Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Прижизненной визуализации нейтрофилов Грунтовка Использование IL-1 промотором управляемые Dsred Reporter Мыши

Published: June 22, 2016 doi: 10.3791/54070

Abstract

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоциты в обращении крови человека и быстро завербован в местах воспаления. Грунтовка является важным событием, которое усиливает фагоцитарную функциональность нейтрофилов. Несмотря на обширные исследования обнародовали существование и важность нейтрофильного затравки во время инфекции и травмы, средства визуализации этого процесса в естественных условиях были недоступны. Протокол при условии , позволяет осуществлять мониторинг динамического процесса нейтрофильных грунтовкой в живых животных путем объединения трех методик: 1) DsRed репортер сигнал - используется в качестве меры затравочных 2) в естественных условиях маркировки нейтрофильной - достигается путем введения флуоресцентной конъюгированных с анти-лимфоцитарный антиген 6G (Ly6G) моноклональное антитело (МАБ) и 3) прижизненной конфокальной микроскопии. Несколько важных шагов участвуют в этом протоколе: оксазолона-индуцированное воспаление уха мыши кожи, соответствующий седации животных, повторные инъекции анти-Ly6G биосфера, и предention фокуса дрейфа во время съемки. Хотя некоторые ограничения наблюдались, такие как предел непрерывного времени изображений (~ 8 часов) в одной мыши и утечки флуоресцеина изотиоцианат-декстрана из кровеносных сосудов в воспалительный состоянии, этот протокол обеспечивает фундаментальную основу для прижизненной визуализации загрунтованную поведение нейтрофилами и функция, которая может быть легко расширена для изучения других иммунных клеток в моделях воспаления мыши.

Introduction

Нейтрофилы являются наиболее распространенными и короткоживущие лейкоциты в обращении. Они быстро набраны к местам инфекции или травмы, где они служат профессиональные фагоциты через высвобождением активного кислорода и азота промежуточных продуктов наряду с гранулами , содержащими антимикробные пептиды и протеазы 1. Во время их набора, нейтрофилы "грунтовкой" различными агентами , включая микробные продукты, хемоаттрактанты и воспалительных цитокинов, в результате чего заметно расширенные функциональные возможности фагоцитарного по прибытии в месте воспаления 2. Механизмы нейтрофильных затравки были широко изучены в пробирке 3,4; Тем не менее, динамический контроль процесса в естественных условиях не представлялось возможным на сегодняшний день.

В последнее время прижизненной визуализации стало важным методом для визуализации и количественной оценки клеточных динамики биологических процессов в живых организмах. Intraviвизуализация Таль может быть осуществлено с помощью обычного однофотонного микроскопии возбуждения (например, конфокальной) или многофотонной микроскопии приближается к 5. Со временем, значительные улучшения были достигнуты в этой технике позволяет увеличить разрешение изображения, улучшенную глубину изображения, снижение фотоповреждения ткани и повышенной стабилизации изображения 6,7. Учитывая свою уникальную возможность включения динамической визуализации клеточной миграции и взаимодействия с течением времени, прижизненной микроскопии широко применяется в различных областях исследования в области иммунологии 8. Прижизненные изображения позволяет иммунологи, чтобы лучше понять и контекстуализировать иммунные реакции на обоих клеточном и молекулярном уровне в живых животных моделей.

Последние достижения в области трансгенной, а также забивные репортер мышей предоставили полезные инструменты для мониторинга динамического поведения нейтрофилов у живых животных. Лизоцим M промотор-приводом усиленный зеленый флуоресцентный белок забивныеМыши были широко используются для характеристики моторики нейтрофилов, моноцитов и макрофагов во время различных воспалительных процессов , в том числе экстравазации, бактериальной инфекции, и стерильного воспаления 9-15. Кроме того, трансгенные мыши , экспрессирующие цитоплазматический флуоресцентного резонансного переноса энергии биосенсора были использованы при изучении деятельности нейтрофилов внеклеточной регулируемой киназы митоген и протеинкиназы А в воспаленном кишечнике 16. Мышиной модели с высокой степенью специфичности экспрессии флуоресценции в нейтрофилах является Catchup стук в мышь, которая производит Cre рекомбиназу, а также флуоресцентного белка tdTomato, который сам по себе связан с экспрессией лимфоцитарных антиген 6G (Ly6G) 17. Визуализация Ly6G-дефицитных нейтрофилов через эту модель показала , что эти клетки оказывают нормальные функциональные возможности в различных стерильных или инфекционных в естественных условиях воспалительных контекстах. Трансгенные мыши, экспрессирующие DsRed флуоресцентный рrotein ген под контролем мыши interleuikin-1 & beta; (ИЛ-1β) промотор (pIL1-DsRed) были использованы для визуализации подвижных поведения IL-1 & beta; продуцирующих клеток - как полагают, включают нейтрофилы, воспалительных моноциты и активированные макрофаги - возникающие в воспаленной кожи 18.

