Abstract
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na circulação sanguínea humana e são rapidamente recrutados para sítios inflamatórios. Priming é um evento crítico que aumenta a funcionalidade fagocitária dos neutrófilos. Apesar de extensos estudos têm revelado a existência e importância de priming de neutrófilos durante a infecção e lesões, os meios de visualizar este processo in vivo têm sido indisponíveis. O protocolo fornecido permite o monitoramento do processo dinâmico de neutrófilos priming em animais vivos através da combinação de três métodos: 1) sinal de repórter DsRed - usado como uma medida de priming 2) in vivo rotulagem de neutrófilos - alcançada por injecção de antigénio anti-linfócito de fluorescência conjugada 6G (Ly6G) de anticorpo monoclonal (mAb) e 3) de imagem confocal intravital. Vários passos críticos estão envolvidos neste protocolo: Rato inflamação induzida por oxazolona pele da orelha, sedação adequada de animais, injeções repetidas de Ly6G anti-mAb, e prevenção do desvio de foco durante o exame. Embora não tenham sido observadas algumas limitações, tais como o limite de tempo de imagem contínua (~ 8 horas) em um mouse e o vazamento de isotiocianato-dextrano fluoresceína a partir de vasos sanguíneos no estado inflamatório, este protocolo fornece uma estrutura fundamental para imagiologia intravital de comportamento e função de neutrófilos com iniciador, que pode ser facilmente expandido para análise de outras células do sistema imunológico em modelos de inflamação do rato.
Introduction
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes e de curta duração em circulação. Eles são rapidamente recrutadas para os locais de infecção ou lesão, onde servem fagócitos como profissionais através de liberação de intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio, juntamente com grânulos contendo peptídeos antimicrobianos e proteases 1. Durante o seu recrutamento, os neutrófilos são "preparada" por vários agentes, incluindo os produtos microbianos, quimioatractivos, e citocinas inflamatórias, resultando em funcionalidade de fagócitos marcadamente melhorada após a chegada ao sítio de inflamação 2. Os mecanismos de escorvamento de neutrófilos têm sido extensivamente estudada in vitro 3,4; No entanto, o controlo dinâmico do processo in vivo, não foi possível até à data.
Recentemente, tornou-se imagens intravital uma técnica importante para visualizar e quantificar a dinâmica de processos biológicos celulares em organismos vivos. IntraviTal imagem pode ser realizada por meio de microscopia de excitação de um fotão convencional (por exemplo, confocal) ou microscopia multifotônica aproxima 5. Com o tempo, melhorias substanciais foram alcançados nesta técnica que permite maior resolução de imagem, profundidade de imagem melhorada, diminuiu photodamage tecidos e melhorada 6,7 estabilização de imagem. Dada a sua capacidade única para permitir a visualização dinâmica da migração celular e interação ao longo do tempo, microscopia intravital tem sido amplamente aplicada a diversas áreas de estudo em imunologia 8. imagens intravital permite imunologistas para melhor compreender e contextualizar as respostas imunes, tanto a nível celular e molecular em modelos animais vivos.
Os recentes avanços na transgênicos, bem como knock-in ratos repórter forneceram ferramentas úteis para o monitoramento dos comportamentos dinâmicos de neutrófilos em animais vivos. Lisozima M promotor-driven proteína verde fluorescente melhorada knock-inratos têm sido amplamente utilizados para caracterizar a motilidade de neutrófilos, monócitos e macrófagos, durante vários processos inflamatórios incluindo extravasamento, infecção bacteriana, e a inflamação estéril 9-15. Além disso, os ratinhos transgénicos que expressam uma energia de ressonância de fluorescência de transferência biossensor citoplasmática foram empregues para estudar as actividades dos neutrófilos mitogénio quinase extracelular regulada e proteína quinase A dentro de intestino inflamado 16. Um modelo murino com elevada especificidade para a expressão de fluorescência em neutrófilos é a knock-in rato Catchup, que produz a recombinase Cre, bem como a proteína fluorescente tdTomato, que por sua vez está acoplado a expressão de antigénio de linfócitos 6G (Ly6G) 17. A visualização de neutrófilos Ly6G deficientes via este modelo tem demonstrado que estas células exercer funcionalidade normal numa variedade de contextos in vivo inflamatórias estéreis ou infecciosas em. camundongos transgênicos expressando o DsRed fluorescente protein gene sob o controlo do rato interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) ter sido utilizada para visualizar os comportamentos motilidade de células produtoras de IL-1 - Acredita-se que os neutrófilos, os monócitos inflamatórios, e macrófagos activados - emergente em pele inflamada 18.
