Summary
Die Kryosphäre bietet Zugang zu den erhaltenen Organismen, die im Rahmen früherer Umweltbedingungen bestehen blieb. Ein Protokoll vorgestellt zu sammeln und Permafrostkerne von Böden und Eis dekontaminieren. Die Abwesenheit von exogenen DNA-Kolonien und schlagen vor, dass Mikroorganismen detektiert das Material darstellen, anstatt Kontamination durch Bohren oder Verarbeitung.
Introduction
Die Kryosphäre (zB Permafrostböden, Eis Features, Gletscher Schnee, Firn und Eis) bietet einen Einblick in welche Arten von Organismen unter vergangener Umweltbedingungen bestehen blieb. Da diese Substrate Zehn- bis Hunderttausende von Jahren sein alt, ihre mikrobiellen Gemeinschaften, wenn da Ablagerung gefroren konserviert, reflektieren alten Umweltbedingungen. Um entsprechend dieser Ökosysteme zu analysieren und aussagekräftige biologische Informationen aus gefrorenen Böden und Eis, die richtige Erfassung und Verarbeitung der gefrorenen Proben extrahieren notwendig. Dies ist von größter Bedeutung , wie Klimaprognosen für das 21. Jahrhundert das Potenzial für eine deutliche Erwärmung in den arktischen und subarktischen Regionen zeigen 1. Insbesondere Interior Alaska und Grönland werden voraussichtlich bis zum Jahr 2100 2,3 etwa 5 ° C und 7 ° C, jeweils zu erwärmen. Dies wird voraussichtlich deutlich von Böden und Gewässern mikrobiellen Gemeinschaften beeinflussen und daher verwandtenbiogeochemische Prozesse. Die wärmeren Temperaturen und veränderte Niederschlagsregimes erwartet Permafrostdegradation in vielen Bereichen zu initiieren 2-5 potenziell zu einem dickeren, was saisonal aufgetaut (aktiv) -Schicht 6,7, das Auftauen von gefrorenen Böden und das Schmelzen von massiven Eiskörper wie Boden, Eis Keile und Segregation Eis 8. Dies würde dramatisch die biogeochemischen Attribute neben der Artenvielfalt von Pflanzen und Tieren in dieser Ökosysteme verändern.
Gletschereis und syngenetisch Permafrost Sediment und Eis Merkmale haben chemische und biologische Beweise für eine Umgebung gefangen darstellt, was zu der Zeit dort lebten die Merkmale gebildet. Zum Beispiel in Interior Alaska, beide Illinoisan und Wisconsin im Alter von Permafrost vorhanden sind und diese Permafrost insbesondere bietet einzigartige Orte von modernen Datierung bis 150.000 Jahre vor der Gegenwart (YBP), die biologische und geochemische Beweise für die impa enthaltenct vergangener Klimaveränderungen auf die Biodiversität. Als Ergebnis bieten diese Sedimente eine Aufzeichnung der Biogeochemie und Biodiversität über viele tausend Jahre. Da die Fläche niedrige Sedimentationsraten hat und wurde nie vergletschert, sind ungestörte Proben zugänglich für die Sammlung und Analyse, entweder Bohrungen vertikal in das Bodenprofil oder Bohren horizontal in Tunneln. Noch wichtiger ist , gibt es umfangreiche Datensätze , die vor allem in dieser Region 9-14 die einzigartigen biogeochemische Eigenschaften des Permafrosts hervorzuheben. Insbesondere ermöglicht die Anwendung der DNA-Analyse zur Schätzung Vorhandensein und das Ausmaß der biologischen Vielfalt in den beiden vorhandenen und alten Eis und Permafrost Proben Erforschung der Verknüpfung von alten Umweltbedingungen und Lebensraum der Besatzung durch bestimmte Organismen.
Frühere Studien haben klimatischen Auswirkungen auf Säugetiere, Pflanzen und Mikroorganismen aus Proben identifiziert 50k YBP Datierung 11, 15-19, obwohl jeder Studie eine differe verwendetnt Methodik zu sammeln und die Permafrost oder Eisbohrkernen dekontaminieren. In einigen Fällen wurden die Bohrkerne 16 sterilisiert, 20-21, obwohl die spezifische Methodik nicht geklärt werden, ob Fremd Nukleinsäuren auch von den Proben wurden eliminiert. In anderen Studien Isolate bakterielle 15 (beispielsweise Serratia marcescens) sowie fluoreszierenden Mikrokugeln 22 verwendet wurden , um die Wirksamkeit der Dekontaminationsverfahren zu messen.
