Summary
在这里,我们描述了从患者来源的成纤维细胞样滑膜细胞产生的诱导的人多能干细胞,使用慢病毒系统无饲养细胞的协议。
Abstract
成熟的体细胞可以使用一组已定义的重编程因子被逆转成多潜能干细胞样的状态。的Oct4,Sox2的,Klf4的和c-Myc:大量的研究已经通过转导4山中转录因子产生的各种体细胞类型的诱导多能干细胞(iPS细胞)。 iPS细胞的研究仍然是生物学和临床研究的前沿。特别是,患者特异性iPSCs的可以被用作疾病病理学的研究开拓工具,因为iPSCs的可以从任何个体的组织进行诱导。类风湿关节炎(RA)是一种慢性炎性疾病,软骨和骨结构中的关节的破坏分类。滑膜增生是导致这些结果在RA中的主要原因或症状之一。成纤维细胞样滑膜细胞(FLSS)是在增生的滑膜的主要成分的细胞。 FLSS在合资无限增殖,最终侵入相邻cartil年龄和骨骼。目前,增生性滑膜只能通过外科手术去除。移除的滑膜用于RA的研究作为反映关节的炎性病症的材料。如在RA的发病机理的主要参与者,FLSS可用作一种材料,以产生并调查RA患者的iPSCs的。在这项研究中,我们使用了RA患者的FLSS产生的iPSC。使用慢病毒系统,我们发现FLSS可以生成RA患者特异性的iPSC。从FLSS产生的iPS细胞可以进一步用来作为一种工具来研究RA的病理生理的未来。
Introduction
多能性干细胞是在不同的临床和生物领域的下一代平台。它们是一种很有前途的工具,可以在疾病建模,药物筛选,并再生医疗治疗中使用。人类胚胎干细胞(胚胎干细胞)主要用于研究和理解多能细胞。然而,由人胚泡的破坏分离,人类胚胎干细胞与几个伦理问题相关联。 2007年,山中伸弥博士和他的团队逆转细胞编程过程和成人的体细胞1,2开发干细胞。因此,与人类胚胎干细胞,诱导多能干细胞(iPS细胞),可以从成熟的体细胞中产生,避免了伦理障碍。
的Oct4,Sox2的,Klf4和c-Myc的:通常,由四个外源基因递送产生的iPSC。这些因素山中正在使用慢病毒和逆转录病毒系统最初交付。第一iPS细胞是从鼠体细胞衍生Ç厄尔3。然后,将技术应用于人皮肤成纤维1,2。随后的研究成功生成从各种来源,如尿4,血液5,6- iPSCs的,角质7和其他一些类型的细胞。然而,也有没有在重新编程中使用的一些体细胞,并从在疾病状态特异组织的各种细胞类型的重新编程能力筛选,仍然需要。
类风湿关节炎(RA)是一种可以攻击所有关节,并导致在其他器官自身免疫疾病的疾病。 RA影响在发达国家成年人约1%。这是一种相当常见的疾病和其发病率逐年增加8。然而,RA是很难在早期识别和摧毁oncebone发生没有治疗,可以恢复的损害。此外,药物的功效,从患者的不同而不同病人,这是很难预测的军医所需INE。因此,药物筛选方法的开发是必要的,并且需要能反映RA的条件的细胞的材料。
成纤维样滑膜(FLSS)均在9,10 RA发病的积极参与者的细胞。 FLSS在关节囊和腔,其也被称为滑膜之间滑膜内膜衬里存在。通过支持接头结构和周围软骨提供营养,FLSS通常发挥关节功能和维护了至关重要的作用。然而,在FLSS RA具有侵入性的表型。 RA FLSS有一个肿瘤样表型,最终被无限增殖10摧毁了周围的骨骼。这种独特的特性,FLSS可以用作一个有前途的材料,可反映RA的病理生物学。然而,这些细胞很少产生,细胞表型改变的细胞经过在体外几段
从理论上讲,RA患者来源的iPS细胞(RA-iPSCs的),可以成为药物筛选和进一步研究的理想工具。产生的iPSC具有自我更新的能力,并且可以保持和体外扩展。与多能性,这些细胞可以分化为成熟软骨细胞和骨细胞谱系,其可为在RA和其它骨相关疾病11具体的研究有助于细胞材料。
在这项研究中,我们将演示如何隔离和从手术切除滑膜,以及如何扩大FLSS使用含有山因素慢病毒从FLSS产生RA-iPSCs的。
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Protocol
伦理学声明:本研究方案被批准由韩国天主教大学(KC12TISI0861)的机构审查委员会。
1.滑膜细胞分离和扩增
- 隔离滑膜
- 消毒2双手术剪和一对钳。
- 转移滑膜组织到100mm皿并用含有1%青霉素/链霉素5毫升磷酸盐缓冲盐水的(PBS)中洗涤。
- 切断淡黄色脂肪组织和骨的残基。转移修整组织到一个6孔板的孔中加入5 ml Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM),用20%胎牛血清(FBS)的。
- 剁用剪刀组织直至件小到足以穿透一次性吸。
- 含组织媒体传送到50ml锥形管中。通过加入5ml DMEM中,用20%的FBS的6孔板收获剩余的材料,然后转移到管中。</ LI>
- 在冰上解冻胶原酶。添加胶原酶到0.01%的终浓度和密封用封口膜的管。孵育在水浴在37℃振荡4小时。
- 温育后,填充有20%FBS的DMEM管,直到总体积为50 ml和离心机在300 xg离心,室温10分钟。
- 不干扰沉淀除去上清液并加40毫升培养基重悬沉淀。
- 重复步骤1.1.10-1.1.11。
- 重悬在25毫升的DMEM的沉淀,用20%FBS和等待组织的大的团块,以沉底。
- 将上清转移至100毫米培养皿,并在5%CO 2在37℃下孵育14一天。
- 滑膜维护和扩展
- 丢弃从板的使用的媒体,并用5毫升的PBS洗细胞。
- 添加1ml的PBS / 1mM EDTA中,并在5%CO 2在37℃下孵育2分钟。
- 轻轻点击菜和transfer中的细胞到15毫升锥形管中。离心细胞,在250 xg离心,室温2分钟。
- 不干扰沉淀除去上清液和重悬沉淀在30ml DMEM中,用20%的FBS。
- 转移细胞以3×100毫米培养皿,不留任何可见的边角料。
- 新鲜传媒每3天更换介质。分裂细胞以用1ml的PBS / 1mM EDTA中80%汇合。保持,直到使用之前3代。分裂细胞的每道菜到每分3菜肴。
注:到达通道3后,即不会立即使用的细胞可以被冷冻。
2.重新编程FLSS使用编码慢病毒,山因素
- 转导(D0)
- 每在生长培养基的6孔板的种子3×10 4细胞(500毫升DMEM中补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素)。孵育细胞O / N在37℃下在5%CO2。
- 次日,除去含有4山因子慢病毒之一小瓶:Oct4的,Klf4的,Sox2的和c-Myc从冷冻和解冻,在4℃。注意:慢病毒通过在我们以前的研究11中描述的方法产生的。
- 而解冻病毒,更改(在DMEM 20%胎牛血清加抗生素)含有10微克/毫升聚凝胺和50微克/毫升抗坏血酸媒体FLS生长培养基。
- 更换介质后,加入30微升慢病毒的细胞,轻轻混匀。以提高感染,在680 XG,35℃30分钟离心板。
- 离心后,孵育细胞在37℃下在5%CO 2。
- 维护直到重新编程可见
- 为第3天,用含有0.1毫丁酸钠和50微克/毫升抗坏血酸FLS培养基每天更换介质。
- 第二天,与FLS生长培养基的混合物代替媒体和含有0.1mM丁酸钠和50微克/毫升抗坏血酸:(1比1)的iPSC介质。
注意:iPSC的介质的组分中的材料/设备列表中给出。
- 拆分单元格的集落形成
- 制备玻连蛋白包被的6孔板中。
- 加入60微升玻〜6毫升的PBS无钙+和Mg2 +。放2毫升混合物到每个孔中,并在室温下孵育至少1小时。注意:玻连蛋白的工作浓度为5微克/毫升。
- 上D5,洗涤细胞,用PBS。
- 添加1ml的PBS / 1mM EDTA中分离细胞,并在37℃,5%CO 2孵育2分钟。
- 收获细胞,离心,在250 xg离心,室温2分钟。
- 分裂的细胞以3个不同的比例(1:3,1:6和1:9),以实现不同的汇合。添加900微升的媒体向细胞沉淀重悬。每孔中添加6- 300,150,和100微升细胞混合物的孔板来实现的比率为1:3,1:6和1:9,分别。
- 直到克隆出现与媒体的iPSC每天更换介质。关于D18菌落后会出现。注意:在此阶段,的iPSC集落共存与非重新编程FLSS。
- 制备玻连蛋白包被的6孔板中。
- 殖民地采摘
- 通过加入500微升玻连至孔准备48孔玻连蛋白包被的板,并在室温下孵育至少1小时。
- 放置一个净化台显微镜,并从培养箱取出6孔板。
- 从48孔板中除去玻连蛋白溶液,并添加补充有含10mM的Rho相关,卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)抑制剂500微升的iPSC介质。
- 用10便士的枪头,切断周围的殖民地。传送所拾取菌落至48孔板的一个孔中。
- 采摘几个菌落后,孵育细胞在37℃,5%的CO 2。
- 维持细胞直到菌落大ENO唉转移。注意:我们通常洒细胞时菌落失控显微镜的可见领域,当在100X放大率的观看。
3.免疫荧光染色
- 细胞的制备
- 放置无菌18毫米盖玻片至12孔板中。
- 加入1毫升的PBS以冷却和冲洗玻璃盖。
- 用1毫升10微克/毫升玻连蛋白溶液的更换。
- 孵育在室温的板至少1小时。
- 弃去玻连蛋白溶液和板的iPSC在玻连蛋白包被的12孔平板并培养7天,在37℃,5%CO 2,每日更换介质。
- 细胞染色
- 弃去培养基,用PBS洗细胞一次。
- 固定在0.4%多聚甲醛(PFA)将细胞在室温30分钟。
- 透用0.1%的Triton X-100将细胞在室温下5分钟。
- 取出透溶液和块与含有2%牛血清白蛋白(BSA)在室温30分钟的PBS。
- 稀释按表1含2%BSA的PBS中的抗体。用在RT 2小时的初级抗体孵育的细胞。
- 添加二次抗体(稀释1:200),孵育所述细胞在室温下1小时,以避免光。
- 处理细胞用1微升/毫升的DAPI 10分钟。
- 放置在载玻片与抗淬灭剂的顶部的盖玻璃,并在室温下孵育24小时,避光。
- 验证用荧光显微镜表达。
4.实时聚合酶链式反应(RT-PCR)
- 使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法11细胞沉淀中提取的mRNA。
- 使用反转录11总RNA 2微克扩增基因。
- 混合使用2微升cDNA的统的用于PCR所需的组件板11。
- 进行RT-PCR和验证通过凝胶电泳11的结果。
5.碱性磷酸酶(AP)染色
- 培养的iPSC 5-7天,在37℃,5%CO 2的前染色。
- 吸媒体和修复用4%PFA的细胞1分钟。
- 丢弃固定液和冲洗用1X冲洗缓冲细胞。
- 准备AP染色试剂。混合试剂在下列比率:快速红紫:酚AS-BI磷酸酯溶液:水= 2:1:1。
- 孵育在室温染色溶液15分钟的细胞中,避光。
- 丢弃染色液和冲洗用漂洗缓冲液将细胞。
- 覆盖细胞用PBS以防止干燥,并用明场显微镜验证表达。
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Representative Results
在这项研究中,我们描述了一种协议使用的慢病毒系统生成从FLSS的iPSC。 图1A示出了FLS隔离协议的一个简单的方案。继手术切除滑膜,组织被切成采用手术剪小块。加入胶原酶向细胞从组织的团块隔离。细胞进一步处理前温育14天。 图 1B示出的分离的FLSS的形态。细胞保持在使用前3的通道。 FLSS共享一般的成纤维细胞的类似特性。我们孤立FLSS表示纤维化指标,波形蛋白和纤维连接蛋白。分离的RA FLSS也显示了巨噬细胞样滑膜细胞标记物,CD68( 图1C)的低表达。
FLSS收获并用含慢病毒4山转纳卡因素重新编程。在各种比例(D7)分裂的细胞后,小菌落开始出现。可见菌落, 如图2A所示 ,出现在D8-11。菌落可以从该点被拾取。 图2B示出一个拾取和扩增菌落的图像。
iPS细胞扩增,直到通道5-10,然后在不同的测定中使用。未分化的胚胎干细胞是由高水平AP的特征。细胞染色为AP以确认未分化状态。 RA-iPS细胞表达的AP( 图2C),这表明它们是未分化的。多能性标志物的表达进行了检查( 图 2D,E)。利用RT-PCR( 图2D)多能性标志物例如的Oct3 / 4,SOX2,Nanog的,LIN28,DPPB5和TDGF1的表达证实。的Oct3 / 4的表达,Sox2的也被免疫已确认nalysis具有附加标记如SSEA4,TRA-1-60,TRA-1-81和Klf4。 TRA-1-60,这是目前被认为是最重要的IPSC的标记物,在我们所产生的iPSC中高表达。
为了进一步分析,我们进行了染色体核型分析和畸胎瘤检测。 RA-iPS细胞表现出44 + XY( 图3A)的正常染色体图案。 12周的后补喷射的RA-iPS细胞的入SCID小鼠,畸胎瘤已经形成并显示不同组织,如腺,脂肪组织和血管( 图3B)。该胚层分化还通过免疫荧光染色证实。外胚层系细胞染色阳性的OTX2。中胚层细胞中表达的Brachyury,和内胚层用SOX17阳性染色确认。
图1:ProtocOL用于从RA患者隔离FLS(A)用于滑膜隔离方法的简单示意图。孤立FLSS( 二 )形态。 (C)荧光显微镜FLSS的形象染有纤维化指标波形蛋白,纤维连接蛋白和巨噬细胞样滑膜细胞标记,CD68。所有比例尺= 200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2:FLSS从RA患者分离的iPS细胞的生成采摘之前的iPSC细胞集落的(A)亮场图像。 ( 二 )采后殖民地的形象。 (C)菌落染色AP。 ( 四 )PCR分析Ø˚F多能性标记。 (E)荧光显微镜iPS细胞的形象。生成的iPS细胞表达所有的多能性标记。所有比例尺= 200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3:核型分析和测定畸胎瘤 (A)高分辨率G-band的图像显示出iPS细胞的正常karyograms。该图像代表46XY正常二倍体男性染色体的内容。畸胎瘤检测和免疫荧光染色的(B)的结果。所有比例尺= 200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
iPS细胞的发现之前,科学家主要用于胚胎干细胞通过差异化来研究干细胞生物学和其他细胞系。然而,胚胎干细胞从胚泡,这是一个早期胚胎的内质起源。为了分离胚胎干细胞,囊胚破坏是不可避免的,提高是不可能克服的伦理问题。此外,尽管胚胎干细胞具有干性特征和多能性,它们不能从个体获得的,并且有时不进行个性化的分析和疾病筛查的理想工具。
在2007年,高桥等人 。从人成纤维细胞2产生iPS细胞。理论上,与胚胎干细胞,可从任何成年体细胞产生的iPSC。用这一优势,iPS细胞被认为是为自动细胞移植的理想工具。另外,对于后生存储器的概念,iPS细胞被认为是对致病条件, 即在模拟的理想的材料。疾病模型。已经有许多研究使用各种细胞,如血细胞,尿细胞和更多的完成。然而,还有许多类型的细胞,如FLSS,其中重新编程尚未进行。
关节炎疾病是主要的免疫功能紊乱,可导致永久性残疾。 RA是由慢性炎症在关节引起的,最终在骨和软骨损伤resultimg。这是很难治愈或逆转损伤特别是因为软骨不能在体内再生。因此,再生医学使用iPS细胞是RA的治疗了新的重要工具。骨和软骨损失也导致血管翳形成。血管翳是一个喇叭状结构可在关节的组织学图像中看到。血管翳是由无限增殖像癌细胞FLSS的。因此,它被认为是所述FLSS能反映该疾病的病理特征。在这项研究中,我们使用病人FLSS生成iPS细胞。
FLSS是导致RA的发病机理中的主要细胞类型。作为被大多暴露在滑膜关节内的炎症环境的细胞,我们的基认为它可以用作反映患者的疾病状况的材料。因此,使用的最早重新编程的方法,我们试图产生从FLSS特定RA-iPS细胞,使用4山的递送因子 - 的Oct3 / 4,Sox2的,Klf4的和c-Myc - 慢病毒。 FLSS从该除去滑膜隔离。隔离FLSS时滑膜的微调是至关重要的。骨和脂肪残留物会使其更加复杂获得纯FLSS。此外,使用胶原酶是不可避免的FLS隔离。使用传代3-8之间的细胞是重要的。当到达FLSS 3代跟随在我们前面的工作11提及的过程中产生含有慢病毒的山中伸弥的因素。使用所产生的慢病毒,我们成功地生成RA滑膜衍生的iPS细胞(RA-iPS细胞)。由殖民地采摘方法生成纯的iPSC克隆。在RA-iPS细胞表达所有的多能性转录标记和有一个正常的核型。另外,RA-iPS细胞能够根据畸胎瘤测定分化成所有三种胚层。此外,我们已经证实,当在体外分化为成骨谱系的RA-iPS细胞表现出更多的矿化(数据未示出)11。
但是,也有以这种方法有一些限制。慢病毒需要重新编程基因组整合。 KLF-4和c-Myc是致癌基因和这两个山因素可促进体内肿瘤生长。因此,它可能不是很理想,以利用这些因素以产生用于临床应用的材料。此外,FLSS和皮肤成纤维细胞都不难获得在诊所。在各种报道,皮肤成纤维细胞中提到( 即真皮升成纤维细胞)只能通过钻取活检获得。 FLSS只能通过侵入性手术过程中分离出来,并在患者谁经历膝关节手术严重增生进行这种手术。因此,没有必要重新编程的非RA的iPSC时使用FLSS。另外,通过该成纤维细胞重编程制备的过程是困难的和费时的。 FLSS共享相同的缺点为皮肤成纤维细胞。因此,需要细胞来源是容易处理,将获得。
出于这个原因,研究人员已经开始寻找替代细胞源。当前使用的材料是血细胞。这是很容易抽血和隔离工艺相对简单和快速。此外,还有从使用慢病毒向不需要基因组的整合工具,如仙台病毒系统,小分子,和附加型质粒的转移。
虽然FLSS不能用作针对不同个人的物质,它产生RA-iPS细胞用于研究目的时,仍然是一个巨大的物质。在未来,我们正在生成RA患者的FLS衍生的iPSC银行。 RA患者个别显示到用于治疗的药物不同的反应。随着RA iPS细胞的几行,我们都希望能产生RA患者的药物筛选细胞银行。通过筛选对各细胞系的所有的药物,我们可以能够预测哪些药物将在其上个别病人工作。
总之,本协议描述的iPSC技术来风湿病的应用程序。与此协议中,可以从RA患者来源FLSS生成的iPSC,和所产生的iPSC具有所需的特性。这些iPS细胞可以在临床研究中,药物筛选,疾病建模和再生医学为RA的生物学的进一步调查使用。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mm Dish | TPP | 93100 | |
6-well Plate | TPP | 92006 | |
50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
12-well Plate | TPP | 92012 | |
FLS Isolation Materials | |||
Surgical Scissors | |||
Surgical Forcep | |||
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
iPSC Generation Materials | |||
DMEM | Life Technologies | 11885 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
Lentivirus | |||
DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Guality Control Materials | |||
18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
loading star | Dyne Bio | A750 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
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