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Biology

古代生物群集抱いて内部を調査するための冷凍コアの外側部分からの外因性物質の除去

doi: 10.3791/54091 Published: July 3, 2016

Summary

雪氷圏は過去の環境条件の下で持続保存生物へのアクセスを提供しています。プロトコルは、収集し、土壌や氷の永久凍土コアを除染するために提示されています。外因性コロニーとDNAの不在が検出された微生物は、掘削や処理からの材料ではなく、汚染を表すことを示唆しています。

Introduction

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雪氷圏( 例えば 、永久凍土の土壌、氷の特徴、氷、雪、フィルン、氷は)過去の環境条件の下で持続する生物の種類に垣間見ることができます。これらの基板が堆積するので凍結保存古い何千年もの間、その微生物群集、数十〜数百することができますので、古代の環境条件を反映しています。適切にこれらの生態系を分析し、凍結した土壌や氷から意味のある生物学的情報を抽出するには、凍結試料の適切な回収方法や処理が必要です。 21世紀のための気候予測は北極と亜北極地域1における顕著な温暖化の可能性を示しているので、これは最も重要です。具体的には、インテリアアラスカやグリーンランドは、2100年2,3によってそれぞれ約5℃〜7℃で、温めることが期待されます。これは、大幅に土壌や水生微生物群集に影響を与えることが予想されるので、関連されます生物地球化学的プロセス。気温の上昇と変更された沈殿政権は、潜在的に厚く、季節解凍(アクティブ)につながる多くの地域2-5の永久凍土の劣化6,7、凍結した土壌の解凍、およびなどの大規模な氷体の融解をレイヤーを開始することが期待されていますグランドアイス、アイスウェッジ、および分離氷8。これは劇的にこれらの生態系における植物や動物の生物多様性に加えて、生物地球化学的属性を変更します。

氷河氷とsyngenetic永久凍土の堆積物と氷の特徴は、化学的および機能が形成された時にそこに住んでいたものを表す環境の生物学的証拠を閉じ込められています。たとえば、インテリアアラスカで、イリノイ州のウィスコンシンの両方が永久凍土が存在している熟成させ、特にこの永久凍土が存在IMPAの生物学的および地球化学的証拠を含む(YBP)の前に15万年に現代の出会い系からのユニークな場所を提供します生物多様性に関する過去の気候の変化のCT。その結果、これらの堆積物は何千年もかけて生物地球化学と生物多様性の記録を提供します。面積が低い沈降速度を有しており、氷河ではありませんでしたので、邪魔されずにサンプルが土壌断面に垂直に掘削やトンネルに水平掘削いずれかで、収集と分析のためにアクセス可能です。さらに重要なのは、大規模なレコードは、特にこの領域9-14で永久凍土のユニークな生物地球化学的特徴を強調することを存在します。具体的には、DNA分析のアプリケーションは両方現存し、古代の氷と永久凍土試料中の生物多様性の有無と程度を推定するためには、特定の生物による占領に古代の環境条件の連携や生息地の探査を可能にします。

各研究はdiffereを使用しても以前の研究では、50kのYBP 11、15-19に遡るサンプルから哺乳動物、植物や微生物の気候への影響を確認しました永久凍土や氷床コアを収集し、除染するためのntの方法論。特定の方法は、外来核酸はまた、試料から除去されたかどうかを明らかにしなかったもののいくつかの例において、掘削コアは、16、20-21を滅菌しました。他の研究では、細菌の分離株15( 例えばセラチア・マルセッセンス )、ならびに蛍光ミクロスフェア22は、除染手順の有効性を測定するために使用されてきました。

この実験は、後方に約40kのYBPまでさかのぼる永久凍土サンプルから微生物群集を調査する大規模な研究の一部でした。研究のこの部分の具体的な目的は、成功した氷と永久凍土コアを除染することでした。我々の知る限り、いかなる方法論は、凍結されたコアの外側部分から外国の核酸および関連するヌクレアーゼを排除するために設計されたソリューションの使用を統合していません。これは、これらのソリューションはcommonlであるという事実にもかかわらずですyは、分子の実験のための実験装置を除染するために使用されます。

コアを除染した後、ゲノムDNAをグリフィス 23及びトウによって開発されたプロトコルを用いて抽出した。24、分光光度計を用いて定量し、反応あたり20 ngのを達成するために、無菌の、DNAを含まない水で希釈しました。 600秒間95℃で45サイクル行った:細菌の16S rRNA遺伝子は、rRNA遺伝子を、プライマーアーチ349Fとアーチ806Rと、以下の条件でTMアーチ516F 26をプローブで増幅したプライマー331Fおよび797Rで増幅し、BacTaq 25と古細菌の16Sをプローブしました。 30秒間、95℃、57℃60秒間、および72℃での30秒間の40℃での最終伸長で25秒間。すべてのqPCR反応は二連で行いました。 20μlの反応容量は、20 ngのDNA、プライマーの10μM、プローブの5μM、および定量PCR反応ミックス10μlのを含んでいました。標準FOR細菌および古細菌の定量PCRは、それぞれ、 シュードモナス・フルオレッセンスおよび好塩菌のsalinarumからのゲノムDNAを用いて調製しました。両方とも、数期まで成長させました。プレートカウントを実施し、DNAを培養物から単離しました。ゲノムDNAはH.ためのゲノム当たり16S rRNA遺伝子の1と6のコピーを仮定した分光光度計で定量しましたsalinarumP.それぞれ27-28、 フルオレッ 。細菌および古細菌の遺伝子のコピー数は、標準曲線に基づいて計算された、治療間不等分散を考慮して対数変換し、ANOVAによって評価しました。

コミュニティ組成物は、16S rRNA遺伝子の配列を決定するフローセルと、ブリッジ増幅技術を使用し、「微生物の生態に定量的洞察'(QIIME)29でコミュニティを分析することによって決定しました。順方向および逆方向読み込みを接合し、その後の配列は、ろ過し、インデックス付けされました、高品質の代表者は、参照データベースとの配列アラインメントを経て新たに操作的分類単位(OTU)の割り当てのために選択しました。整列された配列は、分類学上の割り当てのための別個の基準データベースと比較しました。門レベルのOTUテーブルは、一般的なコミュニティの組成を決定するために作成されました。

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Protocol

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1.機器の準備や永久凍土コアコレクション

  1. 機器の準備およびフィールドサンプル収集および保存ギア
    1. バレルの上部にドライブアダプタを挿入し、所定の位置にロックするレバーを回転させることにより、サンプル収集のためのオーガーを組み立てます。ドライブアダプタにアダプタチューブをピンとアダプターチューブ上にモーターを固定します。バレル上のカッターを挿入します。
    2. サンプルに任意の汚染を低減するために軽量スーツ、ニトリル手袋、マスクを着用してください。耳の保護と永久凍土トンネル( 図1)を入力する際の安全のためヘルメットを着用してください。
    3. サンプル( 図1B)を収集するためにトンネルを入力し、場所を選択します。
      注:垂直または水平掘削場所については、材料( 例えば 、氷や永久凍土の)凍結されているという証拠が知られている領域を選択し、既知の大きな根系が存在しない、とは知ら砂利はありません。すべて削除するサンプルを収集する前に、地域からの植物材料を生きています。垂直方向または水平方向に掘削した場合、比較的平坦なオーガでアクセス領域を選択します。
    4. 70%のイソプロパノール、DNAの除染液、およびRNaseの除染液で滅菌されたプラスチック材料で地面を積層してワークステーションを準備します。
    5. 彼らはオーガーから除去されるコアを保持するためのトラフを提供するために、長さ方向のワークステーション上半分に直径10cmのポリ塩化ビニル(PVC)パイプカットを配置します。 70%のイソプロパノール、DNA汚​​染除去溶液、およびRNaseの汚染除去溶液でPVC管を除染。
    6. ワークステーションの近くに、70%のイソプロパノール、DNAの除染液、およびRNaseの除染液とそれを噴霧することにより、オーガを除染。ワイプとオーガーからソリューションを削除してください。
  2. 氷と永久凍土コアの収集と保管
    1. サンプルに壁の面積を選択します(1.2.1を参照してください注意)。
    2. 70%のイソプロパノール、DNA汚​​染除去溶液、およびRNaseの汚染除去溶液でそれを拭いて凍結壁面積の約10cmの直径を除染。
    3. それはサンプル領域に対して垂直になるように、関心領域に除染オーガを上昇させると壁( 図1C、D)の洗浄面に掘削を開始。
    4. 慎重に試料収集領域からオーガーを削除します。モータからのオーガを取り外し、きれいなワークステーションで滅菌PVCパイプ上記のオーガーを配置します。慎重に凍結されたコアは、無菌の塩ビ管( 図1E)上にスライドさせ、そのようなことはオーガを傾けます。
    5. 70%のイソプロパノール、DNA汚​​染除去溶液、およびRNaseの汚染除去溶液で手袋を除染。
    6. 滅菌手袋をして氷と永久凍土のコアをピックアップし、滅菌袋に入れます。
    7. 彼らは出荷または処理されるまで、クーラーや低温室でのコアを配置します。
    8. Sh0℃以下の温度でそれらを維持するためにドライアイスを用いて凍結したコアをIP。
    9. 直ちに-80℃でコアを格納します。

2.永久凍土と氷コアプロセッシング

  1. 材料の準備
    1. 4時間450℃のオーブンで焼成することにより、滅菌、核酸自由ヘビーデューティーアルミ箔、金属ラック、ガラス製品、金属鉗子、およびグラスウールを準備します。使用されるまで、これらの材料を置いておきます。
    2. 0.22μmフィルターを通して溶液を通過させることによって、95%のエタノールと超純水を殺菌します。
    3. 4°C -20°Cと水で保存エタノール溶液。
    4. 70%エタノール、DNAの除染液、およびRNaseの除染液でそれをスプレーし、す​​ぐにそれぞれの溶液の後に拭くことによって、プラスチック定規を滅菌します。
  2. 細菌培養の準備
    1. セラチアを成長させるために、ブロスとプレートを準備します。
      1. ブイヨンのために、5グラムのトライを組み合わせますptone、1グラムのグルコース、5gの酵母抽出物、および1グラムのリン酸カリウム二塩基性、およびその後、上記混合物に寒天の15グラムを追加し、プレートを作成するには1 L.に到達するために蒸留水を追加します。ブロスおよびプレートは、15分間121℃で7、オートクレーブにpHを調整します。
    2. 8グラムの塩化ナトリウム、塩化カリウム0.2gのリン酸ナトリウム二塩基1.44gの、0.24グラムのリン酸二水素カリウムを組み合わせて1×リン酸バフ食塩水(PBS)を調製800ミリリットル到達するために蒸留水を加えます。 pHを7.4に調整し、15分間121℃で1 L.オートクレーブに到達するために蒸留水を追加します。
    3. Sに浸漬することにより滅菌ループを用いたブロスに接種以前に-80℃で凍結保存したマルセッセンス文化 。無菌条件下で、シリアル希薄文化PBSの9ミリリットルに1mlの培養物を添加し、手動でソリューションを反転することによって。 PBSの9ミリリットルにこの希釈液の1ミリリットルを追加し、手動でソリューションを反転。 10 -9 DILUまで8回以上繰り返します化が達成されます。
    4. プレート上に培養液の1ミリリットルを配布し、細胞スプレッダーと拡散することにより寒天プレート上に10 -6、10 -7、10 -8、10 -9ソリューションを広げます。希釈につき三連でこれを行います。 4°Cで独自の文化を保存してください。
    5. 24時間30℃で培養します。元の培養物中の細胞の数を計算するために、コロニーの数を数えます。注:元の培養中のコロニー数は、細菌の増殖速度に依存します。
    6. ピペット滅菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに元の培養250μlの。前のステップでコロニー数によって決定されるように、約10 9細胞/ mlを得るために1×PBSの十分な量を添加することによって、元の培養物を希釈します。 10分間、2500×gで遠心分離することにより、マイクロ遠心チューブ内の細胞をペレット化。
      注:1×PBSの体積は、細菌の増殖速度に応じて変化します。
    7. 滅菌biohoodで、ブイヨンオフピペットと1ミリリットル1×PBS緩衝液中で細胞を再懸濁します。使用または約2ヶ月まで4℃で保存。
    8. 処理の日に、Sを希釈元Sの1ミリリットルを添加することにより、ステップ2.2.7からマルセッセンス文化50ミリリットルの遠心管中で39ミリリットル、1×PBS緩衝液にマルセッセンス文化
  3. コア処理や保存ギア冷室内空間を準備
    1. 1%の漂白剤溶液を用いて低温室、きれいな壁、床、および金属製のテーブルを冷却する前に。
    2. 約-11℃〜低温室の温度を設定します。
    3. 低温室が所望の温度に達した後は、冷蔵室とサンプルに任意の汚染を低減するために軽量スーツ、ニトリル手袋、マスクを着用。
      注:二適切に服を着た人が、この手順のために必要とされます。
    4. 滅菌材料を持参( 例えば、アルミ箔、金属ラック、ガラス製品、トレー、S.マルセッセンスの文化、MI無菌のテーブルの上に寒い部屋や場所にcrotomeブレード)とサンプル。
  4. 低温室施設における永久凍土や氷床コアの処理
    1. アルミ箔の滅菌、核酸自由シートに永久凍土コアを配置します。
    2. 軽くS.の希薄文化とコアの外側に接種マルセッセンスは、滅菌発泡栓( 図2B)を使用します。
    3. トレイの上に座って無菌金属ラックにコアを配置します。
    4. 70%エタノール、DNA汚​​染除去溶液、およびRNaseの汚染除去溶液で鋼ミクロトームブレードを滅菌します。
    5. 70%エタノール、DNAの除染液、およびRNaseの除染液で個々のAきれいなニトリル手袋を持って、トレイの上45°の角度でコアを保持します。
    6. 個々のBは静かに(個人Aは、各こすり後にコアをオンにしながら、滅菌ブレードを用いて、両端を含む全体のコアの外側の約5ミリメートルを、こすりしています図3A、B)。必要に応じて、70%エタノール、DNA汚​​染除去溶液、およびRNaseの汚染除去溶液でブレードを拭きます。
    7. 個々のAは、溶液が注がれるように、コア( 図2D、3C)をオンにしながら、個々のBは、慎重かつ迅速にコアを覆ってフィルター滅菌し、95%エタノールを注ぐ必要があります。
    8. 個々のBはすぐにフィルター滅菌水でコアを洗い流してもらいます。
    9. 新しい無菌の金属ラックとトレイ上使用される金属ラックを交換してください。
    10. 個々のAは70%エタノール、DNAの除染液、およびRNaseの除染液で彼または彼女のニトリル手袋をきれいにし、トレイの上45°の角度でコアを保持しています。
    11. 個々のBはDNAの除染液でコア全体をスプレーしています。
    12. 個々のBはすぐにフィルター滅菌水でコアを洗い流してもらいます。
    13. 個々のBは、RNアーゼの除染液でコア全体をスプレーしています。
    14. Individuを持っていますアルBはすぐにフィルター滅菌水でコアをすすぎます。
    15. アルミ箔の滅菌シート上のコアを置き、軽くラップ。
  5. 雪解け外側コア
    1. 層流無菌biohood中の滅菌ガラス皿の上に無菌金属ラックを配置します。
    2. Sに特異的な2つの寒天プレートを配置コア( 図2E)から液体を収集するための無菌のラック下のガラス皿でマルセッセンス
    3. 無菌金属ラックにコアを配置します。
    4. (平均して、これは約10分以内に発生します)コアの外側表面の約2〜5ミリメ​​ートルは、23℃で解凍することができます。約90°2分ごとにコアを回します。
    5. 滅菌ピンセットと滅菌ガラスウールを使用して、コアのスワブ表面全体およびSに特異的な2つの寒天プレートに接種プレートの表面に、これらの材料を拭き取りによってマルセッセンス 。の外側をドープするために使用される独自の文化を持つ2つの新しいプレートに接種寒い部屋の低温にさらされたコア。
    6. 近く滅菌定規を配置することによって、解凍し、円筒状コアの外形寸法を測定しますが、コアに触れていません。
    7. 大滅菌バッグの中にコアを配置し、-80℃で保管してください。
  6. 成長のためのチェック
    1. 1週間23℃で寒天プレートをインキュベートします。
    2. S.の成長のための寒天プレートを調べmarcescensのコロニー
      1. プレートには目に見えるコロニーが存在しない場合は、2.5.3に進みます。
      2. コロニーがプレート上に表示された場合は、「永久凍土や氷床コアの処理」セクション2のステップ2.1.1から繰り返します。
    3. 冷凍庫からコアを入手し、無菌的に滅菌バッグに移します。
    4. コア全体を解凍するために約24〜48時間、4℃で滅菌バッグでコアを保管してください。

3.アイスコアと永久凍土からの核酸抽出のためのサブサンプルを入手

  1. 氷床コアからの核酸抽出
    1. そっとバッグ( 図2G)を攪拌することによって氷床コアから解凍した材料を混ぜます。
    2. 微生物を収集するために、真空下で0.22μmのフィルターで無菌容器に解凍された材料を注ぎます。
    3. 無菌的に滅菌ピンセットでフィルタを削除し、滅菌2ミリリットルのセラミックビーズチューブ(1.4ミリメートル)に配置します。
    4. -80℃でフィルターを保管してください。
  2. 永久凍土コアからの核酸抽出
    1. そっとバッグを混練して永久凍土コアから解凍した材料を混ぜます。
    2. 永久凍土が十分に混合された後、滅菌薬匙で約0.5グラムバルク土壌のサブサンプルを取得し、バランスに直立座っ風袋を測定し、滅菌2ミリリットルのセラミックビーズスクリューキャップチューブ(1.4ミリメートル)に配置します。
    3. -80℃で保存サブサンプル。
    4. サンプルの重量含水量を取得します。
      1. sterilで永久凍土の10グラムを測定します天びんの風袋を計った錫での電子の薬匙と場所。永久凍土とスズの湿潤質量を測定します。
      2. 24時間105℃に設定したオーブンで永久凍土をインキュベートします。永久凍土と錫の乾燥質量を測定します。
      3. 永久凍土層の乾燥質量によって永久凍土の湿潤質量を差し引くと永久凍土の乾燥質量で割ることにより、重量含水量を計算します。
    5. -80℃で保存の永久凍土。

4.永久凍土と氷コアから核酸を抽出

  1. 材料の準備
    1. 、0.1%のジエチル(DEPC)で処理し、37℃でO / Nをインキュベートし、オートクレーブで解決策を保持するために琥珀色のバイアルを準備します。
    2. 240 mMのリン酸カリウム緩衝溶液を調製します。リン酸二水素カリウムとリン酸カリウム二塩基性の38.7グラムの2 5グラムを追加します。滅菌水を加えて500ミリリットルに最終的な音量を調整します。
    3. 臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム(CTAB)抽出BUFを準備水80ml 4.1グラムの塩化ナトリウムを溶解させ、ゆっくりと加熱し、撹拌しながら10gのCTABを添加することによってFER。滅菌水を加えて100ミリリットルに最終的な音量を調整します。
    4. 0.22μmのフィルターで滅菌リン酸緩衝液およびCTABバッファおよびフィルタの同等のボリュームを追加します。 RTでアルミ箔とストアとボトルをカバーしています。
    5. 9.35グラムのNaCl、100mlの滅菌水を組み合わせることにより、1.6 M塩化ナトリウム溶液(塩化ナトリウム)を調製します。 1.6 M NaCl溶液とフィルター滅菌するために10グラムのポリエチレングリコール8000を追加します。 4℃で保存。
  2. グリフィス 22及びトウの修正版に従って核酸抽出。23
    1. 軽量スーツ、ニトリル手袋、マスクを着用してください。きれいな実験室スペース、70%エタノール、DNA汚​​染除去溶液、およびRNaseの汚染除去溶液でピペット。
    2. 2ミリリットル中にサブサンプル(氷床コアや永久凍土の土壌サンプルからフィルタ)を取り外しセラミックビーズスクリュー-CARTで-80℃の冷凍庫と融解からのpチューブ。
    3. 簡単臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム(CTAB)抽出緩衝液と渦の0.5ミリリットルを追加します。
    4. フェノール - クロロホルム - イソアミルアルコール(25:24:1)0.5mlの追加(pHが8を)し、ボルテックス上のフラットパネルアダプタを使用して10分間水平にチューブを振ります。
    5. 4℃で5分間、16,100×gでビーズビーティング、遠心チューブを以下。
    6. 新しい無菌の1.5mlチューブに水層を除去し、クロロホルム - イソアミルアルコール等容量のミックス(24:1)。 4℃で5分間、16,100×gで遠心分離します。
    7. 新しい無菌の1.5mlチューブに水層を除去し、30%ポリエチレングリコール8000および1.6 MのNaClの2ボリュームを追加。 4℃で2時間インキュベートします。
    8. 4℃で10分間、16,100×gで遠心分離します。
    9. 4℃で10分間16,100×gでの氷冷70%エタノールおよび遠心分離機の約500μlの核酸ペレットを洗浄します。
    10. 2時間滅菌biohood内の空気の乾燥ペレット。 50μlのDNアーゼ/​​ RNaseフリーのTE緩衝液(pH8.0)で再懸濁します。 DNAは、PCRや定量PCRなどの下流のアプリケーションの準備ができています。
    11. 分光光度計を用いてDNAの濃度を決定します。
    12. 反応あたり20 ngのを達成するために、滅菌、DNAフリーの水でDNAを希釈します。

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Representative Results

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提示された方法は、氷河からの永久凍土に、様々な雪氷圏環境から収集した凍結試料を除染するために使用することができます。ここでは、特に工学研究開発センターから収集した氷と永久凍土サンプルから収集したデータを提示-フォックス、AK( 図1Aおよび1B)に位置する寒冷地調査及び技術研究所(ERDC-CRREL)永久凍土トンネル。永久凍土トンネルは、ゴールドストリーム谷の側に約110メートルを拡張し、氷の豊富なシルトや沖積層30-31へのアクセスを提供します。アイスウェッジと凍土からのサンプルを注意深くサンプリングの時点では10月24日2014年のトンネルの壁から三重に収集した、永久凍土壁の温度は-2.9℃でした。サンプルはから35メートルと60メートルで、トンネルのポータル、および凍土からアイスウェッジ機能約27メートルから採取しましたトンネルのポータル( 図1Cおよび1D)。特別なケアは、氷と永久凍土コア( 図1E)の汚染を制限するために、サンプル収集中に撮影されました。凍結されたコアは、当社の除染プロトコル( 図2)に従って処理し、処理のためのハノーバー、ニューハンプシャーCRREL土壌微生物学研究室にドライアイス上で輸送しました。

すべてのコアは、無菌ミクロトームブレードとソリューション( 図3A、B、およびC)を用いてセクション2に記載したプロトコルを用いて処理しました。本研究の目標は、正常に材料が堆積された時に存在する微生物のコミュニティを決定するために、凍結サンプルからの内因性の核酸を抽出することでした。汚染除去プロトコルは、 セラチア・マルセッセンスの希釈培養物をコアにドープした後、成長後方のためのペトリ皿を試験することによって評価しました。ERコア31を処理しました。 S.の不在marcescensのコロニーは、外因性微生物が適切にコアの外側部分から除去されたことを示しました。しかし、コロニーが存在しない場合は、外因性DNAは、コアの外側部分から削除されたかどうかを示すないだろう。したがって、我々は、 セラチア属からのDNAをチェックするために氷床コアからサ ​​ンプルを配列決定しました。アイスウェッジにおける微生物の存在量は、永久凍土層に比べて有意に低かっそうだったので、我々はSからDNAかどうかを判断するために氷床コアを使用しましたマルセッセンスは、除染のプロトコルに従って存在するであろう。コアは適切に除染されなかった場合は、Sに関連する配列マルセッセンスは、試料中に存在すると予想される。 図4は、16S rRNAの遺伝子配列決定の結果から氷のコア内の低細菌多様性を示しています。 シュードモナス属に関連する配列は、門Gammaproteobacteriaの、氷のsamplを支配しましたエス。 Planctomycetiaに関連するメンバーも氷ではなく、より少ない程度に存在していました。特に注目すべきは、 セラチア属の欠如である配列決定の結果では、除染プロトコルは十分に外来DNAを除去することを示唆しています。

また、核酸の抽出時の汚染の追加の危険性があります。負抽出ブランクは、外因性の核酸からの汚染を明らかにするために使用しました。試料および陰性対照からのDNAは、定量PCRを用いて増幅しました。 qPCRデータは永久凍土が細菌を抱いていることを示したが、古細菌は、永久凍土( 表1)で検出されませんでした。成功した除染はさらに、陽性対照の増幅、 シュードモナス・フルオレッセンス好塩菌のsalinarum( 表1)と併せて、抽出ブランク中の細菌や古細菌アンプリコンの欠如によって証明されました。 abundンス測定60 m個のコア( 表1)と比較して、ポータル35からmでは収集するコア間の細菌の存在量に有意差がなかったことを明らかにしました。現在進行中の研究は、微生物コミュニティ組成物は、コア間の差があったかどうかを決定するために行われています。

図1
フェアバンクス、フェアバンクスのAK。(A)地図、AK(http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html)、(B)ERDC-CRREL永久凍土トンネル、(C)コレクションの近くに 、図1 のサンプルサイト永久凍土オーガ入る永久凍土壁のSIPREオーガー、(D)のビューを使用して、コア、および(E)アーカイブのためのコアを準備するには。 より大きな版を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のシオン。

図2
凍結材料の除染の 図2 の回路図。(A)凍結材料( 例えば、氷床コアや永久凍土コア)は低温室で処理されます。 (B)これは、意図的に細菌培養で汚染されています。 (C)コアは、外側、5mmの部分を除去するために滅菌ミクロトームブレードを用いて剃毛します。 (D)一連の溶液は、さらに、試料の外側部分を除染するために適用されます。 DDSは、DNAの除染液を示し、RDSは、RNaseを除染液を示しています。 RTで開催された無菌biohoodにコアを配置することにより(E)、材料の外側2〜5ミリメートルで解凍します。氷や永久凍土から滴下する液体は、ペトリ皿に収集され、コアが拭くといることを確認するためにメッキコアは、適切に除染しました。細菌の増殖が検出されない場合(FG)は 、その後、コアは無菌容器中で4℃で解凍されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
無菌条件下での低温室での永久凍土コアの 図3. 除染。(A)こすることによって金属ミクロトームの刃で永久凍土コアの外側の層を削除します。 (B)スクレイプの拡大図。 (C)ソリューションリンスは、コアの外側の層を除染する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

コンテンツ "FO:キープtogether.withinページ=" 1 "> 図4
アイスウェッジサンプルから 4. 微生物のシーケンス 。割合によるアイスウェッジ試料中に存在する細菌門の平均相対量を示す棒グラフ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表1
永久凍土表1.細菌豊富。qPCRの結果は永久凍土サンプルおよび関連する抽出ブランク中の細菌の存在量を示します。表中の値は平均±標準誤差として報告されています。 nがサンプルの数です。 NDは検出されませんを示しています。

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雪氷圏は過去の環境条件の下で持続保存生物へのアクセスを提供しています。回収された分類群は完全な歴史的なコミュニティを表していないかもしれないが、氷河や永久凍土サンプルの分析から回収されたものは、選択期間15-16に関する貴重な歴史的な情報を得ることができます。例えば、意味のある生体情報は、解凍33の結果としての炭素循環プロセスを調査アイスグリーンランド氷床20に嫌気活動を調査研究し、永久凍土の研究から引き出されており、ベーリング地峡16に永久凍土からの真菌の多様性への洞察を提供してきました。適切なサンプル収集及び除染は、これらの凍結された材料内の生物群集を調査するために下流分析を行う前に発生しなければなりません。これらの手順は、データを解釈する上で重要な意味を持っているにもかかわらず、多くの研究は、サンプルがワット方法についての具体的な詳細を提供していませんERE収集および処理または画像が凍結された材料を処理する方法を示します。例えば、以前の研究では、これらの物質の正確な濃度は記載されていなかったものの、蛍光マイクロスフェアまたは既知の細菌15とコアの外側部分をドープしています。他の研究では、詳細に汚染除去プロトコルを説明しているが、ハイスループット方法15、32の有効性を試験するために分析適用していない。従って、インタクトな細菌およびペトリプレートのqPCRの成長による外因性DNAの詳細なスクリーニングは、かどうかを決定するために使用されましたサンプル収集、保存、および分析手順は、凍結された材料中に存在する微生物群集を識別するのに十分な滅菌しました。

このプロトコルは、成功した古代のコアからの目的の遺伝物質を単離するために修飾されています。このような特定のギアを着て、用品を除染などのケアは、収集、処理、および抽出の際に注意する必要があります汚染以来のコアからのイオンは、どの段階で発生する可能性があります。コアが輸送中に解凍した場合、その後、コアの外側領域からの汚染物質がコアの内側部分に移動することが高い傾向があるのでさらに、ドライアイスまたは同等の冷却剤を用いてコアを出荷することは不可欠です。さらに汚染の可能性を最小限に抑えるために、電動式オーガではなくプッシュコアと大きなコアを採取することを検討してください。私たちは、プッシュコアが適切にスクレーピングで除染するには小さすぎることがわかりました。あるいは、サンプルのより大きな体積は、生物学的材料の低量のサンプルのために特に重要である大きなコアから抽出することができました。さらに、より大きな体積はセラチア・マルセッセンスコロニーがプレート上で検出された場合、その後、コアは再び処理されるのに十分な大きさであるように、エラーの余地を与えます。

種々の供給は、最も効率的に決定するために試験しました。コアを除染するための方法。例えば、無菌のアルミ箔、コアで許可されるガラス皿またはプラスチック材料は、迅速かつ容易に滅菌表面上に配置されるのではなく。また、このような金属のラックとトレイなどの非伝統的な供給は、再汚染コアのリスクを減少させる、掻き外側材料が離れてコアから蓄積させるのに有益であることが判明しました。プロトコルの初期の反復では、スクレイピングは、汚染のリスクを増加した、平らな面に発生しました。最後に、むしろガラス皿よりも滅菌バッグは、サンプルを混合し、格納に資することが見出されました。

このプロトコルは、凍結コアの外側部分上の微生物及び核酸を除去するために目標としました。イソプロパノール及びエタノールが効果的な消毒剤であるが、それらは、核酸を除去しないでください。したがって、コアの外側部分から核酸および関連酵素を除去する溶液を用いました。これらのソリューンは、一般に、実験室の消耗品や機器からの核酸と関連するヌクレアーゼを除去するために使用されます。実験室の表面にその有効性をテストする場合、RNAの除染液は、DNAの除染液34以上の外因性物質を除去しました。興味の遺伝物質はまた、特定の生物の低豊富なサンプルから除去することができるので、コアの外側部分を除染するためにヌクレアーゼを使用することは常に好ましい方法ではないかもしれません。特に、長期間にわたって永久凍土と氷に保存された遺伝物質は分解を受けます。微生物がこれらのアラスカのサンプルで高い豊富にあるため、解決策は、内因性遺伝物質の高い割合を取り除くことになる懸念が大幅に減少しました。ただし、注意が著しく低下していたり​​、低存在量の生物からのものであるしている核酸はでは削除されないことを確実にするためにヌクレアーゼを含む溶液を使用する際に注意すべきですヌクレアーゼ。

S.の不在ペトリ皿上marcescensのコロニーは、無傷の細胞は、永久凍土コアの外側部分から削除されたという確信を提供します。また、同じプロトコルを受けた氷床コアの分析は、Sに関連する検出可能な配列を示しませんでしたマルセッセンス 。シーケンス結果はシュードモナスがあっても、両方のシュードモナス属かかわらず、これらのサンプルで検出されたことを明らかにしました。 セラチア属。クラスGammaproteobacteriaの範囲内です。 Sの一緒に、不在ペトリプレートおよび定量PCRからのDNAアンプリコンの非存在下でマルセッセンスコロニーは凍結コアが正常に汚染除去されたことを示唆しています。したがって、検出された微生物は、そうではなく、汚染より掘削やコアを処理するから、冷凍材料に埋め込まれました。その他の掘削技術は、より大きな深さで土壌や氷を貫通する油圧掘削が含まれます。このメソッドはwoulもののこれらの貧栄養環境での低微生物の存在量を調査することは有益でdは、それは掘削流体が正常に削除されるかどうか明らかにしていません。ハイスループットシークエンシングは、下流分析の一部でない場合はさらに、特定のPCR反応は、Sを標的マルセッセンスは、抽出されたDNAを増幅するために使用されるべきです。

この例のデータセットからの結果は、無傷のゲノムDNAを正常に凍結材料から抽出されたことを示しました。さらに、両方の永久凍土やアイスウェッジ抱い細菌、それぞれ定量PCRおよび配列決定によって証明されるように。アラスカのサンプルはチベット青海省の高原、中国36とから活性層/永久凍土の土壌から永久凍土よりも大きさが少ない細菌の順序を含んでいても、この研究からアラスカの不連続永久凍土は、カナダの高い北極35に永久凍土層と同様の細菌数を含んでいましたヌナブト準州、カナダ37。私と同様にヌナブト準州、カナダ37に集めCEウェッジ、土壌に共通すると代謝的に多様であるGammaproteobacteria、特にシュードモナスに関連する配列は、本研究ではアラスカの氷のウェッジを支配しました。実際には、片山ら。ERDC-CRREL永久凍土トンネルからアイスウェッジの1から門放線菌、桿菌、およびGammaproteobacteria内の11分離された細菌。これらの研究は、本研究でGammaproteobacteriaの検出を裏付けます。水生サンプルに共通しているPlanctomycetiaも、アイスウェッジで検出されました。これらの生物は、中国39、青海チベット高原では永久凍土層に加えて、北東シベリア38における永久凍土上記活性層の土壌で発見されています。

多くの研究は、永久凍土の解凍として、メタン生成菌は、おそらく、よりアクティブになるという考え、contriと、永久凍土に、古細菌、特にメタン生成菌の存在を調べました大気21、33-34にメタンの流出にbuting。驚くべきことに、古細菌は、ユリアーキオータ門とクレンアーキオータ門の両方は、カナダの高北極17から永久凍土で発見されたとメタン生成菌がロシア21に北極圏ツンドラから永久凍土のサンプルで発見されたにもかかわらず、アラスカの氷のウェッジや永久凍土のサンプルで検出されませんでした。

冷凍材料は、何千年も前に起こった生物地球化学プロセスの記録を提供し、古代の微生物を抱きます。冷凍材料は解凍時に一度雪氷環境に制限されていた微生物が遊離なる可能性があるので、この生物多様性は、現在の気候温暖化体制の下で非常に興味深いです。自信を持って、これらの冷凍材料に抱いて、生物多様性を識別するために、凍結した土壌や氷のサンプルが正しく処理されて浄化されなければなりません。ここでは、凍結サンプルからensuに外来細胞やDNAを除去するためのプロトコルを提示します検出された微生物はむしろ汚染より掘削やコアを処理するから、材料からのものであったことを再度。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Auger Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% Isopropanol Walmart 551116880
95% Ethyl Alcohol (denatured)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA A407-4
DNA decontamination solution, DNA Away Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7010
RNase decontamination solution, RNase Away Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA  7002
Light Duty Suits Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 10606
Nitrile Gloves Fisher Scientific, Pittsburgh, PA FFS-700
Antiviral Masks Curad, Walgreens CUR3845
Sterile Sample Bags  Nasco, Fort Atkinson, WI B01445
Steel Microtome Blade  B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Metal Rack Fabricated at CRREL, Hanover, NH
Tray Handy Paint Products, Chanhassen, MN 7500-CC
Aluminum Foil Western Plastics, Temecula, CA
500 ml Bottle with 0.22 μm Filter Corning, Corning, NY 430513
Serratia marcescens ATCC, Manassas, VA 17991
Biosafety Hood NuAire, Plymouth, MN NU-425-400
Petri Dish Fisher Scientific, Pittsburgh, PA FB0875712
ATCC Agar 181- Tryptone Acros Organics, NJ 61184-5000
ATCC Agar 181- Glucose Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP381-500
ATCC Agar 181- Yeast Extract Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP1422-500
ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate JT Baker, Phillipsburg, NJ 3252-01
ATCC Agar 181- Agar Difco, Sparks, MD 214530
NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 System Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
Halobacterium salinarum American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescens American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Microbial DNA Isolation Kit MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 12224-50
Ear Protection Elvex EP-201
Hard Hat
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34705
Glass Wool Pyrex 430330
Ruler
Weighing Tin  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 08-732-100
Sodium chloride Sigma Aldrich, St Louis, MO S-9625
Potassium chloride JT Baker, Phillipsburg, NJ 3040-04
Potassium phosphate, monobasic JT Baker, Phillipsburg, NJ  3246-01
Potassium phosphate, dibasic JT Baker, Phillipsburg, NJ 3252-01
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP332-500
50 ml Centrifuge Tubes Corning, Corning, NY 4558
2 ml Microcentrifuge Tubes MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 1200-250-T
2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 13113-50
Scoopula Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE 1437520
Balance Ohaus, Parsippany, NJ E12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich, St Louis, MO D5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB)  Acros Organics, NJ 22716-5000
Polyethylene glycol 8000  Sigma Aldrich, St Louis, MO P5413-1KG
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP1752-400
Centrifuge Eppendorf, Hauppauge, NY 5417R
Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) Sigma Aldrich, St Louis, MO C0549-1PT
TE Buffer Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE AM9860
Pipets Rainin, Woburn, MA Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets
Pipet tips Rainin, Woburn, MA Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl
Vortexor Scientific Industries, Bohemia, NY G-560
Vortex Adaptor MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 13000-V1
Clear Bottle Corning, Corning, NY C1395500
Amber Bottle Corning, Corning, NY C5135250
Bottle Top Filters, 0.22 µm Corning, Corning, NY 430513
60 ml Syringe Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ BD 309653
Millex Syringe filters, 0.22 μm EMD Millipore, Billerica, MA SLGV033RB
70% Ethanol Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP2818-500 diluted & filter sterilized
Isotemp 100 L Oven Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 151030511
Cell Spreader Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 08-100-10
Disposable Inoculating Loops Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-363-602

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Barbato, R. A., Garcia-Reyero, N., Foley, K., Jones, R., Courville, Z., Douglas, T., Perkins, E., Reynolds, C. M. Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside. J. Vis. Exp. (113), e54091, doi:10.3791/54091 (2016).More

Barbato, R. A., Garcia-Reyero, N., Foley, K., Jones, R., Courville, Z., Douglas, T., Perkins, E., Reynolds, C. M. Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside. J. Vis. Exp. (113), e54091, doi:10.3791/54091 (2016).

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