Dieses Experiment war Teil einer größeren Studie mikrobieller Gemeinschaften aus Permafrostproben untersuchen zu etwa 40k YBP Jahrhundert. Das spezifische Ziel dieses Teils der Studie war erfolgreich Kerne Eis und Permafrost zu dekontaminieren. Unseres Wissens hat keine Methodik die Verwendung von Lösungen integriert entwickelt, um fremde Nukleinsäuren und die damit verbundenen Nukleasen aus dem äußeren Bereich der gefrorenen Kerne zu beseitigen. Dies ist trotz der Tatsache, dass diese Lösungen sind commonly verwendet Laborgeräte für die molekulare Experimente zu dekontaminieren.
Sobald die Kerne dekontaminiert wurden, wurde genomische DNA extrahiert , die entwickelten Protokolle von Griffiths et al. 23 und Töwe et al. 24, quantifiziert mit einem Spektralphotometer und verdünnt mit sterilen, DNA-freies Wasser 20 ng pro Reaktion zu erreichen. Bakterielle 16S - rRNA - Gene wurden mit den Primern 331f und 797R verstärkt und Sonde BacTaq 25 und Archaea - 16S - rRNA - Gene mit Primern Arch 349F und Arch 806R amplifiziert wurden und die Sonde TM Arch 516f 26 unter den folgenden Bedingungen: 95 ° C für 600 sec , gefolgt von 45 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 57 ° C für 60 sec, und 72 ° C für 25 sec mit abschließende Extension bei 40 ° C für 30 sec. Alle qPCR Reaktionen wurden doppelt durchgeführt. Die 20 & mgr; l Reaktionsvolumina enthalten 20 ng DNA, 10 & mgr; M Primer, 5 & mgr; M der Sonde, und 10 ul der qPCR Reaktionsmischung. Standards for Bakterien und Archaea qPCR wurden unter Verwendung von genomischer DNA , die aus Pseudomonas und Halobacterium salinarum fluorescens, respectively. Beide waren gewachsen Phase zu protokollieren. Plattenzählungen wurden durchgeführt, und die DNA wurde aus den Kulturen isoliert. Genomische DNA wurde mit einem Spektrophotometer unter der Annahme von einem und sechs Kopien des 16S rRNA - Gens pro Genom für H. quantifiziert salinarum und P. fluorescens bzw. 27-28. Kopieren Nummern der Bakterien und Archaea Gene auf der Basis der Standardkurve berechnet wurden, log-transformierten für ungleiche Varianzen zwischen den Behandlungen zu berücksichtigen und durch ANOVA bewertet.
Gemeinschafts Zusammensetzung wurde durch Sequenzierung des 16S - rRNA - Gen unter Verwendung von Flusszellen und Brückenverstärkertechnologie und Analyse der Gemeinden mit "quantitative Einblicke in die mikrobielle Ökologie" (QIIME) 29 bestimmt. Vorwärts und rückwärts liest zusammen wurden zusammengefügt und dann wurden Sequenzen gefiltert, indiziert,und qualitativ hochwertige Vertreter wurden für die de novo operativen taxonomischen Einheiten (OTU) Zuordnung durch Sequenzabgleich mit einer Referenzdatenbank ausgewählt. Aligned Sequenzen wurden für taxonomische Zuordnung zu einer separaten Referenzdatenbank verglichen. Ein phylum Ebene OTU Tabelle wurde erstellt allgemeine Gemeinschaft Zusammensetzung zu bestimmen.
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Protocol
1. Vorbereitung der Ausrüstung und Permafrost Core Collection
- Vorbereitung der Ausrüstung und Feldprobe Sammlung und Erhaltung Gang
- Montieren Schnecke für die Probenentnahme durch den Antriebsadapter in die Spitze des Laufes ein und drehen Sie den Hebel um ihn zu sperren. Pin das Adapterrohr auf den Antriebsadapter und stecken Sie den Motor auf den Adapterrohr. Legen Sie die Messer auf den Lauf.
- Tragen Sie leichte Pflicht Anzüge, Nitril Handschuhe und Masken eine Kontamination der Proben zu reduzieren. Gehörschutz tragen und einen harten Hut für die Sicherheit auf den Permafrost - Tunnel eintritt (Abbildung 1).
