Introduction
I nerveskader, er de proximale og distale nervestumperne ofte forhindret direkte justering den nerve hæfterne grund læsionsstedet 1-2. Normalt er Axon skrifter sammensat af højt bestilt og tilpasset bundter af axoner, som danner komplekse netværk af tilslutningsmuligheder. Men nerve regenerering er en kaotisk proces på grund af dårligt organiseret Axon justering 3-4. Derfor, for at generere et tilstrækkeligt antal regenererende axoner denne bro læsionsstedet, er det nødvendigt at inducere velorganiseret axonal tilpasning. Derudover demyelinisering ledsager nerveskader som følge af død af de myelinerende celler ved skadestedet. Da demyelinisering kraftigt svækker ledende kapacitet af overlevende axoner, behandlinger rettet mod demyelinering eller fremmer remyelinering betydelige for funktionel restitution efter nerveskade 5. Således målet med denne protokol er at illustrere en teknisk tilgang, der tager disse to spørgsmålaf nerveregenerering.
Overflade anisotropi, som er defineret som en forskel, når de måles langs forskellige akser, i et materiales fysiske eller mekaniske egenskaber, er blevet anvendt til at påvirke cellejustering, vækst og migrering 6-7. Foruden topografi, er der andre metoder til at fremkalde anisotropi. Vi har tidligere undersøgte overflade anisotropi induceret af mekanisk statiske pre-strækning af poly-dimethyl-siloxan (PDMS) membran. Teorien om "lille deformation super pålagt store" forudsagde, at den effektive stivhed cellerne fornemmer i den strakte retning afviger fra den vinkelrette retning, og denne forskel i effektiv stivhed skyldes til overfladen anisotropi 8. Mesenkymale stamceller (MSC'er) dyrket på et i forvejen strakt PDMS membran er i stand til at fornemme anisotropien ved aktivt at trække overfladen og som følge heraf, tilslutter i forstrakte retning 9. Ligeledes en anisotrop overflade arIsing fra en mekanisk forstrakt overflade påvirker justeringen, samt vækst og myelination af dorsale ganglion (DRG) axoner 10. Her giver vi en protokol for at fremkalde overflade anisotropi på en statisk forstrakt PDMS substrat at øge Axon regenerering 10.
For at fremkalde Axon tilpasning, topologiske egenskaber med ønskede mønstre, rapporteret at give kontakt vejledning gennem justeret fibre og kanaler 6,11-12, blev påvist at lette Axon justering 11,13. Imidlertid rapporterede teknikker til induktion axon tilpasning gennem topologiske egenskaber, såsom fibre, kanaler og mønsterdannelse, var ude af stand til at forlænge og forøge tykkelsen af axonerne. I modsætning hertil strækning gradvis mekanisk ført til axon tilpasningen på stretch retning med længere og tykkere axoner at øget med størrelsen af strækningen 14. Imidlertid indbygget drevet motor indretning in vivo er ikkegennemførlig. I modsætning hertil statisk forstrakte induceret anisotropi er mindre kompliceret og lettere kan indarbejdes i fremtidige stillads design til in vivo anvendelser.
I denne protokol, er en statisk forstrakt cellekultur, der anvendes til at fremkalde overflade anisotropi uden topologiske egenskaber. Den forstrakt dyrkningssystem består af en PDMS-membran, en strækbar ramme og en strækning stadium, hvorpå membranen er fastgjort på rammen og en forudbestemt strækning størrelsesorden påføres på strækningen scenen. Frisk isolerede DRG-neuroner dyrket på forstrakte overflade i op til 21 dage overvåges for axon tilpasningen og tykkelse. Efterfølgende Schwann celler (SCs) co-dyrkes med de justerede axoner overvåges for myelinering. Ved at inkorporere pre-stretch induceret overflade anisotropi kunne vi øge celle alignment-differentiering og axon justering-vækst i MSC og DRG-neuroner 9-10 hhv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder til isolering af cellerne blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Michigan State University.
1. Fremstilling af Pre-strakt Anisotropisk Surface
- Bland en 10: 1 opløsning af base og hærder og hæld blandingen i en vævskulturskål (12 cm i diameter). Brug 4900 mg base og 490 mg hærdning agent for den samlede tværbinding blanding.
- Hold gelblanding under vakuum i 20 min for at fjerne luftbobler.
- Gelen anbringes blandingen i ovnen for overnight hærdning ved 60 ° C.
- Efter PDMS membran hærder, behandle overfladen med oxygenplasma under anvendelse af en plasma rengøring / ætsning systemet i 3 minutter ved 165 mTorr og 65 sccm strøm af O2.
- Klip et stykke rektangulært membran (5 x 3,5 cm) fra fadet, og samtidig være bevidste hvilken side der er ilt-behandlet, skal du sørge for ilt-behandlede side vender opad og løse på en stretching ramme. Placer ramme på en strække scenen og jævnt strække ved at dreje knappen på scenen, indtil den når 10% forlængelse (eller en anden forud fastsat strækning, forlængelsen direkte kan læses fra stretching etape) på længere akse 9. Fastgør strækning ved at stramme skruerne på rammen.
- Fjerne rammen fra scenen. Sørg membranens overflade er tør og fri for støv, og derefter placere en silikone kammer på membranen tillader den klæbende side af kammeret til at fastgøre tæt til membranen.
Bemærk: silikone kammer tilvejebringer en brønd til fastholdelse cellemediet på PDMS membranen. Indretningen form er vist i figur 1. - Sterilisere overfladen med UV i 10 min.
- Tilsæt 1 ml Poly-L-Lysin (PLL) (0,01% i phosphatbufret saltvand) til PDMS overflade inden i kammeret, inden 6 timer af plasmabehandling og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C før podning af DRG-neuroner. Dette øger cellevedhæftning.
- Forbered standard vækstmedium for DRG-neuroner.
- Forud for isolationen, autoklaveres isolation udstyr og filter reagenser. Der tilsættes 5 ml isolation puffer i en brønd på en plade med 6 brønde, og placere pladen på is. Forbered 10 ml dissociation medium ved tilsætning af 1 ml collagenase A (500 U / ml) til 9 ml 0,05% trypsin-EDTA (1 mg / ml), filtrere opløsninger med et 0,22 um filter og anbring på is.
- Bruge ti til tolv 5 - 7 dages gamle Sprague-Dawley-rotter til isoleringen. Spray hvalpene med 75% isopropanol, og ofre ved halshugning.
- Skær væk huden overliggende rygmarven fra bagsiden og fjerne overskydende væv omkring rygsøjlen. Under en kirurgisk lup med de kirurgiske spotlights på, gøre den første snit fra nakken og derefter en snit langs rygsøjlen på begge sider med en saks. Frigør ryggen fra kroppen af hvalpene og fjerne de overskydende muskler. Brug derefter en saks til at klippe langs long akse af rygsøjlen og brug pincet til at åbne rygsøjlen fuldstændigt og udtrække spinal cord.Remove spidsen fra en pipette til at skabe en større åbning til overførsel af DRG med isolation puffer i et sterilt 15 ml rør.
- Ved hjælp af en fin pincet, fjern ganglion fra knoglen lommen og indsamle cirka 10-16 DRG fra begge sider. Trim nerve rødder og overføre ganglier til iskold isolation buffer.
- Fjern tip fra en pipette til at skabe en større åbning til overførsel af DRG med isolation puffer i et sterilt 15 ml rør. Efter den kemiske dissociation centrifugeres ganglier ved 900 xg og 4 ° C i 5 minutter.
- Lad vævene sedimentere til bunden af røret og fjern forsigtigt isolation buffer på toppen og tilsættes 10 ml dissociation medium ind i røret.
- Inkuber de dissekerede væv i dissociation medium i et 37 ° C vandbad i 1 time under omrystning røret hver 5 - 10 min.
- Efterden kemiske dissociation centrifugeres ganglier ved 900 xg og 4 ° C i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og re-suspendere pellet i 10 ml standard vækstmedier og vortex.
- Centrifuger dissocierede celler som angivet i afsnit 2.9 igen.
- Fjern supernatanten, resuspender pellet i 12 ml af standard vækstmedier og vortex.
3. Kultur DRG på Pre-strakt Surface
- Før podning af cellerne, fjerne PLL løsninger fra kammeret og skyl PDMS overflade med sterilt vand og lufttørre.
- Efter fornyet suspendering af cellerne, lad suspensionen sæt til 1 - 2 min for at tillade snavs at sedimentere til bunden af røret. Tilsættes 1,5 ml cellesuspension til hver strækning kammer og inkuber ved 37 ° C ved 5% CO2.
- For at eliminere gliaceller, på 1 dag i vitro (DIV), tilsættes 10 pi (eller 15 pi) blanding af fluor-2 deoxy-uridin og uridin (FDU-U) stock solutipå (se tabel Materialer) til hver brønd. Efter 7 timer, erstatte dette medium med frisk standard vækstmedium og placere forstrakte dyrkningsindretning i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Under cellekultur periode (2 - 3 uger), ændre medierne hver anden dag ved at erstatte halvdelen af den brugte medium med frisk medium. Bemærk: Efter dyrkning på de strakte og ikke strakte overflader til 2 uger, er renset SCs tilføjet til kammeret og dyrket i en anden uge (trin 4.7).