In vivo rotulagem pode servir como uma abordagem alternativa para a detecção de comportamentos celulares e moleculares de neutrófilos nos tecidos inflamados. Depois de injecção intravenosa de doses baixas de anticorpo monoclonal marcado por fluorescência anti-Gr-1 (Acm), a cascata de recrutamento de Gr-1 + neutrófilos foi visualizada em lesões da pele do rato infectados com Staphylococcus aureus 19. Administração in vivo de conjugados contendo estreptavidina conjugados 705 pontos quânticos nm e mAb anti-Ly6G biotinilado rotular especificamente neutrófilos circulantes 20. Além disso, a endocitose de tais conjugados em neutrophIL vesículas permite o acompanhamento do transporte de vesículas de alta velocidade em neutrófilos que migram para o interstício. In vivo, marcação com anticorpos de fluorescência conjugada contra a P-selectina Ligando-1 Glicoproteico (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e quimioquina (motivo CXC) do receptor 2 (CXCR2) num modelo inflamatória induzida por TNFa tem elucidado os mecanismos de regulação em jogo durante a inflamação precoce 21. neutrófilos polarizados sobressair urópodos PSGL-1-enriquecida para interagir com CD62L presente em plaquetas activadas, resultando na redistribuição de CD11b e CXCR2, receptores que dirigem a migração de neutrófilos e iniciam a inflamação.
IL-1β é um dos genes de assinatura que é elevado em neutrófilos sensibilizados 22. Em ratinhos repórter pIL1-DsRed, DsRed sinais de fluorescência (isto é., A activação do promotor de IL-1β) correlacionam-se positivamente com a IL-1β expressão de ARNm e a produção de proteína IL-1β. <sup> 18 Para monitorar o processo de priming de neutrófilos, um método de microscopia intravital foi desenvolvido envolvendo a indução de inflamação da pele com oxazolona (OX) no modelo do rato pIL1-DsRed seguinte rotulagem in vivo de neutrófilos com Ly6G anti-mAb fluorescência conjugada. Através deste modelo, é possível estudar o comportamento e função de neutrófilos, preparadas em modelos animais de várias doenças e desordens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos com animais são realizadas de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Toledo.
1. A fenotipagem de pIL1-DsRed Mice
NOTA: Offspring são gerados por meio de cruzamento ratos pIL1-DsRed heterozigotos com o tipo selvagem camundongos (WT) C57BL6. Três a quatro semanas filhotes velhos são considerados prontos para fenotipagem. Sangramento submandibulares de ratinhos segue um protocolo estabelecido com modificações menores 23.
- O isolamento de glóbulos brancos do sangue total de rato filhotes de cachorro
- Adicionar 20 ul de heparina a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Adquirir um filhote da gaiola. Grave a etiqueta do filhote de identificação. Não é necessário para anestesiar filhotes antes de recolha de sangue a partir da veia submandibular.
- Segure filhote de cachorro pela nuca do pescoço e perfurou a veia submandibular no thbolsa da bochecha e usando uma lanceta 5 mm. Aplicar uma força suficiente para criar um pequeno furo, de modo que as gotas de sangue exalam do ponto de penetração. Utilize uma agulha nova para cada filhote.
- Recolhe 3 - 5 gotas de sangue por pup num tubo de microcentrífuga contendo heparina. Limpar o local da punção e aplicar pressão para facilitar a hemostasia.
- Coloque cinzento em nova gaiola e observar durante 30 min antes de voltar a gaiola para a instalação para animais.
- Recolha de sangue a partir de ratinhos adultos de um fenótipo conhecido como controlos positivos e negativos.
