Introduction
I nervskador, är de proximala och distala nervstumparna ofta hindras från direkt omläggning av nerv fascicles på grund av skadestället 1-2. Normalt axon områden består av mycket ordnade och inriktade buntar av axoner, som bildar komplexa nätverk av anslutningsmöjligheter. Men är nervregeneration en kaotisk process på grund av dåligt organiserade Axon inriktning 3-4. Därför, för att generera ett tillräckligt antal regenererande axoner som överbryggar lesionsstället, är det nödvändigt att inducera välorganiserad axonal inriktning. Dessutom medföljer demyelinisering nervskador till döds av myeliniserande celler vid skadestället. Eftersom demyelinisering försämrar starkt ledande förmåga att överleva axoner, behandlingar inriktade demyelinisering eller främjar remyelinisering har betydelse för funktionell återhämtning efter nervskada 5. Således Målet med detta protokoll är att illustrera ett ingenjörsmässigt förhållningssätt som tar upp dessa två frågorav nervregeneration.
Yta anisotropi, vilken definieras som en skillnad, vid mätning längs olika axlar, i ett materials fysikaliska eller mekaniska egenskaper, har tillämpats för att påverka celljustering, tillväxt och migration 6-7. Förutom topografi, det finns andra metoder att inducera anisotropi. Tidigare undersökte vi yta anisotropi induceras genom mekanisk statisk försträck av poly-dimetyl-siloxan (PDMS) membran. Teorin om "små deformation super införts på stora" förutspådde att den effektiva styvheten cellerna avkänner i sträckt riktning skiljer sig från den vinkelräta riktningen, och denna skillnad i effektiv styvhet beror på att ytan anisotropi 8. Mesenkymala stamceller (MSC) odlade på ett i förväg sträckt PDMS membranet har möjlighet att känna av anisotropin genom att aktivt dra ytan och som ett resultat, rikta in den försträckta riktning 9. På liknande sätt, en anisotrop yta arising ur mekanisk försträckt ytan påverkar justering, samt tillväxt och myelinering av dorsala rotganglier (DRG) axoner 10. Här ger vi ett protokoll för att framkalla yta anisotropi på en statisk försträckt PDMS substrat för att förbättra Axon förnyelse 10.
Att framkalla axon inriktning, topologiska funktioner med önskade mönster, rapporterade att ge kontakt vägledning genom inriktade fibrer och kanaler 6,11-12, visades att underlätta Axon inriktning 11,13. Rapporterade dock tekniker för att inducera Axon anpassning genom topologiska funktioner, såsom fibrer, kanaler och mönstring, kunde inte förlänga och öka tjockleken av axoner. Däremot gradvis mekanisk sträckning lett till Axon inriktning i sträckningsriktningen med längre och tjockare axoner som ökade med storleken på sträckan 14. Att införliva en driven motor enhet in vivo är intemöjlig. I motsats härtill är statisk försträckt inducerad anisotropi mindre komplicerat och lättare kan införlivas i framtida ställnings designer för tillämpningar in vivo.
I detta protokoll, är en statisk försträckt cellodlingssystem som används för att framkalla yta anisotropi utan topologiska funktioner. Den försträckta odlingssystemet är sammansatt av en PDMS-membran, en töjbar ram och en sträckningssteget, varefter membranet är fäst på ramen och en förutbestämd sträcka magnitud anbringas på sträckningssteget. Nyligen isolerade DRG nervceller odlade på den försträckta yta för upp till 21 dagar övervakas för axon inriktning och tjocklek. Därefter Schwann-celler (SCS) samodlas med de inriktade axoner övervakas för myelinisering. Genom att införliva försträck inducerad yta anisotropi kunde vi öka celljustering-differentiering och axon justerings tillväxten av MSC och DRG nervceller 9-10, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden för isolering av cellerna godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Michigan State University.
1. Framställning av försträckt Anisotrop Surface
- Blanda en 10: 1 lösning av bas och härdare och häll blandningen i en vävnadsodlingsskål (12 cm diameter). Använda 4900 mg bas och 490 mg härdningsmedel för det totala tvärbindningsblandningen.
- Hålla gelblandningen under vakuum i 20 minuter för att avlägsna luftbubblor.
- Placera gelblandningen i ugnen över natten härdning vid 60 ° C.
- Efter PDMS membran härdar, behandla ytan med syre plasma med användning av en plasma rengöring / etsning system för tre minuter vid 165 mTorr och 65 sccm flöde av O2.
- Klipp en bit rektangulär membran (5 x 3,5 cm) från skålen, samtidigt som medveten vilken sida är syre-behandlade, se till att syre behandlade sidan är vänd uppåt och fixa till en stretching ram. Placera ramen på en stretching scenen och jämnt sträcka genom att vrida ratten på scenen tills den når 10% töjning (eller någon annan förutbestämd sträcka, förlängningen kan direkt läsa från sträckningssteget) på längre axeln 9. Fäst sträckan genom att dra åt skruvarna på ramen.
- Ta bort ramen från scenen. Se till membranytan är torr och fri från damm, sedan placera en silikonkammare på membranet tillåter den klibbiga sidan av kammaren för att fästa tätt till membranet.
Obs: Silikonkammaren har en brunn för att behålla cellmediet på PDMS membranet. Anordningen konstruktion visas i figur 1. - Sterilisera ytan med UV under 10 minuter.
- Tillsätt 1 ml poly-L-lysin (PLL) (0,01% i fosfatbuffrad saltlösning) till PDMS yta inuti kammaren, inom 6 h av plasmabehandling och inkubera i 2 h vid 37 ° C före ympning av DRG-neuroner. Detta förbättrar cellvidhäftning.
- Bered standardodlingsmedium för DRG-neuroner.
- Före isoleringen, autoklavera isoleringsutrustning och filter reagens. Tillsätt 5 ml isoleringsbuffert in i en brunn i en 6-brunnsplatta, och placera plattan på is. Förbered 10 ml dissociation medium genom tillsats av 1 ml kollagenas A (500 U / ml) till 9 ml av 0,05% Trypsin-EDTA (1 mg / ml), filtrera lösningar med 0,22 pm filter och placera på is.
- Använd tio till tolv 5-7 dagars gamla Sprague-Dawley för isolering. Spraya valparna med 75% isopropanol, och offra genom halshuggning.
- Skär bort huden som täcker ryggmärgen från baksidan och ta bort överflödig vävnad runt ryggraden. Under ett kirurgiskt förstoringsglas med de kirurgiska spot lampor på, göra den första snittet från halsen och sedan ett snitt längs ryggraden på båda sidor med en sax. Loss ryggraden från kroppen av valparna och avlägsna överskottet muskler. Använd sedan en sax för att klippa längs long axel ryggraden och använda pincett för att öppna ryggraden helt och extrahera spinal cord.Remove spetsen från en pipett för att skapa en större öppning för överföring av DRG med isoleringsbuffert i ett sterilt 15 ml rör.
- Med hjälp av en fin pincett, ta bort ganglion från benet fickan och samla ca 10-16 DRG från båda sidor. Trimma nervrötterna och överför ganglierna till iskall isoleringsbuffert.
- Ta bort spetsen från en pipett för att skapa en större öppning för överföring av DRG med isoleringsbuffert i ett sterilt 15 ml rör. Efter den kemiska dissociationen, centrifugera ganglierna vid 900 xg och 4 ° C under 5 min.
- Låt vävnaderna sedimentera till botten av röret och försiktigt bort isoleringsbuffert på toppen och tillsätt 10 ml dissociation mediet i röret.
- Inkubera dissekerade vävnader i dissociation medium i ett 37 ° C vattenbad i en timme under omskakning av röret var 5 - 10 min.
- Efterden kemiska dissociationen, centrifugera ganglierna vid 900 xg och 4 ° C under 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml standardtillväxtmedium och virvel.
- Centrifugera dissocierade celler som anges i avsnitt 2.9 igen.
- Avlägsna supernatanten, återsuspendera pelleten i 12 ml av standardtillväxtmedium och virvel.
3. Odling av DRG på försträckt Surface
- Före sådd av cellerna, avlägsnande av PLL-lösningar från kammaren och skölj PDMS ytan med sterilt vatten och lufttorka.
- Efter återsuspendering av cellerna, låt suspensionen uppsättning till 1 - 2 min för att tillåta skräp att sedimentera till botten av röret. Tillsätt 1,5 ml cellsuspension i varje sträcka kammare och inkubera vid 37 ° C vid 5% CO2.
- För att eliminera gliaceller, på en dag in vitro (DIV), tillsätt 10 l (eller 15 pl) blandning av fluor-2 deoxi-uridin och uridin (FDU-U) lager solutipå (se tabell av material) till varje brunn. Efter 7 timmar, ersätter detta medium med färskt standardodlingsmedium och placera den försträckta kultur anordning i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Under cellodlingsperioden (2 - 3 veckor), ändra media varannan dag genom att ersätta hälften av använt medium med färskt medium. Obs: Efter odling på de sträckta och osträckta ytor för 2 veckor, renas SCS tillsättes till kammaren och odlades i ytterligare en vecka (steg 4,7).
4. Co-kultur av Schwann-celler (SCS) med DRG nervceller på försträckt Surface
- Isolera SC som beskrivs av Dr Campana grupp tidigare 15.
- I korthet, isolera kaster från en en dag gammal valp. Samla och dissociera ischiasnerverna både kemiskt (trypsin-EDTA och kollagenas A) och mekaniskt (18 gauge nål / 10 ml spruta) 15.
- Ympa dissocierade celler i poly-D-lysin (PDL) coated T25-kolv och odling vid 37 ° C vid 5% CO2. På dag 5, rena de celler genom urval antikropp med användning av Anti-thy 1,1 antikropp och kaninkomplement och subkultur de renade cellerna för passage 2 - 4. Använd odlingsmedium innehållande Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), 10% fetalt bovint serum (FBS) , 1% penicillin / streptomycin (Penn / Strep), 21 ^ g / ml bovint hypofysextrakt (BPE) och 4 pM forskolin.
- Avlägsna odlingsmediet från SCS, och tillsätt 5 ml 0,05% trypsin-EDTA i kolven. Inkubera cellerna vid 37 ° C vid 5% CO2 under 2-3 min.
- Kontrollera celler under optiskt mikroskop med hjälp av en 10X mål att se om de lyfter upp från kolven, tillsätt sedan 5 ml odlingsmedium och blanda med cellerna i kolven.
- Tillsätt cellsuspension till ett 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 200 xg och 20 ° C under 5 min.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 7 ml standard DRG tillväxt Media.
- Ta 10 pl av cellsuspensionen i en 0,5 ml mikrocentrifugrör, blanda med 10 pl trypanblått, och sedan räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer i optisk mikroskopi med hjälp av en 10X objektiv. Späd cellsuspensionen till 5000 celler per ml genom tillsats av DRG tillväxtmedium.
- Avlägsna 0,5 ml medium från DRG kulturen i sträckt kammaren och till 0,5 ml SC suspensionen till DRG kulturen.
- Kultur cellerna i en vecka vid 37 ° C och 5% CO 2. Ändra media varannan dag genom att ersätta hälften av använt medium med färskt standardodlingsmedium för DRG. Efter en vecka co-kultur, process cellerna genom immunohistokemi 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den försträckta cellodlingssystem främjas DRG axon anpassningen 10. DRG nervceller odlades på försträckt och osträckta ytor för 12 dagar. Axoner färgades för β-III-tubulin att visa sin inriktning. Figur 2 jämför axon orientering på försträckt och osträckta PDMS substrat efter 12 dagars odling. DRG axoner inriktade parallellt med den sträckta riktningen, medan de visade slumpmässig inriktning och bildade ett sammanhängande nätverk på den osträckta PDMS substratet.
Förutom att inducera axonet justering, försträck inducerad anisotropi förbättrat fascikulation av axoner. De inriktade axoner på sträckt yta bildade axonal buntar, som skilde sig från den anslutna axonal nätverk observeras på den osträckta ytan. Dessa fascikulära buntar på förhand sträckta ytan liknade nervvävnad tragerar in vivo. Figur 3 visar axoner av DRG nervceller i försträckt och osträckta ytor efter 21 dagars odling. Såsom figur 3 visar, att de axoner på försträckt substrat aggregeras tillsammans bildar knippen, som verkade liknar fascikulära områden. Detta antydde den försträckta ytan kunde främja omfattande axontillväxt i riktning mot den försträck, vilka är viktiga för att förbättra regenerering av nervvävnad.
För att bedöma myelination, kaster samodlades med de inriktade axoner. Efter odling av DRG-neuroner på de sträckta och osträckta ytor för 2 veckor, renades SCS sattes till kammaren och odlades under ytterligare en vecka. I figur 4 är axoner i samodling färgas med β-III-tubulin (grön), och SCS färgas med P0 (röd). P0 är en markör för mogen SCS och är också en komponent av myelinskidan,samt vara en indikator på myeline. Det finns en betydande samlokalisering av grönt och rött på den försträckta yta, tyder på kaster knutna till axoner på sträckta ytan, men inte på den osträckta ytan där de gröna och röda fläckar är slumpvis fördelade. Pre-sträckt ytor förbättrad Axon inriktning, fascikulära liknande vägarna bildning och fastsättning av SC till regenere axoner, alla avgörande för myelinisering.
Figur 1:. Schematisk för Pre-stretch ordningen (a) En bit PDMS membranet fast på två remsor av den ram som kan glida. Ramen på enheten är cirka 7 "x 5"; hängslen är ungefär 5 "x 1, klämmorna på hängslen är ungefär 3" x 0,25 ", och koppen är ca 1,5" diameter vidöppen topp, 1 "öppen botten, och ca 0,25 & #34; lång. (B) Placera ramen på sträckningen scenen, vrid rullen att tillämpa 10% töjning, och därefter fastställa positionerna av remsorna genom att dra åt skruvarna. (C) Ta bort ramen från sträckningen scenen, och bifoga en kiselkammare på membranet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Axon Alignment på försträckt och utan töjning Surface Fluorescerande bilder av DRG-neuroner sådda på (a) statisk förväg sträckt yta under 12 dagar, jämfört med DRG-celler sådda på (b) osträckta ytan under 12 dagar.. Axoner linje i den försträckta riktning, medan axoner linje slumpmässigt på osträckta kontrollytan. Axons färgades med anti-mus β-III-tubulin primära antikroppen, och avbildas med konfokalmikroskop använder en 10X objektiv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Axon Tjocklek Tillväxt på sträckt mot Unstretched PDMS substrat faskontrast bilder av DRG axoner på (a) sträckt och (b) osträckta ytor efter 21 dagar.. Axoner på sträckta ytan bildade tjockare buntar, medan den osträckta ytan axonerna bildas sammankopplade axonal nätverk. Bilder togs med hjälp av inversed faskontrastmikroskop med hjälp av en 10X mål. Klicka här för att se alArger version av denna figur.
Figur 4:. Samodlas SCS med Aligned DRG Axoner på sträckt vs. Unstretched PDMS Substrat Efter odling på de sträckta och osträckta ytor för 2 veckor, renades SCS sattes till kammaren och odlades under ytterligare en vecka. (A) β-III-tubulin (grön) färgning för axoner på sträckta ytan; (B) överlagring av β-III-tubulin (grön), P0 (röd) färgning på den sträckta ytan; (C) β-III-tubulin (grön) färgning för axoner på osträckta ytan; (D) överlagring av β-III-tubulin (grön), P0 (röd) färgning på den osträckta ytan. På den försträckta yta, de röda och gröna fläckar colocalize, vilket tyder på SCS är knutna till och sannolikt myeliniserande axoner. På den osträcktayta, är de röda och gröna fläckar slumpmässigt fördelade, vilket tyder på SCS är inte kopplade till axoner. Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att inducera axon anpassningen försträckt yta, det finns två viktiga steg: 1) PDMS membranet måste vara plan och homogen tjocklek; och 2) gliaceller måste avlägsnas från DRG. Efter blandning av PDMS och tvärbindningsmedel och härdning i en ugn, ska den tvärbundna PDMS gel hållas på en plan bänk och hanteras varsamt för att undvika tippning. Syreplasmabehandling av PDMS membranet bör följas inom 6 tim med PLL-beläggning, eftersom hydrofiliciteten hos ytan (krävs för cellbindning) efter plasmabehandling dämpar över tiden. Eftersom plasmabehandling appliceras på en sida av membranet, måste försiktighet iakttas efter avdragning PDMS utanför skålen för att säkerställa rätt sida är placerad på ramen, det vill säga den plasmabehandlade ytan bör vara vänd uppåt för cellerna till bifoga till.
DRG finns inuti benet fickor som anpassa längs ryggraden. Eftersom färgen av kotan är vitt iunga valpar, är det svårt att skilja de DRG från kotan. I detta fall är det viktigt att placera ryggraden nära den plats ljus. Under ljuset, DRG vända transparent medan benet förblir vit och ogenomskinlig. Det är viktigt att hålla dissektion buffert på is och vid ett fysiologiskt pH-värde, eftersom pH-värdet påverkar viabiliteten hos de neurala celler. De isolerade vävnader är mycket trögflytande och tenderar att hålla sig till pipettspetsen vid överföring till ett centrifugrör. Vilket sänker den yttersta spetsen av pipetten för att generera en större öppning underlättar överföringen.
I vissa protokoll finns det en ytterligare centrifugeringssteg som krävs med de isolerade vävnaderna före tillsats av dissociationsbuffert. I stället för detta steg, kräver våra protokoll vävnaderna att bosätta sig i dissektion buffert för ett par minuter, vilket minskar extra centrifugeringssteg som annars skulle påverka lönsamheten och densiteten av cellerna. Celldensiteten är också beroendepå antalet valpar offras, och således är viktigt att upprätthålla en konsekvent antal pups varje gång. Det finns också gliaceller som är isolerade tillsammans med de DRG-neuroner, således en mitotisk inhibitor, FDU-U, tillsätts till odlingsmediet vid en DIV för att undertrycka tillväxten av gliaceller. Detta används ofta för att hämma gliaceller under den tidiga tillväxtperiod av nervceller, även om vissa protokoll föredrar en kombination av arabinofuranosylcytidine (AraC) och FDU-U. Den molära koncentrationen av FDU-U till odlingen varierar i de olika protokoll, beroende på densiteten hos de isolerade cellerna. Vi hittade mitosinhibitor kan läggas flera gånger (vid den koncentration som anges i steg 3,3), vid behov (om gliaceller förekommer), under hela DRG kultur. Det är i allmänhet inte rekommenderas för att lägga en stor mängd (mer än 15 | j, l) vid varje given tidpunkt, eftersom den påverkar fastsättningen av DRG-neuroner.
Plasmabehandling förhöjer surface hydrofilicitet och PLL-beläggning ger en laddad yta för axoner att initiera fastsättning. Enligt referenser i litteraturen, kommer plasmabehandlingen inducerade hydrofilicitet dämpa tiden, under torra förhållanden 16-17. PDMS kommer dock genomgå en långsam reaktion med vatten under vätskeförhållanden och kommer gradvis att förändras från att vara hydrofoba till hydrofila 18. Därför även om plasmabehandlingen dämpas med tiden, bör det inte påverka våra resultat. För PLL-beläggning, enligt produktinformationen från leverantören, är det stabilt under åren om den placeras under gynnsamma förhållanden. När cellerna fästa på PLL-beläggning, de i allmänhet inte kommer att lossna. Dessutom hjälper den PLL-beläggning med den initiala fastsättning, och när cellerna växer de utsöndrar extracellulär matris (ECM) -proteiner som ytterligare hjälper dem att förbli förankrade till ytan 19. Framtida designförbättringar kan innefatta imbedding peptider i PDMS nätverket under tvärbindning, vilket skulle eliminera plasmabehandlingen och PLL beläggningssteg.
Protokollet, häri, beskrivs ett ingenjörsmässigt förhållningssätt som genererade yta anisotropi att framgångsrikt inducera Axon anpassning, tillväxt och myeline. Tillvägagångssättet kan experimentellt expanderade på två sätt. Först kunde den anisotropa ytan appliceras för att skapa nervvävnader i kultur, och de in vitro-nervbanor kan sedan transplanteras in vivo. För det andra skulle begreppet ytan anisotropi införlivas i designen av transplanterbara byggnadsställningar som kan användas in vivo för att förbättra inriktningen av de regenererande axoner från webbplatsen skada och myelinering från värd SCS. Jämfört med andra metoder som kräver flera och komplicerade enheter 20-22, samt tillsats av tillväxtfaktorer, är vår plattform relativt enkel och lätt att applicera, och förlitar sig endast på försträckning för att öka både Axon alignment och myelinisering utan behov av tillväxtfaktorn tillägg. Dessutom har vi testat detta koncept av försträckning i den experimentella designen på både MSC och DRG nervceller som lätt skulle kunna tillämpas på andra celltyper. Den nuvarande utformningen användes för att undersöka axontillväxt på två-dimensionella ytor, men i framtiden kommer anordningen skulle kunna uppgraderas för att möjliggöra testning av 3-dimenstional cellkulturer. Framtida tillämpningar inom nervreparation och transplantation kan innehålla försträckning i transplanterbara byggnadsställningar gjorda av biologiskt nedbrytbara naturliga eller syntetiska material som innehåller tvärbundna peptider tillsammans med kontrollerad frisättning läkemedelsegenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Eric Vasco för hans hjälp i beredningen av PDMS substrat, Dr. Shiyong Wang i Dr Marina Mata labb vid University of Michigan för användbara förslag och utbildning av DRG isolering och Dr Mark Tuszynski och Dr . W. Marie Campana på UC San Diego för användbara förslag och protokoll för SC isolering. Denna studie stöddes delvis av National Science Foundation (CBET 0.941.055 och CBET 1.510.895), National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866 och R01EB014986).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium 1x | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50x | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100x | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml). | ||
| FDU Uridine stock solution | FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
References
- Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. Organosilicon Materials. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