- Geben Sie den Tunnel und wählen Sie einen Ort , um die Proben (Abbildung 1B) zu sammeln.
Hinweis: Für vertikale oder horizontale Bohrstelle, wählen Sie einen Bereich Liegen Beweise bekannt , dass das Material gefroren ist (zB Eis oder Permafrost), gibt es keine bekannten großen Wurzelsysteme, und es gibt keine bekannte Kies. Alles entfernenPflanzenmaterial aus dem Bereich leben, bevor die Probe zu sammeln. Wenn vertikal oder horizontal gebohrt wird, wählen Sie einen Bereich, der relativ flach und zugänglich mit der Schnecke ist. - Vorbereitung eines Arbeitsstation durch den Boden mit einem Kunststoffmaterial Schichtung, die mit 70% Isopropanol, DNA Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung sterilisiert wurde.
- Legen Sie einen Durchmesser von 10 cm Polyvinylchlorid (PVC) Rohr in der Hälfte der Länge nach auf der Workstation einen Trog vorzusehen, um die Kerne zu halten, wie sie von der Schnecke entfernt werden. Dekontaminieren PVC-Rohr mit 70% Isopropanol, DNA-Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung.
- In der Nähe des Arbeitsplatzes, dekontaminieren die Schnecke indem sie sie mit 70% Isopropanol, DNA-Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung gesprüht wird. Entfernen Sie Lösungen aus der Schnecke mit einem Tuch.
- Eis und Permafrost Kernsammlung und -speicherung
- Wählen Sie einen Bereich der Wand Probe (siehe Abschnitt 1.2.1Hinweis).
- ca. 10 cm Durchmesser von gefrorenen Wandbereich dekontaminieren, indem sie es mit 70% Isopropanol, DNA-Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung abwischen.
- Erhöhen die dekontaminierten auger auf den Bereich von Interesse , so dass es auf die Probenfläche senkrecht und beginnen Bohren in die gereinigte Fläche der Wand (1C, D).
- Entfernen Sie vorsichtig die Schnecke von der Probensammelbereich. Trennen Sie die Schnecke vom Motor und legen Sie die Schnecke über dem sterilen PVC-Rohr in der sauberen Arbeitsplatz. Kippen vorsichtig Schnecke , so dass die gefrorenen Kerne herausgleiten auf die sterile PVC - Rohr (Abbildung 1E).
- Dekontaminieren Handschuhe mit 70% Isopropanol, DNA-Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung.
- Pick-up die Eis und Permafrost Kerne mit sterilen Handschuhen und legen Sie sie in sterile Beutel.
- Legen Sie die Kerne in einem kühleren oder kalten Raum, bis sie versendet werden oder verarbeitet werden.
- Schip die gefrorenen Kerne unter Verwendung von Trockeneis sie unter 0 ° C bei einer Temperatur zu halten.
- Sofort speichern die Kerne bei -80 ° C.
2. Permafrost und Eis-Core-Prozessoren
- Materialvorbereitung
- Bereiten Sie sterile, Nukleinsäure-freie schwere Aluminiumfolie, Metallregale, Glaswaren, Metallzangen, und Glaswolle von 4 Stunden bei 450 ° C in einem Ofen backen. Nehmen Sie sich diese Materialien bis zur Verwendung.
- Sterilisieren 95% Ethanol und Reinstwasser durch die Lösungen durch ein 0,22 um Filter geleitet.
- Store Ethanollösung bei -20 ° C und Wasser bei 4 ° C.
- Sterilisieren einer Kunststofflineal indem sie sie mit 70% Ethanol, DNA Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung Aufsprühen und unmittelbar nach jeder Lösung abgewischt.
- Bakterienkultur Vorbereitung
- Bereiten Sie Brühe und Platten Serratia marcescens zu wachsen.
- Für Brühe, kombinieren 5 g VersuchptEins, 1 g Glucose, 5 g Hefeextrakt und 1 g Kaliumhydrogenphosphat, und dann mit destilliertem Wasser auf 1 L. zu erreichen Platten zu machen, fügen Sie 15 g Agar zu der obigen Mischung. Für Brühe und Platten für 15 min pH-Wert auf 7 und Autoklaven bei 121 ° C einzustellen.
- Bereiten 1x Phosphat geschwabbelt Kochsalzlösung (PBS) durch die Kombination von 8 g Natriumchlorid, 0,2 g Kaliumchlorid, 1,44 g dibasisches Natriumphosphat und 0,24 g monobasisches Kaliumphosphat und fügen destilliertes Wasser 800 ml zu erreichen. PH-Wert auf 7,4 und destilliertes Wasser für 15 min 1 L. Autoklaven bei 121 ° C zu erreichen.