- Adicionar 500 ul de tampão de lise de células vermelhas do sangue a cada um dos tubos, os tubos de vórtice e incubar durante 5 - 10 min em gelo.
- Adiciona-se lentamente 400 - 500 ul de soro de bovino fetal (FBS) por baixo das suspensões de células em cada tubo. Uma interface clara pode ser observado entre a suspensão de células da camada superior e a camada inferior de FBS.
- tubos com tampas de amostras e centrifugar a 1.500 × g por 5 min.
- Repita os passos 1.1.7 - 1.1.9 à peleterap remover as células vermelhas do sangue. Não repita se lise é suficiente pela primeira vez. O sedimento deve ser difícil de discernir, após a centrifugação.
- Lipopolissacarídeo (LPS) Estimulação e Cultura
- Ressuspender as células em 200 ul de completa Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
- Transferir a suspensão de células para um tubo de citometria de fluxo.
- Adicione LPS solução de trabalho através da mistura de 10 uL de solução de reserva de LPS (1 mg / ml) com 990 ul de meio RPMI 1640 completo.
- Adicionar 20 ul de 10 ug / ml de LPS de solução de trabalho de 200 ul de suspensão de células.
- Tampão tubos frouxamente e incubar as amostras durante 4 horas a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Fluxo de Análise de Citometria
- Abra o programa de aquisição de dados para citometria de fluxo. Configurar o modelo de aquisição antes de provar aquisição.
- Clique na ferramenta Dot-Plot na paleta ferramenta. Desenhar uma fodispersão rward (FSC) vs dispersão lateral (SSC) enredo. Defina os parâmetros de tensão FSC e SSC a escala linear.
- Selecione os limites inferiores de FSC e SSC permitidos pelo citômetro. Aplicar limiares de 200 e 50 para o FSC e SSC, respectivamente.
- Dentro do FSC vs SSC trama, desenhar um G1 portão que inclui monócitos, granulócitos e células dendríticas, e exclui detritos, células vermelhas do sangue e linfócitos.
- Clique na ferramenta histograma na paleta ferramenta. Desenhar um histograma FL2 (canal de fluorescência vermelha). Usar uma amostra de controlo negativo para definir a linha de base dos sinais de FL2 e uma amostra de controlo positiva para desenhar um portão para incluir todos os eventos positivos DsRed.
- No painel Fluidics Controle do citômetro, defina o modo fluido a "RUN" ea taxa de fluxo para "HI" (cerca de 60 mL / min). Adquirir 10.000 eventos para cada amostra.
- Determinar pup fenótipo através da medição da percentagem de células positivas DsRed da porta G1.
- Anestesiar rato por injecção intraperitoneal (ip) de injecção de um cocktail anestésico contendo 100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg de xilazina, e 1 mg / kg de acepromazina. camundongos devidamente anestesiados não mostram retirada da pata traseira para pitada dedo do pé.
- Aplique o creme de remoção de pêlos à superfície dorsal de ambas as orelhas do rato. Aguarde 30 segundos a 1 min. Limpe a superfície da orelha com algodão molhado em água e deixe secar ao ar.
- Medir a espessura da orelha usando micrômetro e substituir rato em uma gaiola separada. Observar até à recuperação da anestesia (~ 15-30 min). Para resolver a inflamação da pele induzida pelo produto da remoção do cabelo, permitem mouse para descansar por 3 dias antes da experimentação adicional é realizada.
- Prepare a 1,25% (w / v) OX dissolvendo 16,7 mg de OX em 1 ml de acetona e mistura de 750 ul de solução / acetona OX, com 250 ul de azeite. Preparar a solução de veículo através da mistura de 750 mL de acetona com 250 &# 181; l de azeite.
- Re-anestesiar o mouse através de injecção ip de cocktail anestésico (2,1). Medir a espessura da orelha como antes.
- Aplicar 12,5 ul de 1,25% OX em cada lado da orelha direita. Aplicar 12,5 ul de solução veículo de acetona / azeite em cada lado da orelha esquerda.
- Mantenha o mouse separar gaiola companheiros até que esteja totalmente recuperado para prevenir insulto aos seus ouvidos por outros ratos, em seguida, substituir o mouse em sua gaiola original e voltar a instalação de alojamento animal.
NOTA: A remoção do cabelo pode resultar em inflamação de pele menor seguindo pela mudança da espessura da orelha. Esta inflamação menor será resolvido 3 dias mais tarde confirmada pela espessura do ouvido normal. Após a aplicação tópica, durante 24 h, tratada orelhas-OX mostram significativa (p <0,01) em comparação inchaço solução de veículo sozinha ouvidos tratados.
3. Rotulagem de neutrófilos no pIL1-DsRed Mice
NOTA: Na rotulagem vivo de neutrófilos pela baixa dose de fluorescence-conjugado mAb específicos de neutrófilos segue um protocolo recentemente desenvolvido 19. Injecções retro-orbital, são realizadas de acordo com um protocolo estabelecido com algumas modificações 24.
- Preparar solução de trabalho de anti-Ly6G mAb por diluição de 10 ul de 0,5 mg / mL de Alexa Fluor 647 conjugado com anti-Ly6G mAb (clone 1A8) em 90 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Transferir 100 ul da solução de trabalho Ly6G anti-mAb (50 ug / ml) para uma seringa de insulina U-100 com agulha de calibre 28.
- Anestesiar um adulto pIL1-DsRed do mouse através de injecção ip do cocktail anestésico descrito anteriormente (2,1). Coloque o abdómen do rato anestesiado para baixo em uma placa de trabalho limpo.
- Aplicar uma pressão descendente suave para a pele e dorsal ventral de um olho mouse para se projetam parcialmente o globo ocular da tomada.
- Cuidadosamente colocar a agulha, o bisel para baixo, segundo um ângulo de aproximadamente 30 ° no canto medial para a retro-orbitalseio.
NOTA: O operador pode sentir a pressão, a penetração e resistência aliviada uma vez que as inserções de agulhas dentro do seio. - Lenta e suavemente injectar 100 ul de Ly6G mAb anti-solução (5 ug de mAb / murganho / injecção) no rato de trabalho. Remover a agulha rapidamente. Uma pequena quantidade de sangramento sugere uma injecção bem sucedida.
- aplicar imediatamente 1,25% OX e solução de veículo para a orelha esquerda do rato e direita.
- Após 8 h, administrar 100 ul de solução preparada de fresco de mAb anti-Ly6G de trabalho (5 ug de mAb / murganho / injecção) através de injecção retro-orbital no mesmo rato.
- Para visualizar os vasos sanguíneos, imediatamente antes de imagem, administrar 100 ul de 30 mg / ml de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated dextrano (150 kDa) por meio de injecção de retro-orbital.
4. Imagem intravital de neutrófilos Priming em pIL-1-DsRed Mice
- Anestesiar rato com injeção ip de cocktail anestésico (2,1).0; Aplicar pomada veterinária para os olhos do mouse para evitar a secura sob anestesia para a imagem latente.
- Prepare 1 ml de meia-dose cocktail anestésico por diluição de 500 uL de mistura de anestésico original com um volume igual de PBS.
- Transferir a metade da dose de cocktail de anestésico a seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 27 de borboleta.
- Insira a agulha de borboleta no abdômen do rato por via intraperitoneal e corrigir a asa de borboleta para o abdômen gravando.
- Coloque uma lamela de vidro no centro da fase de imagem. Tape as bordas da lamela para segurá-la no lugar.
- Colocar uma gota de PBS na superfície ventral da orelha de rato, bem como sobre a lamela.
- Posição anestesiados rato com a sua orelha sobre a lamela. Montar a ponta da orelha, com o lado dorsal para baixo, como um sanduíche entre a orelha da lamela e uma lâmina de vidro, também mantida no seu lugar por meio de fita adesiva.
- Ligue um multi-laser de microscópio de fluorescência confocal e todo o relacionado equipment. Desligue as luzes de quarto para minimizar a exposição de luz ambiente.
- Abra o software de aquisição de imagem. Selecionar os canais de laser para detecção de corantes fluorescentes no menu Lista Dye.
- Ajuste o foco na pele da orelha inflamado pela observação de sinais verdes dos vasos sanguíneos e sinais vermelhos das células DsRed + através da ocular.
- Executar uma verificação rápida com velocidade de digitalização de 2 mS / pixel e resolução de 512 × 512 pixels. Selecione um pseudo para cada canal no menu Exibir Live. Ajuste o botão de foco para definir o fim e começar a localização da digitalização.
- Realizar varreduras lentas com velocidade de digitalização de 4-8 ms / pixel e resolução de 800 × 800 ou 1.024 × 1.024 pixels. Ajustar a alta tensão, ganhar, e deslocamento em cada canal para maximizar a intensidade de sinais, evitando saturação (pixels vermelhos). Deve haver apenas alguns pixels vermelhos em cada canal.
- Criar conjuntos de imagens tridimensionais, digitalizando thpele e orelha começando superficialmente no estrato córneo e progredindo para baixo com x, y, os volumes z de 317 uM × 317 uM × 30 mm (objectiva 40x), 635 uM × 635 uM × 30 mm (objectiva 20x), ou 1.270 uM × 1.270 mm × 50 mm (objetiva de 10X) em 2 mm z-passos.
NOTA: O estrato córneo é a camada mais externa da epiderme e pode ser facilmente localizado com base no seu sinal de autofluorescência forte. - Em experimentos com imagens de lapso de tempo, ficha imagens tridimensionais a cada 2 ou 4 min por até 8 horas.
- De forma intermitente, como o rato começa a se recuperar da anestesia, observou baseada na observação de bigodes espasmos, administrar 5 - 10 l de meia dose cocktail anestesia através da agulha borboleta.
NOTA: Tenha cuidado com a dose de anestesia - overdose pode causar a morte mouse. Alternativamente, a anestesia por inalação de um frasco pode ser aplicado para o rato para anestesia a curto prazo e umcone de nariz pode ser usado para imagiologia de longo prazo. - Remover o rato anestesiado do palco quando imaging está completa. Retire a fita e remover a agulha borboleta do abdómen do mouse. Devolver o mouse para uma gaiola separada na unidade de alojamento dos animais.
NOTA: Para imagens de curto prazo (<1 hora), os ratos se recuperar totalmente da anestesia rapidamente em 1-3 horas. Para imagiologia de longo prazo (~ 8 horas), os ratos recuperar lentamente, com um período de recuperação típico de 12 - 16 horas. Assim, a administração de água oral é recomendado, pelo menos várias vezes durante o período de recuperação para evitar a desidratação grave. - Conjuntos de dados de imagem de processo, rastrear células individuais, gerar rotas migratórias, e calcular a direção e velocidade de migração celular usando a imagem do software de análise 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rastreio dos ratinhos pIL1-DsRed é realizada com base no sinal de fluorescência fenotípica DsRed produzido pelos seus leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo. Estimulação por LPS é capaz de induzir a produção de IL-1β em células mielóides, incluindo neutrófilos, monócitos, e células dendríticas 26-28. Assim, os leucócitos isolados foram incubados com LPS durante 4 h antes da análise de citometria de fluxo. Em seguida, é definida para propagação de células mielóides com base no tamanho da célula (FSC) e complexidade interna (SSC) (Figura 1A) 29, e o sinal de DsRed circulante é medido nesta população fechado. Circulantes células mielóides de ratinhos WT minimamente expressar DsRed, enquanto que as mesmas células de ratinhos pIL1-DsRed expressar sinais distinguíveis DsRed (Figura 1B). Os ratinhos pIL1-DsRed identificados por este método são utilizadas para fenotipagem experiências subsequentes. Deve notar-se que o processo de fenotipagem completa demora apenas algunshoras - muito mais curtos do que os métodos de genotipagem tradicionais, incluindo a colheita de tecidos, digestão enzimática, o isolamento do DNA, PCR e eletroforese.
A activação do promotor de IL-1β foi recentemente identificado como um marcador de neutrófilos escorva 22. Assim, o processo dinâmico de priming neutrófilos podem ser visualizados e avaliados em animais vivos usando ratos pIL1-DsRed. Para induzir a inflamação da pele, o OX sensibilizador da pele é aplicada topicamente na orelha direita dos ratinhos pIL1-DsRed e do veículo isolado é aplicado na orelha esquerda do mesmo animal. Para etiquetar neutrófilos em animais vivos, um protocolo recentemente desenvolvido é realizada pela administração de uma pequena quantidade de Ly6G mAb anti-marcado por fluorescência imediatamente antes e 8 h após a aplicação OX. Para localizar os vasos sanguíneos, FITC-dextrano é injectada imediatamente antes da imagiologia.
Em 24 horas após a aplicação OX, umagrande número de DsRed + / + Ly6G células são encontradas no espaço extravascular (Figura 2A) e representam os neutrófilos ferrado. Um pequeno número de DsRed / Ly6G + células também são encontrados, o que provavelmente representam neutrófilos repouso. Além disso, uma pequena população de DsRed + / Ly6G - são observadas células, o qual pode compreender monócitos inflamatórios e macrófagos activados. Em um 40 min de vídeo time-lapse, Ly6G neutrófilos + emergentes dentro de uma lesão inflamatória da pele apresentam movimento rastreamento ameba-like típico (Filme Suplementar 1). Celulares rotas migratórias são rastreadas para comparar comportamentos motilidade do DsRed + / Ly6G + e DsRed - populações / Ly6G + neutrófilos (Figura 2B). A trama trilha análises revelam que ambas as populações de neutrófilos exibir migração "random" uma vez que o espaço extracelular foi inserido (Figura 2C). Curiosamente,DsRed + / + Ly6G neutrófilos exibem uma velocidade significativamente mais elevada em comparação com as suas contrapartidas / DsRed - Ly6G + (Figura 2D). Isto sugere uma associação entre priming neutrófilos e motilidade acelerado nas lesões inflamatórias.
Para monitorar o tempo de priming de neutrófilos, uma série de vídeos de lapso de tempo foram registrados a partir de diferentes momentos após o tratamento OX (Filmes Suplementar 2 - 4). DsRed - / células Ly6G +, os neutrófilos de descanso, se tornar detectável no espaço extravascular tão cedo quanto 8 - 12 horas após a aplicação OX e seus números permanecem relativamente baixas, posteriormente (Figura 2E, filmes Suplementar 3, 4). Pelo contrário, o número de células DsRed + / + Ly6G, os neutrófilos com primário, aumentar progressivamente em pontos de tempo posteriores, a partir das 14-16 h após a aplicação OX. alguns DsRed
Figura 1:. A fenotipagem dos ratos pIL1-DsRed (A) as análises de citometria de fluxo demonstraram uma população de células circulantes mielóides (G1) com base no FSC e SSC parâmetros. (B) Os histogramas no canal FL2 mostram a percentagem de células dentro de + DsRed porta G1 das células de ratinhos pIL-DsRed (vermelho) ou a partir de ratinhos WT (azul). Os dados são representativos de pelo least três experimentos independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Visualização de Motile Atividades de DsRed + / Ly6G + neutrófilos nas lesões inflamatórias da pele (A) imagens de microscopia confocal estática gravada 24 horas após o show de tratamento OX três populações de leucócitos no espaço extravascular, ou seja, células, DsRed + / Ly6G +. (asteriscos), DsRed - / Ly6G + células (triângulos), e DsRed + / Ly6G - células (setas). Barra = 20 uM. DsRed + / Ly6G + células (vermelho) e DsRed - / Ly6G + células (azul) são comparados para migratocaminhos ry (B), parcelas de trilha (C) e velocidade (D) de um filme de lapso de tempo de 40 minutos gravado por microscopia confocal a partir de 24 horas após a aplicação OX (Filme Suplementar 1). (D) As barras indicam os valores médios de velocidade. *** P <0,001. (E) Os números de DsRed + células / Ly6G + e DsRed - / Ly6G + células são contadas a partir de uma série de filmes de lapso de tempo gravados em diferentes pontos de tempo após a aplicação OX (Filmes Suplementar 2 a 4). Os dados apresentados são os números de células / mm 2 (média ± SD) calculado a partir de três imagens consecutivas. (F) imagens estáticas são criados a partir de um filme de lapso de tempo gravado 11-14,5 horas após a pintura OX (Supplemental Filme 5). A seta indica uma célula Ly6G + que adquire expressão DsRed no espaço extravascular durante o período de observação.Barra = 50 uM. As imagens são reproduzidas a partir de referência 22 com permissão (Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc.). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Filme Suplementar 1: Comportamento Motile de DsRed + neutrófilos nas lesões inflamatórias da pele (às 24 h após a pintura OX) imagens de microscopia confocal mostram a motilidade do DsRed células + / Ly6G + (rosa) e DsRed - / Ly6G + células (azul) em o espaço extravascular. Os vasos sanguíneos são vistas em verde. Barra = 20 uM. O vídeo é reproduzido de referência 22 com permissão (Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc.). Por favor, click aqui para ver este vídeo.
. Suplementar Movie 2: Comportamento Motile de DsRed + neutrófilos nas lesões inflamatórias da pele (a 4 horas após a pintura OX) imagens de microscopia confocal mostram DsRed células + / Ly6G + (rosa) e DsRed - / Ly6G + células (azul) no espaço extravascular . Os vasos sanguíneos são vistas em verde. Autofluorescência está presente e associada a folículos pilosos. Barra = 100 um. O vídeo é reproduzido de referência 22 com permissão (Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc.). Por favor clique aqui para ver este vídeo.
Filme Suplementar 3: Comportamento Motile de DsRed + neutrófilos no Inf. lesões de pele lammatory (às 8 horas após a pintura OX) imagens de microscopia confocal mostram DsRed + / Ly6G células + (rosa) e DsRed - / Ly6G + células (azul) no espaço extravascular. Os vasos sanguíneos são vistas em verde. Autofluorescência está presente e associada a folículos pilosos. Barra = 100 um. O vídeo é reproduzido de referência 22 com permissão (Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc.). Por favor clique aqui para ver este vídeo.
Filme Suplementar 4: Comportamento Motile de DsRed + neutrófilos nas lesões inflamatórias da pele (em 11 - 19 horas após a pintura OX) imagens de microscopia confocal mostram DsRed células + / Ly6G + (rosa) e DsRed - células / Ly6G + (azul) no. extravaespaço scular. Os vasos sanguíneos são vistas em verde. Autofluorescência está presente e associada a folículos pilosos. Barra = 100 um. O vídeo é reproduzido de referência 22 com permissão (Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc.). Por favor clique aqui para ver este vídeo.
Filme Suplementar 5: aquisição de sinais DsRed por Ly6G + neutrófilos do filme de lapso de tempo mostrada na suplementar de vídeo 4, este vídeo maior ampliação mostra o processo em que uma célula Ly6G + (indicado com uma seta) adquire expressão DsRed no extravascular. espaço durante o período de observação (11-14,5 horas após a pintura OX). Barra = 50 uM. O vídeo é reproduzido de referência 22 com permissão (Direitos de autor 2015. A Associação Americana de Immunologists, Inc.). Por favor clique aqui para ver este vídeo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O objetivo deste estudo é desenvolver uma tecnologia para monitorar o processo de priming de neutrófilos em animais vivos, que ainda não foi cumprida pelas técnicas atualmente disponíveis. Para atingir este objectivo, três metodologias estabelecidas são realizados: 1) a indução de inflamação da pele em ratinhos repórter DsRed-driven promotor de IL-1p como uma medida da escorva, 2) in vivo rotulagem dos neutrófilos com doses baixas de fluorescência-conjugado anti-Ly6G mAb, e 3) de imagem de microscopia confocal intravital. A combinação destes três métodos permite a visualização de actividades motilidade de neutrófilos sensibilizados (DsRed + / + Ly6G) em lesões inflamatórias da pele. A direção migração e velocidade dos neutrófilos com primário é ainda quantificado através de rastreamento caminho migratório. Ao gravar uma série de vídeos de lapso de tempo, a cinética em tempo real do surgimento de neutrófilos preparado é monitorado no local inflamatório e aquisição de expressão DsRed por individual neutrófilos é também observada no espaço extravascular. Assim, o processo dinâmico de priming de neutrófilos foi visualizado com sucesso em animais vivos, pela primeira vez usando a tecnologia aqui apresentada.