В естественных условиях маркировки может служить в качестве альтернативного подхода для отслеживания клеточных и молекулярных поведения нейтрофилов в воспаленных тканях. После внутривенного введения низких доз флуоресцентно меченных анти-Gr-1 моноклональное антитело (МАБ), набор каскад Gr-1 + нейтрофилов было визуализируется при поражении кожи мышей , зараженных золотистым стафилококком 19. В естественных условиях введение конъюгатов , содержащих стрептавидином конъюгированные 705 нм квантовые точки и биотинилированный анти-Ly6G монАТ специфически маркировать циркулирующие нейтрофилы 20. Кроме того, эндоцитоз таких конъюгатов в neutrophIL везикулы позволяет отслеживать высокоскоростного везикул транспорта в нейтрофилах мигрирующие в интерстиций. В естественных условиях маркировки с флуоресценцией , конъюгированных с антителами против Р-селектина гликопротеинов лиганд-1 (PSGL-1), L-селектина (CD62L), интегрин аш (CD11b ) и хемокина (СХС мотив) рецептора 2 (CXCR2) в ФНО-индуцированной воспалительной модель выяснен регуляторные механизмы при игре на ранних стадиях воспаления 21. Поляризованные нейтрофилы выступают PSGL-1, обогащенный Уроподы взаимодействовать с CD62L на активированных тромбоцитах, что приводит к перераспределению CD11b и CXCR2, рецепторы, которые управляют миграцию нейтрофилов и инициируют воспаление.

ИЛ-1β является одним из генов подписи , что повышается в загрунтованных нейтрофилы 22. У мышей репортер pIL1-DsRed, DsRed сигналы флуоресценции (то есть., Активация IL-1 промотор) положительно коррелирует с IL-1β экспрессию мРНК и IL-1β продуцирования белка. <SUP> 18 Для того, чтобы следить за процессом нейтрофильной затравки, была разработана прижизненный метод микроскопии с участием индукции воспаления кожи с оксазолона (ОХ) в мышиной модели pIL1-DsRed следующую маркировку в естественных условиях нейтрофилов с флуоресцентно-конъюгированным анти-Ly6G мАт. С помощью этой модели, можно изучить поведение и функцию загрунтованных нейтрофилами в животных моделях различных заболеваний и расстройств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с национальными институтами здоровья руководящих принципов и одобрен Institutional Animal Care и использование комитета Университета Толедо мимо.

1. Фенотипирование pIL1-DsRed мышей

Примечание: Потомство генерируются путем селекции гетерозиготных мышей pIL1-DsRed дикого типа мышей (WT) C57BL6. От трех до четырех недель старые щенки считаются готовы к фенотипирования. Подчелюстные кровотечения мышей следует установленным протоколом с незначительными изменениями 23.