- Impfen Brühe mit einer sterilen Schleife durch in den S. Tauchen marcescens Kultur , die zuvor bei -80 ° C eingefroren gelagert wurde. Unter aseptischen Bedingungen wird die Kultur serielle verdünnte durch Zugabe von 1 ml der Kultur zu 9 ml PBS und manuell die Lösung invertieren. 1 ml dieser Verdünnung auf 9 ml PBS und manuell die Lösung invertieren. Wiederholen Sie acht weitere Male , bis ein 10 -9 Dilution erreicht ist.
- Verbreiten Sie die 10 -6, 10 -7, 10 -8 und 10 -9 Lösungen auf Agarplatten durch die Verteilung von 1 ml Brühe auf die Platte und Ausbreitung mit einer Zelle Streuer. Tun Sie dies in dreifacher Ausfertigung pro Verdünnung. Bewahren Sie die ursprüngliche Kultur bei 4 ° C.
- Inkubiere Platten bei 30 ° C für 24 Std. Zähle die Anzahl der Kolonien, die Anzahl der Zellen in der ursprünglichen Kultur zu berechnen. Anmerkung: Die Anzahl der Kolonien in der ursprünglichen Kultur auf die Wachstumsrate der Bakterien abhängen.
- Pipettieren 250 ul der ursprünglichen Kultur in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verdünnte ursprüngliche Kultur von genügend Volumen des 1x PBS Zugabe etwa 10 9 Zellen / ml zu erhalten , wie durch Koloniezahl in dem vorherigen Schritt bestimmt. Pelletieren Sie die Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen durch bei 2.500 xg für 10 min zentrifugiert.
Hinweis: Das Volumen 1x PBS variiert in Abhängigkeit von der Wachstumsrate der Bakterien. - In einem sterilen biohoodPipettieren aus, die Brühe und Resuspendieren der Zellen in 1 ml 1x PBS-Puffer. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung oder etwa zwei Monate.
- Am Tag der Verarbeitung verdünnen S. marcescens Kultur aus Schritt 2.2.7 durch Zugabe von 1 ml des ursprünglichen S. marcescens Kultur zu 39 ml 1x PBS - Puffer in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen.
- Bereiten Sie Brühe und Platten Serratia marcescens zu wachsen.
- Bereiten kalten Raum Platz für Core-Verarbeitung und Konservierung Getriebe
- Vor der kalten Raum kühlen, saubere Wände, Böden und Metalltisch mit einer 1% igen Bleichlösung.
- Die eingestellte Temperatur des Kühlraum auf etwa -11 ° C.
- Sobald der kalten Raum die gewünschte Temperatur erreicht hat, tragen leichte Pflicht Anzüge, Nitril Handschuhe und Masken eine Kontamination in den Kühlraum zu reduzieren und den Proben.
Hinweis: Zwei richtig gekleidet Personen sind für dieses Verfahren erforderlich. - Bringen Sie die sterile Materialien (zB Aluminiumfolie, Metallregale, Glaswaren, Tablett, S. marcescens Kultur und microtome Klinge) und Proben in den Kühlraum und Platz auf dem sterilen Tisch.
- Permafrost und Eis Core-Verarbeitung in einem kalten Raum Einrichtung
- Legen Sie einen Permafrostkern auf einem sterilen, Nukleinsäure-freie Aluminiumfolie.
- Beimpfen leicht die Außenseite des Kerns mit der verdünnten Kultur von S. marcescens mit einem sterilen Schaum - Stecker (2B).
- Setzen Sie den Kern auf dem sterilen Metallgestell, das über einem Tablett sitzt.
- Sterilisieren des Stahl Mikrotomklinge mit 70% Ethanol, DNA Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung.
- Haben einzelne Eine saubere Handschuhe aus Nitril mit 70% Ethanol, DNA-Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung und halten Kern bei einem Winkel von 45 ° über dem Tablett.
- Haben einzelne B sanft ca. 5 mm von der Außenseite des gesamten Kerns kratzen, einschließlich der Enden, die sterile Klinge während Identität Einzel den Kern nach jeder Schramme dreht (
- Haben einzelne B - Filter-sterilisierte 95% Ethanol über den Kern sorgfältig und schnell gießen, während Einzelne A den Kern dreht als die Lösung (Figuren 2D, 3C) gegossen wird.
- Haben einzelne B den Kern mit Filter-sterilisiertes Wasser sofort ausspülen.
- Ersetzen Sie gebrauchte Metallgestell auf Tablett mit einer neuen sterilen Metallgestell.
- Habe Identität Einzel seine Handschuhe aus Nitril mit 70% Ethanol, DNA-Dekontaminationslösung reinigen und RNase Dekontaminationslösung und halten Sie den Kern in einem Winkel von 45 ° über dem Tablett.
- Haben einzelne B den gesamten Kern mit DNA-Dekontaminationslösung besprühen.
- Haben einzelne B den Kern mit Filter-sterilisiertes Wasser sofort ausspülen.
- Haben einzelne B den gesamten Kern mit RNase Dekontaminationslösung besprühen.
- haben Individual B sofort gründlich den Kern mit Filter-sterilisiertes Wasser.
- Setzen Sie den Kern auf einem sterilen Blatt aus Aluminiumfolie und leicht zu wickeln.
- Thaw äußeren Kern
- Legen Sie eine sterile Metallgestell über eine sterile Glasschale in einem sterilen biohood mit Laminar-Flow.
- Legen Sie zwei Agarplatten spezifisch für S. marcescens in der Glasschale unter dem sterilen Rack Flüssigkeit aus dem Kern (Abbildung 2E) zu sammeln.
- Setzen Sie den Kern auf dem sterilen Metallgestell.
- Erlauben etwa 2-5 mm von der Außenfläche des Kerns bei 23 ° C auftauen (im Durchschnitt, dies innerhalb von etwa 10 min stattfindet). Drehen Sie den Kern etwa 90 ° alle 2 min.
- Swab gesamte Oberfläche des Kerns mit einer sterilen Pinzette und sterile Glaswolle und impfen zwei Agarplatten spezifisch für S. marcescens durch diese Materialien auf die Oberfläche der Platten Abtupfen. Beimpfen von zwei neuen Platten mit der ursprünglichen Kultur verwendet der Außenseite des zu dotierenKern, die den niedrigen Temperaturen des kalten Raum ausgesetzt war.
- Messen Außenabmessungen des aufgetauten zylindrischen Kern durch einen sterilen Lineal platzieren in der Nähe, aber nicht berühren den Kern.
- Setzen Sie den Kern in großen sterilen Beutel und lagern Sie es bei -80 ° C.
- Überprüfen Sie für das Wachstum
- Inkubieren Agarplatten bei 23 ° C für eine Woche.
- Untersuchen Agarplatten für das Wachstum von S. marcescens Kolonien.
- Wenn es keine sichtbaren Kolonien auf der Platte sind, gehen 2.5.3 zu treten.
- Wenn Kolonien auf der Platte erscheinen, wiederholen Sie die Schritte 2.1.1 in Abschnitt 2 "Permafrost und Eiskern Verarbeitung".
- Erhalten Sie den Kern aus dem Gefrierschrank und aseptisch Übertragung auf einen sterilen Beutel.
- Lagern Sie den Kern in einem sterilen Beutel bei 4 ° C für etwa 24 bis 48 Stunden den gesamten Kern aufzutauen.
3. Erhalten Subsample für die Nukleinsäure-Extraktion aus Eisbohrkernen und Permafrost
- Nukleinsäureextraktion aus Eisbohrkernen
- Mischen Sie die aufgetauten Material aus dem Eiskern durch leichtes Schütteln der Tasche (2G).
- Gießen die aufgetauten Material in einen sterilen Behälter mit einem 0,22 um-Filter unter Vakuum Mikroorganismen zu sammeln.
- Aseptisch entfernen Sie den Filter mit einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in einem sterilen 2 ml Keramikperlen Rohr (1,4 mm).
- Lagern Sie den Filter bei -80 ° C.
- Nukleinsäureextraktion aus Permafrostkerne
- Mischen Sie die aufgetauten Material aus dem Permafrostkern vorsichtig den Beutel kneten.
- Nach der Permafrost gut gemischt wurde, erhalten eine Teilprobe von etwa 0,5 g Masse Boden mit einem sterilen Spatel und legen Sie sie in einem tariert sterile 2 ml Keramikperlen Schraubverschluss Rohr (1,4 mm), die senkrecht auf einer Waage sitzt.
- Shop subsamples bei -80 ° C.
