Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Published: August 24, 2016 doi: 10.3791/54085

Introduction

Sinir yaralanmalarının ise, yakın ve uzak sinir kütükleri çoğu zaman lezyon yerinde 1-2 sinir liflerinin direkt yeniden düzenlenmesi engellenir. Normalde, akson yolları bağlantı karmaşık ağlar oluşturan aksonların çok düzenli ve uyumlu demetleri, oluşmaktadır. Ancak, sinir rejenerasyonu kötü organize akson hizalama 3-4 dolayı kaotik bir süreçtir. Bu nedenle, lezyon yerinin köprü aksonlar rejenere yeterli bir sayı üretmek için, iyi organize aksonal hizalanma yaratmak için de gereklidir. Ayrıca, demiyelinizasyon yaralanma yerinde myelinating hücrelerin ölümüne bağlı sinir yaralanmaları eşlik eder. Demiyelinizasyon kuvvetle aksonlar hayatta iletken kapasitesini bozar yana, demiyelinizasyon hedefleme veya yeniden miyelin oluşumunu teşvik tedaviler sinir hasarı 5 sonra fonksiyonel iyileşme için önemlidir. Dolayısıyla, bu protokolün amacı, bu iki konuyu ele alan bir mühendislik yaklaşımı göstermektirSinir rejenerasyon.

Bir malzemenin fiziksel ve mekanik özellikleri, farklı eksenler boyunca ölçüldüğünde, bir fark olarak tanımlanan yüzey anizotropi, hücre hizalama, büyüme ve taşıma 6-7 etkilemek için uygulanmaktadır. topografya ek olarak, anizotropi indükleme için diğer yöntemler bulunmaktadır. Daha önce, poli-dimetil-siloksan (PDMS) membranın mekanik statik ön streç neden olduğu yüzey anizotropi incelenmiştir. "Büyük uygulanan küçük deformasyon süper" teorisi hücreleri gerilmiş yönde anlamda etkili bir sertliği dik yönde farklıdır tahmin ve etkin sertlikteki bu fark anizotropi 8 yüzey kaynaklanmaktadır. Önceden gerilmiş PDMS zar üzerinde kültürlenmiş mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) aktif yüzeyi çekerek ve bunun sonucu olarak anizotropiye duyu önceden gerilmiş yönde 9 hizalamak edebiliyoruz. Benzer şekilde, anizotropik yüzey armekanik ön-gerilmiş yüzeyinden ising sırt kök gangliyonu hizalamasını yanı sıra büyüme ve miyelinasyonun (DRG) 10 aksonlar etkiler. Burada akson rejenerasyonu 10 artırmak için statik bir önceden gerilmiş PDMS substrat yüzey anizotropi uyarılması için bir protokol sağlar.

Akson hizalama, istenilen desenleri ile topolojik özellikleri ortaya çıkarmak için, hizalanmış lifleri ve kanallar 6,11-12 ile temas rehberlik sağlamak için rapor, akson hizalama 11,13 kolaylaştırmak için ortaya konmuştur. Ancak, bu tür lifleri, kanallar ve desen olarak topolojik özellikler aracılığıyla akson hizalama uyarılması için teknikler bildirdi uzatmak ve akson kalınlığını artırmak için koyamadık. Tersine, mekanik kademeli bir esneme 14 büyüklüğü arttı daha uzun ve daha kalın akson streç yönünde akson hizalama yol germe. Bununla birlikte, in vivo koşullarında, bir çalışan motorlu cihazı içeren değildirmümkün. Bunun aksine, statik önceden gerilmiş neden anizotropi daha az karmaşık ve daha kolay bir şekilde in vivo uygulamalar için gelecekteki iskele tasarımlar içine dahil edilebilir.