  1. Выделение Лейкоциты из цельной крови мыши Pups
    1. Добавьте 20 мкл гепарина в каждую 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
    2. Приобретите один щенок из клетки. Запишите идентификационный тег щенком. Не требуется, чтобы обезболить щенков до забора крови из подчелюстной вены.
    3. Держите щенка на шею шкирку и прокалывают подчелюстной вену йе щека сумка с помощью 5 мм ланцет. Применить адекватные силы, чтобы создать небольшой прокол, так что капли крови выделяют с точки проникновения. Используйте новую иглу для каждого щенка.
    4. Соберите 3 - 5 капель крови на детеныша в гепарин-содержащих микроцентрифужных трубки. Очистите место прокола и оказать давление, чтобы облегчить гемостаза.
    5. Поместите щенка в новой клетке и наблюдать в течение 30 минут, прежде чем вернуться в клетку к вивария.
    6. Сбор крови у взрослых мышей известного фенотипа, как положительных, так и отрицательных контролей.
    7. Добавить 500 мкл буфера для растворения красных клеток крови в каждую пробирку, вихревые трубки и инкубировать в течение 5 - 10 мин на льду.
    8. Медленно добавляют 400 - 500 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS) под Суспензии клеток в каждой пробирке. Четкий интерфейс можно наблюдать между суспензией клеток верхнего слоя и нижнего слоя FBS.
    9. Cap трубы и образцы центрифуге при 1500 × г в течение 5 мин.
    10. Повторите шаги 1.1.7 - 1.1.9 мехаTher удаление эффекта красных кровяных телец. Не повторяется, если лизис достаточно в первый раз. Осадок должен быть трудно различить после центрифугирования.
  2. Липополисахарида (LPS) Стимулирование и культура
    1. Ресуспендируют клеток в 200 мкл института Roswell Park полный Memorial (RPMI) 1640.
    2. Передачи клеточной суспензии в проточной цитометрии трубки.
    3. Сделать LPS рабочий раствор путем смешивания 10 мкл исходного раствора LPS (1 мг / мл) с 990 мкл полной среды RPMI 1640 среды.
    4. Добавьте 20 мкл 10 мкг LPS / мл рабочего раствора до 200 мкл клеточной суспензии.
    5. Cap трубы свободно и инкубировать образцов в течение 4 ч при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
  3. Анализ проточной цитометрией
    1. Откройте программу сбора данных для проточной цитометрии. Настройка шаблона приобретения до начала выборки приобретения.
    2. Выберите инструмент Dot-земля в палитре инструментов. Нарисуйте FOrward разброс (FSC) против бокового рассеяния (SSC) сюжет. Установите параметры напряжения FSC и SSC в линейном масштабе.
    3. Выберите самые низкие пороги FSC и SSC разрешенные цитометра. Применить пороговые значения 200 и 50 для FSC и SSC, соответственно.
    4. В ФСБ против SSC участка, нарисуйте ворота G1, который включает в себя моноциты, гранулоциты и дендритные клетки, и не включает мусора, эритроциты и лимфоциты.
    5. Выберите инструмент Гистограмма в палитре инструментов. Нарисуйте FL2 (красная флуоресценция канал) гистограмма. Используйте отрицательный контрольный образец, чтобы установить базовую линию сигналов FL2 и положительный контрольный образец, чтобы сделать ворота, чтобы включить все Dsred позитивные события.
    6. На панели управления Флюидика из цитометра, установите режим жидкости в положение "RUN" и скорость потока "HI" (приблизительно 60 мкл / мин). Acquire 10000 событий для каждого образца.
    7. Определение фенотипа путем тюлененок измерением процента DsRed положительных клеток от G1 затвора.
  1. Обезболить мышь внутрибрюшинной (IP) инъекции анестезирующего коктейля, содержащего 100 мг / кг кетамина, 10 мг / кг ксилазина и 1 мг / кг Ацепромазин. Адекватно наркотизированных мышей не показывают заднюю лапу вывод до ног крайнем случае.
  2. Нанесите крем удаления волос на дорсальной поверхности обоих ушей мыши. Подождите 30 сек до 1 мин. Протрите поверхность уха с водой смачивают хлопка и позволяют высохнуть на воздухе.
  3. Измерьте толщину уха с помощью микрометра и заменить мышь в отдельной клетке. Наблюдайте до выхода из наркоза (~ 15 - 30 мин). Чтобы устранить воспаление кожи, вызванное продуктом удаления волос, позволяют мышь отдыхать в течение 3-х дней перед дальнейшей экспериментирования осуществляется.
  4. Готовят 1,25% (вес / об) OX растворением 16.7 мг ОХ в 1 мл ацетона и перемешивание 750 мкл раствора / ацетона ОХ 250 мкл оливкового масла. Приготовьте раствор транспортного средства путем смешивания 750 мкл ацетона с 250 &# 181; л оливкового масла.
  5. Re-обезболить мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции анестетика коктейля (2.1). Измерьте толщину уха, как и раньше.
  6. Нанести 12,5 мкл 1,25% ОХ на каждую сторону правого уха. Нанести 12,5 мкл ацетона / оливкового масла раствор транспортного средства на каждую сторону левого уха.
  7. Держите мышь отдельно от клетки товарищей, пока полностью не выздоровел, чтобы предотвратить оскорбление его ушей другими мышей, а затем заменить мышь в своей первоначальной клетке и вернуться на жилище животных объекта.
    Примечание: Удаление волос может привести к незначительным воспалением кожи последующим изменением толщины уха. Это незначительное воспаление будет решена через 3 дня подтверждается нормальной толщины уха. После местного применения в течение 24 ч, OX обработанных ушей показывают значимое <0,01) набухания по сравнению раствора носителя в одиночку обработанных ушей.

