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Neuroscience

एक दृष्टिकोण संरेखण और पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की myelination बढ़ाने के लिए

Published: August 24, 2016 doi: 10.3791/54085
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan State University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University

Introduction

तंत्रिका चोटों में, समीपस्थ और बाहर का तंत्रिका स्टंप अक्सर घाव साइट 1-2 के कारण तंत्रिका fascicles के प्रत्यक्ष फिर से संगठित करना से रोका जाता है। आम तौर पर, अक्षतंतु इलाकों axons की अत्यधिक आदेश दिया है और गठबंधन बंडलों, जो कनेक्टिविटी के जटिल नेटवर्क के रूप में बना रहे हैं। हालांकि, तंत्रिका उत्थान खराब का आयोजन अक्षतंतु संरेखण 3-4 के कारण एक अराजक प्रक्रिया है। इसलिए, एक्सोन कि घाव साइट को पाटने regenerating के लिए पर्याप्त संख्या में उत्पन्न करने के लिए है, यह अच्छी तरह से आयोजित axonal संरेखण प्रेरित करने के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, माइलिन रहित चोट साइट पर myelinating कोशिकाओं की मौत के कारण तंत्रिका चोटों के साथ जुडा हुआ। चूंकि माइलिन रहित जोरदार एक्सोन जीवित रहने की क्षमता को बाधित प्रवाहकीय, माइलिन रहित लक्षित या remyelination को बढ़ावा देने के उपचार तंत्रिका चोट के बाद 5 कार्यात्मक वसूली के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रकार इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के एक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण है कि इन दो मुद्दों के पते वर्णन करने के लिए हैतंत्रिका उत्थान की।

भूतल anisotropy, जब विभिन्न कुल्हाड़ियों साथ मापा, एक सामग्री के भौतिक या यांत्रिक गुणों में है, जो एक अंतर के रूप में परिभाषित किया गया है, सेल संरेखण, विकास, और प्रवास 6-7 प्रभावित करने के लिए लागू किया गया है। स्थलाकृति के अलावा, वहाँ अन्य तरीकों anisotropy प्रेरित करने के लिए कर रहे हैं। इससे पहले, हम सतह anisotropy पाली डाइमिथाइल-siloxane (PDMS) झिल्ली के यांत्रिक स्थिर पूर्व खंड से प्रेरित जांच की। "छोटे विरूपण सुपर बड़े पर लगाया" के सिद्धांत भविष्यवाणी की है कि प्रभावी कठोरता कोशिकाओं बढ़ाकर दिशा में भावना सीधा दिशा से अलग है, और प्रभावी कठोरता में इस अंतर anisotropy 8 सतह के कारण है। Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) एक पूर्व बढ़ाकर PDMS झिल्ली पर सुसंस्कृत, सक्रिय रूप से सतह खींच कर और एक परिणाम के रूप में anisotropy भावना पूर्व बढ़ाकर दिशा 9 में संरेखित करने में सक्षम हैं। इसी तरह, एक anisotropic सतह की गिरफ्तारीएक यांत्रिक पूर्व बढ़ाकर सतह से आइसिंग संरेखण, साथ ही विकास और myelination पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि के (डीआरजी) एक्सोन 10 प्रभावित करता है। यहाँ हम एक स्थिर पूर्व बढ़ाकर PDMS सब्सट्रेट पर सतह anisotropy उत्प्रेरण अक्षतंतु उत्थान 10 बढ़ाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

अक्षतंतु संरेखण, वांछित पैटर्न के साथ topological सुविधाओं को प्रकाश में लाना करने के लिए, गठबंधन फाइबर और चैनलों के माध्यम से संपर्क 6,11-12 मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए सूचना, अक्षतंतु संरेखण 11,13 की सुविधा के लिए प्रदर्शन किया गया। हालांकि, इस तरह के फाइबर, चैनलों और patterning के रूप में topological सुविधाओं, के माध्यम से अक्षतंतु संरेखण उत्प्रेरण के लिए तकनीक की सूचना दी, लंबा और एक्सोन की मोटाई में वृद्धि करने में असमर्थ थे। इसके विपरीत, क्रमिक मैकेनिकल अब और गहरा एक्सोन कि खंड 14 की भयावहता के साथ बढ़ के साथ खिंचाव दिशा में अक्षतंतु संरेखण के लिए नेतृत्व खींच। हालांकि, विवो में एक मोटर संचालित डिवाइस को शामिल नहीं हैसंभव। इसके विपरीत, स्थिर पूर्व बढ़ाकर प्रेरित anisotropy कम जटिल है और अधिक आसानी से इन विवो अनुप्रयोगों के लिए भविष्य पाड़ डिजाइन में शामिल किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, एक स्थिर पूर्व बढ़ाकर सेल संस्कृति प्रणाली topological सुविधाओं के बिना सतह anisotropy प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। पूर्व बढ़ाकर संस्कृति प्रणाली, एक PDMS झिल्ली, एक stretchable फ्रेम और एक खींच चरण की रचना की जिस झिल्ली फ्रेम पर तय हो गई है और एक पूर्व निर्धारित खिंचाव परिमाण खींच मंच पर लागू किया जाता है। हौसले से पृथक डीआरजी अप करने के लिए 21 दिनों के लिए पूर्व बढ़ाकर सतह पर सभ्य न्यूरॉन्स अक्षतंतु संरेखण और मोटाई के लिए निगरानी कर रहे हैं। बाद में, श्वान कोशिकाओं (एससी) गठबंधन एक्सोन myelination के लिए निगरानी कर रहे हैं के साथ सह सुसंस्कृत। पूर्व खंड प्रेरित सतह anisotropy को शामिल करके हम MSCs और डीआरजी न्यूरॉन्स 9-10 क्रमश: सेल संरेखण-भेदभाव और अक्षतंतु संरेखण-विकास को बढ़ाने में सक्षम थे।

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Protocol

कोशिकाओं के अलगाव के लिए सभी प्रक्रियाओं मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. पूर्व बढ़ाकर एनिस्ट्रोपिक सतह की तैयारी

  1. आधार और इलाज एजेंट के 1 समाधान और एक टिशू कल्चर पकवान (12 सेमी व्यास) में मिश्रण डालना: एक 10 मिलाएं। 4,900 मिलीग्राम आधार और 490 कुल crosslinking मिश्रण के लिए इलाज एजेंट मिलीग्राम का प्रयोग करें।
  2. 20 मिनट के लिए वैक्यूम के अंतर्गत जेल मिश्रण रखें हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए।
  3. 60 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इलाज के लिए ओवन में जेल मिश्रण रखें।
  4. PDMS झिल्ली इलाज के बाद, 165 mTorr पर 3 मिनट और ओ 2 के 65 SCCM प्रवाह के लिए एक प्लाज्मा सफाई / नक़्क़ाशी प्रणाली का उपयोग ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ सतह का इलाज।
  5. डिश से आयताकार झिल्ली (5 × 3.5 सेमी) का एक टुकड़ा काट, जबकि जानकार जा रहा है जो पक्ष ऑक्सीजन का इलाज है, यकीन है कि ऑक्सीजन का इलाज पक्ष का सामना करना पड़ रहा है बनाने के लिए और एक खींच फ्रेम पर ठीक। एक फ्रेम पर रखें मंच खींच और समान रूप से घुंडी जब तक यह 10% तक पहुँच जाता है बढ़ाव मंच पर बदल कर खिंचाव, अब अक्ष 9 में (या कुछ अन्य पूर्व निर्धारित खिंचाव बढ़ाव सीधे खींच मंच से पढ़ा जा सकता है)। सीमा पर शिकंजा कस द्वारा खिंचाव को ठीक करें।
  6. मंच से फ्रेम निकालें। सुनिश्चित करें झिल्ली सतह सूखी और धूल से मुक्त है, तो झिल्ली झिल्ली को कसकर संलग्न करने के लिए चैम्बर के चिपचिपा पक्ष की इजाजत देने पर एक सिलिकॉन चैम्बर जगह है।
    नोट: सिलिकॉन चैम्बर PDMS झिल्ली पर सेल के माध्यम बनाए रखने के लिए एक अच्छी तरह से प्रदान करता है। डिवाइस डिजाइन चित्र 1 में दिखाया गया है।
  7. 10 मिनट के लिए यूवी के साथ सतह जीवाणुरहित।
  8. जोड़े 1 मिलीलीटर पाली एल Lysine (पीएलएल) (बफर फॉस्फेट खारा में 0.01%) कक्ष के भीतर PDMS सतह के लिए, प्लाज्मा उपचार के 6 घंटा के भीतर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते डीआरजी न्यूरॉन्स बोने से पहले। यह सेल लगाव को बढ़ाता है।
Le "> 2। डीआरजी का अलगाव

  1. डीआरजी न्यूरॉन्स के लिए मानक मध्यम विकास तैयार करें।
  2. अलगाव के लिए पहले, अलगाव उपकरण और फिल्टर अभिकर्मकों आटोक्लेव। 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में अलगाव बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और बर्फ पर थाली जगह है। 0.05% की 9 मिलीलीटर trypsin EDTA (1 मिलीग्राम / एमएल) के लिए कोलैजिनेज़ ए (500 यू / एमएल) के 1 मिलीलीटर जोड़कर हदबंदी के माध्यम के 10 मिलीलीटर की तैयारी 0.22 माइक्रोन फिल्टर और बर्फ पर जगह के साथ समाधान फिल्टर।
  3. अलगाव के लिए 7 दिन 'पुराने Sprague-Dawley चूहों - दस से बारह 5 का प्रयोग करें। 75% isopropanol साथ पिल्ले स्प्रे, और कत्ल द्वारा बलिदान।
  4. त्वचा पीछे से रीढ़ की हड्डी overlying दूर कट और रीढ़ की हड्डी के आसपास किसी भी अतिरिक्त ऊतक को हटा दें। पर सर्जिकल जगह रोशनी के साथ एक शल्य ताल के तहत, कैंची के साथ दोनों पक्षों पर रीढ़ साथ एक कट तो गर्दन से पहले चीरा बनाने के लिए और। पिल्ले के शरीर से रीढ़ की हड्डी को अलग करें और अतिरिक्त मांसपेशियों को हटा दें। फिर, लंदन के साथ कटौती करने के लिए कैंची का उपयोगरीढ़ की हड्डी और उपयोग चिमटी की जी अक्ष रीढ़ की हड्डी पूरी तरह से खुला है और रीढ़ की हड्डी में cord.Remove एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में अलगाव बफर के साथ DRGs स्थानांतरित करने के लिए एक बड़ा खोलने बनाने के लिए एक विंदुक टिप से निकालने के लिए।
  5. चिमटी का जुर्माना जोड़ी का उपयोग, हड्डी जेब से नाड़ीग्रन्थि हटाने और लगभग 10 इकट्ठा - दोनों पक्षों से 16 डीआरजी। तंत्रिका जड़ों ट्रिम और ठंडा अलगाव बफर करने के लिए गैन्ग्लिया हस्तांतरण।
  6. एक विंदुक टिप से हटाये एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में अलगाव बफर के साथ DRGs स्थानांतरित करने के लिए एक बड़ा खोलने बनाने के लिए। रासायनिक हदबंदी के बाद, सेंट्रीफ्यूज 900 XG और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गैन्ग्लिया।
  7. ऊतकों ट्यूब के नीचे बसा है और धीरे शीर्ष पर अलगाव बफर हटाने और ट्यूब में हदबंदी माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  8. 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में हदबंदी मध्यम में विच्छेदित ऊतकों सेते हैं जबकि ट्यूब हर 5 हिलती - 10 मिनट।
  9. बादरासायनिक हदबंदी, सेंट्रीफ्यूज 900 XG पर ganglia और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
  10. तैरनेवाला निकालें और 10 मिलीलीटर मानक विकास मीडिया और भंवर में गोली फिर से निलंबित।
  11. के रूप में एक बार फिर से धारा 2.9 में संकेत अलग कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  12. सतह पर तैरनेवाला निकालें, मानक विकास मीडिया और भंवर के 12 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित।

3. पूर्व बढ़ाकर भूतल पर डीआरजी की संस्कृति

  1. , कोशिकाओं बोने चैम्बर से पीएलएल समाधान निकालें और बाँझ पानी और शुष्क हवा के साथ PDMS सतह कुल्ला करने से पहले।
  2. 2 मिनट के मलबे ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए - कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के बाद, 1 के लिए निलंबन स्थापित करते हैं। सेल निलंबन के 1.5 मिलीलीटर प्रत्येक खंड के चेंबर में जोड़ें और 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. इन विट्रो में 1 दिन (DIV) में glial कोशिकाओं को खत्म करने के लिए, 10 μl (या 15 μl) फ्लोरो 2 Deoxy-uridine और uridine (FDU-यू) के शेयर soluti का मिश्रण जोड़ेंपर (सामग्री की तालिका देखें) प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए। 7 घंटे के बाद, ताजा मानक मध्यम विकास के साथ इस माध्यम की जगह है और 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पूर्व बढ़ाकर संस्कृति डिवाइस जगह है।
  4. सेल संस्कृति अवधि के दौरान (2 - 3 सप्ताह), ताजा माध्यम के साथ आधा खर्च मध्यम जगह से मीडिया हर दो दिन बदल जाते हैं। नोट: पर 2 सप्ताह के लिए बढ़ाया और unstretched सतहों संवर्धन के बाद, शुद्ध अनुसूचित जाति चैम्बर के लिए जोड़ा गया है और एक और सप्ताह (कदम 4.7) के लिए सुसंस्कृत हैं।

4. पूर्व बढ़ाकर भूतल पर डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ श्वान कोशिकाओं (एससी) के सह-संस्कृति

  1. अनुसूचित जाति को अलग रूप में डा Campana के समूह पहले से 15 से वर्णन किया।
    1. संक्षेप में, एक 1 दिन पुराने पिल्ला से अनुसूचित जाति अलग। लीजिए और sciatic नसों दोनों रासायनिक (trypsin-EDTA और कोलेजिनेस ए) और यंत्रवत् (18 गेज सुई / 10 मिलीलीटर सिरिंज) 15 अलग कर देना।
    2. में पाली डी lysine (पीडीएल) के सह अलग कोशिकाओं बीज5% सीओ 2 में पैदा T25 फ्लास्क और 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति। 5 दिन, का उपयोग कर-तेरा विरोधी 1.1 एंटीबॉडी और खरगोश पूरक एंटीबॉडी चयन के माध्यम से कोशिकाओं को शुद्ध और 2 पारित होने के लिए शुद्ध कोशिकाओं उपसंस्कृति - 4. का प्रयोग संस्कृति Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त मध्यम (एफबीएस) , 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / Strep), 21 माइक्रोग्राम / एमएल गोजातीय पिट्यूटरी निकालने (BPE), और 4 माइक्रोन के Forskolin।
  2. अनुसूचित जाति से संस्कृति के माध्यम से निकालें, और कुप्पी में 5 मिलीलीटर 0.05% trypsin EDTA जोड़ें। 3 मिनट - 5% सीओ 2 2 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  3. एक 10x उद्देश्य का उपयोग करता है, तो वे कुप्पी से ऊपर उठा देखते हैं, तो संस्कृति के माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और फ्लास्क में कोशिकाओं के साथ मिश्रण करने के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें।
  4. 200 XG पर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए सेल निलंबन जोड़ें और 5 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस।
  5. तैरनेवाला निकालें और 7 मिलीलीटर मानक डीआरजी विकास मेड में गोली resuspendमैं एक।
  6. एक 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में सेल निलंबन के 10 μl ले लो, trypan नीले रंग के 10 μl के साथ मिश्रण, और फिर एक 10x उद्देश्य का उपयोग ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के तहत एक hemocytometer का उपयोग सेल नंबर गिनती। डीआरजी विकास मीडिया जोड़कर मिलीलीटर प्रति 5,000 कोशिकाओं के लिए सेल निलंबन पतला।
  7. बढ़ाकर कक्ष में डीआरजी संस्कृति से मध्यम के 0.5 मिलीलीटर निकालें और डीआरजी संस्कृति के लिए अनुसूचित जाति निलंबन के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  8. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. परिवर्तन पर 1 सप्ताह के लिए कोशिकाओं मीडिया डीआरजी के लिए नए सिरे से मानक मध्यम विकास के साथ आधा खर्च मध्यम जगह से हर दो दिन। 1 सप्ताह के सह-संस्कृति के बाद, प्रक्रिया immunohistochemistry 10 से कोशिकाओं।

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Representative Results

पूर्व बढ़ाकर सेल संस्कृति प्रणाली डीआरजी अक्षतंतु संरेखण 10 बढ़ावा दिया। डीआरजी न्यूरॉन्स 12 दिनों के लिए पर पूर्व बढ़ाकर और unstretched सतहों संवर्धन किया गया। एक्सोन β-III ट्यूबिलिन उनके संरेखण को प्रदर्शित करने के लिए दाग रहे थे। चित्रा 2 संस्कृति के 12 दिनों के बाद पूर्व बढ़ाकर और unstretched PDMS substrates पर अक्षतंतु उन्मुखीकरण तुलना करती है। डीआरजी एक्सोन बढ़ाकर दिशा के समानांतर गठबंधन किया है, जबकि वे यादृच्छिक संरेखण दिखाया और unstretched PDMS सब्सट्रेट पर एक परस्पर नेटवर्क का गठन किया।

