Introduction
I nerveskader, blir de proksimale og distale nervestumpene ofte hindres fra direkte omstillingen av nerve fascicles på grunn av lesjon området 1-2. Normalt er axon traktater inneholder meget bestilt og justert bunter av aksoner, som danner komplekse nettverk av tilkoblingsmuligheter. Imidlertid er nerve regenerering en kaotisk prosess på grunn av dårlig organisert axon justering 3-4. Derfor, for å generere et tilstrekkelig antall regenerering av aksoner som bro over lesjon området, er det nødvendig å indusere godt organisert aksonal innretting. I tillegg følger demyelinisering nerveskader som følge av dødsfallet av myelinerende celler på skadestedet. Siden demyelinisering sterkt svekker ledende kapasitet til å overleve aksoner, behandlinger rettet mot demyelinisering eller fremme remyelinisering har betydning for funksjonell bedring etter nerveskade 5. Dermed målet med denne protokollen er å illustrere en teknisk tilnærming som tar disse to spørsmåleneav nerve regenerering.
Overflate anisotropi, som er definert som en forskjell, da målt langs forskjellige akser, i en materialenes fysikalske eller mekaniske egenskaper, har vært anvendt for å påvirke celle innretting, vekst og migrasjon 6-7. I tillegg til topografi, finnes det andre metoder for å indusere anisotropi. Tidligere undersøkte vi overflaten anisotropi indusert av mekanisk statisk pre-strekning av poly-dimetyl-siloksan (PDMS) membran. Teorien om "liten deformasjon super pålagt store" spådd at den effektive stivhet cellene fornemme i strukket retning avviker fra den vinkelrett retning, og denne forskjellen i effektiv stivhet skyldes overflate anisotropi 8. Mesenchymale stamceller (MSC) dyrket på en på forhånd strukket PDMS membran er i stand til å avføle anisotropien ved aktivt å trekke overflaten og som et resultat, justere i forstrukket retning 9. Tilsvarende en anisotropisk overflate arisere fra en mekanisk pre-strukket overflaten påvirker justeringen, samt vekst og myelination av dorsal root ganglion (DRG) aksoner 10. Her gir vi en protokoll for å indusere overflate anisotropi på en statisk pre-strukket PDMS underlaget for å forbedre axon regenerering 10.
For å lokke fram axon innretting, topologiske egenskaper med ønskede mønstre, rapportert å gi kontakt veiledning gjennom orienterte fibre og kanaler 6,11-12, ble demonstrert for å lette axon justering 11,13. Imidlertid rapporterte teknikker for å indusere axon innretting gjennom topologiske trekk, såsom fibre, kanaler og mønstring, ikke var i stand til å forlenge og øke tykkelsen av aksonene. I motsetning til dette gradvis mekanisk strek ført til axon innretting i strekkretningen med lengre og tykkere aksoner som økte med størrelsen av den strekning 14. Imidlertid, som omfatter en motordrevet anordning in vivo er ikkegjennomførbar. I kontrast, er statisk pre-strukket indusert anisotropi mindre komplisert og kan lettere innarbeidet i fremtidige stillas design for in vivo-applikasjoner.
I denne protokollen, er en statisk forstrukket cellekultursystem som brukes for å indusere overflate anisotropi uten topologiske egenskaper. Den forstrukket kultursystem er sammensatt av en PDMS-membran, en strekkramme og en strekking stadium, hvoretter membranen er festet til rammen og en på forhånd bestemt strekning størrelse blir påført på strekketrinnet. Fersk isolerte DRG nerveceller dyrket på pre-strukket overflate for opp til 21 dager overvåkes for axon justering og tykkelse. Deretter Schwann celler (SCS) co-dyrket med de flukt axoner overvåkes for myelination. Ved å innlemme pre-stretch indusert overflate anisotropi vi var i stand til å forbedre celle alignment-differensiering og axon alignment-vekst av MSC og DRG nevroner 9-10, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer for isolering av cellene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Michigan State University.
1. Utarbeidelse av pre-strukket Anisotropic Surface
- Blande en 10: 1 løsning av base og herder og hell blandingen i en vevskulturskål (12 cm diameter). Bruk 4900 mg base og 490 mg herdemiddel for den totale tverrbindingsmonomer blanding.
- Hold gel blandingen under vakuum i 20 min for å fjerne luftbobler.
- Plassere gelen blandingen i ovnen for herding natten over ved 60 ° C.
- Etter PDMS membran kurer, behandle overflaten med oksygenplasma ved hjelp av et plasma rengjøring / etsning system i 3 minutter ved 165 mTorr og 65 sccm strøm av O 2.
- Klipp et stykke rektangulær membran (5 × 3,5 cm) fra fatet, men som samtidig er bevisst hvilken side er oksygen-behandlet, må oksygenbehandlede side vender opp og fikse på en strekk ramme. Plasser rammen på en strekker scenen og jevnt strekk ved å vri rattet på scenen til den når 10% forlengelse (eller noen andre forhåndsbestemt strekning, forlengelsen kan direkte lese fra strekker scenen) på lengre aksen 9. Fix strekningen ved å stramme skruene på rammen.
- Fjern rammen fra scenen. Sørg for at membranen overflaten er tørr og fri for støv, deretter plassere en silikon kammer på membranen slik at den klebrige siden av kammeret til å feste fast i membranen.
Merk: silikon kammer gir et godt for å holde cellen medium på PDMS membran. Anordningen utforming er vist i figur 1. - Sterilisere overflaten med UV i 10 min.
- Tilsett 1 ml poly-L-lysin (PLL) (0,01% i fosfatbufret saltvann) for å PDMS overflate i kammeret, innen 6 timer fra plasma behandling og inkuber i 2 timer ved 37 ° C før utsåing av DRG-neuroner. Dette forbedrer celle vedlegg.
- Forbered standard vekstmedium for DRG nevroner.
- Før isolering, autoklaver isolasjon utstyr og filter reagenser. Tilsett 5 ml isoleringsbuffer i en brønn i en 6-brønns plate, og plassere platen på is. Fremstille 10 ml dissosiasjon medium ved å tilsette 1 ml av kollagenase A (500 U / ml) til 9 ml av 0,05% Trypsin-EDTA (1 mg / ml), filtrere løsninger med et 0,22 mikrometer filter og sted på is.
- Bruk ti til tolv 5-7 dagers gamle Sprague-Dawley rotter for isolering. Spray valpene med 75% isopropanol, og ofre ved halshogging.
- Skjær bort huden overliggende ryggmargen fra baksiden og fjerne overflødig vev rundt ryggraden. Under en kirurgisk forstørrelsesglass med kirurgiske spotlys på, gjør den første snitt fra nakken og deretter en kutt langs ryggraden på begge sider med saks. Løsne ryggraden fra kroppen av valpene og fjerne overflødig muskler. Deretter bruker saks til å klippe langs long aksen av ryggraden og bruke pinsett for å åpne ryggraden helt og pakke rygg cord.Remove tips fra en pipette for å lage en større åpning for overføring av DRG med isolasjon buffer i en steril 15 ml tube.
- Ved hjelp av en fin pinsett, fjerner ganglion fra benet lommen og samle ca 10-16 DRG fra begge sider. Trim nerverøtter og overføre ganglia til iskald isolasjon buffer.
- Fjerne spissen fra en pipette for å skape en større åpning for overføring av DRG med isolasjonsbuffer inn i et sterilt 15 ml rør. Etter kjemisk dissosiasjon, sentrifuger gangliene ved 900 xg og 4 ° C i 5 minutter.
- La vev sette seg på bunnen av røret og fjern forsiktig isolasjon buffer på toppen og tilsett 10 ml dissosiasjon medium inn i røret.
- Inkuber dissekerte vev i dissosiasjon medium i et 37 ° C vannbad i 1 time under rysting røret hvert 5. - 10 min.
- Etterkjemisk dissosiasjon, sentrifuger gangliene ved 900 xg og 4 ° C i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og re-suspendere pelleten i 10 ml standard vekstmedier og vortex.
- Sentrifuger dissosierte celler som angitt i § 2.9 igjen.
- Fjern supernatanten, re-suspendere pelleten i 12 ml av standard vekstmedier og virvle.
3. Kultur av DRG på Pre-strukket Surface
- Før såing cellene, fjerne PLL løsninger fra kammeret og skyll PDMS overflaten med sterilt vann og lufttørke.
- Etter re-suspendering av cellene, la suspensjonen satt i 1 - 2 minutter for å tillate avfall å sette seg på bunnen av røret. Tilsett 1,5 ml av cellesuspensjonen i hver strekning kammeret og inkuber ved 37 ° C ved 5% CO2.
- For å eliminere gliacellene, på en dag in vitro (DIV), tilsett 10 ul (eller 15 mL) blanding av fluor-2 deoksy-uridin og uridin (FDU-U) lager solutipå (se tabell of Materials) til hver brønn. Etter 7 timer, erstatte dette mediet med frisk standard vekstmedium og plasser pre-strukket kultur enhet i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2.
- I løpet av celledyrkningsperioden (2 - 3 uker), endrer mediet annenhver dag ved å erstatte halvparten av den brukte mediet med friskt medium. Merk: Etter dyrking på strukket og unstretched overflater for 2 uker, blir renset SC'er lagt til kammeret og dyrket i en uke (trinn 4.7).
4. Co-kulturen i Schwann celler (SCS) med DRG nevroner på Pre-strukket Surface
- Isoler SC'er som beskrevet av Dr. Campana gruppe tidligere 15.
- Kort, isolere SC'er fra en 1 dag gammel valp. Samle og distansere de sciatic nervene både kjemisk (Trypsin-EDTA og Collage A) og mekanisk (18 gauge nål / 10 ml sprøyte) 15.
- Seed dissosiert celler i poly-D-lysin (PDL) corerte T25-kolbe og kulturen ved 37 ° C ved 5% CO2. På dag 5, rense cellene gjennom antistoff ved bruk av anti-THY-1,1-antistoff og kaninkomplement og subkultur de rensede celler til passasje 2 - 4. Bruk kulturmedium inneholdende Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM), 10% føtalt bovint serum (FBS) , 1% penicillin / streptomycin (Penn / Strep), 21 ug / ml bovint hypofyseekstrakt (BPE), og 4 uM Forskolin.
- Fjerne kulturmediet fra SCS, og tilsett 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA i kolben. Inkuber cellene ved 37 ° C ved 5% CO2 i 2 - 3 min.
- Sjekk-celler under optisk mikroskop ved hjelp av et 10X objektiv for å se om de løfter opp fra flasken, deretter tilsett 5 ml kulturmedium og blandes med cellene i kolben.
- Legg til cellesuspensjonen i et 15 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 200 xg og 20 ° C i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 7 ml standard DRG vekst Media.
- Ta 10 mL av cellesuspensjonen i en 0,5 ml mikrosentrifugerør, bland med 10 mL av trypan blå, og deretter telle celle nummer ved hjelp av en hemocytometer henhold optisk mikroskopi ved hjelp av en 10X objektiv. Fortynn cellesuspensjonen til 5000 celler per ml ved tilsetning av DRG vekstmedier.
- Fjern 0,5 ml av medium fra DRG-kultur i den strukkede kammeret og tilsett 0,5 ml SC suspensjon til den DRG-kultur.
- Kultur av cellene i 1 uke ved 37 ° C og 5% CO 2. Endring mediet annenhver dag ved å erstatte halvparten av den brukte mediet med friskt standard vekstmedium for DRG. Etter en uke co-kultur, prosess cellene ved immunhistokjemi 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den pre-strukket cellekultur system fremmet DRG axon justering 10. DRG nevroner ble dyrket på pre-strukket og unstretched overflater i 12 dager. Aksonene ble farget for β-III-tubulin å demonstrere sin innretting. Figur 2 sammen axon orientering på pre-strukket og unstretched PDMS underlag etter 12 dager med kultur. DRG-aksoner innrettet parallelt med den strukkede retning, mens de viste tilfeldig innretting, og dannet et sammenkoplet nettverk på den ustrukkede PDMS substratet.
I tillegg til å fremkalle axon justering, pre-stretch indusert anisotropi forbedret Leamus av aksoner. De justert aksoner på strukket overflaten dannet aksonal bunter, som skilte seg fra den tilkoblede aksonal nettverk observert på strukket overflaten. Disse fascikulær bunter på pre-strukket overflate lignet nervevev trhandlinger in vivo. Figur 3 viser axoner av DRG nevroner på pre-strukket og unstretched overflater etter 21 dager med kultur. Som figur 3 viser, til aksonene på pre-strukket underlaget aggregert sammen danner bunter, som dukket opp lik fascikulær traktater. Dette antydet at forstrukket overflate var i stand til å fremme utstrakt axon vekst i retning av forstrekking, som er viktige i å forbedre regenerering av nervevev.
For å vurdere myelination, SC'er samtidig var dyrket med de flukt aksoner. Etter dyrking av DRG-neuroner på de strukkede og ustrukkede overflater i 2 uker, ble renset SC'er tilsatt til kammeret og dyrket i en uke. I figur 4 er axons av co-kultur farget med β-III-tubulin (grønn), og SCS er farget med P0 (rød). P0 er en markør for moden SC'er og er også en komponent i myelinlaget,så vel som betraktes som en indikator på myelinisering. Det er betydelig samlokalisering av grønt og rødt på pre-strukket overflate, som tyder på SC'er som knytter seg til aksonene på strukket overflaten, men ikke på strukket overflaten der den grønne og røde flekker er tilfeldig fordelt. De forhånds strukket overflater forbedret axon justering, fascikulær lignende kanalen formasjon, og feste av SC'er til regenererte aksoner, all kritisk for myelination.
Figur 1:. Skjematisk for Pre-strekningen Prosedyre (a) Et stykke PDMS membranen klipses på to strimler av rammen som er glid. Rammen av enheten er ca. 7 "x 5"; bukseseler er ca 5 "x 1; klemmene på bukseseler er ca 3" x 0,25 ", og koppen er 1,5" diameter vidåpne toppen, 1 "åpen bunn, og om 0,25 & #34; høy. (B) Plasser rammen på stretching scenen, slår valsen for å bruke 10% forlengelse, og deretter fikse posisjonene til strimlene ved å stramme skruene. (C) Fjern rammen fra stretching scenen, og legge ved en silisium kammer på membranen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Axon Alignment på Pre-strukket og strukket Surface Fluorescent bilder av DRG nevroner seeded på (a) statisk pre-strukket overflate for 12 dager, sammenlignet med DRG-celler seeded på (b) strukket overflaten i 12 dager.. Axoner justert i pre-strukket retning, mens aksoner justert tilfeldig på strukket kontroll overflaten. axons ble farget med anti-mus β-III tubulin primær antistoff, og avbildes med confocal mikroskop bruker en 10X objektiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Axon Tykkelse Vekst på strukket vs. unstretched PDMS Underlag fase kontrast av DRG axoner på (a) strukket og (b) unstretched overflater etter 21 dager.. Aksoner i strukket overflate formet tykkere bunter, mens på den ustrukkede overflaten aksonene dannes inter-forbundet aksonal nettverk. Bilder ble tatt med inversed fasekontrastmikroskop ved hjelp av en 10X objektiv. Klikk her for å se alArger versjon av denne figuren.
Figur 4:. Co-dyrket SC'er med Aligned DRG Axoner på strukket vs. unstretched PDMS Underlag Etter dyrking på strukket og unstretched overflater for 2 uker, ble renset SC'er lagt til kammeret og dyrket i en uke. (A) β-III-tubulin (grønn) farging for axoner på den strukkede flate; (B) Overlegg av β-III-tubulin (grønn), P0 (rød) flekker på strukket overflaten; (C) β-III-tubulin (grønn) farging for axoner på den ustrukkede overflaten; (D) Overlegg av β-III-tubulin (grønn), P0 (rød) flekker på strukket overflaten. På pre-strukket overflaten, de røde og grønne flekker colocalize, foreslår SCS festet til og sannsynlig myelinerende aksonene. På ustrukkedeoverflaten, blir de røde og grønne flekker tilfeldig fordelt, noe som tyder på SCS er ikke knyttet til aksonene. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å indusere axon innretting på pre-strukket overflaten, er det to viktige trinn: 1) PDMS membranen må være flat og homogen tykkelse; og 2) gliaceller må fjernes fra DRG. Etter blanding av PDMS og kryssbinder og herding i en ovn, bør det tverrbundne PDMS gel holdes på en flat benk og håndteres forsiktig for å unngå vipping. Den oksygenplasma behandling av PDMS membranen bør man innen 6 timer etter PLL belegg, ettersom hydrofilisiteten til overflaten (kreves for cellebinding) etter plasmabehandling dempes over tid. Siden plasmabehandling benyttes på den ene siden av membranen, må det utvises forsiktighet når peeling av PDMS av fatet for å sikre den riktige side er plassert på rammen, det vil si plasma behandlede overflate skal vende opp for cellene til feste til.
De DRG er plassert inne i bein lommer som justerer langs ryggraden. Siden fargen av vertebra er hvitsmå pups, er det vanskelig å skille fra DRG vertebra. I dette tilfellet er det viktig å plassere den nær ryggraden til stedet lys. Under lyset, DRG slå gjennomsiktig mens beinrester hvit og ugjennomsiktig. Det er viktig å holde disseksjon buffer på is og ved en fysiologisk pH, siden pH påvirker levedyktigheten av neuralceller. De isolerte vev er svært tyktflytende og har en tendens til å holde seg til pipettespissen ved overføring til et sentrifugerør. Dermed kutte selve spissen av pipetten for å generere et større åpning letter overføringen.
I noen protokoller, er det enda en sentrifugeringstrinn som kreves med de isolerte vev før tilsetning av dissosiasjon buffer. I stedet for dette trinnet krever vår protokoll vev for å avgjøre i disseksjon buffer for et par minutter, noe som reduserer den ekstra sentrifugeringstrinn som ellers ville påvirke levedyktigheten og tettheten av cellene. Celletettheten er også avhengigpå antall valper ofret, og dermed er viktig å opprettholde en konsekvent antall unger hver gang. Det er også gliaceller som er isolert sammen med DRG-neuroner, således en mitotisk inhibitor, FDU-U, tilsettes til kulturmediet ved en DIV for å undertrykke veksten av gliaceller. Dette er ofte brukt til å hemme gliaceller i den tidlige vekstperioden av nevroner, selv om noen protokoller foretrekker en kombinasjon av arabinofuranosylcytidine (AraC) og FDU-U. Den molare konsentrasjon av FDU-U tilsatt til kulturen varierer i de forskjellige protokoller, avhengig av tettheten av de isolerte celler. Vi fant mitotisk inhibitor kan tilsettes flere ganger (i samme konsentrasjon som er angitt i trinn 3.3), som nødvendig (hvis gliacellene er tilstede), under hele DRG-kultur. Det er generelt ikke anbefalt å legge en stor mengde (mer enn 15 ul) til enhver tid, siden den påvirker innfestingen av DRG-neuroner.
Plasma behandling forbedrer surface hydrophilicity og PLL belegget gir et ladet overflate for axoner å initiere vedlegg. Ifølge referanser i litteraturen, vil plasma behandling indusert hydrophilicity dempe over tid under tørre forhold 16-17. Men PDMS vil gjennomgå en langsom reaksjon med vann under flytende betingelser og vil gradvis endres fra å være hydrofob til hydrofil 18. Derfor selv om plasma behandling demper over tid, bør det ikke påvirke våre resultater. For PLL belegg, i henhold til produktinformasjon fra leverandøren, er det stabilt over flere år hvis den plasseres under gunstige forhold. Når cellene feste på PLL belegg, de vanligvis ikke vil løsne. I tillegg hjelper de PLL belegg med til å feste seg, og etter hvert som cellene vokser de utskiller ekstracellulær matriks (ECM) proteiner som ytterligere hjelper dem å forbli forankret til overflaten 19. Fremtidige forbedringer kan omfatte imbedding peptider inn i PDMS nettverk i løpet av kryssbinding, noe som ville eliminere plasma behandling og PLL belegg trinn.
Protokollen, heri beskrevet en teknisk tilnærming som genereres overflaten anisotropi å kunne indusere axon justering, vekst og myelination. Tilnærmingen kan eksperimentelt utvides på to måter. For det første kan den anisotrope overflate anvendes for å skape nervevev i kultur, og de in vitro nervebaner kan deretter bli transplantert in vivo. For det andre, kan begrepet overflate anisotropi bli innlemmet i utformingen av transplanterbare stillas som kan brukes in vivo for å forbedre innrettingen av regenererende axoner fra skadestedet og myelinisering fra verts SC'er. Sammenlignet med andre fremgangsmåter som krever flere og kompliserte innretninger 20-22, så vel som tilsetningen av vekstfaktorer, er vår plattform forholdsvis enkel og lett å påføre, og baserer seg bare på pre-strekning for å forbedre både axon alignment og myelinisering uten behov for vekstfaktor tilsetning. Videre har vi testet dette konseptet av pre-stretch i den eksperimentelle design på begge MSC og DRG nevroner som lett kan brukes til andre celletyper. Den nåværende utforming ble brukt for å undersøke axon vekst på to-dimensjonale overflater, men i fremtiden anordningen kan oppgraderes for å muliggjøre testing av 3-dimenstional cellekulturer. Fremtidige anvendelser innen nerve reparasjon og transplantasjon kunne innlemme pre-stretch i de transstillasene er laget av biologisk nedbrytbare naturlige eller syntetiske materialer som inneholder krysskoblet peptider sammen med kontrollert frigivelse narkotika egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Eric Vasco for hans hjelp i utarbeidelsen av PDMS underlag, Dr. Shiyong Wang i Dr. Marina Mata laboratoriet ved University of Michigan for nyttige forslag og opplæring av DRG isolasjon, og Dr. Mark Tuszynski og Dr . W. Marie Campana ved UC San Diego for nyttige forslag og protokoll for SC isolasjon. Denne studien ble støttet delvis av National Science Foundation (CBET 0.941.055 og CBET 1.510.895), National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866, og R01EB014986).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
- Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. Organosilicon Materials. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