3. Маркировку нейтрофилы в pIL1-DsRed мышей

Примечание: В естественных условиях маркировки нейтрофилов низкой дозы Fluorescence-конъюгирован нейтрофилы конкретных мАт следует недавно разработанного протокола 19. Ретро-орбитальные инъекции выполняются в соответствии с установленным протоколом с некоторыми изменениями 24.

  1. Подготовка анти-Ly6G рабочего раствора MAB разбавлением 10 мкл 0,5 мг / мл Alexa Fluor 647-конъюгированные анти-Ly6G мАт (клон 1A8) в 90 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS).
  2. Перенести 100 мкл рабочего раствора анти-Ly6G монАТ (50 мкг / мл) в инсулиновый шприц U-100 с 28 иглы калибра.
  3. Обезболить взрослого pIL1-DsRed мышь путем внутрибрюшинной инъекции ранее описанного анестезирующего коктейля (2.1). Поместите наркозом живот мыши вниз на чистую рабочую доску.
  4. Слегка понижательное давление на кожу спины и брюшного один глаз мыши, чтобы частично выступать глазного яблока из розетки.
  5. Аккуратно положите иглу, скос вниз, под углом примерно 30 ° в медиальной кантуса в ретро-орбитальноепазухи.
    Примечание: Оператор может чувствовать давление, проникновение и освобождаемый сопротивление только игла вставляет в пазухи.
  6. Медленно и плавно вводят 100 мкл анти-Ly6G мАт рабочего раствора (5 мкг мАт / мышь / инъекция) в мышь. Удалите иглу быстро. Небольшое количество кровотечения предполагает успешную инъекцию.
  7. Сразу применять 1,25% OX и решение транспортного средства на правую и левую уши мыши.
  8. Через 8 ч, введение 100 мкл свежеприготовленного анти-Ly6G рабочего раствора мАт (5 мкг мАт / мышь / инъекцию) через ретро-орбитальное инъекции в той же мыши.
  9. Чтобы визуализировать кровеносные сосуды, непосредственно перед визуализации, управлять 100 мкл 30 мг / мл флуоресцеинизотиоцианата (FITC) -conjugated декстрана (150 кДа) через ретро-орбитальное инъекции.

