Introduction
神経損傷では、近位および遠位の神経断端はしばしば病変部位1-2に神経繊維束の直接の再編が防止されます。通常、軸索路は、接続の複雑なネットワークを形成する軸索の高度に秩序と整列束で構成されています。しかし、神経再生は不十分編成軸索整列3-4による無秩序なプロセスです。したがって、損傷部位を埋める軸索再生の十分な数を生成するためには、よく組織軸索整列を誘導することが必要です。さらに、脱髄は、損傷部位でのミエリン形成細胞の死による神経損傷を伴います。脱髄が強く軸索の生存導電容量を損なうので、脱髄をターゲットまたは再ミエリン化を促進する治療は、神経損傷5後の機能回復のために重要です。したがって、このプロトコルの目的は、これらの2つの問題に対処する工学的手法を説明することです神経再生の。
材料の物理的又は機械的性質に、異なる軸に沿って測定したとき、差として定義される面の異方性は、セルの配置、増殖、および遊走6-7に影響を与えるために適用されています。地形に加えて、異方性を誘導する他の方法があります。以前、我々は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）膜の機械的静的プレストレッチによって誘発される表面異方性を調べました。 「小変形超大規模に課さ」の理論は、細胞が延伸方向に感知有効剛性は、垂直方向と異なり、有効剛性の違いは、表面異方性8によるものであること。予想しました予備延伸PDMS膜上で培養した間葉系幹細胞（MSC）は、積極的に表面を引っ張ることにより、結果として異方性を感知する事前延伸方向9に整列することができます。同様に、異方性表面AR機械的な事前延伸表面からイジングすると、アライメントに影響を与えるだけでなく、後根神経節（DRG）の成長と髄鞘形成は、10を軸索。ここでは、軸索再生10を強化するために、静的な事前延伸PDMS基板上の表面異方性を誘導するためのプロトコルを提供します。
軸索アライメント、目的のパターンを持つ地形的特徴を引き出すために、整列した繊維およびチャネル6,11-12を通じて接触ガイダンスを提供することが報告、軸索アライメント11,13を容易にするために実証されました。しかしながら、そのような繊維、チャネルおよびパターニングなどの地形的特徴を介して軸索整列を誘導するための技術が報告され、長く及び軸索の厚さを増加させることができませんでした。これとは対照的に、ストレッチング緩やかな機械的ストレッチ14の大きさに伴って増加長く、太く軸索との延伸方向における軸索アライメントにつながりました。しかしながら、 インビボでの電力供給のモータ装置を搭載することはありません実現可能。対照的に、静的な事前延伸誘導異方性は、より複雑で、より容易にインビボ用途のための将来の足場の設計に組み込むことができます。
このプロトコルでは、静的な事前延伸細胞培養系は、トポロジー特徴なし表面異方性を誘導するために使用されます。膜は、フレームに固定され、所定の伸びの大きさは、延伸ステージに適用されるところの事前延伸培養系は、PDMS膜、伸縮フレーム延伸ステージで構成されています。最大21日間の事前延伸表面上で培養新たに単離したDRGニューロンは軸索のアライメントおよび厚さのために監視されています。続いて、シュワン細胞（SCS）整列軸索と共培養は、髄鞘形成のために監視されます。プレストレッチ誘発される表面異方性を組み込むことによって、私たちはそれぞれ、MSCおよびDRGニューロン9-10のセルアライメント分化と軸索配向成長を促進することができました。
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Protocol
細胞の単離のためのすべての手順は、ミシガン州立大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
前延伸異方性表面の調製
- 塩基及び硬化剤の1液及び組織培養皿（直径12cm）中に混合物を注ぐ：10を混合します。 4900 mgのベースと合計架橋混合物のための490 mgの硬化剤を使用してください。
- 気泡を除去するために20分間真空下でゲル混合物を保管してください。
- 60℃で一晩硬化のためにオーブンでゲル混合物を置きます。
- PDMS膜が硬化した後、165ミリトルで3分間及びO 2の65 SCCMフローのプラズマ洗浄/エッチングシステムを使用して酸素プラズマを用いて表面を処理します。
- 皿から長方形のメンブレン（5×3.5センチメートル）の一部をカットし、酸素処理されている側認識しながら、必ず酸素処理された面を上に、延伸フレームに固定されていることを確認。上のフレームを配置ステージをストレッチし、均等に、それは10％の伸び率に達するまでステージ上のノブを回してストレッチ（またはいくつかの他の予め定められたストレッチを、伸びが直接、延伸段階から読み取ることができます）長軸9に。フレームのネジを締めて、ストレッチを修正しました。
- ステージからフレームを削除します。膜表面が乾燥し、ほこりのないことを確認し、その後、チャンバーの粘着面が膜に強固に取り付けることができるようにメンブレン上にシリコーン室を配置します。
注：シリコーン室は、PDMS膜上の細胞培地を保持するための十分を提供します。装置の設計は、 図1に示されています。 - 10分間UVで表面を滅菌します。
- 追加1 mlのポリ-L-リジンプラズマ処理の6時間以内にチャンバー内PDMS表面に（PLL）（リン酸緩衝生理食塩水0.01％）、および37℃で2時間インキュベートDRGニューロンを播種する前に。これは、細胞接着を増強します。
- DRGニューロンのための標準的な増殖培地を準備します。
- 分離前に、分離装置とフィルタ試薬をオートクレーブ。 6ウェルプレートの1ウェル中に分離緩衝液5mlを追加し、氷上にプレートを置きます。 0.05％トリプシン-EDTA（1mg / ml）の9ミリリットルにコラゲナーゼA（500 U / ml）を1ミリリットルを追加することにより、解離培地10mlを用意し、氷上で0.22μmフィルターと場所とのソリューションをフィルタリングします。
- 単離のために7日間の齢のSprague-Dawleyラット - 10 5〜12を使用してください。 75％イソプロパノールで子犬をスプレーし、断頭により犠牲に。
- 背中から脊髄を覆う皮膚を切り取ると、背骨の周りの余分な組織を除去します。上の外科手術用のスポットライトが付いている外科手術用ルーペの下では、首から最初の切開を行い、その後、ハサミで両側の背骨に沿ってカット。仔の身体から背骨を外し、過剰な筋肉を取り除きます。その後、経度に沿って切断するはさみを使用して脊椎および使用ピンセットのG軸は完全に脊椎を開いて滅菌15mlチューブに分離緩衝液でのDRGを転送するための大きな開口部を作成するために、ピペットから脊髄cord.Removeに先端を抽出します。
- ピンセットの罰金ペアを使用して、骨のポケットから神経節を除去し、約10収集 - 両側から16 DRGを。神経根をトリムし、氷冷分離バッファに神経節を移します。
- 滅菌15ミリリットルチューブに分離バッファでのDRGを転送するための大きな開口を作成するために、ピペットからヒントを削除します。化学解離した後、5分間900×gで4℃で遠心神経節を。
- 組織は、チューブの底に沈殿し、そっと上に単離緩衝液を除去し、チューブに解離培地10mlを追加してみましょう。
- 10分 - チューブごと5を振とうしながら1時間、37℃の水浴中で解離培地中で解剖した組織をインキュベートします。
- 後の5分間900×gで4℃での化学的解離、遠心神経節。
- 上清を除去し、10ミリリットルの標準的な成長培地、ボルテックスでペレットを再懸濁。
- 再び2.9節に示されているように解離した細胞を遠心します。
- 上清を除去し、標準的な増殖培地と渦の12ミリリットル中にペレットを再懸濁します。
前延伸表面上のDRGの3文化
- 、細胞を播種チャンバーからPLLソリューションを除去し、滅菌水と空気乾燥でPDMS表面を洗浄する前に。
- 2分の残骸がチューブの底に沈殿することを可能にするために - 細胞を再懸濁した後、1用のサスペンションセットができます。各ストレッチチャンバ内に細胞懸濁液1.5 mlを加え、5％CO 2で37℃でインキュベートします。
- 10μlの（または15μl）をフルオロ-2-デオキシウリジンおよびウリジン（FDU-U）の株式solutiの混合物を追加し、in vitroで 1日（DIV）で、グリア細胞を排除するために、各ウェルに（ 材料の表を参照してください）に。 7時間後、新鮮な標準的な増殖培地でこの培地を交換し、5％CO 2、37℃のインキュベーター中でプレ延伸培養装置を配置します。
- 細胞培養期間中（2から3週間）、新鮮な培地で半分使用済み培地を交換し、2日毎に培地を変更します。注：2週間の延伸、未延伸面に培養した後、精製されたSCがチャンバに追加され、別の週（ステップ4.7）培養しました。
4.事前延伸表面上のDRGニューロンとシュワン細胞（SCS）の共培養
- 博士カンパーナのグループ以前に15で説明したようにのSCを分離します。
- 簡単に言えば、1日齢の子犬からのSCを分離します。収集し、機械的に坐骨神経化学（トリプシンEDTAおよびコラゲナーゼA）の両方と（18ゲージの針/ 10ミリリットルの注射器）15を解離。
- ポリ-D-リジン（PDL）の共同に解離細胞をシード5％CO 2で37℃でT25フラスコと文化をated。 5日目に、抗なた1.1抗体及びウサギ補体を用いて抗体の選択を介して細胞を精製し、流路2に精製された細胞を継代培養 - ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）を含む4.培養培地、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌）、21 / mlのウシ下垂体は、（BPE）を抽出し、4μMフォルスコリン。
- SCからの培養培地を除去し、そしてフラスコに5ミリリットル0.05％トリプシン-EDTAを追加します。 3分- 2、5％CO 2にて37℃で細胞をインキュベートします。
- 彼らはフラスコから持ち上げる場合には、培地の5ミリリットルを追加し、フラスコ内の細胞と混合見るために10倍の対物レンズを用いて光学顕微鏡下で細胞を確認してください。
- 200×gで15ミリリットルの遠心管と遠心分離機に細胞懸濁液を追加し、20℃で5分間。
- 上清を除去し、7ミリリットル標準DRG成長MEDにペレットを再懸濁IA。
- 0.5 mlマイクロチューブに10μlの細胞懸濁液を取り、トリパンブルーを10μlと混合し、次いで10×対物レンズを用いて光学顕微鏡下で血球計数器を用いて細胞数をカウントします。 DRGの増殖培地を添加することによって1ml当たり5,000細胞の細胞懸濁液を希釈します。
- 延伸室でDRG培養物から培地の0.5ミリリットルを削除し、DRG培養物にSC懸濁液0.5ミリリットルを追加します。
- 文化DRGのための新たな標準的な増殖培地で半分使用済み培地を交換することにより、37℃で1週間の細胞および5％CO 2を変更し、メディアごとに2日。 1週間共培養した後、免疫組織化学10で細胞を処理します。
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Representative Results
予備延伸細胞培養系は、DRG軸索アラインメント10を推進します。 DRGニューロンは、12日間プレ延伸、未延伸表面上で培養しました。軸索は、それらの位置合わせを実証するために、β-IIIチューブリンを染色した。 図2は、培養の12日後に前延伸、未延伸PDMS基板上の軸索の向きを比較します。彼らは、ランダムな配向を示し、未延伸PDMS基板上の相互接続ネットワークを形成し、一方、DRG軸索は、延伸方向に平行に整列されます。
軸索整列を誘導することに加えて、プレストレッチ誘導異方性は、軸索の束形成を増強しました。接続された軸索のネットワークとは異なって、延伸表面に形成され、軸索の束に整列軸索は、未延伸の表面に観察しました。前延伸表面上のこれらの束状の束は、神経組織のTRに似ていました生体内での働きをする。 図3は、培養の21日後に前延伸、未延伸表面上のDRGニューロンの軸索を示しています。 図3のように、束状管と同様の登場バンドルを形成するために一緒に凝集し、予め延伸基板上に軸索を示します。これは、事前延伸面が神経組織の再生を増強するのに重要であるプレストレッチの方向に豊富な軸索成長を促進することができることを示唆しました。
髄鞘形成を評価するために、SCが整列軸索と共培養しました。 2週間の延伸、未延伸表面のDRGニューロンを培養した後、精製されたSCがチャンバーに添加し、さらに1週間培養しました。 図4では、共培養の軸索は、β-IIIチューブリン（緑）で染色され、そしてSCがP0（赤）で染色されています。 P0は、成熟したSCのマーカーであり、また、ミエリン鞘のコンポーネントですならびに髄鞘形成の指標を検討しました。延伸表面上の軸索に付着SCの挑発ではなく、緑と赤の汚れがランダムに分布している未延伸表面上の予め延伸表面上の緑と赤の重要な共局在は、あります。髄鞘形成のためのすべての重要な軸索アライメント、束状のような管形成、及び再生軸索へのSCの添付ファイルを、拡張された前延伸面。
図1：プレストレッチ手順のための回路図（a）は、PDMS膜の片を摺動可能なフレームの2つのストリップ上にクリップされます。装置のフレームは、約7 "×5"です。ブレースは約5である "×1、中括弧にクランプが、約3"×0.25 "、そしてカップは約1.5である「直径ワイドオープントップ、1"開放底部、および約0.25＆＃34;背の高いです。 （b）は 、ストレッチングステージ上にフレームを置き、10％の伸び率を適用するためにローラーを回し、その後、ネジを締めてストリップの位置を固定。 （c）は 、延伸段階からフレームを削除し、膜上にシリコンチャンバーを取り付けます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： プレ延伸・未延伸表面の軸索アライメント DRGニューロンの蛍光画像は、12日間（B）未延伸表面上に播種DRG細胞と比較して、12日間、（a）は静的プレ延伸表面に播種しました。軸索は未延伸制御面にランダムに整列しながら軸索は、前延伸方向に並びます。軸索sは抗マウスβ-IIIチューブリン一次抗体で染色し、10倍の対物レンズを用いた共焦点顕微鏡で画像化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3： 軸索厚成長 DRG軸索の未延伸PDMS基板位相差画像対ストレッチ上の （a）の上には、21日後に未延伸面を伸ばし、および（b）。未延伸表面に軸索が相互接続された軸索のネットワークを形成しながら伸ばし表面上の軸索は、厚い束を形成しました。画像は10倍の対物レンズを用いて逆位相差顕微鏡を用いて撮影した。 アルを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のargerバージョン。
図4は： 未延伸PDMS基板対ストレッチ上に整列DRG軸索とのSCを共培養 2週間の延伸、未延伸表面上に培養した後、精製されたSCがチャンバーに添加し、さらに1週間培養しました。延伸表面上の軸索のための（a）は、β-IIIチューブリン（緑）染色; （b）は、β-IIIチューブリン（緑）のオーバーレイ、P0（赤）は、延伸表面に染色します。未延伸表面上の軸索のための（c）の β-IIIチューブリン（緑）染色; （d）の未延伸表面上のβ-IIIチューブリン（緑）、P0（赤）染色のオーバーレイ。前延伸表面には、赤と緑の汚れが共存し、示唆SCがに取り付けられ、おそらく軸索をミエリン形成されています。未延伸で表面は、赤と緑の汚れがランダムに軸索に取り付けられていないのSCを示唆し、分散されています。スケールバー=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
前延伸表面に軸索アライメントを誘導するために、2つの重要なステップがあります：1）PDMS膜は、均一な厚さのフラットでなければなりません。及び2）グリア細胞をDRGから削除する必要があります。 PDMSと架橋剤を混合し、オーブンで硬化させた後、架橋PDMSゲルは平らな作業台の上に保持し、任意の傾きを避けるために慎重に取り扱われるべきです。プラズマ処理後（細胞接着に必要な）表面の親水性は経時的に減衰するため、PDMS膜の酸素プラズマ処理は、PLLコーティングによって6時間以内に従うべきです。プラズマ処理は、膜の一方の側に印加されるので、注意がプラズマ処理された表面への細胞のために上向きにされるべきである、すなわち、フレーム上に配置され、正しい側を確実にするために皿からPDMSを剥離した後に注意しなければなりませんに接続します。
DRGは脊柱と一緒に揃え骨ポケットの内側に配置されています。椎骨の色は、白ですので、若い仔は、椎骨からのDRGを区別することは困難です。この場合には、スポット光に近い背骨を配置することが重要です。骨は白と不透明のまま光の下では、DRGを透明にします。 pHは、神経細胞の生存率に影響を与えるので、氷の上および生理的pHで解離緩衝液を保持することが重要です。単離した組織は非常に粘性であり、遠心分離管に転送する際ピペットチップに固執する傾向があります。このように大きな開口を生成するために、ピペットの非常に先端を切断して転送を容易にします。
いくつかのプロトコルでは、解離緩衝液を添加する前に、単離された組織と必要なもう一つの遠心分離工程があります。このステップの代わりに、我々のプロトコルは、そうでなければ、細胞の生存率および密度に影響を与える余分な遠心分離工程を削減し、数分のための解剖バッファに解決するために組織が必要です。細胞密度も依存しています仔の数に屠殺し、したがって仔の一貫した数たびに維持することが重要です。 DRGニューロン、従って有糸分裂阻害剤、FDU-U、グリア細胞の増殖を抑制するために1 DIVで培地に添加されると共に単離されるグリア細胞もあります。いくつかのプロトコルはarabinofuranosylcytidine（のAraC）とFDU-Uの組み合わせを好むが、これは、一般的に、神経細胞の初期の成長期間中のグリア細胞を阻害するために使用されます。 FDU-Uのモル濃度は、単離された細胞の密度に依存して、異なるプロトコルで変化培養物に添加しました。我々は、全DRG培養の間、（グリア細胞が存在する場合）、必要に応じて、有糸分裂阻害剤は、（ステップ3.3で指定された濃度で）複数回追加することができるが見つかりました。一般的に影響を与えるDRGニューロンの添付ファイル以来の任意の時点で大量（以上15μl）を追加することは推奨されません。
プラズマ処理はsurfacを増強します軸索は添付ファイルを開始するための電子親水性およびPLLコーティングは、帯電した表面を提供します。文献中の参考文献によれば、親水性を誘導し、プラズマ処理は、乾燥条件16-17の下で、時間の経過とともに減衰します。しかし、PDMSは、液体の条件の下で、水と遅い反応を受けることになると徐々に親水18に疎水性であることから変更されます。したがって、プラズマ処理は、時間の経過とともに減衰していても、それが当社の業績に影響を与えるべきではありません。有利な条件下に置かれた場合、PLLコーティングのために、供給業者からの製品情報によると、それは、長年にわたって安定です。細胞は、PLLコーティング上にアタッチすると、彼らは一般的にデタッチされません。また、PLLコーティングは初期付着に役立ち、そして細胞は、さらに、それらが表面19に固定されたままに役立つ細胞外マトリックス（ECM）タンパク質を分泌成長します。将来の設計改善は、PDにペプチドを埋め込む含めることができますプラズマ処理およびPLLコーティング工程を排除する架橋時MSネットワーク。
プロトコルは、本明細書において、正常軸索整列、成長および髄鞘形成を誘導するために、表面異方性を発生工学的手法を記載しています。アプローチは、実験的に二つの方法で拡張することができます。まず、異方性の表面は、培養中の神経組織を作成するために適用することができ、 インビトロ神経路は、次いで、in vivoで移植することができます。第二に、表面異方性の概念は、ホストのSCから損傷部位および髄鞘形成の再生軸索の位置合わせを向上させるためにインビボで使用することができる移植可能な足場の設計に組み込むことができます。複数かつ複雑な装置20-22、ならびに成長因子の添加を必要とする他のアプローチと比較して、我々のプラットフォームは、比較的単純で適用が容易であり、そして両方の軸索アリを向上させるためにのみプレストレッチに依存します成長因子の添加を必要とせずgnment及び髄鞘形成。さらに、我々は簡単に他の細胞型に適用することができるMSCおよびDRGニューロンの両方で実験的なデザインでプレストレッチのこの概念をテストしています。現在の設計は、装置は、3 dimenstional細胞培養物の試験を可能にするためにアップグレードすることができたが、将来的に、2次元表面上の軸索成長を調べました。神経修復および移植における将来のアプリケーションは、制御放出薬物特性と共に、架橋ペプチドを含む生分解性の天然または合成材料から作られた移植可能な足場にプレストレッチを組み込むことができます。
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Acknowledgments
著者らは、PDMS基板の製造に彼の援助のためのエリック・バスコ、博士Shiyong王有益な提案とDRG分離の訓練のためのミシガン大学の博士マリーナ・マタの研究室で、博士マークTuszynski博士に感謝したいと思いますUCサンディエゴ校。W.マリーカンパーナ有益な提案とSC分離のためのプロトコルのために。この研究は、国立科学財団（CBET 0941055とCBET 1510895）、国立衛生研究所（R21CA176854、R01GM089866、およびR01EB014986）によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
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