4. Co-kultur af Schwann celler (SCS) med DRG neuroner på Pre-strakt Surface
- Isoler SC'er som beskrevet af Dr. Campana gruppe tidligere 15.
- Kort fortalt isolere SCS fra en 1 dag gammel hvalp. Indsamle og dissociere Det ischiadicus nerver både kemisk (trypsin-EDTA og Collagenase A) og mekanisk (18 gauge nål / 10 ml sprøjte) 15.
- Pode dissocierede celler i poly-D-lysin (PDL) coated T25-kolbe og dyrkning ved 37 ° C ved 5% CO2. På dag 5, rense cellerne gennem udvælgelse af antistoffer ved hjælp af Anti-thy 1.1 antistof og kanin supplere og videredyrke de rensede celler til passage 2 - 4. Brug dyrkningsmedium indeholdende Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), 10% føtalt bovint serum (FBS) , 1% penicillin / streptomycin (Penn / Strep), 21 ug / ml oksehypofyseekstrakt (BPE), og 4 uM forskolin.
- Fjern kulturmediet fra SCS, og der tilsættes 5 ml 0,05% trypsin-EDTA i kolben. Inkuber cellerne ved 37 ° C ved 5% CO2 til 2 - 3 min.
- Check celler under det optiske mikroskop ved anvendelse af et 10X objektiv at se om de løfte fra kolben, hvorefter der tilsættes 5 ml dyrkningsmedium og blandes med cellerne i kolben.
- Tilføj cellesuspensionen til et 15 ml centrifugerør og centrifugeres ved 200 xg og 20 ° C i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og pellet resuspenderes i 7 ml standard DRG vækst withia.
- Tage 10 pi cellesuspension i en 0,5 ml mikrocentrifugerør, blandes med 10 pi trypanblåt, og derefter tælle antallet af celler under anvendelse af et hæmocytometer under optisk mikroskopi ved anvendelse af et 10X objektiv. Fortynd cellesuspensionen til 5.000 celler pr ml ved tilsætning af DRG vækstmedier.
- Fjern 0,5 ml medium fra DRG kultur i den strakte kammer, og der tilsættes 0,5 ml SC suspensionen til DRG kultur.
- Dyrke cellerne i 1 uge ved 37 ° C og 5% CO 2. Ændring medierne hver anden dag ved at erstatte halvdelen af den brugte medium med frisk standard vækstmedium for DRG. Efter 1 uges co-kultur, proces cellerne ved immunhistokemi 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den forstrakt cellekultur-system fremmes DRG Axon justering 10. DRG-neuroner blev dyrket på forhånd strakt og ikke-strakte overflader i 12 dage. De axoner blev farvet for β-III-tubulin at vise deres tilpasning. Figur 2 sammenligner Axon orientering om de foreløbigt strakte og ikke strakte PDMS substrater efter 12 dages kultur. De DRG axoner linie parallelt med den strakte retning, mens de viste tilfældige justering og dannede et sammenhængende netværk af ikke-strakte PDMS underlaget.
Ud over at inducere axon alignment, pre-stretch induceret anisotropi forøgede fascikulationer af axoner. De justerede axoner på de strakt overflade dannede axonale bundter, som afveg fra den tilsluttede axonal netværk observeret på den ikke strakte overflade. Disse knippede bundles på forstrakte overflade lignede nervevæv trhandlinger in vivo. Figur 3 viser axoner af DRG neuroner på forhånd strakt og ikke strakte overflader efter 21 dage kultur. Som figur 3 viser, at axonerne på forstrakte substrat aggregeret sammen danner bundter, der udkom ligner knippede skrifter. Dette antydede den forstrakte overflade var i stand til at fremme omfattende axon vækst i retning af den præ-stretch, som er vigtige til forøgelse regenerering af nervevæv.
For at vurdere myelinering, SCs blev co-dyrket med de flugtende axoner. Efter dyrkning af DRG-neuroner på de strakte og ikke-strakte overflader til 2 uger blev oprensede SC'er tilsat til kammeret og dyrket i en anden uge. I figur 4 er axonerne i co-kultur farvet med β-III-tubulin (grøn), og SCS farves med P0 (rød). P0 er en markør for modent SC'er og er også en bestanddel af myelinskeden,samt betragtes som en indikator for myelinering. Der er betydelig co-lokalisering af grøn og rød på forstrakte overflade, antyder SC'er er knyttet til de axoner på det strakte overflade, men ikke på den ustrakte overflade, hvor de grønne og røde pletter er tilfældigt fordelt. De præ-strakt overflader forbedret Axon justering, dannelse fascicular-lignende tarmkanalen, og fastgørelse af SCs til regenererede axoner, alle kritiske for myelinering.
Figur 1:. Skematisk for Pre-stretch Procedure (a) Et stykke af PDMS membran klippet på to strimler af den ramme, der er forskydelige. Rammen af enheden er ca. 7 "x 5"; seler er omkring 5 "x 1, de klemmer på seler er omkring 3" x 0,25 ", og koppen er ca. 1,5" diameter bred åben top, 1 "åben bund, og ca. 0,25 & #34; høj. (B) Der anbringes rammen på strækningen stadium dreje rullen til at anvende 10% forlængelse, og derefter fastsætte positionerne af strimlerne ved at spænde skruerne. (C) Fjern rammen fra strække scenen, og vedlægge en silicium kammer på membranen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Axon Alignment på Pre-strakt og ustrakt Surface Fluorescerende billeder af DRG-neuroner podet på (a) statisk forstrakt overflade i 12 dage, sammenlignet med DRG-celler podet på (b) ustrakte overflade i 12 dage.. Axoner på linie i den forstrakte retning, mens axoner tilpasset tilfældigt på ustrakte styreflade. Axons blev farvet med anti-muse β-III tubulin primære antistof, og filmede med konfokal mikroskopet med en 10X objektiv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Axon Tykkelse Vækst på Strakt vs. ustrakt PDMS Substrat fasekontrast billeder af DRG axoner på (a) strækkes og (b) ikke-strakte overflader efter 21 dage.. Axoner på strakte overflade dannet tykkere bundter, mens den ikke-strakte overflade axoner dannede indbyrdes forbundne axonal netværk. Billeder blev taget ved hjælp inversed fasekontrastmikroskop ved hjælp af en 10X mål. Klik her for at se alArger version af dette tal.
Figur 4:. Co-dyrkes SCs med Alliancefri DRG Axoner på Strakt vs. ikke-strakt PDMS Underlag Efter dyrkning på de strakte og ikke strakte overflader til 2 uger, blev renset SCs tilføjet til kammeret og dyrket i en anden uge. (A) β-III-tubulin (grøn) farvning for axoner på det strakte overflade; (B) overlejring af β-III-tubulin (grøn), P0 (rød) farvning på det strakte overflade; (C) β-III-tubulin (grøn) farvning for axoner på ustrakte overflade; (D) overlejring af β-III-tubulin (grøn), P0 (rød) farvning på den ustrakte overflade. På den forstrakte overflade, de røde og grønne pletter colocalize, der tyder SCS knyttet til og sandsynligvis myelinerende axoner. På den ikke-strakteoverflade, distribueres de røde og grønne pletter tilfældigt, hvilket tyder SCS er ikke knyttet til axoner. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at fremkalde axon tilpasning på præ-strakt overflade, er der to kritiske trin: 1) PDMS membranen skal være plan og er af homogen tykkelse; og 2) gliaceller skal fjernes fra DRG. Efter blanding af PDMS og tværbinderen og hærdning i en ovn, bør tværbundet PDMS gel holdes på en flad bænk top og håndteres omhyggeligt for at undgå enhver hældning. Den ilt plasmabehandling af PDMS membranen bør inden for 6 timer efter PLL-coating, idet hydrofiliciteten af overfladen (kræves til cellebinding) efter plasmabehandling dæmpes over tid. Da plasma behandling påføres den ene side af membranen, skal man passe på, efter skrælning PDMS fra skålen for at sikre den korrekte side placeres på rammen, dvs. plasmaet behandlede overflade skal vende opad for cellerne til tillægger.
De DRG er placeret inde knoglen lommer, der justeres langs rygsøjlen. Da farven på ryghvirvel er hvid ismå hvalpe, er det vanskeligt at skelne de DRG fra ryghvirvel. I dette tilfælde er det vigtigt at placere rygsøjlen tæt på stedet lys. Under lys, de DRG dreje transparent mens knoglen forbliver hvide og uigennemsigtige. Det er vigtigt at holde dissektion buffer på is og ved en fysiologisk pH, idet pH-værdien påvirker levedygtigheden af de neurale celler. De isolerede væv er meget tyktflydende og har tendens til at holde sig til pipettespidsen ved overførsel til et centrifugerør. Således skærer selve spidsen af pipetten for at generere en større åbning letter overførslen.
I nogle protokoller, der er endnu centrifugeringstrin kræves med de isolerede væv før tilsætning dissociation buffer. I stedet for dette trin, vores protokol kræver væv til at bosætte sig i dissektion buffer i et par minutter, hvilket reducerer den ekstra centrifugering skridt, ellers ville påvirke levedygtigheden og tæthed af cellerne. Celledensiteten er også afhængigaf antallet af unger aflivet, og derfor er vigtigt at opretholde en konsistent antal unger hver gang. Der er også gliale celler, der er isoleret sammen med DRG-neuroner, således en mitotisk inhibitor, FDU-U, sættes til dyrkningsmediet ved 1 DIV at undertrykke væksten af gliaceller. Dette bruges normalt til at inhibere gliaceller i den tidlige vækstperiode af neuronerne, selv om nogle protokoller foretrækker en kombination af arabinofuranosylcytidine (AraC) og FDU-U. Den molære koncentration af FDU-U tilsat til kulturen varierer i de forskellige protokoller, afhængigt af densiteten af de isolerede celler. Vi fandt den mitotiske inhibitor kan tilføjes flere gange (ved den specificerede koncentration i trin 3.3), efter behov (hvis gliaceller er til stede), under hele DRG kultur. Det er generelt ikke anbefales at tilføje en stor mængde (over 15 pi) på et givent tidspunkt, da det påvirker fastgørelsen af DRG-neuroner.
Plasma behandling forbedrer overflade hydrofilicitet og PLL-coating tilvejebringer en ladet overflade for axoner at initiere binding. Ifølge referencer i litteraturen, vil plasma behandling induceret hydrofilicitet dæmpe over tid, under tørre forhold 16-17. PDMS vil imidlertid undergå en langsom reaktion med vand under flydende betingelser og vil gradvist ændre sig fra at være hydrofob til hydrofil 18. Derfor selvom plasma behandling dæmper over tid, bør det ikke påvirke vores resultater. For PLL-coating, ifølge de oplysninger produkt fra leverandøren, det er stabil over året, hvis de placeres under gunstige betingelser. Når cellerne vedhæfte på PLL-coating, er de generelt ikke vil løsne. Derudover PLL-coating hjælper med første tilkobling, og som cellerne vokser de udskiller ekstracellulær matrix (ECM) proteiner, som yderligere hjælper dem til at forblive forankret til overfladen 19. Fremtidige design forbedringer kunne omfatte imbedding peptider i PDMS netværket under tværbinding, hvilket ville eliminere plasmabehandling og PLL belægningstrin.
Protokollen, heri, beskrev en ingeniør tilgang, der genererede overflade anisotropi at kunne fremkalde axon tilpasning, vækst og myelinering. Tilgangen kan eksperimentelt udvides på to måder. For det første kunne den anisotrope overflade anvendes til at skabe nervevæv i kultur, og de in vitro nervegange kunne derefter transplanteres in vivo. For det andet kan begrebet overfladen anisotropi inkorporeres i designet af transplanterbare stilladser, der kunne anvendes in vivo til at forbedre tilpasningen af de regenererende axoner fra skadestedet og myelinering fra værten SC'er. Sammenlignet med andre tilgange, som kræver flere og komplicerede enheder 20-22, samt tilsætning af vækstfaktorer, vores platform er forholdsvis enkel og let at anvende, og bygger kun på pre-stretch at styrke både axon alignment og myelinering uden behov for vækstfaktor tilsætning. Derudover har vi testet dette koncept af pre-stretch i den eksperimentelle design på begge MSC og DRG-neuroner, som let kan anvendes på andre celletyper. Den nuværende udformning blev anvendt til at undersøge axon vækst på 2-dimensionelle overflader, men i fremtiden indretningen kunne opgraderes for at muliggøre afprøvning af 3-dimenstional cellekulturer. Fremtidige applikationer i nerve reparation og transplantation kunne indarbejde pre-stretch i transplanterbare stilladser fremstillet af biologisk nedbrydelige naturlige eller syntetiske materialer, der indeholder krydsbundne peptider sammen med kontrolleret frigivelse drug egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Eric Vasco for hans assistance i udarbejdelsen af PDMS substrater, Dr. Shiyong Wang i Dr. Marina Mata laboratorium ved University of Michigan for nyttige forslag og uddannelse af DRG isolation, og Dr. Mark Tuszynski og Dr. . W. Marie Campana på UC San Diego for nyttige forslag og protokol for SC isolation. Denne undersøgelse blev støttet delvist af National Science Foundation (cbet 0.941.055 og cbet 1.510.895), National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866, og R01EB014986).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
- Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. Organosilicon Materials. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