अक्षतंतु संरेखण उत्प्रेरण के अलावा, पूर्व खंड प्रेरित anisotropy axons की स्फुरण बढ़ाया। बढ़ाकर सतह का गठन axonal बंडलों पर गठबंधन एक्सोन, जो जुड़ा axonal नेटवर्क से मतभेद unstretched सतह पर मनाया। पूर्व बढ़ाकर सतह पर इन स्तबकीय बंडलों तंत्रिका ऊतक टीआर मचीमें कृत्यों विवो। चित्रा 3 संस्कृति के 21 दिनों के बाद पूर्व बढ़ाकर और unstretched सतहों डीआरजी न्यूरॉन्स की एक्सोन से पता चलता है। चित्रा 3 दिखाता है, पूर्व बढ़ाकर सब्सट्रेट एक साथ एकत्रित पर एक्सोन बंडलों, जो स्तबकीय इलाकों के समान दिखाई दिया के रूप में। यह सुझाव पूर्व बढ़ाकर सतह पूर्व खंड की दिशा है, जो तंत्रिका ऊतक के उत्थान को बढ़ाने में महत्वपूर्ण हैं में व्यापक अक्षतंतु विकास को बढ़ावा देने के लिए सक्षम था।

myelination का आकलन करने के लिए, अनुसूचित जाति गठबंधन एक्सोन के साथ सह-सुसंस्कृत थे। पर 2 सप्ताह के लिए बढ़ाया और unstretched सतहों डीआरजी संवर्धन न्यूरॉन्स के बाद, शुद्ध अनुसूचित जाति चैम्बर के लिए जोड़ा गया है और एक सप्ताह के लिए सुसंस्कृत थे। चित्रा 4 में, सह संस्कृति की एक्सोन β-III ट्यूबिलिन (हरा) के साथ दाग रहे हैं, और अनुसूचित जाति P0 (लाल) के साथ दाग रहे हैं। P0 परिपक्व अनुसूचित जाति के एक मार्कर है और यह भी माइलिन आवरण का एक घटक है,साथ ही साथ myelination का सूचक माना जाता है। वहाँ महत्वपूर्ण पूर्व बढ़ाकर सतह पर हरे और लाल रंग की सह स्थानीयकरण, बढ़ाकर सतह पर एक्सोन के लिए संलग्न अनुसूचित जाति का सूचक है, लेकिन unstretched सतह जहां हरे और लाल दाग बेतरतीब ढंग से वितरित कर रहे हैं पर नहीं है। पूर्व बढ़ाकर सतहों अक्षतंतु संरेखण, स्तबकीय की तरह पथ गठन, और पुनर्जीवित करने के लिए एक्सोन अनुसूचित जाति की कुर्की, myelination के लिए सभी महत्वपूर्ण बढ़ाया।

आकृति 1
चित्रा 1:। पूर्व खंड प्रक्रिया के लिए योजनाबद्ध (क) PDMS झिल्ली का एक टुकड़ा फ्रेम कि फिसलने लायक हैं के दो स्ट्रिप्स पर काटा गया है। डिवाइस के फ्रेम लगभग 7 "एक्स 5" है; ब्रेसिज़ के बारे में 5 कर रहे हैं "एक्स 1; ब्रेसिज़ पर clamps हैं के बारे में 3" एक्स .25 ", और कप के बारे में 1.5 है" व्यास खुली शीर्ष, 1 "खुले नीचे, और के बारे में 0.25 & #34; लंबा। (ख) खींच मंच पर फ्रेम की जगह, 10% बढ़ाव लागू करने के लिए रोलर की बारी है, और फिर शिकंजा कस द्वारा स्ट्रिप्स के पदों को ठीक। (ग) खींच मंच से फ्रेम निकालें, और झिल्ली पर एक सिलिकॉन चैम्बर देते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एक्जॉन संरेखण पूर्व बढ़ाकर और unstretched भूतल पर 12 दिनों के लिए (क) स्थिर पूर्व बढ़ाकर सतह पर वरीयता प्राप्त डीआरजी न्यूरॉन्स, 12 दिनों के लिए (ख) unstretched सतह पर वरीयता प्राप्त डीआरजी कोशिकाओं के साथ तुलना के फ्लोरोसेंट छवियों।। एक्सोन, पूर्व बढ़ाकर दिशा में गठबंधन जबकि एक्सोन unstretched नियंत्रण सतह पर बेतरतीब ढंग से गठबंधन किया। एक्जॉनविरोधी माउस β-III ट्यूबिलिन प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे, और confocal खुर्दबीन एक 10x उद्देश्य का उपयोग के साथ imaged। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: पर एक्जॉन मोटाई विकास बनाम तनी unstretched PDMS सब्सट्रेट पर (क) बढ़ाकर और (ख) के 21 दिनों के बाद unstretched सतहों डीआरजी एक्सोन के चरण विपरीत छवियों।। फैला सतह पर एक्सोन, मोटा बंडलों का गठन करते हुए unstretched सतह पर एक्सोन आपस में जुड़े axonal नेटवर्क का गठन किया। छवियाँ उल्टा चरण विपरीत एक 10x उद्देश्य का उपयोग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था। अल देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की arger संस्करण।

चित्रा 4
चित्रा 4:। सह सुसंस्कृत निरपेक्ष डीआरजी Axons के साथ अनुसूचित जाति पर बनाम unstretched PDMS Substrates तनी पर 2 सप्ताह के लिए बढ़ाया और unstretched सतहों संवर्धन के बाद, शुद्ध अनुसूचित जाति चैम्बर के लिए जोड़ा गया है और एक सप्ताह के लिए सुसंस्कृत थे। (क) β-III ट्यूबिलिन (हरा) बढ़ाकर सतह पर एक्सोन के लिए धुंधला हो जाना; (ख) β-III ट्यूबिलिन के ओवरले (हरा), P0 (लाल) बढ़ाकर सतह पर धुंधला हो जाना; (ग) β-III ट्यूबिलिन (हरा) unstretched सतह पर एक्सोन के लिए धुंधला हो जाना; (घ) β-III ट्यूबिलिन (हरा) के ओवरले, P0 (लाल) unstretched सतह पर धुंधला हो जाना। पूर्व बढ़ाकर सतह पर, लाल और हरे रंग के धब्बे colocalize, अनुसूचित जाति सुझाव से जुड़े होते हैं और संभावना एक्सोन myelinating। unstretched परसतह, लाल और हरे रंग के धब्बे बेतरतीब ढंग से वितरित कर रहे हैं, अनुसूचित जाति सुझाव एक्सोन से जुड़ी नहीं हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पूर्व बढ़ाकर सतह पर अक्षतंतु संरेखण के लिए प्रेरित करने के लिए, वहाँ दो महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) PDMS झिल्ली सपाट होना चाहिए और समरूप मोटाई की; और 2) glial कोशिकाओं डीआरजी से हटा दिया जाना चाहिए। PDMS और crosslinker मिश्रण और एक ओवन में इलाज करने के बाद, Crosslinked PDMS जेल एक फ्लैट बेंच शीर्ष पर रखा है और किसी भी झुकने से बचने के लिए सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए। के बाद से सतह के hydrophilicity (सेल लगाव के लिए आवश्यक) प्लाज्मा उपचार के बाद समय के साथ attenuates PDMS झिल्ली की ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार, पीएलएल कोटिंग से 6 घंटा के भीतर का पालन किया जाना चाहिए। चूंकि प्लाज्मा उपचार झिल्ली के एक तरफ करने के लिए लागू किया जाता है, देखभाल सही पक्ष सुनिश्चित करने के लिए पकवान बंद PDMS छीलने के बाद लिया जाना चाहिए फ्रेम पर रखा गया है, वह यह है कि प्लाज्मा इलाज सतह के लिए कोशिकाओं के लिए ऊपर का सामना करना पड़ जाना चाहिए संलग्न करें।

DRGs हड्डी जेब है कि रीढ़ की हड्डी के साथ संरेखित के अंदर स्थित हैं। चूंकि बांस के रंग में सफेद हैयुवा पिल्ले, यह बांस से DRGs भेद करना मुश्किल है। इस मामले में, यह रीढ़ जगह रोशनी के करीब जगह के लिए महत्वपूर्ण है। प्रकाश के तहत, DRGs पारदर्शी बारी है, जबकि हड्डी सफेद और अपारदर्शी बनी हुई है। इसके बाद से पीएच तंत्रिका कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित करती है, बर्फ पर और एक शारीरिक पीएच पर विच्छेदन बफर रखने के लिए महत्वपूर्ण है। पृथक ऊतकों बहुत चिपचिपा रहे हैं और जब एक अपकेंद्रित्र ट्यूब को स्थानांतरित करने के लिए विंदुक टिप रहना हैं। इस प्रकार उत्पन्न करने के लिए एक बड़ा खोलने हस्तांतरण की सुविधा पिपेट की बहुत टिप काटने।

कुछ प्रोटोकॉल में, वहाँ एक और centrifugation पृथक ऊतकों के साथ आवश्यक कदम हदबंदी बफर जोड़ने से पहले है। इस कदम के एवज में, हमारे प्रोटोकॉल मिनट की एक जोड़ी है, जो अतिरिक्त centrifugation कदम है कि अन्यथा व्यवहार्यता और कोशिकाओं का घनत्व प्रभाव होगा कम कर देता है के लिए विच्छेदन बफर में बसने के लिए ऊतकों की आवश्यकता है। सेल घनत्व भी निर्भर हैपिल्ले की संख्या पर बलिदान, और इस तरह पिल्ले की एक सुसंगत संख्या हर समय बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। वहाँ भी glial कोशिकाओं है कि डीआरजी न्यूरॉन्स, इस प्रकार एक mitotic अवरोध, FDU-यू, glial कोशिकाओं के विकास को दबाने के लिए 1 DIV पर संस्कृति के माध्यम से जोड़ा जाता है के साथ अलग कर रहे हैं। यह आमतौर पर है, हालांकि कुछ प्रोटोकॉल arabinofuranosylcytidine (Arac) और FDU-यू का एक संयोजन पसंद करते हैं न्यूरॉन्स के प्रारंभिक विकास की अवधि के दौरान glial कोशिकाओं को बाधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। FDU-यू की दाढ़ एकाग्रता जोड़ा संस्कृति, अलग प्रोटोकॉल में बदलता अलग कक्षों के घनत्व पर निर्भर करता है। हम पूरे डीआरजी संस्कृति के दौरान mitotic अवरोध जरूरत के रूप में (यदि glial कोशिकाओं मौजूद हैं), (एकाग्रता 3.3 कदम में निर्दिष्ट) कई बार जोड़ा जा सकता पाया। यह आम तौर पर यह प्रभावों डीआरजी न्यूरॉन्स की कुर्की के बाद से किसी भी समय में एक बड़ी राशि (अधिक से अधिक 15 μl) जोड़ने के लिए सिफारिश नहीं है।

प्लाज्मा उपचार surfac को बढ़ाता हैएक्सोन लगाव को आरंभ करने के लिए ई hydrophilicity और पीएलएल कोटिंग एक आरोप लगाया सतह प्रदान करता है। साहित्य में संदर्भ के अनुसार, प्लाज्मा उपचार प्रेरित hydrophilicity सूखे की स्थिति 16-17 के तहत समय के साथ attenuate जाएगा। हालांकि PDMS तरल की शर्तों के तहत पानी के साथ एक धीमी प्रतिक्रिया से गुजरना होगा और धीरे-धीरे हाइड्रोफिलिक से 18 हाइड्रोफोबिक किया जा रहा से बदल जाएगा। इसलिए भले ही प्लाज्मा उपचार समय के साथ attenuates, यह हमारे परिणामों को प्रभावित नहीं करना चाहिए। पीएलएल कोटिंग के लिए, आपूर्तिकर्ता से उत्पाद जानकारी के अनुसार, यह पिछले कुछ वर्षों में स्थिर यदि अनुकूल परिस्थितियों के तहत रखा गया है। एक बार कोशिकाओं पीएलएल कोटिंग पर देते हैं, वे आम तौर पर अलग नहीं होंगे। इसके अतिरिक्त, पीएलएल कोटिंग प्रारंभिक लगाव के साथ मदद करता है, और के रूप में कोशिकाओं वे छिपाना बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन है जो आगे बढ़ने के लिए उन्हें मदद की सतह से 19 लंगर डाले रहते हैं। भविष्य डिजाइन सुधार पीडी में पेप्टाइड्स imbedding शामिल हो सकते हैंcrosslinking दौरान एमएस नेटवर्क है, जो प्लाज्मा उपचार और पीएलएल कोटिंग कदम को समाप्त होगा।

प्रोटोकॉल के साथ साथ, एक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण है कि सतह anisotropy उत्पन्न सफलतापूर्वक अक्षतंतु संरेखण, विकास और myelination के लिए प्रेरित करने का वर्णन किया। दृष्टिकोण प्रयोगात्मक दो मायनों में विस्तार किया जा सकता है। सबसे पहले, anisotropic सतह संस्कृति में तंत्रिका ऊतकों बनाने के लिए लागू किया जा सकता है, और इन विट्रो तंत्रिका इलाकों तो विवो में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। दूसरा, सतह anisotropy की अवधारणा transplantable scaffolds के डिजाइन है कि इन विवो में इस्तेमाल किया जा सकता मेजबान अनुसूचित जाति से चोट साइट और myelination से regenerating axons की संरेखण को बढ़ाने के लिए में शामिल किया जा सकता है। दूसरे दृष्टिकोण है जो कई और जटिल उपकरणों 20-22, साथ ही विकास के कारकों के अलावा आवश्यकता की तुलना में हमारे मंच अपेक्षाकृत सरल और आसानी से लागू है, और केवल पूर्व खंड पर निर्भर करता है दोनों अक्षतंतु अली को बढ़ाने के लिएgnment और विकास के कारक इसके लिए आवश्यकता के बिना myelination। इसके अलावा हम दोनों MSCs और डीआरजी न्यूरॉन्स जो आसानी से अन्य प्रकार की कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है पर प्रयोगात्मक डिजाइन में पूर्व खंड की इस अवधारणा का परीक्षण किया है। वर्तमान डिजाइन 2-आयामी सतहों पर अक्षतंतु विकास जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, हालांकि भविष्य में डिवाइस 3-dimenstional सेल संस्कृतियों के परीक्षण के लिए सक्षम करने के लिए उन्नत किया जा सकता है। तंत्रिका की मरम्मत और प्रत्यारोपण में भविष्य अनुप्रयोगों biodegradable प्राकृतिक या सिंथेटिक सामग्री नियंत्रित रिलीज दवा गुणों के साथ साथ crosslinked पेप्टाइड्स युक्त से बने transplantable scaffolds में पूर्व खंड शामिल कर सकता है।

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Acknowledgments

लेखकों PDMS substrates की तैयारी में उसकी सहायता के लिए एरिक वास्को का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, उपयोगी सुझाव और डीआरजी अलगाव के प्रशिक्षण के लिए मिशिगन विश्वविद्यालय में डॉ मरीना माता की लैब में डॉ Shiyong वैंग, और डॉ मार्क Tuszynski और डॉ । यूसी सैन डिएगो में डब्ल्यू मैरी Campana अनुसूचित जाति अलगाव के लिए उपयोगी सुझाव और प्रोटोकॉल के लिए। इस अध्ययन में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (CBET 0941055 और 1510895 CBET), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R21CA176854, R01GM089866, और R01EB014986) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Medium 1x GibcoBRL 21103-049
B27 Supplement 50x GibcoBRL 17504-044
Glutamax-I 100x GibcoBRL 35050-061
Albumax-I GibcoBRL 11020-021
Nerve Growth Factor-7S Invitrogen 13290-010
Penicillin-streptomycin GibcoBRL 15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA GibcoBRL 25300-054
Poly-L-Lysine Trevigen 3438-100-01
Poly-D-Lysine Sigma p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine Sigma F0503
Uridine Sigma U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112 Isolation Buffer
Type I Collagenase Worthington LS004196
DMEM Gibco 11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum Hyclone SH30080.03
BPE Clonetics CC-4009
Forskolin Calbiochem 344270
Silicone chamber Greiner bio-one FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system March Instruments PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody Sigma- Aldrich M7898
Rabbit Complement Sigma- Aldrich S-7764
Standard growth medium For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.

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तंत्रिका विज्ञान अंक 114 डीआरजी अलगाव पूर्व खंड anisotropy अक्षतंतु संरेखण श्वान सेल myelination।
एक दृष्टिकोण संरेखण और पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की myelination बढ़ाने के लिए
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Liu, C., Chan, C. An Approach to… More

Liu, C., Chan, C. An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (114), e54085, doi:10.3791/54085 (2016).

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