4. прижизненной визуализации Грунтовка в нейтрофилов PIL-1-DsRed мышей

  1. Обезболить мышь с внутрибрюшинной инъекции анестетика коктейля (2.1).0; Нанесите мазь ветеринарная глаза мыши, чтобы предотвратить сухость под наркозом для работы с изображениями.
    1. Готовят 1 мл половинной дозы анестетика коктейль, разбавляя 500 мкл первоначальной анестезирующего коктейля с равным объемом PBS.
    2. Перенести половину дозы анестетика коктейль 1 мл шприц с иглой бабочки 27.
    3. Вставьте иглу бабочки в животе мыши внутрибрюшинно и зафиксировать крыло бабочки в животе пластырем.
  2. Поместите покровное стекло в центре сцены визуализации. Лента края покровного стекла, чтобы удерживать его на месте.
  3. Поместите каплю PBS на вентральной поверхности уха мыши, а также на покровное.
  4. Позиция наркозом мышь с ухом над покровным. Установите кончик уха, спинной стороной вниз, на прослаивая ухо между покровное и предметное стекло, также удерживается на месте с помощью ленты.
  5. Включите мульти-лазерной флуоресценции конфокальной микроскопии и всех связанных с этим еquipment. Выключите комнате свет, чтобы свести к минимуму воздействие окружающего света.
  6. Открытое программное обеспечение захвата изображений. Выберите лазерные каналы для обнаружения люминесцентных красителей в меню Dye List.
  7. Отрегулируйте фокус на воспаленной кожи уха путем наблюдения зеленых сигналов от кровеносных сосудов и красные сигналы от DsRed + клеток через окуляр.
  8. Выполните быстрое сканирование со скоростью сканирования 2 мкс / пиксель и разрешением 512 × 512 пикселей. Выберите псевдоцвете для каждого канала в прямом меню View. Отрегулируйте ручку фокусировки, чтобы установить конец и начать расположение сканирования.
  9. Выполните медленные сканирования со скоростью сканирования 4 - 8 мкс / пиксель и разрешением 800 × 800 или 1024 × 1024 пикселей. Регулировка высокого напряжения, усиления и смещения на каждом отдельном канале, чтобы максимизировать интенсивность сигналов, избегая при этом насыщения (красные пиксели). Там должно быть только несколько красных пикселей в каждом канале.
  10. Создание трехмерных наборов изображений путем сканирования тысе кожи уха начинают поверхностно в роговом слое кожи и продвигается вниз с х, у, г объемах 317 мкм × мкм × 30 мкм (объектив 40Х) 317 мкм × 635 мкм × 30 мкм (объектив 20Х), или 1,270 мкм × 635 1270 мкм × 50 мкм (объектив 10X) на Z-шагом 2 мкм.
    Примечание: Роговой слой является внешний слой эпидермиса и может быть легко локализованным на основании его сильного сигнала автофлуоресцентной.
  11. В экспериментах покадровой обработки изображений, записывать трехмерные изображения каждые 2 или 4 мин до 8 ч.
  12. Intermittently, как мышь начинает восстанавливаться после анестезии, отметил на основе наблюдения за подергивание усов, администрировать 5 - 10 мкл половинной дозы анестезии коктейль через бабочка иглы.
    Примечание: Будьте осторожны дозы анестезии - передозировка может привести к смерти мыши. В качестве альтернативы, ингаляции обезболивание в банку может быть применена к мыши для кратковременного наркоза и аобтекатель может быть использован для длительной обработки изображений.
  13. Удалите наркозом мышь со сцены, когда визуализация завершена. Снять пленку и удалить бабочки иглу из живота мыши. Вернуть мышь в отдельную клетку в жилищном вивария.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для кратковременного томографии (<1 час), мышей полностью оправиться от наркоза быстро в 1 - 3 ч. Для длительной обработки изображений (~ 8 ч), мыши восстанавливаться медленно, с характерным периодом восстановления 12 - 16 ч. Таким образом, пероральное введение воды рекомендуется по крайней мере несколько раз в течение периода восстановления, чтобы предотвратить обезвоживание тяжелой.
  14. Наборы данных визуализации процесса, отслеживать отдельные клетки, генерировать миграционные пути, и рассчитать скорость и направленность миграции клеток с использованием программного обеспечения для анализа изображения 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Скрининг pIL1-DsRed мышей осуществляется на основании фенотипического флуоресцентного сигнала DsRed производимого их лейкоцитов периферической крови с помощью проточной цитометрии. LPS стимуляция как известно, индуцирует продукцию IL-1 & beta ; в миелоидных клетках , включая нейтрофилы, моноциты, дендритные клетки и 26-28. Таким образом, изолированные лейкоциты инкубируют с LPS в течение 4 ч до начала анализа методом проточной цитометрии. Затем стробирования устанавливается для циркуляции миелоидных клеток на основе размера клеток (FSC) и внутренней сложности (SSC) (рис 1А) 29, и сигнал DsRed измеряется в этом закрытом населения. Циркулирующие миелоидные клетки мышей WT минимально выражают DsRed, в то время как одни и те же клетки мышей pIL1-DsRed выражают различимые сигналы Dsred (рис 1В). Мыши pIL1-DsRed, определенные этим методом фенотипирования используются для последующих экспериментов. Следует отметить, что полный процесс Фенотипирование занимает всего несколькочасов - намного короче, чем традиционные методы генотипирования, включая ткани урожая, ферментативного расщепления, выделения ДНК, ПЦР и электрофореза.

Активация промотора IL-1β недавно был идентифицирован как маркер нейтрофилу грунтования 22. Таким образом, динамический процесс нейтрофильной затравки можно визуализировать и оценивать в живых животных с использованием мышей pIL1-DsRed. Для того, чтобы вызвать воспаление кожи, сенсибилизатором ОХ наносят местно на правое ухо мышей pIL1-DsRed и только носитель наносят на левое ухо одного и того же животного. Для того, чтобы маркировать нейтрофилы в живых животных, недавно разработанный протокол выполняется путем введения небольшого количества флуоресцентно меченными анти-Ly6G мАт непосредственно до и 8 часов после нанесения ОХ. Для того, чтобы определить местонахождение кровеносных сосудов, FITC-декстрана вводят непосредственно перед началом визуализации.

