Introduction
في الإصابات العصبية، وغالبا ما يمنعون جذوعها الداني والقاصي العصبية من إعادة تنظيم مباشرة من كراسات العصبية نظرا لموقع الآفة 1-2. عادة، تتكون مساحات محور عصبي حزم أمر غاية والانحياز من المحاور، والتي تشكل شبكات معقدة من الاتصال. ومع ذلك، وتجديد الأعصاب هو عملية الفوضى بسبب سوء التنظيم محور عصبي محاذاة 3-4. لذلك، لتوليد عدد كاف من تجديد المحاور التي ردم موقع الآفة، فمن الضروري للحث على محاذاة محور عصبي منظمة تنظيما جيدا. بالإضافة إلى ذلك، إزالة الميالين يصاحب الإصابات العصبية بسبب موت الخلايا myelinating في موقع الإصابة. منذ إزالة الميالين يضعف بشدة قدرة موصلة للبقاء محاور وعلاجات تستهدف إزالة الميالين أو تشجيع عودة الميالين هامة للانتعاش وظيفية بعد إصابة العصب 5. وبالتالي فإن الهدف من هذا البروتوكول هو لتوضيح نهج الهندسية التي تعالج هاتين المسألتينتجديد الأعصاب.
وقد تم تطبيق تباين السطح، الذي يعرف بأنه الفرق، عند قياسها على طول محاور مختلفة، في الخصائص الفيزيائية أو الميكانيكية مادة، والتأثير على محاذاة الخلية، والنمو، والهجرة 6-7. بالإضافة إلى طبوغرافية، هناك طرق أخرى للحث على تباين. في وقت سابق، ونحن التحقيق تباين سطح الناجم عن ميكانيكي ثابت قبل تمتد من بولي ميثيل-siloxane (PDMS) الغشاء. نظرية "سوبر تشوه صغير المفروض على كبير" توقعت أن تصلب فعالة الخلايا تستشعر في الاتجاه امتدت يختلف عن اتجاه عمودي، وليس هذا الاختلاف في صلابة فعالة يرجع إلى السطح تباين 8. الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) مثقف على غشاء PDMS امتدت قبل قادرة على الشعور تباين عن طريق سحب بنشاط السطح ونتيجة لذلك، محاذاة في الاتجاه امتدت قبل 9. وبالمثل، وهو ع سطح متباينإيسينج من سطح امتدت قبل ميكانيكي يؤثر على المحاذاة، فضلا عن النمو وتكون الميالين من عقدة الجذر الظهري (DRG) محاور 10. نحن هنا نقدم بروتوكول لإحداث تباين السطح على ساكنة امتدت ما قبل الركيزة PDMS لتعزيز تجديد أكسون 10.
للحصول محاذاة المحور، ملامح الطوبوغرافية مع أنماط المطلوب، ذكرت لتوفير التوجيه الاتصال من خلال الألياف وقنوات 6،11-12 الانحياز، وقد تجلت لتسهيل محور عصبي محاذاة 11،13. ومع ذلك، ذكرت تقنيات لإحداث المواءمة محور عصبي من خلال الميزات الطوبوغرافية، مثل الألياف والقنوات والزخرفة، لم يتمكنوا من إطالة وزيادة سماكة من المحاور. في المقابل، تدريجيا الميكانيكية تمتد أدت إلى محاذاة محور عصبي في الاتجاه تمتد مع محاور أطول وأكثر سمكا التي زادت مع حجم امتداد 14. ومع ذلك، يتضمن جهاز بمحرك في الجسم الحي ليسعمليا. في المقابل، ثابت قبل امتدت-تباين الناجم أقل تعقيدا ويمكن إدراجها بسهولة أكبر إلى تصاميم سقالة المستقبلية للتطبيقات في الجسم الحي.
في هذا البروتوكول، ويستخدم نظام زراعة الخلايا امتدت قبل ساكنة للحث على تباين السطح دون ملامح الطوبوغرافية. ويتكون نظام ثقافة امتدت مسبقا من غشاء PDMS، إطار لمط ومرحلة تمتد، وعندها يتم إصلاح غشاء على الإطار ويتم تطبيق قوته تمتد محددة سلفا على مرحلة تمتد. ويتم رصد الخلايا العصبية DRG المعزولة حديثا مثقف على سطح امتدت قبل لمدة تصل إلى 21 يوما للمحاذاة محور عصبي وسمك. وفي وقت لاحق، خلايا شوان (المنبوذة) شارك في تربيتها مع ومراقبتها لتكون الميالين المحاور الانحياز. من خلال دمج ما قبل امتداد الناجم عن تباين سطح تمكنا من تعزيز خلية الانحياز التمايز ومحور عصبي الانحياز نمو اللجان الدائمة والخلايا العصبية DRG 9-10، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق جميع الإجراءات لعزل الخلايا عن طريق لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة ولاية ميشيغان.
1. إعداد امتدت قبل سطح متباين الخواص
- خلط 10: حل 1 من قاعدة وكيل علاج ويصب الخليط في صحن زراعة الأنسجة (12 سم القطر). استخدام 4900 قاعدة ملغ و 490 ملغ وكيل علاج لمجموع خليط يشابك.
- الحفاظ على مزيج هلام في ظل فراغ لمدة 20 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء.
- ضع الخليط جل في الفرن لعلاج بين عشية وضحاها في 60 درجة مئوية.
- بعد علاج غشاء PDMS، وعلاج السطح مع البلازما الأكسجين باستخدام نظام التنظيف / النقش البلازما لمدة 3 دقائق في 165 mTorr و 65 تدفق SCCM من O 2.
- قطع قطعة من غشاء مستطيلة (5 × 3.5 سم) من الطبق، في حين يجري تدرك الجانب الذي هو المعالجة الأوكسجين، تأكد يواجه الجانب المعالجة الأكسجين صعودا وإصلاح على إطار التمدد. وضع إطار على وتمتد المرحلة وتمتد بالتساوي من خلال تحويل مقبض الباب على مرحلة حتى يصل إلى 10٪ استطالة (أو بعض الدول الأخرى تمتد محددة سلفا، واستطالة يمكن قراءة مباشرة من مرحلة تمتد) في المحور الطويل 9. إصلاح تمتد من خلال تشديد الخناق على الإطار.
- إزالة الإطار من المرحلة. ضمان سطح غشاء جافة وخالية من الغبار، ثم ضع دائرة سيليكون على الغشاء يسمح الجانب زجة من غرفة إرفاق بإحكام إلى الغشاء.
ملاحظة: غرفة سيليكون توفر أيضا للاحتفاظ المتوسطة الخلية على غشاء PDMS. يظهر تصميم الجهاز في الشكل 1. - تعقيم السطح مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 1 مل بولي-L-ليسين (PLL) (0.01٪ في الفوسفات مخزنة المالحة) إلى سطح PDMS داخل غرفة، في غضون 6 ساعة من العلاج البلازما واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية قبل البذر الخلايا العصبية DRG. وهذا يعزز مرفق الخلية.
- إعداد متوسط النمو القياسي لالخلايا العصبية DRG.
- قبل العزلة، تعقيم المعدات العزلة والكواشف التصفية. إضافة 5 مل من العازلة العزل في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا، ووضع لوحة على الجليد. إعداد 10 مل من المتوسط التفكك عن طريق إضافة 1 مل من كولاجيناز ألف (500 U / مل) إلى 9 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA (1 ملغ / مل)، تصفية حلول مع مرشح 0.22 ميكرون ومكان على الجليد.
- استخدام 10-12 5-7 الفئران سبراغ داولي القديمة أيام لعزل. رش الجراء مع 75٪ الأيزوبروبانول، والتضحية بقطع الرأس.
- قطع الجلد المغطي للنخاع الشوكي من الخلف وإزالة أي نوع من الأنسجة الزائدة حول العمود الفقري. تحت المكبر الجراحية مع الأضواء الجراحية على، وجعل شق الأولى من الرقبة ثم قطع واحد على طول العمود الفقري في كلا الجانبين مع مقص. فصل العمود الفقري من الجسم من الجراء وإزالة العضلات الزائدة. ثم، استخدم مقص لقطع على طول خط الطولز محور العمود الفقري واستخدام ملاقط لفتح العمود الفقري تماما واستخراج العمود الفقري cord.Remove غيض من ماصة لإنشاء أكبر الافتتاح لنقل DRGs مع العازلة العزلة في أنبوب 15 مل العقيمة.
- باستخدام زوج جيد من ملاقط، وإزالة العقدة من جيب العظام وجمع ما يقرب من 10-16 DRG من كلا الجانبين. تقليم جذور الأعصاب ونقل العقد إلى المخزن المؤقت العزلة الجليد الباردة.
- إزالة غيض من ماصة لإنشاء أكبر الافتتاح لنقل DRGs مع العازلة العزلة في أنبوب 15 مل العقيمة. بعد التفكك الكيميائي، الطرد المركزي العقد في 900 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- السماح للأنسجة تترسب في قاع الأنبوب وإزالة بلطف العازلة العزلة على رأس وإضافة 10 مل من المتوسط التفكك داخل الأنبوب.
- احتضان الأنسجة تشريح في المتوسط التفكك في 37 ° C حمام الماء لمدة 1 ساعة في حين هز أنبوب كل 5-10 دقيقة.
- بعدالتفكك الكيميائي، الطرد المركزي العقد في 900 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه في 10 مل وسائط النمو القياسية ودوامة.
- أجهزة الطرد المركزي لفصل الخلايا كما هو مبين في القسم 2.9 مرة أخرى.
- إزالة طاف، وإعادة تعليق-بيليه في 12 مل من وسائط النمو القياسية ودوامة.
3. ثقافة DRG على السطح امتدت ما قبل
- قبل البذر الخلايا، وإزالة الحلول PLL من الغرفة وشطف السطح PDMS مع الماء المعقم والهواء الجاف.
- بعد إعادة تعليق-الخلايا، والسماح للمجموعة تعليق 1 - 2 دقيقة للسماح للالحطام لتستقر في قاع الأنبوب. إضافة 1.5 مل من تعليق خلية في كل غرفة تمتد واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
- للقضاء على الخلايا الدبقية، في 1 يوم في المختبر (DIV)، إضافة 10 ميكرولتر (أو 15 ميكرولتر) مزيج من الفلورية 2 ديوكسي-يوريدين ويوريدين (FDU-U) soluti الأسهمعلى (انظر الجدول المواد) إلى كل بئر. بعد 7 ساعات، استبدل هذا المتوسطة مع نمو قياسي جديد ووضع الجهاز ثقافة امتدت قبل في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- خلال فترة زراعة الخلايا (2-3 أسابيع)، وتغيير وسائل الاعلام كل يومين عن طريق استبدال نصف المتوسطة الذي يقضيه مع المتوسط الطازجة. ملاحظة: بعد زراعة على أسطح امتدت وغير المتمدد لمدة 2 أسابيع، تضاف المنبوذة تنقيته إلى الغرفة وتربيتها لمدة أسبوع آخر (الخطوة 4.7).
4. المشارك الثقافة من خلايا شوان (المنبوذة) مع DRG الخلايا العصبية على سطح امتدت ما قبل
- عزل المنبوذة كما هو موضح من قبل مجموعة الدكتور كامبانا في السابق 15.
- لفترة وجيزة، عزل المنبوذة من الجرو العمر 1 يوم. جمع وفصل الأعصاب الوركي على حد سواء كيميائيا (التربسين-EDTA وكولاجيناز أ) وميكانيكيا (18 إبرة قياس / 10 مل حقنة) 15.
- البذور الخلايا نأت إلى بولي-D-ليسين (PDL) شاركATED T25 قارورة والثقافة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. في يوم 5، وتنقية الخلايا من خلال اختيار الأجسام المضادة باستخدام مكافحة خاصتك 1.1 الأجسام المضادة والأرنب المتممة وثقافة فرعية الخلايا النقاء لمرور 2 - 4. المتوسطة استخدام الثقافة التي تحتوي على Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM)، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (بنسلفانيا / بكتيريا)، 21 ميكروغرام / مل الأبقار النخامية استخراج (BPE)، و 4 ميكرومتر Forskolin.
- إزالة مستنبت من المنبوذة، وإضافة 5 مل 0.05٪ التربسين-EDTA في القارورة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 ل2-3 دقيقة.
- تحقق الخلايا تحت المجهر الضوئي باستخدام الهدف 10X لمعرفة ما اذا كان رفع من القارورة، ثم يضاف 5 مل من مستنبت وتخلط مع الخلايا في قارورة.
- إضافة تعليق خلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج و 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف و resuspend بيليه في 7 مل ميد النمو DRG القياسيةI ل.
- يستغرق 10 ميكرولتر من تعليق خلية في أنبوب microcentrifuge 0.5 مل، مع مزيج 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق، ومن ثم حساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات تحت المجهر الضوئي باستخدام الهدف 10X. تمييع تعليق خلية إلى 5000 خلية لكل مل عن طريق إضافة وسائط النمو DRG.
- إزالة 0.5 مل من المتوسط من ثقافة DRG في غرفة امتدت وإضافة 0.5 مل من تعليق SC للثقافة DRG.
- ثقافة الخلايا لمدة 1 الأسبوع عند 37 درجة مئوية وCO 2. تغيير 5٪ من وسائل الاعلام كل يومين عن طريق استبدال نصف المتوسطة الذي يقضيه مع متوسط نمو قياسي جديد لDRG. بعد 1 أسبوع ثقافة مشتركة، عملية الخلايا المناعية 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النظام امتدت ما قبل زراعة الخلايا الترويج DRG محوار محاذاة 10. ومثقف الخلايا العصبية DRG على السطوح قبل امتدت وغير المتمدد لمدة 12 يوما. كانت ملطخة محاور لβ-III تويولين لإثبات اتساقها الشكل 2 يقارن التوجه محور عصبي على ركائز PDMS قبل امتدت وغير المتمدد بعد 12 يوما من الثقافة. المحاور DRG محاذاة موازية لاتجاه امتدت، في حين أنها أظهرت محاذاة عشوائية وشكل شبكة مترابطة على الركيزة PDMS غير المتمدد.
بالإضافة إلى إحداث المواءمة المحور، تعزيز تباين قبل امتداد يسببها تليف من المحاور. لاحظت محاور الانحياز على حزم محور عصبي سطح امتدت تشكيلها، والتي تختلف من الشبكة محور عصبي المتصلة على سطح غير المتمدد. هذه الباقات حزمية في مرحلة ما قبل امتدت سطح تشبه آر النسيج العصبيأعمال في الجسم الحي. ويبين الشكل 3 محاور الخلايا العصبية DRG على الأسطح قبل امتدت وغير المتمدد بعد 21 يوما من الثقافة. كما يوضح الشكل 3، المحاور على الركيزة امتدت ما قبل تجميعها معا لتشكيل حزم، والتي ظهرت على غرار مساحات حزمية. اقترح هذا كان السطح قبل تمدد قادرة على تعزيز نمو محور عصبي واسعة في اتجاه مرحلة ما قبل التمدد، والتي تعتبر مهمة في تعزيز تجديد الأنسجة العصبية.
لتقييم المايلين، كانت المنبوذة شارك في تربيتها مع المحاور الانحياز. بعد زراعة الخلايا العصبية DRG على أسطح امتدت وغير المتمدد لمدة 2 اسابيع، وأضيفت المنبوذة تنقيته إلى الغرفة وتربيتها لمدة أسبوع آخر. في الشكل (4)، ملطخة محاور من الثقافة المشتركة مع β-III تويولين (الخضراء)، وملطخة المنبوذة مع P0 (الحمراء). P0 هو علامة على النضج المنبوذة وهو أيضا مكون من غمد المايلين،وكذلك يعتبر مؤشرا على المايلين. هناك كبير شارك في توطين الأخضر والأحمر على سطح امتدت مسبقا، توحي المنبوذة المترتبة على محاور على سطح ممدد، ولكن ليس على سطح غير المتمدد حيث يتم توزيع البقع الخضراء والحمراء بشكل عشوائي. السطوح امتدت قبل عززت محاذاة المحور، تشكيل الجهاز حزمي مثل، والحجز على المنبوذة إلى المحاور مجدد، كل حاسمة لتكون الميالين.
الشكل 1:. تخطيطي لإجراء ما قبل امتداد (أ) يتم قص قطعة من غشاء PDMS على قطعتين من الإطار التي slidable. الإطار من الجهاز هو حوالي 7 "س 5". الأقواس هي حوالي 5 "× 1، والمشابك على الأقواس حوالي 3" × 0.25 "، والكأس حوالي 1.5" قطر أعلى مفتوحة على مصراعيها، 1 "أسفل مفتوحة، ونحو 0.25 & #34؛ طويل القامة. (ب) وضع إطار على خشبة المسرح وتمتد، وتحويل الأسطوانة إلى تطبيق 10٪ استطالة، ومن ثم تحديد مواقف شرائط من خلال تشديد الخناق. (ج) إزالة الإطار من مرحلة تمتد، وإرفاق غرفة السيليكون على الغشاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أكسون محاذاة على تمدد قبل والمتمدد السطحية الصور فلوري من الخلايا العصبية DRG المصنف على (أ) سطح امتدت قبل ساكنة لمدة 12 يوما، مقارنة مع الخلايا DRG المصنف على (ب) سطح غير المتمدد لمدة 12 يوما. محاذاة محاور في الاتجاه امتدت مسبقا، في حين محاور محاذاة بشكل عشوائي على سطح السيطرة المتمدد. أكسونكانت ملطخة الصورة مع مكافحة فأر β-III تويولين الأجسام المضادة الأولية، وتصوير مع المجهر متحد البؤر باستخدام الهدف 10X. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): أكسون سمك النمو على متمدد مقابل المتمدد PDMS الركيزة الصور المرحلة النقيض من المحاور DRG على (أ) امتدت و(ب) الأسطح غير المتمدد بعد 21 يوما. محاور على سطح امتدت شكلت حزم سمكا، بينما على سطح غير المتمدد المحاور شكلت مترابطة شبكة المحاور. وقد أخذت صور باستخدام المرحلة المقلوب على النقيض المجهر باستخدام الهدف 10X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة النسخة arger من هذا الرقم.
الرقم 4: المنبوذة مع الانحياز DRG محاور عصبية شركة تربيتها على متمدد مقابل المتمدد PDMS ركائز بعد زراعة على أسطح امتدت وغير المتمدد لمدة 2 اسابيع، وأضيفت المنبوذة تنقيته إلى الغرفة وتربيتها لمدة أسبوع آخر. (أ) β-III تويولين (الأخضر) تلطيخ للمحاور على سطح امتدت؛ (ب) تراكب من β-III تويولين (الخضراء)، P0 (الحمراء) تلطيخ على السطح امتدت؛ (ج) β-III تويولين (الأخضر) تلطيخ للمحاور على سطح غير المتمدد. (د) تراكب من β-III تويولين (الخضراء)، P0 (الحمراء) تلطيخ على السطح غير المتمدد. على سطح امتدت مسبقا، والبقع الحمراء والخضراء colocalize، وترد يشير إلى المنبوذة لويرجح myelinating المحاور. على غير المتمددالسطح، ويتم توزيع البقع الحمراء والخضراء بشكل عشوائي، مما يشير إلى المنبوذة لم تعلق على المحاور. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
للحث على محاذاة محوار على سطح امتدت مسبقا، هناك نوعان من الخطوات الحاسمة: 1) يجب أن يكون غشاء PDMS مسطحة وسمك متجانس. و2) يجب إزالة الخلايا الدبقية من DRG. بعد خلط PDMS وcrosslinker وعلاج في الفرن، يجب أن تبقى جل PDMS crosslinked على قمة مقاعد البدلاء شقة والتعامل معها بعناية لتجنب أي إمالة. وينبغي أن يتبع العلاج الأكسجين البلازما الغشاء PDMS في غضون 6 ساعة بواسطة PLL طلاء، منذ hydrophilicity من السطح (مطلوب لمرفق الخلية) بعد العلاج البلازما خفف على مر الزمن. منذ يتم تطبيق العلاج البلازما إلى جانب واحد من الغشاء، يجب توخي الحذر بعد تقشير PDMS قبالة طبق لضمان الجانب الصحيح يوضع على الإطار، وهذا هو، على سطح البلازما المعالجة يجب أن يواجه ما يصل للخلايا ل يرفق الى.
وتقع DRGs داخل جيوب العظام التي تتماشى جنبا إلى جنب مع العمود الفقري. منذ لون فقرة أبيض فيالجراء الصغار، فمن الصعب التمييز بين DRGs من فقرة. في هذه الحالة، فمن المهم وضع العمود الفقري بالقرب من بقعة ضوء. تحت الضوء، وDRGs تحويل شفافة في حين لا يزال العظم الأبيض ومبهمة. فمن المهم للحفاظ على المخزن المؤقت تشريح على الجليد وعلى درجة الحموضة الفسيولوجية، لأن درجة الحموضة يؤثر على بقاء الخلايا العصبية. الأنسجة المعزولة هي لزجة جدا وتميل إلى التمسك طرف ماصة عندما نقل إلى أنبوب الطرد المركزي. وهكذا قطع غيض جدا ماصة لتوليد افتتاح أكبر يسهل نقلها.
في بعض البروتوكولات، هناك واحد أكثر الطرد المركزي خطوة لازمة مع الأنسجة المعزولة قبل أن يضيف المخزن المؤقت التفكك. بدلا من هذه الخطوة، لدينا بروتوكول يتطلب أنسجة لتسوية في المنطقة العازلة تشريح لبضع دقائق، مما يقلل من خطوة الطرد المركزي الإضافية التي لولاها تؤثر على سلامة وكثافة الخلايا. كثافة الخلية تعتمد أيضاعلى عدد من الجراء التضحية، وبالتالي من المهم للحفاظ على عدد ثابت من الجراء في كل مرة. هناك أيضا الخلايا الدبقية التي يتم عزلها جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية DRG، وبالتالي مثبط الإنقسامية، FDU-U، يضاف إلى مستنبت في 1 DIV إلى وقف نمو الخلايا الدبقية. ويشيع استخدام هذا لمنع الخلايا الدبقية خلال فترة النمو في وقت مبكر من الخلايا العصبية، على الرغم من بعض البروتوكولات تفضل مزيج من arabinofuranosylcytidine (أراك) وFDU-U. وأضاف تركيز المولي من FDU-U لثقافة تختلف في بروتوكولات مختلفة، تبعا لكثافة الخلايا المعزولة. وجدنا مثبط الإنقسامية يمكن إضافة عدة مرات (في تركيز تحديده في الخطوة 3.3)، حسب الحاجة (إذا كانت الخلايا الدبقية موجودة)، خلال ثقافة DRG بأكملها. عموما لا ينصح بإضافة كمية كبيرة (أكثر من 15 ميكرولتر) في أي وقت من الأوقات لأنه يؤثر على مرفق من الخلايا العصبية DRG.
العلاج البلازما تعزز surfacالبريد hydrophilicity وطلاء PLL يوفر سطح المفروضة على محاور عصبية لبدء المرفق. وفقا لمراجع في الأدب، وسوف يتسبب hydrophilicity العلاج البلازما تخفف مع مرور الوقت، في ظل ظروف جافة 16-17. ومع ذلك PDMS سيخضع رد فعل بطيء مع الماء تحت ظروف السائلة وسوف يتغير تدريجيا من كونها مسعور لماء 18. على الرغم من ذلك حتى العلاج البلازما خفف على مر الزمن، فإنه لا ينبغي أن تؤثر على نتائجنا. لطلاء PLL، وفقا لمعلومات المنتج من المورد، أنها مستقرة على مدى سنوات إذا وضعت في ظل ظروف مواتية. مرة واحدة نعلق على الخلايا على طلاء PLL، وعموما لن فصل. بالإضافة إلى ذلك، وطلاء PLL يساعد على المرفق الأولي، وحيث تنمو الخلايا التي تفرز المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات التي تزيد من مساعدتها على أن تظل راسية على سطح 19. ويمكن أن تشمل التحسينات تصميم المستقبل الطمر الببتيدات في PDشبكة MS خلال يشابك، التي من شأنها القضاء على العلاج البلازما وPLL خطوات الطلاء.
البروتوكول، في هذه الوثيقة، ووصف نهج الهندسية التي ولدت تباين السطح للحث على محاذاة محور عصبي والنمو وتكون الميالين بنجاح. النهج يمكن توسعت التجربة بطريقتين. أولا، يمكن تطبيقها على سطح متباين الخواص لخلق الأنسجة العصبية في الثقافة، ويمكن بعد ذلك زرع مساحات العصبية في المختبر في الجسم الحي. ثانيا، يمكن أن تدمج مفهوم تباين السطح في تصميم السقالات استنساخها التي يمكن أن تستخدم في الجسم الحي لتعزيز المواءمة بين المحاور تجديد من موقع الإصابة وتكون الميالين من المنبوذة المضيف. بالمقارنة مع المناهج الأخرى التي تتطلب متعددة ومعقدة الأجهزة 20-22، فضلا عن إضافة عوامل النمو، ومنصة لدينا هي بسيطة نسبيا وسهلة التطبيق، وتعتمد فقط على ما قبل امتداد لتعزيز كل محور عصبي عليgnment وتكون الميالين دون الحاجة إلى عامل النمو بالإضافة. وعلاوة على ذلك يتم اختبار هذا المفهوم من قبل تمتد في التصميم التجريبي على كل اللجان الدائمة والخلايا العصبية DRG التي يمكن بسهولة أن تطبق على أنواع الخلايا الأخرى. تم استخدام التصميم الحالي للتحقيق نمو محور عصبي على الأسطح 2-الأبعاد، ولكن في المستقبل يمكن أن تتم ترقية الجهاز لتمكين اختبار مزارع الخلايا 3-dimenstional. التطبيقات المستقبلية في إصلاح الأعصاب وزرع يمكن أن تتضمن مرحلة ما قبل تمتد في السقالات استنساخها المصنوعة من المواد الطبيعية أو الاصطناعية القابلة للتحلل تحتوي على الببتيدات crosslinked جنبا إلى جنب مع خصائص المخدرات التي تسيطر عليها الافراج عنهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر اريك فاسكو لمساعدته في إعداد ركائز PDMS، الدكتور Shiyong وانغ في مختبر الدكتور مرسى ماتا في جامعة ميشيغان للحصول على اقتراحات مفيدة والتدريب من العزلة DRG، والدكتور مارك Tuszynski والدكتور دبليو ماري كامبانا في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو للحصول على اقتراحات مفيدة وبروتوكول لعزل SC. وأيد هذه الدراسة في جزء من مؤسسة العلوم الوطنية (CBET 0941055 وCBET 1510895)، والمعهد الوطني للصحة (R21CA176854، R01GM089866، وR01EB014986).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
- Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. Organosilicon Materials. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
