Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים נגרם אדם מן synoviocytes חולה נגזרת כמו-פיברובלסטים, באמצעות מערכת lentiviral ללא תאים מזינים.
Abstract
תאי סומטיים בוגרים יכולים להיות הפוכים לתוך גזע פלוריפוטנטיים דמוי תא מדינה באמצעות סט של גורמי תכנות מחדש מוגדר. מחקרים רבים יצרו תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) סוגי תאים שונים סומטיים ידי transducing ארבעה גורמי שעתוק יאמאנאקה: Oct4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc. המחקר של iPSCs נשאר בחוד החנית של מחקר ביולוגי וקליני. בפרט, iPSCs המטופל ספציפי יכול לשמש ככלי חלוצים למחקרי של pathobiology מחלה, מאז iPSCs יכול להיגרם מן הרקמה של כל אדם. דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה דלקתית כרונית, אשר סווגו על ידי הרס הסחוס ומבנה העצם במפרק. היפרפלזיה הסינוביאלי הוא אחד הסיבות העיקריות או סימפטומים שיובילו לתוצאות אלה ב- RA. Synoviocytes פיברובלסטים דמויי (FLSs) הם התאים המרכיבים העיקריים הסינוביום hyperplastic. FLSs במפרק להתרבות ללא הגבלה, בסופו של דבר פולש cartil סמוךגיל ועצמות. נכון לעכשיו, synovium hyperplastic ניתן להסיר רק על ידי הליך כירורגי. הסינוביום שהוסר משמש למחקר RA כחומר המשקף את המצב הדלקתי של המפרק. כשחקן מרכזי בפתוגנזה של RA, FLSs יכול לשמש כחומר ליצור ולחקור את iPSCs של חולי RA. במחקר זה, השתמשנו FLSs של חולה RA כדי ליצור iPSCs. באמצעות מערכת lentiviral, גילינו כי FLSs יכול ליצור iPSC המטופל הספציפי RA. IPSCs המופק FLSs ניתן להשתמש כדי להמשיך ככלי ללמוד בפתופיזיולוגיה של RA בעתיד.
Introduction
תאי גזע פלוריפוטנטיים הם הפלטפורמה של הדור הבא בתחומים קליניים וביולוגיים שונים. הם כולים מבטיחים כי ניתן להשתמש ב דוגמנות מחלה, הקרנת סמים, וטיפול רפואי רגנרטיבית. אדם תאי גזע עוברי (hESCs) שמשו בעיקר כדי ללמוד ולהבין תאים פלוריפוטנטיים. עם זאת, מבודד על ידי הרס של הבלסטוציסט האנושי, hESCs המשויכים מספר שיקולים אתיים. בשנת 2007, ד"ר שיניה יאמאנאקה וצוות הפכו את תהליך תכנות תא ופתחו תאי גזע תאי סומטיים אדם בוגרי 1,2. לכן, בניגוד hESCs, נגרמת pluripotent בתאי גזע (iPSCs) ניתן להפיק מן התאים הסומטיים בוגרים, הימנעות המכשולים המוסריים.
בדרך כלל, iPSCs מופקים על ידי משלוח של ארבעה גנים אקסוגניים: Oct4, Sox2, Klf4, ו- c-Myc. גורמי יאמאנאקה אלה מועברים במקור באמצעות מערכות lentiviral ו retroviral. IPSCs הראשון נגזרו ג סומטיים העכבראמות 3. לאחר מכן, הטכניקה יושמה כדי fibroblasts עורי האנושי 1,2. מחקרים מאוחרים יותר שנוצרו iPSCs בהצלחה ממקורות שונים, כגון שנתן 4, דם 5,6, קרטינוציטים 7, סוגי תאים כמה אחרים. עם זאת, ישנם כמה תאים סומטיים שלא היה בשימוש תכנות מחדש, והקרנת יכולות תכנות מחדש של תאים מסוגים שונים ברקמות ספציפיות במצב מחלה, עדיין נדרש.
דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה שיכולה לפגוע בכל המפרקים להוביל מחלות אוטואימוניות באיברים אחרים. RA המשפיעה על כ -1% מהמבוגרים בעולם המפותח. זוהי מחלה די נפוצה שכיחותה גדלה מידי שנת 8. עם זאת, דלקת מפרקים שגרונית היא קשה לזהות בשלבים מוקדמים oncebone הרס מתרחשת אין טיפול שיכול לשחזר את הנזק. יתר על כן, יעילות תרופה שונה מחולה לחולה, וזה קשה לחזות את החובשine כי נדרש. לכן, הפיתוח של שיטת סמי הקרנה יש צורך, ואת חומר תא זה יכול לשקף את התנאים של RA נדרש.
Synoviocytes פיברובלסטים דמויים (FLSs) מהווה השתתף הסלולר פעיל בפתוגנזה של 9,10 RA. FLSs להתקיים רירית intimal הסינוביאלי בין קופסית מפרק ואת החלל, אשר גם הוא המכונה הסינוביום. על ידי תמיכה במבנה המשותף ומתן מזיני הסחוס שמסביב, FLSs בדרך כלל לשחק תפקיד מכריע בתפקוד ותחזוקה משותפים. עם זאת, FLSs ב- RA יש פנוטיפ פולשני. יש RA FLSs פנוטיפ סרטן דמוי, בסופו של דבר להרוס את העצם שמסביב ב -10 התפשטות אינסופית. עם מאפיין ייחודי זה, יכול לשמש FLSs כחומר מבטיח שיכול לשקף את pathobiology של RA. עם זאת, תאים אלו הם לעתים נדירות מיוצרים, ואת פנוטיפים התא לשנות כמו התאים לעבור כמה קטעים במבחנה
באופן תיאורטי, iPSCs החולה נגזר RA (RA-iPSCs) יכול להיות כלי אידיאלי עבור הקרנת סמים ומחקר נוסף. יצר iPSCs יכולת התחדשות עצמית והוא יכול להישמר והרחיב במבחנה. עם pluripotency, תאים אלה יכולים להיות מובחנים לתוך שושלות הכונדרוציטים ו osteocyte בוגרות, אשר יכול לתרום חומר תא של מחקרים ספציפיים ב- RA ומחלות הקשורות עצם אחרים 11.
במחקר זה, אנו מדגימים כיצד לבודד להרחיב FLSs מתוך synovium הוסר בניתוח, וכיצד ליצור RA-iPSCs מ FLSs באמצעות lentiviruses המכיל גורמים יאמאנאקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
משפט ואתיקה: זה פרוטוקול מחקר אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה (KC12TISI0861).
1. בידוד Synoviocyte ורחב
- בידוד Synoviocyte
- לעקר שני זוגות מספריים כירורגיות וזוג אחד של מלקחיים.
- העברת רקמה סינוביאלי לצלחת 100 מ"מ ולשטוף עם 5 מ"ל של בופר פוספט (PBS) המכיל 1% פניצילין / סטרפטומיצין.
- חותך את שאריות שומן רקמות ועצמות הצהבהבות. העברת הרקמה הגזוזה באר של צלחת 6-היטב ומוסיף 5 מיליליטר של המדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) עם 20% בסרום שור עוברי (FBS).
- קוצץ את הרקמות עם המספריים עד החתיכות קטנות מספיק כדי לחדור פיפטה חד פעמי.
- מעבירים את התקשורת המכיל רקמות צינור חרוטי 50 מ"ל. קציר את החומר הנותר על ידי הוספת 5 מ"ל של DMEM עם 20% FBS לצלחת 6-היטב ולאחר מכן להעביר את הצינור. </ Li>
- collagenase להפשיר על הקרח. להוסיף collagenase לריכוז סופי של 0.01% ו לאטום את הצינור עם parafilm. דגירה באמבט מים ב 37 ° C עם רעד במשך 4 שעות.
- לאחר דגירה, למלא את הצינור עם DMEM עם 20% FBS, עד הנפח הכולל הוא 50 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 300, RT במשך 10 דקות.
- הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה ולהוסיף 40 מ"ל של התקשורת כדי resuspend גלולה.
- חזור על שלבי 1.1.10-1.1.11.
- Resuspend גלולה ב 25 מ"ל של DMEM עם 20% FBS ולחכות גושים גדולים של רקמה לשקוע לקרקעית.
- מעבירים את supernatant לצלחת 100 מ"מ ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 עבור 14 ימי.
- תחזוקת Synoviocyte ורחבה
- מחק את התקשורת בשימוש מהצלחת לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של PBS.
- הוסף 1 מ"ל PBS / 1 mM EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 2 דקות.
- הקש על צלחת בעדינות transfer התאים צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה התאים ב 250 XG, RT במשך 2 דקות.
- הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה ו resuspend גלולה ב 30 מ"ל של DMEM עם 20% FBS.
- להעביר את התאים 3 x 100 מנות מ"מ, מבלי לעזוב כל חומר שאריות גלוי.
- החלף את המדיה עם תקשורת טריה כל 3 ד. פיצול התאים ב confluency 80% באמצעות 1 מ"ל PBS / 1 mM EDTA. שמור עד חלוף 3 לפני השימוש. מחלקים כל צלחת של תאים לתוך 3 מנות בכל פיצול.
הערה: לאחר שהגיע מעבר 3, תאים שאינם הולכים לשמש מיד אפשר להקפיא.
2. FLSs Reprogramming שימוש Lentiviruses קידוד גורמים יאמאנאקה
- תמרה (D0)
- זרע 3 × 10 4 תאים לכל גם צלחת 6-גם בתקשורת צמיחה (500 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין). דגירה התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.
- למחרת, להסיר בקבוקון אחד של lentivirus המכיל 4 יאמאנאקה גורמים: Oct4, Klf4, Sox2 ו- c-Myc מהמקפיא להפשיר ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: Lentivirus הופק על ידי ההליך המתואר במחקר הקודם שלנו 11.
- בעוד להפשרת וירוס, לשנות את התקשורת למדיה צמיחה FLS (20% FBS בתוספת אנטיביוטיקה DMEM) המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל ברומיד hexadimethrine ו -50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית.
- לאחר שינוי התקשורת, להוסיף 30 μl של lentivirus לתאים ומערבבים בעדינות. כדי לשפר את הזיהום, בצנטריפוגה הצלחת ב -680 XG, 35 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
- תחזוקה עד Reprogramming גלויה
- במשך 3 ימים, להחליף את התקשורת יומית עם תקשורת צמיחת FLS המכילה בוטיראט 0.1 מ"מ נתרן ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אסקורבית.
- למחרת, להחליף את התקשורת עם תערובת של תקשורת צמיחת FLS והתקשורת iPSC (1: 1 יחס) המכיל 0.1 מ"מ בוטיראט נתרן ו -50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית.
הערה: מרכיבי תקשורת iPSC ניתנים ברשימת חומרים / ציוד.
- תאי פיצול עבור גיבוש קולוני
- כן 6-גם צלחת vitronectin המצופה.
- הוסף 60 μl vitronectin עד 6 מ"ל PBS ללא Ca 2 + ו Mg 2+. שים 2 מ"ל של התערובת לתוך כל בארות דגירה RT לפחות שעה 1. הערה: ריכוז העבודה של vitronectin הוא 5 מיקרוגרם / מ"ל.
- ביום D5, לשטוף את התאים עם PBS.
- הוסף 1 מ"ל PBS / 1 mM EDTA כדי לנתק את התאים ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 2 דקות.
- קציר התאים צנטריפוגות ב 250 XG, RT במשך 2 דקות.
- פיצול התאים ב 3 יחסים שונים (1: 3, 1: 6 ו -1: 9) על מנת להשיג confluencies השונה. להוסיף 900 μl של התקשורת גלולה התא גלולה. הוספת 300, 150, ו -100 μl של תערובת תאים לכל גם 6-צלחת גם להשיג יחס של 1: 3, 1: 6 ו -1: 9, בהתאמה.
- החלף את המדיה יומית עם תקשורת iPSC עד מושבות להופיע. מושבות תופענה לאחר כ D18. הערה: בשלב זה, מושבות iPSC להתקיים עם FLSs שאינם לתכנות מחדש.
- כן 6-גם צלחת vitronectin המצופה.
- קטיף קולוני
- הכינו צלחת 48-היטב מצופה vitronectin על ידי הוספת 500 μl vitronectin על בארות, דגירה ב RT לפחות שעה 1.
- מניחים את המיקרוסקופ על ספסל נקי, ולהסיר את צלחת 6-היטב מן החממה.
- הסר את הפתרון vitronectin מהצלחת 48-היטב ולהוסיף 500 מדיה iPSC μl בתוספת 10mm Rho הקשורים, המכיל פרוטאין קינאז-סליל מפותל (ROCK) מעכב.
- בעזרת קצה פיפטה 10p, לחתוך סביב המושבה. מעבירים את המושבה הרים כדי היטב אחד של הצלחת 48-היטב.
- לאחר בחירת מושבות כמה, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לשמור על התאים עד ההתנחלויות הן Eno גדולאיכס להעברה. הערה: בדרך כלל אנחנו נשפכים התאים כאשר המושבה יוצאת של השדה הגלוי של המיקרוסקופ, כאשר צפו בהגדלת 100X.
3. Immunofluorescence מכתים
- תא הכנה
- מניחים כוס כיסוי סטרילי 18 מ"מ לתוך צלחת 12-היטב.
- הוסף 1 מ"ל של PBS לצנן ולשטוף את מכסה זכוכית.
- החלף עם 1 מ"ל של פתרון 10 מיקרוגרם / מ"ל vitronectin.
- דגירה את הצלחת על RT במשך שעה 1 לפחות.
- מחק את הפתרון vitronectin ו iPSCs צלחת צלחת 12-היטב מצופה vitronectin והתרבות למשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לשנות את התקשורת מדי יום.
- מכתים תא
- מחק את התקשורת והתרבות לשטוף את התאים עם PBS פעם.
- תקן את התאים paraformaldehyde 0.4% (PFA) במשך 30 דקות ב RT.
- Permeabilize את התאים עם 0.1% Triton X-100 במשך 5 דקות ב RT.
- הסר את permeabilizationפתרון ולחסום עם PBS המכיל 2% אלבומין בסרום שור (BSA) למשך 30 דקות ב RT.
- לדלל את הנוגדנים PBS המכיל BSA 2% לפי טבלה 1. דגירה התאים עם נוגדנים ראשוניים עבור שעה 2 ב RT.
- מוסיפים את נוגדנים משני (בדילול 1: 200) ו דגירה התאים במשך שעה 1 ב RT, הימנעות אור.
- פנקו את התאים עם 1 μl / מ"ל DAPI במשך 10 דקות.
- מניחים את מכסה זכוכית על גבי זכוכית שקופית עם antifade מגיב לדגור על RT למשך 24 שעות, הימנעות אור.
- ודא ביטוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
4. תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR)
- חלץ mRNA מן התא גלולה בשיטת החילוץ thiocyanate-פנול, כלורופורם guanidinium 11.
- להגביר cDNA מ 2 מיקרוגרם של ה- mRNA הכולל שימוש שעתוק לאחור 11.
- מערבבים את הרכיבים הנדרשים עבור ה- PCR באמצעות 2 μl של TEM cDNAצלחת 11.
- בצע RT-PCR ולאמת את התוצאות על ידי ג'ל אלקטרופורזה 11.
5. אלקליין phosphatase (AP) מכתים
- IPSCs תרבות 5-7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפני מכתים.
- לשאוב התקשורת לתקן את התאים עם 4% PFA דקות 1.
- מחק את מקבע ולשטוף את התאים עם חיץ שטיפת 1X.
- הכן את ריאגנטים עבור מכתים AP. מערבבים את ריאגנטים היחס הבאים: Fast האדום ויולט: Naphthol פתרון פוספט AS-BI: מים = 2: 1: 1.
- דגירת התאים עם הפתרון המכתים ב RT במשך 15 דקות, הימנעות אור.
- מחק את הפתרון מכתים ולשטוף את התאים עם חיץ לשטוף.
- לכסות את התאים עם PBS כדי למנוע התייבשות ולוודא ביטוי באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול ליצור iPSCs מ FLSs באמצעות מערכת lentiviral. איור 1 א מציג תוכנית פשוטה של פרוטוקול בידוד FLS. בעקבות הסרה כירורגית של synovium, הרקמה היה קצוץ לחתיכות קטנות באמצעות מספריים כירורגיות. Collagenase התווסף לבודד את התאים מן הגושים של רקמות. תאי הודגרו במשך 14 ימים לפני עיבוד נוסף. 1B האיור מראה את המורפולוגיה של FLSs המבודד. תאים נשמרו למשך 3 קטעים לפני השימוש. FLSs לשתף מאפיין דומה עם פיברובלסטים בכלל. FLSs המבודד שלנו והביע סמנים פיברוטיים, vimentin ו פיברונקטין. FLSs RA מבודד גם הראה ביטוי נמוך של סמן synoviocyte כמו-מקרופאג, CD68 (איור 1 ג).
FLSs נקצרו transduced עם lentiviruses המכיל 4 יאמהNaka גורמים לתכנות מחדש. לאחר פיצול התאים ב יחסים שונים (D7), מושבות קטנות החלו להופיע. מושבות גלויות, כפי שניתן לראות בתרשים 2A, שנראות בעת D8-11. מושבות ניתן לאסוף מנקודה זו. איור 2B מראה תמונה של מושבה הרים ומוגברת.
iPSCs הורחב עד מעבר 5-10 ולאחר מכן השתמש ב מבחנים שונים. ESCs המובחן מאופיינים ברמה גבוהה של AP. תאים הוכתמו עבור AP כדי לאשר את המדינה המובחנת. RA-iPSCs הביע AP (איור 2 ג), מציין הם מובחנים. ביטוי סמן פלוריפוטנטיים נבדק (2D איור, E). הביטוי של סמני pluripotent כגון Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28, DPPB5 ו TDGF1 אושר באמצעות RT-PCR (איור 2 ד). הביטוי של Oct3 / 4, Sox2 אושר גם על ידי immunofluorescencenalysis עם סמנים נוספים כגון SSEA4, TRA-1-60, tra-1-81 ו Klf4. TRA-1-60, אשר נחשב כיום להיות סמן iPSC החשוב ביותר, בא לידי ביטוי מאוד iPSCs שנוצר שלנו.
לניתוח נוסף, ביצענו karyotyping ו assay תפלצת רוחנית. RA-iPSCs הראו דפוס כרומוזומליות נורמלי של 44 + XY (איור 3 א). הזרקת 12 שבועות פוסט-RA-iPSCs לעכברי SCID, teratomas יצר ומוצגת רקמות מגוונות, כגון בלוטה, רקמת שומן וכלי דם (איור 3 ב). בידול השכבה ניבט אושר גם דרך מכתים immunofluorescence. תאי שושלת האאקטודרם הוכתמו חיוביים עבור Otx2. תאי mesodermal הביעו brachyury, ו endoderm אושר על ידי מכתים חיובי של SOX17.
איור 1: Protocol בידוד FLS מחולת RA. (א) תרשים פשוט של השיטה לבידוד synoviocyte. (ב) מורפולוגיה של FLSs המבודד. (C) פלואורסצנטי מיקרוסקופיה תמונה של FLSs מוכתם vimentin סמנים פיברוטיים, פיברונקטין ועם סמן synoviocyte דמוי מקרופאג, CD68. כל הברים בקנה המידה = 200 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הדור של iPSCs מ FLSs שבודד מחולה RA (א) התמונה מוארת שדה של המושבה iPSC לפני לקטוף.. (ב) תמונה של מושבה לאחר קטיפתם. (C) מושבה מוכתמת עבור AP. (ד) PCR ניתוח oסמנים פלוריפוטנטיים f. (E) פלואורסצנטי מיקרוסקופיה תמונה של iPSCs. IPSCs שנוצר הביע כל הסמנים פלוריפוטנטיים. כל הברים בקנה המידה = 200 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ניתוח קריוטיפ ו teratoma Assay (א) ברזולוציה גבוהה תמונות G-רצועה מראה karyograms נורמלי של iPSCs.. התמונה מייצגת תוכן כרומוזומליות זכר דיפלואידי נורמלי 46XY. (ב) תוצאות של מבחני teratoma והכתים immunofluorescence. כל הברים בקנה המידה = 200 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לפני גילוי iPSCs, מדענים משמשים בעיקר ESCs ללמוד ביולוגית גזע תא שושלות תאים אחרות באמצעות בידול. עם זאת, ESCs מקורן המסה הפנימית של הבלסטוציסט, המהווה העובר בשלב מוקדם. כדי לבודד ESCs, הרס של הבלסטוציסט הוא בלתי נמנע, העלאת סוגיות אתיות כי ניתן להתגבר. יתר על כן, למרות שיש ESCs מאפייני stemness ו pluripotency, הם לא יכולים לקבל מיחידים הם לפעמים לא כלי אידיאלי לניתוח אישי והקרנת מחלה.
בשנת 2007, טקהאשי et al. iPSCs המופק פיברובלסטים אדם 2. באופן תיאורטי, בניגוד ESCs, iPSCs ניתן להפיק מכל תאים סומטיים מבוגר. עם היתרון הזה, iPSCs נחשב לכלי האידיאלי להשתלה אוטומטית תאים. כמו כן, עם הרעיון של זיכרון אפיגנטיים, iPSCs נחשב חומר התא האידיאלי עבור הסימולציה של תנאי פתוגניים, כלומר. מודלי מחלה. נעשו מחקרים רבים נעשה שימוש בסוגים שונים של תאים כמו תאי דם, תאי שתן ועוד. עם זאת, ישנם סוגים רבים של תאי, כגון FLSs, שבה תכנות מחדש לא נערכו.
מחלות מפרקים הן פרעות חיסוניות גדולות שיכול לגרום נכות צמיתה. RA נגרמת על ידי דלקת כרונית במפרקים, בסופו של דבר resultimg נזק העצם והסחוס. קשה לרפא או לתקן את הנזק בעיקר בגלל הסחוס לא יכול להתחדש in vivo. לכן iPSCs באמצעות רפואה רגנרטיבית הם כלי קריטי חדש עבור תרופה של RA. ההפסד העצם והסחוס הוא הביא גם במבנה pannus. Pannus הוא מבנה דמוי קרן שניתן לראות בתמונה היסטולוגית של המפרק. Pannus נעשית על ידי FLSs כי להתרבות ללא הגבלה כמו תאים סרטניים. לכן, הוא חשב כי FLSs יכול לשקף את המאפיינים הפתולוגיים של המחלה. במחקר זה, השתמשנו חולה FLSs ליצור iPSCs.
FLSs הם סוג התאים העיקריים שתורמים בפתוגנזה של RA. כתא כי הוא חשוף בעיקר לסביבה הדלקתית בתוך מפרק סינוביאלי, הקבוצה שלנו חשבה שהוא יכול לשמש כחומר המשקף את מצב המחלה של המטופל. לכן, בשיטת תכנות מחדש המוקדם, ניסינו ליצור iPSCs RA-ספציפיים FLSs, באמצעות משלוח של 4 יאמאנאקה גורמים - Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc - ידי lentivirus. FLSs נותקו מן synovium שהוסר. הקיצוץ של synovium היה קריטי כאשר לבודד FLSs. שאריות עצם ושומן יכול לעשות את זה יותר מסובך להשיג FLSs טהור. כמו כן, השימוש של collagenase הוא בלתי נמנע עבור בידוד FLS. חשוב להשתמש בתאים בין קטעי 3-8. כאשר FLSs להגיע מעבר 3, גורם יאמאנאקה המכיל lentiviruses נוצר בעקבות ההליך המוזכר העבודה הקודמת שלנו 11. שימוש lentiviruses מיוצרiPSCs, שעוררנו בהצלחה הנגזרת FLS RA (RA-iPSCs). שיבוטים טהורים iPSC נוצרו בשיטת קטיף מושבה. RA-iPSCs הביע כל סמני השעתוק פלוריפוטנטיים והיה לו קריוטיפ נורמלי. יתר על כן, RA-iPSCs הצליח להתמיין כל שלוש שכבות ניבטו פי assay התפלצת הרוחני. כמו כן, יש לנו אישר כי RA-iPSCs הראה יותר מינרליזציה כאשר מובחן לתוך שושלות osteogenic במבחנה (מידע לא מוצג) 11.
עם זאת, ישנן מספר מגבלות לשיטה זו. Lentiviruses דורש אינטגרציה הגנומי לתכנות מחדש. KLF-4 ו- c-Myc הם אונקוגנים ושני אלה גורמים יאמאנאקה יכול להקל את צמיחת הגידול in vivo. לכן, זה לא יכול להיות אידיאלי לשימוש הגורמים הללו כדי ליצור חומרים עבור יישומים קליניים. יתר על כן, FLSs ו פיברובלסטים העור הם לא קשה להשיג במרפאות. כמצוין בדיווחים שונים, פיברובלסטים עור (כלומר dermaפיברובלסטים l) יכולים להיות מושגת רק על ידי ביופסיות אגרוף. FLSs ניתן לבודד רק באמצעות הליך כירורגי פולשני ניתוח זה מבוצע על חולים עם היפרפלזיה חמור שעבר ניתוח בברך. לכן, אין צורך להשתמש FLSs כאשר תכנות מחדש iPSC הלא-RA. בנוסף, התהליך שבו פיברובלסטים ערוכים לתכנות מחדש קשה ונדרש זמן רב. FLSs לשתף את החסרונות זהים פיברובלסטים עור. לכן, מקורות סלולריים, כי הם יותר קלים לטפל ולקבל נדרשים.
מסיבה זו, חוקרים החלו לחפש מקור תא חלופי. חומר המשמש כיום הוא תאי דם. יקל לצייר דם ואת תהליך הבידוד הוא יחסית פשוט ומהיר. יתר על כן, יש שינוי משימוש lentiviruses לכלים שאינם דורשים אינטגרציה הגנום, כגון מערכות ויראלי סנדאי, מולקולות קטנות, ו פלסמידים episomal.
למרות FLSs לא יכול לשמשחומר עבור אנשים שונים, זה עדיין חומר רב בעת יצירת RA-iPSCs למטרות מחקר. בעתיד, אנו מחפשים ליצור בנק iPSC נגזר FLS חולה RA. חולי RA בנפרד להראות תגובות מגוונות לתרופות המשמשות לטיפול. עם כמה שורות של iPSCs RA, אנו מקווים ליצור תא בנקאי ההקרנה סמים לחולי דלקת מפרקים שגרונית. על ידי הקרנת כל התרופות על כל קו התא, אנו עשויים להיות מסוגלים לחזות אילו סמים יעבוד שעליו המטופל.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את היישום של טכנולוגית iPSC כדי ראומטולוגיה. עם פרוטוקול זה, iPSCs יכול להיווצר מדלקת מפרקים החולה הנגזרות FLSs, ואת iPSCs שנוצר יש את התכונות הנדרשות. iPSCs אלה יכולים לשמש במחקר קליני, ההקרנה סמים, דוגמנות המחלה, ורפואה רגנרטיבית עבור חקירות נוספות של הביולוגיה של RA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