Bu protokol, statik önceden gerilmiş hücre kültür sistemi topolojik özellikler olmadan yüzey anizotropi indüklemek için kullanılır. Membran çerçevesi üzerine sabitlenir ve önceden tespit edilmiş bir germe büyüklüğü germe aşaması uygulanır, bunun üzerine önceden gerilmiş kültür sistemi, PDMS zar, bir gerilebilir çerçeve ve bir germe aşamasında oluşmaktadır. 21 güne kadar önceden gerilmiş yüzünde kültür taze izole DRG nöronları akson hizalama ve kalınlık için izlenir. Daha sonra, Schwann hücreleri (SCS) miyelinasyon izlenir hizalanmış aksonlar ile birlikte kültürlendi. Ön streç kaynaklı yüzey anizotropi birleşmeyle biz MSC ve DRG nöronlarının sırasıyla 9-10, hücre hizalama farklılaşma ve akson hizalama büyümeyi artırmak başardık.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hücrelerin izolasyonu için tüm prosedürler, Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Önceden gerilmiş Anisotropik Yüzeyin hazırlanması 1.

  1. taban ve sertleştirme maddesinin 1 çözeltisi ve bir doku kültürü kabı (12 cm çapında) içine dökün: 10 karıştırın. 4900 mg tabanı ve toplam çapraz bağlama karışımı için sertleştirici 490 mg kullanın.
  2. Hava kabarcıklarını uzaklaştırmak için 20 dakika süreyle vakum altında jel karışımı tutun.
  3. 60 ° C de bir gece sertleştirme fırında jel karışımı yerleştirin.
  4. PDMS membran tedavileri sonrasında, 165 mTor 3 dakika ve O 2 65 sccm akışı için bir plazma temizleme / aşındırma sistemi kullanılarak oksijen plazma ile yüzey davranın.
  5. haberdar olmak hangi tarafı oksijen tedavi ise, çanak dikdörtgen membranın (5 × 3.5 cm) bir parça kesin emin oksijen tedavi tarafı karşı karşıya makyaj ve germe çerçeve üzerine sabitleyin. Bir çerçeveye yerleştirin sahne germe ve eşit 10% uzama ulaşıncaya kadar sahnede düğmeyi çevirerek streç (ya da diğer bazı önceden belirlenmiş streç; uzama doğrudan germe aşamasından okunabilir) uzun eksen 9. çerçeve vidaları sıkarak streç sabitleyin.
  6. aşamasından çerçeveyi çıkarın. membran yüzeyi kuru ve tozsuz olduğundan emin olun, sonra zara sıkıca bağlamak için odasının yapışkan tarafını sağlayan zar üzerine bir silikon odasına yerleştirin.
    Not: Silikon odası PDMS zarı üzerinde hücre orta tutmak için bir kuyu sağlar. Cihaz tasarımı Şekil 1 'de gösterilmiştir.
  7. 10 dakika boyunca UV ile yüzey sterilize edin.
  8. Ekle 1 ml poli-L-lizin plazma işlemi 6 saat içinde oda içinde PDMS yüzeyine (PLL) (fosfat tamponlu salin içinde% 0.01) ve 37 ° C de 2 saat inkübe DRG nöronlarını tohumlanmasından önce. Bu hücre eki artırır.
DRG le "> 2. İzolasyon

  1. DRG nöronlar için standart büyüme ortamı hazırlayın.
  2. izolasyon öncesinde, izolasyon ekipmanları ve filtre reaktifleri otoklav. 6 oyuklu plakanın bir kuyuya yalıtım tamponu 5 ml, ve buz üzerinde plaka koyun. 9 mi% 0.05 tripsin-EDTA (1 mg / ml), kolajenazın (500 U / ml), 1 ml ekleyerek ayrışma ortamı 10 ml hazırlamak buz üzerinde 0.22 um'lik bir filtreden ve yer ile çözümler filtre.
  3. izolasyonu için 7 gün 'Sprague-Dawley sıçanları - on 5 oniki kullanın. % 75 izopropanol ile yavrular Sprey ve boyunları vurularak kurban.
  4. arka omurilik örten cilt kesip ve omurga etrafında herhangi bir aşırı doku kaldırmak. cerrahi spot ışıklandırma cerrahi büyüteç altında bir kesim makas ile her iki tarafta omurga boyunca, sonra boynundan ilk kesi yapmak ve. Yavruların vücuttan omurga ayırın ve aşırı kas çıkarın. Ardından, lon boyunca kesmek için makas kullanınomurga ve kullanımı cımbız g ekseni tam omurga açıp steril bir 15 ml tüp içine yalıtım tamponu DRG'ler aktarımı için daha büyük bir açıklık oluşturmak için bir pipet spinal cord.Remove uç elde etmek için.
  5. cımbız ince çifti kullanılarak, kemik cebinden ganglion kaldırmak ve yaklaşık 10 toplamak - Her iki taraftan 16 DRG. sinir kökleri Trim ve buz gibi soğuk izolasyon tampon ganglionlar aktarın.
  6. steril bir 15 ml tüp içine yalıtım tamponu DRG'ler aktarımı için daha büyük bir açıklık oluşturmak için bir pipetten ucu çıkarın. Kimyasal ayırmadan sonra, santrifüj 900 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C'de gangliyon.
  7. dokular tüpün dibine çöker ve yavaşça üstüne izolasyon tampon kaldırmak ve tüp içine ayrışma ortamı 10 ml ekleyelim.
  8. 10 dakika - tüp her 5 çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C su banyosu içinde ayrışma ortamı içinde parçalara dokuların inkübe edin.
  9. SonraKimyasal ayrışma santrifüj 900 xg'de gangliyon ve 5 dakika için 4 ° C.
  10. Süpernatantı ve 10 ml standart büyüme ortamı ve vorteks pelet yeniden askıya.
  11. bir kez daha bölüm 2.9 de belirtildiği gibi ayrışmış hücreleri Santrifüj.
  12. Süpernatantı standart büyüme ortamı ve vorteks 12 ml pelet yeniden askıya.

Önceden gergin Yüzeyde DRG 3. Kültür

  1. , Hücrelerin ekim odasından PLL çözümleri kaldırmak ve steril su ve kuru hava ile PDMS yüzeyin durulanması önce.
  2. 2 dakika enkaz tüpün dibine yerleşmek için izin - hücrelerin yeniden askıya sonra, 1 için süspansiyon seti sağlar. Her streç odasına hücre süspansiyonu, 1.5 ml ilave edilir ve% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C'de inkübe edin.
  3. 10 ul (veya 15 ul) floro-2-deoksi-uridin ve üridin (FDU-U) stok soluti karışımı ekleyin, in vitro 1 gün (DIV) de, glial hücreleri ortadan kaldırmak için(Malzeme Tablo bakınız) de her birine. 7 saat sonra, taze, standart büyüme ortamı ile orta yerine ve% 5 CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde, önceden gerilmiş bir kültür Cihazı.
  4. Hücre kültürü döneminde (2-3 hafta), taze ortam ile yarım harcanan orta değiştirerek her iki günde bir ortamı değiştirmek. Not: 2 hafta boyunca gerilmiş gerek gerilmemiş yüzeylerde kültürlendikten sonra arıtılmış, SC'ler bölmeye ilave edilir ve bir hafta (aşama 4.7) kültürlendi.

Önceden gergin Yüzey üzerinde DRG Nöronlar ile Schwann Hücreleri (SC'ler) 4. Co-kültür

  1. Dr Campana'nın grubuna daha önce 15 tarafından açıklandığı gibi SC'ler izole eder.
    1. Kısaca, bir 1 gün eski yavru SC'ler izole eder. Toplayın ve mekanik siyatik sinirleri kimyasal (Tripsin-EDTA ve kollajenaz A) hem de (18 gauge iğne / 10 ml şırınga) 15 ayırmak.
    2. poli-D-lisin (PDL) co ayrışmış hücreleri Tohum% 5 CO2 37 ° C'de ATED T25 şişesi ve kültür. 5. günde, anti-Thy 1.1 antikoru ve tavşan komplemanı kullanılarak antikor seçimi ile hücrelerin saflaştırılması ve geçişi ile 2 saflaştırılmış hücreleri alt-kültürü - Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM),% 10 fetal inek serumu ihtiva eden 4. kültür ortamı (FBS) ,% 1 Penisilin / Streptomisin (Penn / Strep), 21 ug / ml büyükbaş hayvan hipofız bezi (BPB) ayıklamak ve 4 uM Forskolin.
  2. SC'ler kültür ortamının çıkarın ve şişeye 5 mi,% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin. 3 dakika - 2% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
  3. bu şişeden kaldırın, ardından da, kültür ortamının 5 ml ilave edilir ve şişe hücreler ile karıştırmak için 10X objektif kullanılarak optik mikroskop altında Hücrelerden.
  4. 200 xg, 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj hücre süspansiyonu ilave edilir ve 5 dakika boyunca 20 ° C.
  5. Süpernatantı ve 7 ml standart DRG büyüme med peletia.
  6. Bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine hücre süspansiyonu 10 ul alır tripan mavisi 10 ul ile kanştınn, ve daha sonra bir 10X objektif kullanılarak optik mikroskopta hemasitometre kullanılarak hücre sayısı. DRG büyüme ortamı ekleyerek ml başına 5.000 hücreleri hücre süspansiyonu seyreltilir.
  7. gerilmiş bölme DRG kültüründen 0.5 ml ortamda çıkarın ve DRG kültüre SC süspansiyon 0.5 ml ilave ediniz.
  8. Kültür, 37 ° C'de ve% 5 CO 2. değiştirme 1 hafta hücreler ortam DRG taze standart büyüme ortamı yarı harcanan ortamının değiştirilmesiyle her iki günde. 1 hafta ko-kültür sonrası işlem immünohistokimyasal 10, hücrelerin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Önceden gerilmiş hücre kültür sistemi DRG akson hizalama 10 terfi. DRG nöronları için 12 gün önceden gerilmiş gerek gerilmemiş yüzeylerine kültürlenmiştir. Aksonlar hizalarını göstermek için β-III-tubulin boyandı. 2 Kültür 12 gün sonra önceden gerilmiş gerek gerilmemiş PDMS yüzeylerde akson yönünü karşılaştırır Şekil. rastgele uyum gösterdi ve gerilmemiş PDMS substrat üzerinde birbirine bağlı bir ağ kurdu ise DRG aksonlar, gergin doğrultusuna paralel olarak hizalanmış.

akson hizalama indükleyici ilave olarak, ön-germe ile indüklenen anizotropi akson fasikülasyon geliştirilmiş. Bağlı aksonal ağdan farklı gerilmiş yüzey oluşturduğu aksonal demetleri üzerinde hizalanmış aksonlar, gerilmemiş yüzeyde gözlemledik. önceden gerilmiş yüzey üzerinde bu fasikül demetleri sinir doku tr benziyordudavranırsa vivo. Şekil 3 kültürün 21 gün sonra önceden gerilmiş ve gerilmemiş yüzeylerde DRG nöronların aksonları gösterir. Şekil 3 de gösterildiği gibi, bir araya toplanmış, önceden gerilmiş alt-tabaka üzerindeki aksonlardan fasikül yolları için benzer bulunmuştur demetleri oluşturmak üzere. Bu ön-gerilmiş bir yüzey sinir dokusunun rejenerasyonu sağlamak önemlidir ön germe yönünde geniş akson büyümesini teşvik etmek mümkün olduğuna işaret ediyor.

miyelinasyonun değerlendirmek için, SCs hizalanmış aksonlar ile birlikte kültürlenmiştir. 2 hafta boyunca gerilmiş gerek gerilmemiş yüzeylerde DRG nöronlarını kültürlendikten sonra arıtılmış, SC'ler bölmeye ilave edilmiş ve bir hafta için kültüre. Şekil 4'te, eş-kültür aksonlar β-III-tubulin (yeşil) ile boyandı ve SC'ler P0 (kırmızı) ile boyanır. P0 olgun AVM bir belirtecidir ve aynı zamanda miyelin kılıf bir bileşenidir,yanı sıra miyelinasyonun bir göstergesi olarak kabul. gerilmiş yüzeyinde aksonlar takılarak SC'ler düşündüren, ama yeşil ve kırmızı leke rastgele dağıtılır gerilmemiş yüzeyinde önceden gerilmiş bir yüzeye, yeşil ve kırmızı önemli bir birlikte yeri vardır. önceden gerilmiş yüzeyler akson hizalama, fasiküler benzeri sistem oluşumunu ve rejenere aksonlar SC'ler tutunmasını, miyelinasyon için tüm kritik geliştirilmiş.

Şekil 1
Şekil 1:. Ön streç Prosedür için şematik (a) PDMS membran bir parça kayabilir olan çerçevenin iki şerit üzerine kırpılır. Cihazın çerçeve yaklaşık 7 "x 5" dir; parantez yaklaşık 5 olan "x 1; parantez üzerinde kelepçeler ile ilgili 3" x 0,25 "ve fincan yaklaşık 1.5" çapında geniş üstü açık, 1 "açık alt ve yaklaşık 0.25 & #34; uzun boylu. (B), germe sahneye çerçevesini yerleştirin% 10 uzama uygulamak için silindiri çevirin, sonra vidaları sıkarak şeritlerin konumlarını düzeltin. (C) germe aşamasından çerçeveyi çıkarın ve membran üzerine bir silikon odasını takın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Önceden gerilmiş gerek gerilmemiş Yüzeyde Axon Hizalama 12 gün (B) gerilmemiş yüzeyine serpildi DRG hücreleri ile karşılaştırıldığında, 12 gün için, (a) sabit, önceden gerilmiş bir yüzey üzerine ekildi DRG nöronlarının, Floresan fotoğraflar Şekil 2,.. aksonlar gerilmemiş kontrol yüzeyinde rastgele hizalanmış ise aksonlar, önceden gerili yönde hizalanır. aksons anti-fare β-III tubulin primer antikor ile boyanmış, ve 10X objektif kullanılarak konfokal mikroskop ile görüntülendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: Akson Kalınlığı Büyüme vs Gerilmiş uzatılmamış PDMS Yüzey (a) gergin ve (b) gerilmemiş yüzeyler 21 gün sonra DRG akson Faz kontrastlı görüntüler.. gerilmemiş yüzeyde aksonlar inter-connected aksonal ağı oluşturmuştur ise gergin yüzeyde aksonlar, kalın demetler kurdu. Görüntüler 10X objektif kullanılarak ters çevrilmiş faz kontrast mikroskobu kullanılarak alınmıştır. Al görmek için buraya tıklayınızBu rakamın Arger sürümü.

Şekil 4,
Şekil 4:., Gerilmemiş PDMS Yüzeyler genel Gerilmiş hizalanmış DRG Aksonlar sahip SC'ler birlikte kültür 2 hafta içinde gerilmiş gerek gerilmemiş yüzeylerde kültürlendikten sonra arıtılmış, SC'ler bölmeye ilave edilmiş ve bir hafta için kültüre. Gerilmiş yüzeyinde akson (a) β-III-tubulin (yeşil) boyama; (B) β-III-tubulin Yerleşimi (yeşil) gergin yüzeyde, P0 (kırmızı) boyama; Gerilmemiş yüzeyinde akson (c) β-III-tubulin (yeşil) boyama; Β-III-tubulin (yeşil), (d) paylaşımlı gerilmemiş yüzeyi üzerinde, P0 (kırmızı) boyama. önceden gerilmiş yüzeyde, kırmızı ve yeşil lekeler colocalize, düşündüren AVM'ler bağlı ve büyük olasılıkla aksonlar myelinating vardır. gerilmemiş üzerindeYüzey, kırmızı ve yeşil lekeler rasgele aksonlar bağlı değildir SC'ler öne dağıtılır. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

önceden gerilmiş bir yüzeye akson hizalama teşvik etmek için, iki kritik adımlar vardır: 1) PDMS zarı ve homojen kalınlıkta düz olmalıdır; ve 2) glia hücreleri DRG uzaklaştırılmalıdır. PDMS ve çapraz bağlayıcı karıştırma ve bir fırında kür sonra, çapraz PDMS jel düz bir tezgah üstünde tutulur ve herhangi bir eğilmesini önlemek için dikkatle ele alınmalıdır. Plazma tedaviden sonra (hücre bağlanması için gerekli olan) sert yüzeye adsorbe zamanla azaltır çünkü PDMS dokunun oksijen plazma işleme PLL kaplama ile 6 saat içinde uygulanmalıdır. plazma işleme membranın bir tarafına uygulandığı için bakım plazma muamele edilen yüzey için hücreler için yukarı bakacak şekilde olmalıdır, yani, çerçeve üzerine yerleştirilir doğru yan sağlamak için çanak kapalı PDMS soyma sonra alınmalıdır eklemek.

DRG omurga yanında hizaya kemik cepleri içinde yer almaktadır. vertebra rengi beyaz olduğundanGenç yavrular, omur gelen DRG'ler ayırt etmek zordur. Bu durumda, spot ışığı yakın omurga yerleştirmek önemlidir. Kemik beyaz ve opak kalır ışığında, DRG şeffaf açın. PH nöral hücrelerin canlılığını etkilediğinden, buz üzerinde ve fizyolojik pH'da diseksiyon tamponu tutmak önemlidir. İzole dokular çok viskoz ve bir santrifüj tüpüne aktarırken pipet sopa eğilimindedir. Böylece daha büyük bir açılış transferini kolaylaştırır oluşturmak için pipet çok uç kesim.

Bazı protokoller olarak, ayrıştırma tamponu ilave edilmeden önce izole edilmiş dokular ile istenen bir daha santrifüj adımı vardır. Bu adımın yerine, protokol, aksi takdirde hücrelerin canlılığını ve yoğunluğunu etkileyecektir ekstra santrifüj adım azaltır birkaç dakika için diseksiyon tampon yerleşmek dokuları gerektirir. Hücre yoğunluğu da bağlıdıryavruların sayısı kurban ve böylece yavruların tutarlı sayı her zaman muhafaza etmek önemlidir. DRG nöronlarının, böylece mitotik durdurucu, FDU-U, gliyal hücrelerinin büyümesini bastırmak için 1 DIV kültür ortamına ilave edilir birlikte izole edilmiş glial hücreler de vardır. Bazı protokoller arabinofuranosylcytidine (AraC) ve FDU-U bir kombinasyonu tercih ancak bu genel olarak, nöronlardan erken bir büyüme süresi içinde, glial hücreleri inhibe etmek için kullanılır. Kültür izole hücre yoğunluğuna bağlı olarak, farklı protokoller değişir için FDU-U molar konsantrasyonu ilave edildi. Biz tüm DRG kültürü sırasında, (glial hücreler varsa) gerektiği gibi mitotik inhibitörü, (adım 3.3 belirtilen konsantrasyonda), birden çok kez eklenebilir bulundu. Genellikle Darbelere DRG nöronlarının eki beri herhangi bir zamanda büyük miktarda (en fazla 15 ul) eklemek için tavsiye edilmez.

Plazma işleme Surfac artırıraksonlar eki başlatmak için e hidrofiliklik ve PLL kaplama bir ücret yüzey sağlar. Literatürde referanslara göre, plazma tedavisi kaynaklı hidrofiliklik kuru şartlarda 16-17 altında, zamanla azaltacaktır. Ancak PDMS sıvı koşullar altında su ile yavaş reaksiyonuna maruz ve yavaş yavaş hidrofilik 18'e hidrofobik olan değişecektir. Plazma tedavisi zamanla zayıflar, bu nedenle olsa bile, bu bizim sonuçlarını etkilememelidir. uygun koşullarda yerleştirilir eğer PLL kaplama, tedarikçiden ürün bilgilerine göre, yıllar içinde stabildir. Hücreler PLL kaplama üzerine takmak sonra, genellikle ayırmak olmaz. Ayrıca, PLL kaplama ilk eki ile yardımcı olur ve hücreler daha onlara yardım Ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri salgılayan büyüdükçe yüzeye 19 demirlemiş kalması. Gelecek tasarım geliştirmeleri PD içine peptitler Imbedding içerebilirPlazma tedavi ve PLL kaplama adımlarını ortadan kaldıracak çapraz bağlanma sırasında MS ağı.

protokol, burada başarılı akson hizalama, büyüme ve miyelinasyonun ikna etmek için yüzey anizotropi oluşturulan bir mühendislik yaklaşımı tanımlamıştır. yaklaşım deneysel iki şekilde genişletilebilir. İlk olarak, anizotropik yüzey kültürleri sinir dokuları oluşturmak için uygulanabilir, in vitro sinir yolları daha sonra in vivo olarak transplante edilebilir. İkinci olarak, yüzey anizotropi kavramı konak SC'ler yaralanma site ve miyelinasyon gelen rejenere akson uyum geliştirmek için in vivo kullanılabilecek transplante iskelelerinin tasarım içine dahil edilebilir. Birden fazla ve karmaşık cihazlar 20-22 yanı sıra büyüme faktörlerinin eklenmesini gerektiren diğer yöntemlere göre, bizim platformu nispeten basit ve kolay uygulanabilir ve her iki akson ali geliştirmek için sadece önceden streç dayanırbüyüme faktörü eklenmesine gerek kalmadan gnment ve miyelinasyon. Ayrıca biz kolayca diğer hücre tiplerine uygulanabilecek hem MSC ve DRG nöronlarının deneysel tasarım ön streç bu kavramı test ettik. Geçerli tasarım cihazı 3-dimenstional hücre kültürlerinin test sağlamak için yükseltilmiş olabilir ancak gelecekte, 2 boyutlu yüzeyler üzerinde akson büyümesini araştırmak için kullanıldı. Sinir onarımı ve transplantasyon Gelecek uygulamalar kontrollü salımlı ilaç özellikleri ile birlikte çapraz peptidler içeren biyobozunur doğal veya sentetik malzemelerden yapılmış transplante iskeleleri içine önceden streç dahil olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yazarlar PDMS alt tabakaların hazırlanmasında yaptığı yardım için Eric Vasco teşekkür etmek istiyorum, yararlı öneriler ve DRG izolasyon eğitimi için Michigan Üniversitesi'nden Dr. Marina Mata'nın laboratuarında Dr. Shiyong Wang ve Dr. Mark Tuszynski ve Dr . UC San Diego W. Marie Campana SC izolasyonu için yararlı öneriler ve protokol için. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (CBET 0941055 ve CBET 1510895), Ulusal Sağlık Enstitüsü (R21CA176854, R01GM089866 ve R01EB014986) tarafından kısmen desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Medium 1x GibcoBRL 21103-049
B27 Supplement 50x GibcoBRL 17504-044
Glutamax-I 100x GibcoBRL 35050-061
Albumax-I GibcoBRL 11020-021
Nerve Growth Factor-7S Invitrogen 13290-010
Penicillin-streptomycin GibcoBRL 15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA GibcoBRL 25300-054
Poly-L-Lysine Trevigen 3438-100-01
Poly-D-Lysine Sigma p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine Sigma F0503
Uridine Sigma U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170-112 Isolation Buffer
Type I Collagenase Worthington LS004196
DMEM Gibco 11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum Hyclone SH30080.03
BPE Clonetics CC-4009
Forskolin Calbiochem 344270
Silicone chamber Greiner bio-one FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system March Instruments PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody Sigma- Aldrich M7898
Rabbit Complement Sigma- Aldrich S-7764
Standard growth medium For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C., et al. Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).
  2. Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
  3. Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
  4. Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
  5. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
  6. Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
  7. Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
  8. Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
  9. Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
  10. Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  11. Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
  12. Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
  13. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  14. Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
  15. Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
  16. Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
  17. Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
  18. Chandra, G. Organosilicon Materials. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).
  19. Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
  20. Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
  21. Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
  22. Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).

Tags

Nörobilim Sayı 114 DRG izolasyon ön streç anizotropi akson hizalama Schwann hücresi myelinizasyondur.
Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, C., Chan, C. An Approach toMore

Liu, C., Chan, C. An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (114), e54085, doi:10.3791/54085 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter