の200μlに作業溶液を10μg/ mlのLPSの20μLを加えます。
- キャップチューブを緩くし、5％CO 2で37℃で4時間サンプルをインキュベートします。
- フローサイトメトリー分析
- フローサイトメトリーのためのデータ取得プログラムを開きます。前サンプル取得に取得テンプレートを設定します。
- ツールパレットのドットプロットツールをクリックします。 FOを描きます側方散乱（SSC）プロット対rward散乱（FSC）。リニアスケールにFSCとSSCの電圧パラメータを設定します。
- サイトメーターによって許可されたFSCとSSCの最低のしきい値を選択します。それぞれ、FSCとSSCのしきい値200と50を適用します。
- SSCプロット対FSC内、破片、赤血球およびリンパ球、単球、顆粒球、および樹状細胞を含み、かつ除外ゲートG1を描きます。
- ツールパレットのヒストグラムツールをクリックします。 FL2（赤色蛍光チャネル）ヒストグラムを描画します。すべてのDsRed陽性事象を含めるようにゲートを描画するFL2信号のベースラインと陽性対照サンプルを設定するには、陰性対照試料を使用してください。
- サイトメーターの流体工学コントロールパネルで、「HI」（約60マイクロリットル/分）に「RUN」への流体モードと流量を設定します。各サンプルについて10,000事象を獲得します。
- G1のゲートからのDsRed陽性細胞の割合を測定することにより、子犬の表現型を決定します。
- 100mg / kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン、および1mg / kgのアセプロマジンを含む麻酔薬カクテルの腹腔内（ip）注射によりマウスを麻酔。適切に麻酔したマウスは、つま先のピンチに後足の撤退を示しません。
- マウスの両耳の背側表面に脱毛クリームを適用します。 1分30秒を待ちます。水湿らせたコットンで耳の表面を拭き、風乾させます。
- マイクロメーターを使用して、耳の厚さを測定し、別々のケージにマウスを交換します。 （ - 30分〜15）麻酔から回復するまで観察します。脱毛製品によって誘発される皮膚の炎症を解決するために、さらなる実験が行われる前に、マウスは3日間休むことができます。
- 1ミリリットルのアセトンにOXの16.7ミリグラムを溶解し、オリーブオイル250μlのOX /アセトン溶液750μLを混合することにより、1.25％（w / v）のOXを準備します。 250とアセトンの750μLを混合することにより、車両のソリューションを準備＃181;オリーブオイルのリットル。
- 麻酔薬カクテル（2.1）の腹腔内注射による再麻酔マウス。以前のように耳の厚さを測定します。
- 右耳の各側に1.25％OXの12.5μLを適用します。左耳のそれぞれの側にアセトン/オリーブオイルビヒクル溶液12.5μlのを適用します。
- 完全に元のケージにマウスを交換し、動物飼育施設に戻り、その後、他のマウスがその耳に侮辱を防ぐために回復するまでマウスをケージメイトとは別に保管してください。
注：脱毛は、耳の厚さの変化により、以下の軽微な皮膚の炎症を引き起こすことがあります。このマイナーな炎症は3日後に、通常の耳の厚さによって確認解決されます。 24時間局所適用した後、OX-処理された耳は有意な（P <0.01）と比較ビヒクル溶液のみで処理した耳膨潤を示します。
pIL1-DsRedをマウスにおける好中球の3ラベリング
注：低用量Fで好中球のin vivo標識luorescence共役好中球特異的mAbは、最近開発されたプロトコル19に従います。眼窩後注射は、いくつかの変更24で確立されたプロトコルに従って行われます。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の90μlの0.5 mg / mlでアレクサフルオロ647結合抗Ly6Gモノクローナル抗体（クローン1A8）の10μLを希釈することにより抗Ly6G mAbのワーキング溶液を調製します。
- 28ゲージの針を持つU-100インスリン注射器に抗Ly6G mAbのワーキング溶液（50μg/ mlの）の100μlのを転送します。
- 先に説明した麻酔薬カクテル（2.1）の腹腔内注射により大人pIL1-DsRedをマウスを麻酔。クリーンな作業ボードに麻酔マウスの腹部を下に置きます。
- 部分的にソケットから眼球突出する1つのマウスの眼に優しい下方皮膚背に圧力と腹を適用します。
- 慎重に眼窩後に内側眼角で約30°の角度で、ダウンベベル、針を置きます洞。
注：オペレータが洞に針を挿入一度圧力、浸透とホッと抵抗を感じることができます。 - ゆっくりとスムーズマウスに抗Ly6G mAbの100μlのワーキング溶液（5μgのモノクローナル抗体/マウス/注射）を注入します。すぐに針を外します。出血少量の成功した注入を示唆しています。
- すぐに右と左のマウスの耳の上に1.25％OXと車両のソリューションを適用します。
- 8時間後、同じマウスに眼窩後部注射を介して新たに調製した抗Ly6G mAbのワーキング溶液（5μgのモノクローナル抗体/マウス/注射）の100μLを管理します。
- 血管を可視化するために、すぐに撮影する前に、30 mg / mlでフルオレセインイソチオシアネート（FITC）の管理100μlを眼窩後部注射によってデキストラン（150kDaのを）抱合しました。
pIL-1-DsRedをマウスにおける好中球プライミングの4生体内イメージング
- 麻酔薬カクテル（2.1）の腹腔内注射でマウスを麻酔。0;しばらくイメージングのための麻酔下で乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医の軟膏を適用します。
- 等量のPBSで元の麻酔薬カクテル500μlの希釈して1ミリリットル半用量の麻酔薬カクテルを準備します。
- 蝶27ゲージの針で1ミリリットル注射器に半用量の麻酔薬カクテルを転送します。
- 腹腔内にマウスの腹部に蝶の針を挿入し、テーピングによって腹部に蝶の羽を修正。
- 撮影台の中心にカバーガラスを置きます。所定の位置に保持するためにカバースリップの端をテープで固定します。
- マウスの耳の腹側表面上だけでなく、カバースリップ上でPBSのドロップを置きます。
- 位置は、カバーガラスの上に、その耳で、マウスを麻酔しました。また、テープを介して、所定の位置に保持カバーガラスとスライドガラスとの間に耳を挟むことによって、ダウン耳の先端、背側をマウントします。
- マルチレーザ蛍光共焦点顕微鏡および関連するすべての電子をオンにしますquipment。周囲光の露出を最小限にするために部屋の照明をオフにします。
- 画像取得ソフトウェアを開きます。色素一覧メニューの蛍光色素の検出のためのレーザー・チャネルを選択します。
- 接眼レンズを通してのDsRed +細胞から血管や赤の信号から緑色の信号を観測することによって炎症を起こした耳皮膚にフォーカスを調整します。
- スキャン2マイクロ秒/ピクセルの速度と512×512ピクセルの解像度で高速スキャンを実行します。ライブビューメニューの各チャンネルの擬似カラーを選択します。最後に設定し、スキャンの場所を開始するために、フォーカスノブを調整します。
- 8マイクロ秒/ピクセルと800×800または1024×1024ピクセルの解像度 - スキャン4の速度でゆっくりとスキャンを実行します。高電圧を調整し、ゲイン、及び彩度（赤ピクセル）を回避しながら、信号の強度を最大化するために各チャンネルのオフセット。各チャンネルで唯一の少数の赤色画素があるはずです。
- 目をスキャンすることによって三次元画像セットを作成電子の耳皮膚、635ミクロン×635ミクロン×30ミクロン（20X対物レンズ）、または1270ミクロン×を角質層に表面的に始まり、X、Y、317ミクロン×30ミクロン（対物レンズ40倍）×317ミクロンのZボリューム下方に進んで2ミクロンのzの手順で1270ミクロン×50ミクロン（10×対物レンズ）。
注：角質層は、表皮の最も外側の層であり、容易にその強い自家蛍光信号に基づいてローカライズすることができます。 - タイムラプスイメージング実験では、レコードの3次元画像を最大8時間ごとに2または4分。
- 蝶の針を介して半用量の麻酔カクテル10μlの - マウスが麻酔から回復し始めると断続的に、5を管理し、けいれんウィスカーの観察に基づいて指摘しました。
注：麻酔用量の注意が必要 - 過剰摂取がマウスの死を引き起こす可能性があります。また、瓶内吸入麻酔は、短期的な麻酔およびAのマウスに適用することができますノーズコーンは、長期的画像化のために使用することができます。 - イメージングが完了した段階から麻酔マウスを削除します。テープを外し、マウスの腹部から翼状針を取り除きます。動物飼育施設内の別々のケージにマウスを返します。
注： - 3時間の短期イメージング（<1時間）のために、マウスは完全に1に迅速に麻酔から回復します。 16時間 - 長期イメージング（〜8時間）のために、マウスは、12の一般的な回復期間で、ゆっくりと回復します。したがって、経口水投与は重度の脱水症を防ぐために、回復期間中に少なくとも数回をお勧めします。 - 処理画像データセットは、個々の細胞を追跡遊走経路を生成し、画像解析ソフトウェア25を使用して細胞移動の方向と速度を算出します。
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Representative Results
pIL1-DsRedのマウスのスクリーニングを、フローサイトメトリーを使用して、末梢血白血球によって産生される表現型のDsRed蛍光シグナルに基づいて行われます。 LPS刺激は、好中球、単球、および樹状細胞を26〜28を含む骨髄細胞におけるIL-1βの産生を誘導することが知られています。したがって、単離された白血球は、フローサイトメトリー分析の前に4時間、LPSとインキュベートします。次に、ゲートは、このゲート制御集団で測定される細胞サイズ（FSC）および内部の複雑さ（SSC）（ 図1A）29、およびDsRedの信号に基づいて、骨髄細胞を循環させるために設定されています。 pIL1-DsRedをマウスからの同じ細胞が識別可能なDsRedの信号（ 図1B）を発現しながら、WTマウスからの循環骨髄細胞は、最小限、DsRedを発現します。この表現型の方法によって同定さpIL1-DsRedのマウスは、その後の実験に使用されています。完全な表現型のプロセスはわずか数を要することに留意すべきです時間 - 組織の収穫、酵素消化、DNAの単離、PCRおよび電気泳動を含む伝統的な遺伝子型決定法よりもはるかに短いです。
IL-1βプロモーターの活性化は、最近22をプライミング好中球のマーカーとして同定されています。したがって、好中球のプライミングの動的プロセスはpIL1-DsRedのマウスを用いた動物の生体内で可視化評価することができます。皮膚の炎症を誘発するために、皮膚感作のOXは、局所pIL1-DsRedをマウスの右耳に塗布し、ビヒクル単独を、同じ動物の左耳に塗布します。生きた動物での好中球を標識するために、最近開発されたプロトコルは、直前に蛍光標識された抗Ly6G mAbの少量を投与することによって行われ、OX適用後8時間です。血管を見つけるには、FITCデキストランは、撮影の直前に注入されます。
OX適用後24時間、Aに大型のDsRed + / Ly6G +細胞の数は、血管外の空間（ 図2A）に見られ、プライミングされた好中球を表しています。少数のDsRed / Ly6G +細胞はまた、最も可能性の高い休んで好中球を表す、発見されました。また、のDsRed + / Ly6Gの小集団-細胞は観察され、炎症性単球および活性化マクロファージを含むことができます。 40分タイムラプスビデオでは、炎症性皮膚病変内に新興Ly6G +好中球は、典型的なアメーバ状のクロールの動き（ 補足ムービー1）を示します。 / Ly6G +好中球集団（ 図2B） -細胞の遊走パスはDsRedを+ / Ly6G +とのDsRedの運動性挙動を比較するために追跡されます。トラックのプロットは、細胞外空間が（ 図2C）に入力された後、両方の好中球集団は「ランダム」の移行を表示することを明らかにした分析します。興味深いことに、/ Ly6G +対応（ 図2D） - DsRedを+ / Ly6G +好中球は、彼らのDsRedと比較して有意に高い速度を示します。これは、炎症性病変における好中球のプライミングと加速運動性との関連を示唆しています。
好中球のプライミングのタイミングを監視するには、タイムラプスビデオのシリーズは、OX処理（ - 4補足作品2）以下の異なる時間に始まる記録しました。 DsRedを- / Ly6G +細胞、休止好中球は、早ければ8と血管外空間での検出可能になる- OX適用後12時間とその数は（4、図2E、補足作品3）その後、比較的低いままです。 OX適用後16時間-逆に、のDsRed + / Ly6G +細胞の数は、プライミングされた好中球は、14で始まり、後の時点で徐々に増加します。いくつかのDsRed
図1：pIL1-DsRedをマウスの表現型 （A）フローサイトメトリーは、FSCとSSCのパラメータに基づいて、骨髄細胞（G1）を循環の人口を実証分析します。 （B）FL2チャネルにおいてヒストグラムがのpIL-DsRedのマウス（赤）またはWTマウス（青）からの細胞のG1ゲート内のDsRed +細胞の割合を示します。データがleでの代表的なものです3つの独立した実験AST。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 炎症性皮膚病変中 のDsRed + / Ly6G + 好中球 の運動性活動の可視化 （A）静的共焦点顕微鏡画像は、OX処理ショーの後血管外空間での3白血球集団、 すなわち 24時間を記録し、DsRedを+ / Ly6G +細胞。 （アスタリスク）、DsRedを- / Ly6G +細胞（三角形）、およびDsRedを+ / Ly6G -細胞（矢印）。バー=20μmです。 DsRedを+ / Ly6G +細胞（赤）とのDsRed - / Ly6G +細胞（青）migratoについて比較しますOXアプリケーション（ 補足ムービー1）24時間後に開始する共焦点顕微鏡によって記録された40分のタイムラプスムービーからRYパス（B）、トラックプロット（C）、および速度（D）。 （D）バーは、平均速度の値を示しています。 *** P <0.001。 （E）のDsRed + / Ly6G +細胞との数のDsRed - / Ly6G +細胞はOXアプリケーション（ 補足作品2〜4）後の異なる時点で記録されたタイムラプスムービーの一連からカウントされます。示したデータは、3連続した画像から算出した細胞数/ mm 2の（平均±SD）です。 （F）静的画像はOX塗装（ 補足ムービー5）後11〜14.5時間から記録タイムラプスムービーから作成されます。矢印は、観察期間中に血管外空間内のDsRedの発現を取得Ly6G +細胞を示しています。バー=50μmです。画像は許可（著作権2015免疫学者のアメリカの協会）と、基準22から再生されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。 補足ムービー1： - / Ly6G +細胞（青）中（OX塗装後24時間での）炎症性皮膚病変中 のDsRed + 好中球 の運動性挙動は、共焦点顕微鏡画像はDsRedを+ / Ly6G +細胞（ピンク）とのDsRedの運動性を示します血管外空間。血管は緑色に見えます。バー=20μmです。ビデオが許可（著作権2015免疫学者のアメリカ協会、Inc.）を参照22から再生されます。 をクリアしてくださいこのビデオを見るにはこちらICK。
補足ムービー2： 炎症性皮膚病変中 のDsRed + 好中球 の運動性挙動 （OXの塗装後4時間で）共焦点顕微鏡画像はDsRedを+ / Ly6G +細胞（ピンク）とDsRedの表示-血管外空間に/ Ly6G +細胞（青色）。 。血管は緑色に見えます。自己蛍光が存在し、毛包に関連しています。バー=100μmです。ビデオが許可（著作権2015免疫学者のアメリカの協会）と、基準22から再生される。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
補足ムービー3：INF に DsRedを + 好中球 の運動性挙動（OXの塗装後8時間で）lammatory皮膚病変共焦点顕微鏡画像はDsRedを+ / Ly6G +細胞（ピンク）とDsRedを示す- 。血管外空間に/ Ly6G +細胞（青色）。血管は緑色に見えます。自己蛍光が存在し、毛包に関連しています。バー=100μmです。ビデオが許可（著作権2015免疫学者のアメリカの協会）と、基準22から再生される。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
補足ムービー4： 運動性 炎症性皮膚病変中 のDsRed + 好中球 の挙動 （11時- OXの塗装後19時間）共焦点顕微鏡画像は（ピンク）のDsRed + / Ly6G +細胞を示すとのDsRed -中/ Ly6G +細胞（青）。 extravascularスペース。血管は緑色に見えます。自己蛍光が存在し、毛包に関連しています。バー=100μmです。ビデオが許可（著作権2015免疫学者のアメリカの協会）と、基準22から再生される。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
補足ムービー5：Ly6G + 好中球 によってDsRedの信号の取得 、この高倍率のビデオは（矢印で示す）Ly6G +細胞が血管外でのDsRed発現を獲得する過程を示して補足ビデオ4に示すタイムラプスムービーから。観察期間（OX塗装後の11から14.5時間）の間にスペース。バー=50μmです。ビデオは許可（著作権2015年イムのアメリカの協会と参照22から再生されますmunologists社）。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本研究の目的は、まだ現在利用可能な技術によって満たされていない生きている動物における好中球のプライミングのプロセスを監視するための技術を開発することです。この目標を達成するために、3つの確立された方法が実行される：IL-1βプロモーター駆動のDsRedレポーターマウスの皮膚炎症の1）誘導プライミングの尺度として、蛍光結合抗Ly6Gの低用量での好中球の2）in vivo標識モノクローナル抗体、3）生体内共焦点顕微鏡画像。これらの3つの方法の組み合わせは、炎症性皮膚病変におけるプライミングされた好中球（DsRedを+ / Ly6G +）の運動性活動の可視化を可能にします。下塗りされた好中球の移動方向と速度がさらに回遊経路追跡を経由して定量化されます。タイムラプスビデオのシリーズを記録することにより、下塗りされた好中球の出現のリアルタイムの動態は、iで炎症部位とのDsRed発現の買収で監視されていますndividual好中球はまた、血管外空間に観察されます。このように、好中球のプライミングの動的なプロセスが正常にここで紹介する技術を使用して初めて生きている動物で可視化されています。
この技術は、いくつかの重要なステップで使用されます。まず、皮膚組織は、生体内画像化のための最も便利な体の部分です。マウスの耳にOXの局所適用は、共焦点顕微鏡下で炎症を起こしている皮膚における免疫細胞の挙動の直接可視化を可能にします。第二に、マウスは麻酔薬の反復注射を必要と撮像中に常に鎮静剤を投与されなければなりません。しかし、過鎮静は、マウスが撮影中に死亡の原因となります。過剰摂取を避けるために、麻酔薬（半二重または全用量の第三）の低用量は、長期的なイメージングのために推奨されています。第三に、蛍光共役好中球特異的mAbが原因で、マウス好中球（8-10時間30の半減期）の短い寿命に断続的に注入する必要があります。最後に、フォーカスDRIFTは、温度変化、マウス本体の動き、時間の経過とともに耳の腫脹、および計測器31の動作に起因する振動を含む複数の要因が原因で発生することがタイムラプスイメージング、中に大きな問題です。いくつかの方法が鎮静さに酸素と暖かさを提供するために、環境室を設置、ステージ上でその上にスライドガラスをテーピングすることにより所定の位置にマウスの耳を固定し、このような撮像時の鎮静の一定用量の投与として、ドリフトを防ぐために開発されてきました手動で再フォーカス範囲、必要なときに32,33によって生物と同様に。
このプロトコルの制限を述べることも同様に重要です。まず、低速のマウス・リカバリ（12から16時間）の長さの撮像期間8時間は、このプロトコルは、このような長時間の実験に適していないかもしれないことを示すによる連続鎮静に観察された後。別のアプローチは、Uではなく撮像期間にわたって配列にいくつかのマウスを使用することです一つだけを歌います。第二循環FITCデキストランの段階的な漏れは、おそらく炎症状態34 における皮膚血管透過性の増大に起因する経時的画像化の間に観察されます。従って、血管の視覚化は、著しく画像化の後の段階での循環における減少した蛍光を与え損なわれる。あるいは、これらは、血管内皮細胞35に付着するように血管をマークするために、このようなイソレクチンB4として蛍光共役レクチンを使用してもよいです。
皮膚の炎症性病変における好中球のプライミングのプロセスの視覚化に加えて、ここに記載の技術は、多くの他の実験設定で適用することができます。最近開発された撮像ウインドウとの組み合わせでは、プライミングされた好中球の挙動を描写する生体顕微鏡は、脳、乳腺、肺、腹部臓器36-39を含む深部組織や器官で評価することができました。プリムのまた、可視化単球およびマクロファージのような他の細胞型のING /活性化を介してin vivo標識と共にpIL1-DsRedのマウスを使用して達成することができる蛍光結合目的の細胞型に特異的mAb。まとめると、この技術は、生きた動物中の好中球のプライミング工程の生体内イメージングのための基本的な枠組みを提供するが、それはまた、異なる組織で展開種々の炎症状態にある他の免疫細胞の挙動と機能を研究するための新しいアプローチを発表だけではありません。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 kDa | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
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