Esta tecnologia é utilizada em vários passos críticos. Em primeiro lugar, os tecidos da pele são as partes do corpo mais convenientes para as imagens intravital. A aplicação tópica de OX sobre a orelha de rato permite a visualização direta de comportamentos de células imunitárias em pele inflamada sob microscopia confocal. Em segundo lugar, o rato deve ser sedado constantemente durante a imagem que necessita de injecções repetidas de anestésico. No entanto, o excesso de sedação pode causar rato morrer durante o exame. Para evitar uma sobredosagem, baixas doses de anestésico (uma metade ou um terço da dose completa) são recomendados para a imagem latente a longo prazo. Acm específicos de neutrófilos Terceiro, a fluorescência conjugado tem de ser injectado de forma intermitente, devido ao curto tempo de vida de neutrófilos de murino (meia-vida de 8-10 h 30). Última, dr focoIFT é uma questão importante durante a imagem de lapso de tempo, o que poderia ser causada por vários fatores, incluindo variações de temperatura, movimento do mouse corpo, inchaço da orelha ao longo do tempo, e as vibrações decorrentes da operação do instrumento 31. Vários métodos foram desenvolvidos para evitar deriva, como a administração de uma dose constante de sedação durante o exame, que fixa a orelha de rato no lugar gravando uma lâmina de vidro sobre ele no palco, a instalação de uma câmara ambiental para fornecer oxigênio e calor para a sedado organismo, bem como por manualmente re-focando o alcance quando necessário 32,33.
É igualmente importante referir as limitações deste protocolo. Em primeiro lugar, uma recuperação lenta do rato (12 - 16 horas) após uma imagem período de 8 horas de duração é observado devido a sedação contínua, indicando que este protocolo pode não ser adequado para tais experimentos longos. Uma abordagem alternativa é a utilização de vários ratinhos em sequência ao longo do período de imagem, em vez de ucantar apenas um. Em segundo lugar, uma fuga gradual de FITC-dextrano em circulação é observado durante a imagem ao longo do tempo, o que é provavelmente causado pelo aumento da permeabilidade dos vasos sanguíneos da pele, no estado inflamatório 34. Assim, a visualização dos vasos sanguíneos é marcadamente comprometida dada fluorescência reduzida na circulação em fases posteriores da imagem. Alternativamente, pode-se utilizar lectinas conjugados fluorescentes, tais como B4 isolectina para marcar vasos sanguíneos uma vez que estes aderem às células endoteliais vasculares 35.
Além disso a visualização do processo de escorvamento de neutrófilos em lesões inflamatórias da pele, a tecnologia aqui descrita pode também ser aplicado em muitas outras configurações experimentais. Em combinação com o Windows Imaging recentemente desenvolvidas, microscopia intravital delinear os comportamentos dos neutrófilos imunizadas puderam ser avaliadas em tecidos e órgãos profundos, incluindo cérebro, glândulas mamárias, pulmões e órgãos abdominais 36-39. Além disso, a visualização de priming / activação de outros tipos de células, tais como monócitos e macrófagos pode ser conseguida utilizando ratinhos pIL1-DsRed juntamente com etiquetagem in vivo através de fluorescência conjugado com mAb específico para o tipo celular de interesse. Tomados em conjunto, não só esta tecnologia fornecem uma estrutura fundamental para imagiologia intravital do processo de priming de neutrófilos nos animais vivos, mas também revela novas abordagens para estudar o comportamento e função de outras células do sistema imunológico em vários estados inflamatórios que se desdobram em diferentes tecidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 kDa | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
- El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
- Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
- Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
- Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
- Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
- Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
- Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
- Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
- Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
- Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
- Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
- Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
- Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
- Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
- Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
- Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