Через 24 ч после применения ОХ, вБольшое количество DsRed + / Ly6G + клетки находятся в внесосудистое пространство (фиг.2А) и представляют собой загрунтованных нейтрофилы. Небольшое количество DsRed / Ly6G + клетки также обнаружили, что , скорее всего , представляют собой покоящиеся нейтрофилы. Кроме того, небольшая популяция DsRed + / Ly6G - наблюдаются клетки, которые могут содержать воспалительные моноциты и активированные макрофаги. В 40 мин покадровой видео с, Ly6G + нейтрофилы зарождающиеся в воспалительном поражении кожи демонстрируют типичное амебовидных движение ( о сканировании Справочная Movie 1). Клеточные миграционные пути отслеживаются сравнить поведение подвижных в DsRed + / Ly6G + и DsRed - население / Ly6G + нейтрофильные (рис 2В). Трек сюжет анализ показывает , что обе популяции нейтрофилов отображать "случайную" миграцию как только межклеточное пространство было введено (рис 2С). Интересно,DsRed + / Ly6G + нейтрофилы демонстрируют значительно более высокую скорость по сравнению с их DsRed - / + Ly6G аналогами (рис 2D). Это наводит на мысль о связи между нейтрофильной грунтования и ускоренным моторики при воспалительных поражений.

Для контроля сроков нейтрофильной затравки, серия покадровой видео были записаны , начиная в разное время после лечения ОХ (Supplemental Фильмы 2 - 4). DsRed - / Ly6G + клетки, покоящейся нейтрофилы, становятся выявляли в внесосудистое пространство уже в 8 - 12 ч после нанесения OX и их номера остаются относительно низкими в дальнейшем (Рисунок 2E, Фильмы Дополнительные 3, 4). Напротив, количество DsRed + / Ly6G + клеток, со штрихом нейтрофилы, увеличение постепенно в более поздние моменты времени, начиная с 14 - 16 ч после применения ОХ. Некоторые DsRed + клетки постепенно приобретают Dsred сигналы после набора на внесосудистое пространство в течение этого периода (рис 2F, Дополнительный Movie 5). В 16 - 20 ч, большинство экстраваскулярных нейтрофилы Ly6G + рассматриваются как "загрунтованную" на основе их выражения DsRed. Эти наблюдения показывают величину, темпа и расположение нейтрофильной затравки при воспалительных встречающийся поражений у живых животных.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Фенотипирование pIL1-DsRed мышей (A) Проточная цитометрия анализы показывают популяцию циркулирующих миелоидных клеток (G1) на основе FSC и SSC параметров. (Б) Гистограммы на канале FL2 показывают процент DsRed + клеток в пределах G1 затвора клеток от PIL-DsRed мышей (красный) или от мышей дикого типа (синий). Данные являются репрезентативными по леAST трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2:. Визуализация подвижны деятельности DsRed + / Ly6G + нейтрофилы в воспалительных поражениях кожи (A) Статические конфокальной микроскопии изображений , записанных через 24 ч после лечения ОХ показывают три популяции лейкоцитов в внесосудистое пространстве, т.е. DsRed + / Ly6G + клеток. (звездочки), DsRed - / Ly6G + клетки (треугольники) и DsRed + / Ly6G - клетки (стрелки). Бар = 20 мкм. DsRed + / Ly6G + клетки (красный) и DsRed - / Ly6G + клетки (синие) сравниваются для migratoRy пути (В), треком участки (С) и скорость (D) от 40 мин покадровой фильма , записанного с помощью конфокальной микроскопии , начиная через 24 часа после нанесения OX (Supplemental Movie 1). (D) Барс указывают средние значения скорости. *** P <0,001. (Е) Числа DsRed + / Ly6G + клеток и DsRed - / Ly6G + клетки подсчитывают из серии покадровой фильмов , записанных в различные промежутки времени после применения ОХ (Supplemental Фильмы с 2 по 4). Приведенные данные являются номера ячеек / мм 2 (среднее ± SD) , рассчитанные из трех последовательных изображений. (F) Статические изображения создаются из покадровой фильма , записанного с 11 до 14,5 ч после OX живописи (Supplemental Movie 5). Стрелка указывает на ячейку Ly6G +, приобретающей экспрессию DsRed в внесосудистое пространстве в течение периода наблюдения.Бар = 50 мкм. Изображения воспроизводятся со ссылкой 22 с разрешения (Copyright 2015. Американская ассоциация иммунологов, Inc.). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

. Дополнительное Фильм 1: Подвижные Поведение DsRed + нейтрофилы в воспалительных поражениях кожи (через 24 часа после OX живописи) конфокальной микроскопии изображения показывают моторику DsRed + / Ly6G + клеток (розовый) и DsRed - / Ly6G + клеток (синий) в внесосудистое пространство. Кровеносные сосуды видны в зеленый цвет. Бар = 20 мкм. Видео воспроизводится из ссылки 22 с разрешения (авторское право 2015. Американская ассоциация иммунологов, Inc.). Пожалуйста , клИк здесь, чтобы просмотреть это видео.

. Дополнительное Фильм 2: Подвижные Поведение DsRed + нейтрофилы в воспалительных поражениях кожи (в 4 ч после OX живописи) конфокальной микроскопии изображения показывают Dsred + / Ly6G + клеток (розовый) и DsRed - / Ly6G + клетки (синие) в внесосудистое пространстве , Кровеносные сосуды видны в зеленый цвет. Автофлюоресценции присутствует и связано с волосяных фолликулах. Бар = 100 мкм. Видео воспроизводится из ссылки 22 с разрешения (Copyright 2015. Американская ассоциация иммунологов, Inc.). Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео.

Справочная Фильм 3: Подвижные Поведение DsRed + нейтрофилы в Inf. lammatory поражениях кожи (в 8 ч после OX живописи) конфокальной микроскопии изображения показывают Dsred + / Ly6G + клеток (розовый) и DsRed - / Ly6G + клетки (синий) в внесосудистое пространстве. Кровеносные сосуды видны в зеленый цвет. Автофлюоресценции присутствует и связано с волосяных фолликулах. Бар = 100 мкм. Видео воспроизводится из ссылки 22 с разрешения (Copyright 2015. Американская ассоциация иммунологов, Inc.). Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео.

Справочная Фильм 4: Подвижные Поведение DsRed + нейтрофилы в воспалительных поражениях кожи (на 11 - 19 ч после OX живописи) конфокальной микроскопии изображения показывают Dsred + / Ly6G + клеток (розовый) и DsRed - / Ly6G + клетки (синие) в. extravascular пространство. Кровеносные сосуды видны в зеленый цвет. Автофлюоресценции присутствует и связано с волосяных фолликулах. Бар = 100 мкм. Видео воспроизводится из ссылки 22 с разрешения (Copyright 2015. Американская ассоциация иммунологов, Inc.). Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео.

Справочная Фильм 5: Приобретение DsRed сигналов от Ly6G + нейтрофилы Из фильма покадровой показанного в дополнительном видео 4, это более высокое увеличение видео показывает процесс , в котором Ly6G + клеток (указано стрелкой) приобретает выражение DsRed в внесосудистое. пространство в течение периода наблюдения (11-14.5 ч после OX живописи). Бар = 50 мкм. Видео воспроизводится из ссылки 22 с разрешения (авторское право 2015. Американская ассоциация Immunologists, Inc.). Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Целью данного исследования является разработка технологии для мониторинга процесса нейтрофильной затравки в живых животных, которые еще не были выполнены с помощью имеющихся в настоящее время методов. Для достижения этой цели, три установленные методики выполняются: 1) индукция воспаления кожи в IL-1 & beta ; промотор-приводом мышей репортер DsRed как мера затравки, 2) в естественных условиях маркировки нейтрофилы с низкими дозами флуоресцентной конъюгированных с анти-Ly6G мАт, и 3) прижизненной конфокальной микроскопии изображений. Сочетание этих трех методов позволяет визуализировать подвижных деятельности загрунтованных нейтрофилов (DsRed + / Ly6G +) при воспалительных поражений кожи. Направление миграции и скорость штрихованных нейтрофилы дополнительно количественно с помощью проходных отслеживания пути. Записывая серию покадровой видео, в реальном масштабе времени кинетика загрунтованную нейтрофилов появление контролируется на воспаленном участке и приобретение выражения DsRed на гndividual нейтрофилы также наблюдается в внесосудистое пространстве. Таким образом, динамический процесс нейтрофильной затравки был успешно визуализированы в живых животных в первый раз с использованием технологии, представленную здесь.

Эта технология используется в нескольких важных этапов. Во-первых, ткани кожи являются наиболее удобные части тела для прижизненной визуализации. Местное применение ОХ на ухе мыши позволяет осуществлять прямую визуализацию поведения иммунных клеток в воспаленной кожи под конфокальной микроскопии. Во-вторых, мышь должна быть постоянно успокоительное во время формирования изображения, которая диктует необходимость повторных инъекции анестетика. Однако, чрезмерная седации может привести к мыши умирают во время съемки. Чтобы избежать передозировки, низкие дозы анестетика (половину или треть от полной дозы) рекомендуются для долгосрочной визуализации. В- третьих, флуоресцентной конъюгированных с нейтрофилами специфичные мАт должен вводиться с перерывами из - за короткой продолжительности жизни мышиных нейтрофилах (период полураспада 8-10 часов 30). Последний, фокус дрIFT является серьезной проблемой во время съемки в заданный промежуток времени, что может быть вызвано несколькими факторами , в том числе изменениям температуры, движения тела мыши, уха отек в течение долгого времени, и вибраций , возникающих при эксплуатации прибора 31. Несколько методов были разработаны, чтобы предотвратить дрейфующих, такие как введение постоянной дозы седативных препаратов во время визуализации, фиксации уха мыши на месте пластырем на предметное стекло над ним на сцене, устанавливая климатическую камеру, чтобы обеспечить кислород и тепло в отключке организм, а также вручную перефокусирования объем при необходимости 32,33.

Не менее важно, чтобы сформулировать ограничения этого протокола. Во-первых, медленное восстановление мыши (12 - 16 ч) после обработки изображений период 8 часов в длину наблюдается из-за непрерывного седативного эффекта, что указывает, что этот протокол не может быть пригодным для таких длительных экспериментов. Альтернативный подход состоит в использовании нескольких мышей в определенной последовательности в течение периода формирования изображения, а не Uпоют только один. Во- вторых, наблюдается постепенное утечка циркулирующей FITC-декстрана во время съемки с течением времени, что, вероятно , обусловлено увеличением проницаемости сосудов кожи в воспалительном состоянии 34. Таким образом, визуализация кровеносных сосудов заметно скомпрометированы дается снижение флуоресценции в обращении на более поздних стадиях визуализации. В качестве альтернативы, можно использовать флуоресцентно конъюгированных лектины , такие как isolectin B4 , чтобы отметить кровеносные сосуды , как они прилипать к эндотелиальных клеток сосудов 35.

В дополнение к визуализации процесса нейтрофильной затравки при кожных воспалительных поражений, технология, описанная здесь, также могут быть применены во многих других экспериментальных условиях. В сочетании с недавно разработанными окнами с изображениями, прижизненной микроскопии разграничением поведение загрунтованных нейтрофилов может быть оценена в глубоких тканей и органов , включая головной мозг, молочных желез, легких, органов брюшной полости и 36-39. Кроме того, визуализация чопорнаяING / активация других типов клеток , таких как моноциты и макрофаги могут быть достигнуты с использованием мышей pIL1-DsRed наряду с маркировкой в естественных условиях с помощью флуоресцентного-конъюгированные МАт привязанными к типу клеток , представляющих интерес. Взятые вместе, то это не только технология обеспечивает фундаментальную основу для прижизненной визуализации процесса грунтовочного нейтрофилов у животных, но также раскрывает новые подходы к изучению поведения и функции других иммунных клеток в различных воспалительных состояниях, происходящих в различных тканях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin sodium APP Pharmaceuticals NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer Lonza 10-548E
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F0926
Lipopolysaccharides Sigma-Aldrich L4391
Ketamine hydrochloride Hospira NDC 0409-2051-05
Xylazine LLOYD Laboratory NADA #139-236
Acepromazine Boehringer Ingelheim ANADA 200-361
Hair-removal cream Church & Dwight
Acetone Fisher Scientific A16P4
Oxazolone Sigma-Aldrich E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody BioLegend 127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle BD 329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa Sigma-Aldrich 74817
Butterfly infusion set (27 G needle) BD 387312
FACSCalibur cytometer BD
CellQuest Pro software BD
Confocal microscope Olympus FV1000
Metamorph Software Universal Imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
  3. Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
  4. El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
  5. Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
  6. Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
  7. Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
  8. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  9. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  10. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  11. Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
  12. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  13. Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
  14. Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
  15. Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
  16. Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
  17. Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
  18. Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
  19. Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
  20. Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
  21. Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
  22. Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
  23. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  24. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  25. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  26. Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
  27. Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
  28. Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
  29. Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
  30. Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
  31. Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
  32. Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
  33. Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
  34. Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
  35. Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
  36. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  37. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  38. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
  39. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).

Tags

Immunology выпуск 112 Immunology прижизненной микроскопии нейтрофилы грунтование, мышь воспаление кожи конфокальной микроскопии моторика
Прижизненной визуализации нейтрофилов Грунтовка Использование IL-1 промотором управляемые Dsred Reporter Мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yao, Y., Liu, Y., Takashima, A.More

Yao, Y., Liu, Y., Takashima, A. Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice. J. Vis. Exp. (112), e54070, doi:10.3791/54070 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter