Abstract
Neutrofiler är de mest förekommande leukocyter i humant blodcirkulationen och snabbt rekryteras till inflammatoriska ställen. Priming är en kritisk händelse som förbättrar fagocytiska funktionerna av neutrofiler. Trots omfattande studier har avslöjat existensen och betydelsen av neutrofila priming under infektion och skada innebär att visualisera denna process in vivo har varit otillgänglig. Protokollet som tillhanda möjliggör övervakning av den dynamiska processen för neutrofil priming i levande djur genom att kombinera tre metoder: 1) DsRed reportersignal - används som ett mått på priming 2) in vivo neutrofil märkning - uppnås genom injektion av fluorescens-konjugerat anti-lymfocyt-antigen 6G (Ly6G) monoklonal antikropp (mAb) och 3) intravital konfokal avbildning. Flera viktiga steg är inblandade i detta protokoll: oxazolon-inducerad mus öra hudinflammation, lämplig sedering av djur, upprepade injektioner av anti-Ly6G mAb, och föregåendeention fokusAvvikelsen under avbildning. Även några begränsningar har iakttagits, såsom gränsen för kontinuerlig imaging tid (~ 8 h) i en mus och läckage av fluoresceinisotiocyanat-dextran från blodkärlen i den inflammatoriska tillstånd, ger detta protokoll en grundläggande ramen för intravital avbildning av primade neutrofila beteende och funktion, som lätt kan utökas till granskning av andra immunceller i mus inflammationsmodeller.
Introduction
Neutrofiler är de vanligast förekommande och kortlivade leukocyter i omlopp. De snabbt rekryteras till platserna för infektion eller skada, där de fungerar som professionella fagocyter genom frisättning av reaktiva syre- och kvävemellan tillsammans med granuler innehållande antimikrobiella peptider och proteaser 1. Under deras rekrytering, neutrofiler "primas" genom olika medel, inklusive mikrobiella produkter, kemoattraherande ämnen och inflammatoriska cytokiner, vilket resulterar i markant förbättrade fagocyt funktionalitet vid ankomsten till en inflammationsstället 2. Mekanismerna för neutrofila priming har studerats ingående in vitro 3,4; emellertid, har dynamisk övervakning av processen in vivo inte varit möjligt hittills.
Nyligen har intravital avbildning blivit en viktig teknik för att visualisera och kvantifiera de cellulära dynamiken i biologiska processer i levande organismer. Intravital avbildning kan göras via konventionella-foton-excitation mikroskopi (t.ex. konfokal) eller multifotonmikroskop närmar 5. Med tiden har avsevärda förbättringar gjorts i denna teknik som möjliggör ökad bildupplösning, förbättrad bilddjupet, minskad vävnadsfotoskador, och förbättrad bildstabilisering 6,7. Med tanke på dess unika förmåga att möjliggöra dynamisk visualisering av cellulära migration och interaktion med tiden har intravital mikroskopi i stor utsträckning tillämpas på olika områden i studien i immunologi 8. Intravital avbildning gör immunologer att bättre förstå och kontextualisera immunsvar på både cellulär och molekylär nivå i levande djurmodeller.
Senaste framstegen inom transgena samt knock-in reporter möss har gett användbara verktyg för att övervaka de dynamiska beteenden neutrofiler i levande djur. Lysozym M promotor drivna förbättrad grönt fluorescerande protein knock-inmöss har i stort sett används för att karaktärisera rörligheten av neutrofiler, monocyter och makrofager under olika inflammatoriska processer bland extravasering, bakteriell infektion, och steril inflammation 9-15. Vidare har transgena möss som uttrycker en cytoplasmisk fluorescensresonansenergiöverföring biosensor använts för att studera verksamheten i neutrofila extracellulärt reglerad mitogen kinas och proteinkinas A inom inflammerad tarm 16. En murin modell med hög specificitet för fluorescens expression i neutrofiler är Catchup knock-in mus, som producerar Cre-rekombinas samt det fluorescerande proteinet tdTomato, som i sig är kopplad till expression av lymfocytantigen 6G (Ly6G) 17. Visualisering av Ly6G-saknande neutrofiler via denna modell har visat att dessa celler utövar normal funktion i en variation av sterila eller infektiösa in vivo inflammatoriska sammanhang. Transgena möss som uttrycker den DsRed fluorescerande protein-genen under kontroll av mus interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) har använts för att visualisera de motila beteenden av IL-1 p-producerande celler - antas innefatta neutrofiler, inflammatoriska monocyter och aktiverade makrofager - emerging i inflammerad hud 18.
In vivo märkning kan tjäna som ett alternativ för att spåra de cellulära och molekylära beteenden neutrofiler i inflammerade vävnader. Efter intravenös injektion av låga doser av fluorescensmärkta anti-Gr-1 monoklonal antikropp (mAb), rekrytering kaskad av Gr-1 + neutrofiler har visualiseras i mus hudlesioner infekterade med Staphylococcus aureus 19. In vivo-administrering av konjugat innehållande streptavidin- konjugerade 705 nm kvantprickar och biotinylerad anti-Ly6G mAb märka specifikt cirkulerande neutrofiler 20. Dessutom endocytos av sådana konjugat i neutrophil vesiklar möjliggör spårning av höghastighets vesikel transport i neutrofiler migrerar in interstitium. In vivo märkning med fluorescens konjugerade antikroppar mot P-selektin glykoprotein ligand-1 (PSGL-1), L-selektin (CD62L), integrin αM (CD11b ) och kemokin (CXC motiv) receptor 2 (CXCR2) i en TNF-inducerad inflammatorisk modell har klar de regleringsmekanismer som spelar under tidig inflammation 21. Polariserade neutrofiler sticker PSGL-1-berikade uropods att interagera med CD62L närvarande på aktiverade blodplättar, vilket resulterar i omfördelning av CD11b och CXCR2, receptorer som driver neutrofilmigrationen och initierar inflammation.
IL-1β är en av signaturen gener som är förhöjd i primade neutrofiler 22. I pIL1-dsRed reporter möss, dsRed fluorescenssignaler (dvs., Aktivering av IL-1β promotor) positivt korrelerar med IL-1β mRNA-expression och IL-1β proteinproduktion. <sup> 18 För att övervaka processen för neutrofila priming var en intravital mikroskopi metod som utvecklats som involverar induktion av hudinflammation med oxazolon (OX) i pIL1-DsRed musmodell efter in vivo märkning av neutrofiler med fluorescens-konjugerad anti-Ly6G mAb. Via denna modell, är det möjligt att studera beteende och funktion av stimulerade neutrofiler i djurmodeller av olika sjukdomar och störningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utförs i enlighet med National Institutes of riktlinjer Hälsa och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Toledo.
1. Fenotypning av pIL1-DsRed Möss
OBS: Offspring genereras genom avel heterozygota pIL1-DsRed-möss med vildtyp (WT) C57BL6 möss. Tre till fyra veckor gamla valpar anses redo för fenotypning. Submandibular blödning hos möss följer ett etablerat protokoll med mindre modifieringar 23.
- Isolering av vita blodkroppar från helblod av Mus Pups
- Tillsätt 20 | il av heparin till varje 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Förvärva en valp från buren. Notera identitets taggen valpen. Det är inte nödvändigt att söva valpar innan blodinsamling från submandibular ven.
- Håll valpen av nackskinnet och tränga igenom submandibular ven i the kindpåsen med hjälp av en 5 mm Lancet. Applicera tillräcklig kraft för att skapa en liten punktering, så att droppar av blod utstrålar ur penetration. Använd en ny nål för varje valp.
- Samla 3 - 5 droppar blod per valp i en heparin-innehållande mikrocentrifugrör. Rengör stickstället och utöva påtryckningar för att underlätta hemostas.
- Sätt valp i ny bur och observera under 30 minuter innan han återvände till buren till djuranläggningen.
- Samla blod från vuxna möss av en känd fenotyp som positiva och negativa kontroller.
- Tillsätt 500 pl av röda blodkroppar lyserings-buffert till varje rör, vortexrör, och inkubera under 5 - 10 min på is.
- Tillsätt långsamt 400 - 500 | il av fetalt bovint serum (FBS) under cellsuspension i varje rör. En tydlig gränssnitt kan observeras mellan det övre skiktet cellsuspension och det nedre lagret av FBS.
- Cap-rör och centrifugera prover vid 1500 x g under 5 min.
- Upprepa steg 1.1.7 - 1.1.9 till pälsther avlägsna röda blodkroppar. Upprepa inte om lys är tillräcklig för första gången. Pelleten bör vara svårt att urskilja efter centrifugering.
- Lipopolysackarid (LPS) Stimulering och kultur
- Resuspendera cellerna i 200 pl komplett Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium.
- Överför cellsuspensionen till ett flödescytometri rör.
- Göra LPS arbetslösning genom att blanda 10 ^ il av LPS-stamlösning (1 mg / ml) med 990 ^ il fullständigt RPMI 1640-medium.
- Tillsätt 20 | il av 10 | ig / ml LPS arbetslösning till 200 | il cellsuspension.
- Förslut rören löst och inkubera proverna under 4 h vid 37 ° C med 5% CO2.
- Flödescytometrianalys
- Öppna datainsamlingsprogram för flödescytometri. Inrätta förvärv mall före prov förvärv.
- Klicka på Dot-Plot verktyg i verktygspaletten. Rita en forward spridning (FSC) mot sidospridning (SSC) plot. Ställ in spänningsparametrarna FSC och SSC till linjär skala.
- Välj de lägsta tröskelvärdena i FSC och SSC tillåts av cytometern. Tillämpa trösklar 200 och 50 för FSC och SSC, respektive.
- Inom FSC vs SSC plot, rita en grind G1, som innefattar monocyter, granulocyter och dendritiska celler, och utesluter skräp, röda blodkroppar och lymfocyter.
- Klicka på Histogram verktyg i verktygspaletten. Rita en FL2 (röd fluorescens kanal) histogram. Använd en negativ kontrollprov för att ställa baslinjen FL2 signaler och en positiv kontrollprov för att rita en grind för att inkludera alla dsRed positiva händelser.
- På Fluidics Kontrollpanel av cytometern det, ställer fluidläget på "RUN" och flödeshastigheten till "HÖG" (ca 60 | j, l / min). Förvärva 10.000 händelser för varje prov.
- Bestämma pup fenotyp genom mätning av procentandelen av DsRed positiva celler från G1-grinden.
- Söva musen genom intraperitoneal (ip) injektion av en anestetisk cocktail innehållande 100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin, och 1 mg / kg acepromazin. Adekvat sövda möss visar inte baktass tillbakadragande till tå nypa.
- Applicera hår-borttagning grädde till den dorsala ytan av båda öronen hos musen. Vänta 30 sekunder till en minut. Torka örat ytan med vatten-vätta bomull och låt lufttorka.
- Mät örats tjocklek med hjälp av mikrometer och ersätta musen i en separat bur. Observera tills återhämtning från anestesi (~ 15-30 min). Lös hudinflammation induceras av hårborttagning produkt, tillåter musen för att vila i 3 dagar innan ytterligare experimente utförs.
- Förbered 1,25% (vikt / volym) OX genom upplösning 16,7 mg OX i 1 ml aceton och blandning 750 pl av OX / acetonlösning med 250 | il av olivolja. Bered fordon lösning genom att blanda 750 pl aceton med 250 &# 181; l olivolja.
- Åter söva musen genom ip-injektion av bedövningsmedel cocktail (2,1). Mäta örats tjocklek som tidigare.
- Applicera 12,5 pl 1,25% OX på varje sida av höger öra. Applicera 12,5 pl aceton / olivolja fordons lösningen på varje sida av vänster öra.
- Håll musen separat från bur kamrater tills återhämtat sig helt för att förhindra förolämpning mot öronen av andra möss, sedan ersätta musen i sin ursprungliga bur och återgå till djurstallar anläggning.
OBS: Hårborttagning kan resultera i mindre hudinflammation följt av byte av örats tjocklek. Denna mindre inflammation kommer att lösas 3 dagar senare bekräftades av normal örontjockleken. Efter lokal applicering under 24 timmar, OX-behandlade öron visar signifikant (p <0,01) svullnad jämfört bärarlösning enbart behandlade öron.
3. Märkning av neutrofiler i pIL1-DsRed möss
OBS: In vivo märkning av neutrofiler genom låg dos fluorescence-konjugerat neutrofil-specifika mAb följer en nyutvecklad protokoll 19. Retro-orbital injektioner utförs enligt ett fastställt protokoll med några ändringar 24.
- Förbereda anti-Ly6G mAb arbetslösning genom att späda 10 pl av 0,5 mg / ml Alexa Fluor 647-konjugerad anti-Ly6G mAb (klon 1A8) i 90 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Överför 100 | il av anti-Ly6G mAb arbetslösning (50 | j, g / ml) in i en insulinspruta U-100 med 28 gauge nål.
- Söva en vuxen pIL1-DsRed musen genom ip-injektion av den tidigare beskrivna bedövningsmedel cocktail (2,1). Placera sövda musen buken ner på en ren arbets styrelse.
- Applicera mild nedåtriktat tryck mot huden rygg och ventrala till en mus ögat att delvis skjuta ut ögongloben ur vägguttaget.
- Placera försiktigt nålen, fasa ned, med en vinkel på ungefär 30 ° vid den mediala ögonvrå i retro-orbitalsinus.
OBS: Operatören kan känna press, penetration och lättad motstånd när nålen sätts in i sinus. - Långsamt och jämnt injicera 100 pl anti-Ly6G mAb arbetslösning (5 mikrogram mAb / mus / injektion) i musen. Ta bort nålen snabbt. En liten mängd blödning antyder en framgångsrik injektion.
- Omedelbart tillämpa 1,25% OX och fordon lösningen på höger och vänster musöron.
- Efter åtta timmar, administrera 100 pl nyframställd anti-Ly6G mAb arbetslösning (5 mikrogram mAb / mus / injektion) via retro-orbital injektion i samma mus.
- För att visualisera blodkärl, omedelbart före avbildning, administrera 100 pl av 30 mg / ml fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugerad dextran (150 kDa) genom retroorbital injektion.
4. Intravital avbildning av neutrofila Priming i pIL-1-DsRed Möss
- Söva musen med ip-injektion av bedövningsmedel cocktail (2,1).0; Applicera veterinär salva till mus ögon för att förhindra torrhet under narkos för avbildning.
- Förbereda 1 ml halv dos bedövningsmedel cocktail genom att späda 500 pl ursprungliga bedövningsmedel cocktail med en lika stor volym PBS.
- Överför halv dos bedövningsmedel cocktail till 1 ml spruta med en fjäril 27 gauge nål.
- Sätt nål fjäril i mus buken intraperitonealt och fixa fjärilen vingen till buken genom att tejpa.
- Placera ett täckglas i centrum av avbildningssteget. Tejpa kanterna på täckglaset för att hålla den på plats.
- Placera en droppe PBS på den ventrala ytan av musörat samt på täckglas.
- Position sövda mus med sin öra över täck. Montera spetsen på örat, ryggsidan nedåt, genom sandwiching örat mellan täckglas och en glasplatta, som också hålls på plats via tejp.
- Slå på en multi-laser fluorescens konfokalmikroskop och alla tillhörande equipment. Stänga rum ljus för att minimera omgivande ljusexponering.
- Öppna bilden förvärvet programvara. Välj laser kanaler för detektering av fluorescerande färgämnen i Dye List.
- Justera fokus på den inflammerade örat huden genom observation av gröna signaler från blodkärlen och röda signaler från de DsRed + celler genom okularet.
- Utför snabb skanning med skanningshastighet på 2 ps / pixel och upplösning på 512 x 512 pixlar. Välj en pseudo för varje kanal i Live View-menyn. Justera fokus ratten för att ställa in slutet och startplats för skanning.
- Utför långskanningar med skanningshastighet på 4-8 ps / pixel och upplösning på 800 x 800 eller 1024 x 1024 pixlar. Justera den höga spänningen, förstärkning och offset på varje enskild kanal för att maximera intensiteten hos signaler samtidigt undvika mättnad (röda pixlar). Det bör finnas endast ett fåtal röda pixlar i varje kanal.
- Skapa tredimensionella bilduppsättningar genom att skanna the örat huden börjar ytligt i hornlagret och framåt nedåt med x, y, z volymer av 317 um × 317 pm x 30 pm (40X objektiv), 635 pm x 635 pm x 30 pm (20X objektiv), eller 1,270 um × 1270 um x 50 um (10X objektiv) vid 2 pm z-steg.
OBS: Hornlagret är det yttersta lagret av epidermis och kan lätt lokaliserad baserat på dess starka autofluorescens signal. - I tidsförlopp imaging experiment, spela tredimensionella bilder varje 2 eller 4 min för upp till åtta timmar.
- Intermittent som musen börjar återhämta sig från anestesi, noterade bygger på observationer av ryckningar whiskers, administrera 5 - 10 il halv dos anestesi cocktail genom fjärilsnål.
OBS: Var försiktig med anestesi dos - överdos kan leda till döden mus. Alternativt skulle inhalationsanestesi i en burk appliceras på musen för kortsiktig anestesi och ennoskon kan användas för långsiktig avbildning. - Avlägsna sövda musen från scenen när avbildning är klar. Dra av tejpen och avlägsna fjärilsnål från musens buk. Återgå musen till en separat bur i djurstallar anläggningen.
OBS: För korttids imaging (<1 timme), möss återhämta sig helt från anestesi snabbt i 1-3 tim. För långtids imaging (~ 8 tim), möss återhämta sig långsamt, med en typisk återhämtningsperiod på 12-16 timmar. Således är oral vatten administration rekommenderas minst flera gånger under återhämtningsperioden för att förhindra allvarlig uttorkning. - Processavbildningsdatamängder, spåra enskilda celler, genererar flyttvägar, och beräkna riktning och hastighet av cellmigration med hjälp av bildanalys programvara 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Screening av pIL1-DsRed möss utförs baserat på den fenotypiska DsRed fluorescenssignalen producerad av deras perifera blodleukocyter med användning av flödescytometri. LPS-stimulering är känt för att inducera IL-1β produktion i myeloida celler inklusive neutrofiler, monocyter och dendritiska celler 26-28. Sålunda är isolerade leukocyter inkuberades med LPS för 4 h före flödescytometrianalys. Därefter grind inställd för att cirkulera myeloidceller baserade på cellstorlek (FSC) och inre komplexitet (SSC) (Figur 1A) 29, och DsRed signalen mäts i detta gated population. Cirkulerande myeloida celler från WT möss minimalt uttrycka DsRed, medan samma celler från pIL1-DsRed möss uttrycker urskiljbara DsRed signaler (Figur 1B). De pIL1-dsRed möss identifierade genom denna fenotypning metod används för efterföljande experiment. Det bör noteras att hela fenotypning processen tar bara ett fåtaltimmar - mycket kortare än de traditionella genotypning metoder inklusive vävnad skörd, enzymatisk digerering, DNA-isolering, PCR och elektroföres.
IL-1β promotoraktivering har nyligen identifierats som en markör för neutrofil priming 22. Således kan den dynamiska processen för neutrofila priming visualiseras och bedömas i levande djur med hjälp av pIL1-dsRed möss. För att inducera hudinflammation, är hudsensibiliserande OX lokalt appliceras på det högra örat av pIL1-dsRed möss och vehikel tillämpas på vänster öra hos samma djur. Att märka neutrofiler i levande djur, är en nyutvecklad protokoll utförs genom att administrera en liten mängd av fluorescensmärkt anti-Ly6G mAb omedelbart före och åtta timmar efter OX ansökan. Att lokalisera blodkärl är FITC-dextran injiceras omedelbart före avbildning.
Vid 24 timmar efter OX ansökan, enstort antal DsRed + / Ly6G + celler finns i det extravaskulära utrymmet (figur 2A) och representerar primade neutrofilerna. Ett litet antal DsRed / Ly6G + celler finns också, vilket sannolikt representerar vilande neutrofiler. Dessutom en liten population av DsRed + / Ly6G - celler observeras, som kan bestå av inflammatoriska monocyter och aktiverade makrofager. I en 40 min time-lapse video, Ly6G + neutrofiler framväxande inom en inflammatorisk hudförändring uppvisar typisk amöba-liknande genomsökning rörelse (Supplemental Movie 1). Cellflyttvägar spåras för att jämföra rörliga beteenden i DsRed + / Ly6G + och DsRed - / Ly6G + neutrofila populationer (figur 2B). Spårplotten analyser visar att både neutrofila populationer visar "random" migration när det extracellulära utrymmet har matats in (figur 2C). Intressant,DsRed + / Ly6G + neutrofiler uppvisar en betydligt högre hastighet jämfört med sina dsRed - / Ly6G + motsvarigheter (figur 2D). Detta tyder på ett samband mellan neutrofila priming och snabbare rörlighet i inflammatoriska lesioner.
Att övervaka tidpunkten för neutrofila priming, en serie tidsfördröjda videos registrerades vid olika tidpunkter efter OX behandling (kompletterande filmer 2 - 4). DsRed - / Ly6G + celler, vilande neutrofiler, blir detekterbara i extravaskulärt så tidigt som 8-12 timmar efter OX ansökan och deras antal förblir relativt låg därefter (Figur 2E, Kompletterande filmer 3, 4). Tvärtom, antalet DsRed + / Ly6G + -celler, de grundade neutrofiler, öka progressivt vid senare tidpunkter, med början vid 14-16 h efter OX ansökan. några DsRed
Figur 1:. Fenotypning av pIL1-dsRed möss (A) Flödescytometri analys visar en population av cirkulerande myeloidceller (G1) baserade på FSC och SSC parametrar. (B) Histogram på FL2-kanalen visar andelen dsRed + celler inom G1 grind av cellerna från pIL-DsRed möss (röd) eller från WT möss (blå). Data är representativa för på least tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Visualisering av Rörliga verksamhet DsRed + / Ly6G + neutrofiler vid inflammatoriska hudskador (A) Statisk konfokalmikroskopi bilder registreras 24 timmar efter OX behandling visar tre leukocytpopulationer i extravaskulärt, det vill säga, DsRed + / Ly6G + celler. (asterisker), DsRed - / Ly6G + -celler (trianglar), och DsRed + / Ly6G - celler (pilar). Bar = 20 ^ m. DsRed + / Ly6G + celler (röd) och dsRed - / Ly6G + celler (blå) jämförs för migratory vägar (B), spårytor (C) och hastighet (D) från en 40 min time-lapse film som spelats in av konfokalmikroskopi start 24 timmar efter OX ansökan (Supplemental Movie 1). (D) Bars anger menar hastighetsvärden. *** P <0,001. (E) Antalet dsRed + / Ly6G + celler och DsRed - / Ly6G + celler räknas från en serie tidsförlopp filmer som spelats in på olika tidpunkter efter OX ansökan (Kompletterande filmer 2 till 4). De data som visas är de cellantal / mm 2 (medel ± SD) som beräknats från tre bilder i följd. (F) Statiska bilder skapas från en time-lapse film som spelats in från 11 till 14,5 timmar efter OX målning (Supplemental Movie 5). Pilen visar en Ly6G + cell som förvärvar DsRed uttryck i extravaskulärt under observationsperioden.Bar = 50 | im. Bilder återges från referens 22 med tillstånd (Copyright 2015. American Association of Immunologer, Inc.). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Kompletterande Movie 1: Rörlig Beteende DsRed + neutrofiler vid inflammatoriska hudskador (vid 24 timmar efter OX målning) konfokalmikroskopi bilder visar motilitet dsRed + / Ly6G + celler (rosa) och DsRed - / Ly6G + celler (blå) i extravasalt. Blodkärl ses i grönt. Bar = 20 ^ m. Videon återges från referens 22 med tillstånd (Copyright 2015. American Association of Immunologer, Inc.). Vänligen click här för att se den här videon.
. Kompletterande Movie 2: Rörlig Beteende DsRed + neutrofiler vid inflammatoriska hudskador (vid 4 h efter OX målning) konfokalmikroskopi bilder visar dsRed + / Ly6G + celler (rosa) och dsRed - / Ly6G + celler (blå) i extravaskulärt . Blodkärl ses i grönt. Autofluorescens är närvarande och associerat med hårsäckar. Bar = 100 | j, m. Videon återges från referens 22 med tillstånd (Copyright 2015. American Association of Immunologer, Inc.). Klicka här för att se filmen.
Kompletterande Movie 3: Rörlig Beteende DsRed + neutrofiler i Inf. lammatory hudskador (vid 8 h efter OX målning) konfokalmikroskopi bilder visar dsRed + / Ly6G + celler (rosa) och DsRed - / Ly6G + celler (blå) i det extravaskulära rummet. Blodkärl ses i grönt. Autofluorescens är närvarande och associerat med hårsäckar. Bar = 100 | j, m. Videon återges från referens 22 med tillstånd (Copyright 2015. American Association of Immunologer, Inc.). Klicka här för att se filmen.
Kompletterande Movie 4: Rörlig Beteende DsRed + neutrofiler vid inflammatoriska hudskador (vid 11-19 timmar efter OX målning) konfokalmikroskopi bilder visar dsRed + / Ly6G + celler (rosa) och dsRed - / Ly6G + celler (blå) i. extravaganscular utrymme. Blodkärl ses i grönt. Autofluorescens är närvarande och associerat med hårsäckar. Bar = 100 | j, m. Videon återges från referens 22 med tillstånd (Copyright 2015. American Association of Immunologer, Inc.). Klicka här för att se filmen.
Kompletterande Movie 5: Förvärv av dsRed Signaler från Ly6G + neutrofila granulocyter från tidsförlopp filmer som visas i kompletterande Video 4, visar denna högre förstoring video den process där en Ly6G + cell (indikeras med en pil) förvärvar DsRed uttryck i det extravaskulära. utrymme under observationsperioden (från 11 till 14,5 timmar efter OX målning). Bar = 50 | im. Videon återges från referens 22 med tillstånd (Copyright 2015. American Association of Immunologists, Inc.). Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med denna studie är att utveckla en teknik för att övervaka processen för neutrofila priming i levande djur, som ännu inte uppfyllts av de för närvarande tillgängliga teknik. För att uppnå detta mål, är tre etablerade metoder utförs: 1) induktion av hudinflammation i IL-1 promotor-driven dsRed reporter möss som ett mått på priming, 2) in vivo märkning av neutrofiler med låga doser av fluorescens-konjugerad anti-Ly6G mAb, och 3) intravital konfokalmikroskopi avbildning. Kombinationen av dessa tre metoder möjliggör visualisering av rörliga aktiviteter stimulerade neutrofiler (DsRed + / Ly6G +) i inflammatoriska hudskador. Migrationen riktning och hastighet av de grundade neutrofiler ytterligare kvantifieras via vandrande väg spårning. Genom att spela in en serie tidsfördröjda videos, är realtids kinetik primas neutrofila uppkomst övervakas på inflammationsstället och förvärv av DsRed uttryck av Individual neutrofiler har också observerats i det extravaskulära rummet. Sålunda har den dynamiska processen för neutrofila priming framgångsrikt visualiseras i levande djur för första gången med hjälp av den teknik som presenteras här.
Denna teknik används i flera viktiga steg. Först hudvävnad är de mest bekväma kroppsdelar för intravital avbildning. Lokal applicering av OX på musörat medger direkt visualisering av immuncellbeteenden i inflammerad hud under konfokalmikroskopi. För det andra måste musen vara sövd ständigt under avbildning som kräver upprepade injektioner av bedövningsmedel. Dock kan över sedering orsaka mus dör under avbildning. För att undvika överdosering är låga doser av narkosmedel (en halv eller en tredjedel av full dos) rekommenderas för långsiktig avbildning. Tredje, fluorescens-konjugerad neutrofil specifika mAb måste injiceras intermittent på grund av den korta livslängden av murina neutrofiler (halveringstid på 8-10 h 30). Slutligen fokus drIFT är en viktig fråga under time-lapse avbildning, som kan orsakas av flera faktorer, bland annat temperaturvariationer, mus kroppsrörelse, öron svullnad över tiden, och vibrationer som härrör från driften av instrumentet 31. Flera metoder har utvecklats för att förhindra drifting, såsom administration av en konstant dos av sedering under avbildning, fastställande av mus öra på plats genom att tejpa en glasskiva över den på scenen, installera en miljökammare för att ge syre och värme till sövd organism, liksom genom att manuellt återfokusering räckvidden vid behov 32,33.
Det är lika viktigt att ange begränsningar i detta protokoll. Först, en långsam mus återhämtning - är (12 16 h) efter en avbildning perioden 8 h i längd observer på grund av kontinuerlig sedering, vilket tyder på att detta protokoll inte kan vara lämpliga för sådana långa experiment. Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda flera möss i sekvens över bildperioden snarare än usjunga bara en. För det andra, är en gradvis läckage av cirkulerande FITC-dextran observerades under avbildning över tiden, vilket sannolikt beror på en ökad permeabilitet fartyg hud blod i den inflammatoriska tillstånd 34. Således är visualisering av blodkärl markant äventyras med tanke på minskad fluorescens i omlopp i senare skeden av avbildning. Alternativt kan man använda fluorescerande konjugerade lektiner såsom isolectin B4 för att markera blodkärl eftersom dessa vidhäftar till vaskulära endotelceller 35.
Förutom visualisering av processen för neutrofil priming i hud inflammatoriska skador, kan den teknik som beskrivs här även tillämpas i många andra experimentella inställningar. I kombination med nyutvecklade avbildningsfönster kan intravital mikroskopi avgränsar beteenden grundade neutrofiler bedömas i djupa vävnader och organ, inklusive hjärna, bröstkörtlar, lungor, och bukorganen 36-39. Dessutom visualisering av priming / aktivering av andra celltyper, såsom monocyter och makrofager skulle kunna uppnås med hjälp av pIL1-DsRed möss tillsammans med in vivo-märkning via fluorescens-konjugerad mAb specifik för celltypen av intresse. Sammantaget inte bara denna teknik ger en grundläggande ram för intravital avbildning av flödningsprocessen av neutrofiler i levande djur, men det avslöjar också nya metoder för att studera beteende och funktion av andra immunceller i olika inflammatoriska tillstånd utspelas i olika vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-540-31 | |
| ACK lysing buffer | Lonza | 10-548E | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Lipopolysaccharides | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Ketamine hydrochloride | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | LLOYD Laboratory | NADA #139-236 | |
| Acepromazine | Boehringer Ingelheim | ANADA 200-361 | |
| Hair-removal cream | Church & Dwight | ||
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | |
| Oxazolone | Sigma-Aldrich | E0753 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody | BioLegend | 127610 | |
| U-100 insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| FITC-CM-Dextran, 150 kDa | Sigma-Aldrich | 74817 | |
| Butterfly infusion set (27 G needle) | BD | 387312 | |
| FACSCalibur cytometer | BD | ||
| CellQuest Pro software | BD | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Metamorph Software | Universal Imaging |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
- Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
- Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
- El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
- Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
- Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
- Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
- Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
- Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
- Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
- Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
- Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
- Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
- Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
- Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
- Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
- Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
- Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
- Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