- Erhalten gravimetrischen Wassergehalt der Proben.
- Messen Sie 10 g des Permafrostes mit einem Sterile Spatel und in eine tarierte Zinn auf einer Waage. Messen Sie feuchte Masse des Permafrosts und Zinn.
- Inkubieren Permafrost in einem Ofen bei 105 ° C eingestellt für 24 Stunden. Messen Trockenmasse des Permafrosts und Zinn.
- Berechnen Sie die gravimetrische Wassergehalt der feuchten Masse des Permafrosts durch die Trockenmasse des Permafrost abgezogen und durch die Trockenmasse des Permafrost geteilt wird.
- Shop Permafrost bei -80 ° C.
4. Extrahieren von Nukleinsäuren aus Permafrost und Eisbohrkernen
- Materialvorbereitung
- Bereiten Sie amber Fläschchen Lösungen zu halten, indem sie mit 0,1% Diethylpyrocarbonat (DEPC) Behandlung, Inkubation O / N bei 37 ° C, und Autoklaven.
- Bereiten 240 mM Kaliumphosphatpufferlösung. Hinzufügen 2. 5 g monobasisches Kaliumphosphat und 38,7 g Kaliumhydrogenphosphat. Stellen Sie Endvolumen auf 500 ml mit sterilem Wasser hinzugefügt wird.
- Bereiten Sie Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) Extraktion buffer von in 80 ml Wasser 4,1 g Natriumchlorid gelöst und 10 g CTAB langsame Zugabe unter Erhitzen und Rühren. Stellen Sie Endvolumen auf 100 ml mit sterilem Wasser hinzugefügt wird.
- Hinzufügen gleichen Volumina Phosphat-Pufferlösung und CTAB-Puffer und Filter sterilisieren mit einem 0,22 um-Filter. Decken-Flasche mit Aluminiumfolie und lagern bei RT.
- Bereiten 1,6 M Natriumchloridlösung (NaCl) durch die Kombination von 9,35 g NaCl und 100 ml sterilem Wasser. 10 g Polyethylenglykol 8000 auf 1,6 M NaCl-Lösung und Filter sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C.
- Nukleinsäureextraktion nach einer modifizierten Version von Griffiths et al. 22 und Töwe et al. 23
- Tragen Sie leichte Pflicht Anzüge, Nitril Handschuhe und Masken. Sauberen Laborraum und Pipetten mit 70% Ethanol, DNA Dekontaminationslösung und RNase Dekontaminationslösung.
- Entfernen Substichprobe (Filter aus Eisbohrkernen oder Permafrostboden Probe) in 2 ml Keramikperlen Schraube-cap Rohr von -80 ° C Gefrierschrank und Auftauen bei RT.
- 0,5 ml Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) Extraktionspuffer und Wirbel kurz.
- In 0,5 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25: 24: 1) (pH 8) und schütteln Rohre horizontal für 10 min auf einem Vortexer einen Flachbildschirm-Adapter.
- Nach Wulst-Schlagen, Zentrifugenröhrchen bei 16.100 xg für 5 min bei 4 ° C.
- Entfernen wässrige Schicht in ein neues steriles 1,5-ml-Röhrchen und Mischen mit einem gleichen Volumen Chloroform-Isoamylalkohol (24: 1). Zentrifuge bei 16.100 xg für 5 min bei 4 ° C.
- Entfernen wässrige Schicht in ein neues steriles 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie zwei Volumina von 30% Polyethylenglykol 8000 und 1,6 M NaCl. Inkubieren für 2 h bei 4 ° C.
- Zentrifuge bei 16.100 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Waschen Sie das Pellet Nukleinsäure mit etwa 500 ul eiskaltem 70% Ethanol und Zentrifuge bei 16.100 g für 10 min bei 4 ° C.
- Luft trocknen Pellet in einem sterilen biohood für 2 Stunden. Resuspendieren in 50 & mgr; l DNase / RNase-freiem TE-Puffer (pH 8,0). DNA ist bereit für Downstream-Anwendungen wie PCR und qPCR.
- Die Konzentration der DNA mit einem Spektrophotometer.
- Verdünnen Sie DNA mit sterilem, DNA-freies Wasser zu erreichen, 20 ng pro Reaktion.
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Representative Results
Die vorgestellte Methode könnte verwendet werden, gefrorenen Proben aus verschiedenen Kryosphäre Umgebungen, von Gletschereis gesammelt zu dekontaminieren Permafrost. Hier präsentieren wir Daten gesammelt speziell aus Eis und Permafrost - Proben gesammelt aus dem Engineering Research and Development Center - Cold Regions Research and Engineering Laboratory (ERDC-CRREL) Permafrost - Tunnel befindet sich in Fox, AK (1A und 1B). Der Permafrost Tunnel erstreckt sich etwa 110 m in die Seite des Goldstream Tal und bietet Zugriff auf Eis reiche Schlamm und Schlick 30-31. Die Proben aus einem Eis Keil und gefrorenen Boden wurden in dreifacher Ausfertigung von den Wänden des Tunnels am 24. Oktober 2014. Zum Zeitpunkt der Probenahme, war die Temperatur der Permafrostwand -2,9 ° C sorgfältig gesammelt. Die Proben wurden von einem Eiskeil Merkmal etwa 27 m vom Portal des Tunnels, und gefrorenen Boden auf 35 m und 60 m gesammelt ausdas Portal des Tunnels (1C und 1D). Besondere Sorgfalt wurde bei der Probensammlung genommen Kontamination der Eis und Permafrost Kerne (Abbildung 1E) begrenzen. Die gefrorenen Kerne wurden entsprechend unserer Dekontaminationsprotokoll (Abbildung 2) gehandhabt und auf Trockeneis zum Labor in Hanover, NH zur Verarbeitung CRREL Bodenmikrobiologie transportiert.
Alle Kerne wurden verarbeitet , um das Protokoll in Abschnitt 2 mit sterilen Mikrotomklingen und Lösungen (3A, B und C) beschrieben ist . Das Ziel dieser Studie war es, erfolgreich endogene Nukleinsäuren aus den gefrorenen Proben extrahieren, um die mikrobiellen Gemeinschaften, die zu dem Zeitpunkt zu bestimmen, dass das Material abgelagert wurde. Das Dekontaminationsprotokoll wurde durch Dotieren der Kerne mit einer verdünnten Kultur von Serratia marcescens , bewertet und dann die Petrischalen für Wachstum achtern Prüfunger die Kerne wurden 31 behandelt. Das Fehlen von S. marcescens Kolonien zeigten , dass die exogene Mikroorganismen in geeigneter Weise aus dem äußeren Bereich des Kerns entfernt wurden. Jedoch würde die Abwesenheit von Kolonien nicht an, ob exogene DNA aus dem äußeren Bereich des Kerns entfernt wurde. Daher sequenziert wir Proben aus dem Eiskern für DNA aus Serratia sp zu überprüfen. Da mikrobielles Häufigkeit im Eis Keil wahrscheinlich deutlich niedriger war als im Permafrost, haben wir die Eisbohrkerne , wenn DNA von S. zu bestimmen marcescens würde nach dem Dekontaminations Protokoll vorhanden sein. Wenn die Kerne nicht richtig dekontaminiert wurden, Sequenzen dann auf S. bezogenen marcescens würde erwartet , dass in den Proben vorhanden sein. Abbildung 4 zeigt die geringe bakterielle Vielfalt im Eiskern aus 16S - rRNA - Gen - Sequenzierung Ergebnisse. Sequenzen im Zusammenhang mit Pseudomonas sp., Der phylum Gammaproteobacteria, dominiert das Eis samples. Mitglieder Planctomycetia Zusammenhang waren auch in dem Eis, jedoch in geringerem Maße. Von besonderer Bedeutung ist die Abwesenheit von Serratia sp. In den Sequenzierungsergebnissen, was darauf hindeutet , dass die Dekontamination Protokoll ausreichend exogene DNA entfernt.
Darüber hinaus besteht ein zusätzliches Risiko einer Kontamination während der Extraktion von Nukleinsäuren. Negative Extraktion Rohlinge wurden zu offenbaren Kontamination von exogenen Nukleinsäuren verwendet. Die DNA aus den Proben und negative Kontrollen wurden mittels qPCR amplifiziert. qPCR - Daten zeigten , dass die Permafrost Bakterien beherbergte, aber Archaea wurden im Permafrost (Tabelle 1) nicht erkannt. Erfolgreiche Dekontamination weiter durch das Fehlen von bakteriellen oder archaebakteriellen Amplikons in Extraktions Rohlingen mit positiver Verstärkung der Betätigungseinrichtungen in Verbindung belegt wurde, Pseudomonas fluorescens und Halobacterium salinarum (Tabelle 1). Die abundrungs Messungen zeigten , dass es in Bakterienfluss zwischen den Kernen gesammelt bei 35 m vom Portal wurden keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den 60 m Kernen (Tabelle 1). Laufende Forschung wird durchgeführt, ob Zusammensetzung war zwischen den Kernen verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaft bestimmen.
Abbildung 1. Die Probenahmestellen in der Nähe von Fairbanks, AK. (A) Karte von Fairbanks, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html), (B) ERDC-CRREL Permafrost - Tunnel, (C) Sammlung Permafrostkerne die SIPRE Schnecke, (D) Ansicht der Schnecke Eingabe Permafrostwand, und (E) Herstellung des Kerns für die Archivierung verwendet wird . Bitte klicken Sie hier um ein , um zu vergrößern version von dieser Figur.
Abbildung 2. Schematische Darstellung des gefrorenen Materials dekontaminieren. (A) Das gefrorene Material (zB Eiskern oder Permafrostkern) in einem kalten Raum verarbeitet. (B) Es wird gezielt mit einer Bakterienkultur kontaminiert. (C) Der Kern wird mit einer sterilen Mikrotomklinge rasierten den äußeren Teil 5 mm zu entfernen. (D) Eine Reihe von Lösungen angewendet werden, um die äußere Teil der Probe dekontaminieren. DDS zeigt DNA-Dekontaminationslösung und RDS zeigt RNase Dekontaminationslösung. (E) durch den Kern in einer sterilen biohood bei RT gehalten platzieren, wobei die äußere 2-5 mm des Materials auftaut. Die Flüssigkeit, die aus dem Eis oder Permafrost tropft wird in Petrischalen gesammelt und der Kern abgetupft und plattiert zu prüfen, ob Der Kern wurde ordnungsgemäß dekontaminiert. (F und G) Wenn das Bakterienwachstum nicht erkannt wird, dann wird der Kern bei 4 ° C in einem sterilen Behälter aufgetaut ist. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Dekontamination von Permafrostkerne in kalten Raum unter sterilen Bedingungen. (A) Entfernen Sie die äußere Schicht des Permafrostes Kern mit einer Klinge Metall Mikrotom durch Schaben. (B) Ein genauerer Blick auf eine Schramme. (C) Lösung Spülen Sie die äußere Schicht des Kerns zu dekontaminieren. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Mikrobielle Sequenzen aus den Eiskeil Proben. Balkendiagramm die durchschnittliche relative Häufigkeit von Bakterienstämmen , die in den Eiskeil Proben Prozentsatz zeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1. Bakterien Fülle im Permafrost. QPCR Ergebnisse die Fülle von Bakterien in den Permafrostproben und die damit verbundenen Extraktionsrohlingen zeigt. Die Werte in der Tabelle sind als Mittelwert ± Standardfehler gemeldet. n ist die Anzahl von Proben. ND gibt an nicht erkannt.
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Discussion
Die Kryosphäre bietet Zugang zu den erhaltenen Organismen, die im Rahmen früherer Umweltbedingungen bestehen blieb. Obwohl die zurückgewonnene Taxa die komplette historische Gemeinde nicht darstellen können, aus der Analyse von Gletschereis und Permafrostproben gewonnen diejenigen können 15-16 wertvolle historische Informationen über ausgewählte Zeiträume ergeben. So hat beispielsweise sinnvolle biologische Informationen wurden aus Eis Studien zur Untersuchung der anaeroben Aktivität in grönländischen Eisschildes 20 gezogen und Permafrost Studien Kohlenstoffkreislauf Prozesse als Folge der Auftau - Untersuchung 33 und haben Einblick in Pilz Vielfalt von Permafrost vorgesehen in Beringia 16. Die richtige Probenentnahme und Dekontamination muss erfolgen, bevor nachgelagerten Analysen biologischen Gemeinschaften innerhalb dieser gefrorenen Materialien zu untersuchen. Auch wenn diese Schritte erhebliche Auswirkungen haben die Daten über die Interpretation, viele Studien bieten keine spezifischen Details, wie die Proben were erhoben und verarbeitet oder Bilder zeigen, wie die gefrorenen Materialien zu handhaben. Zum Beispiel haben frühere Studien den äußeren Teil der Kerne mit fluoreszierenden Mikrokügelchen oder bekannten Bakterien 15 dotiert, obgleich die genauen Konzentrationen dieser Materialien nicht beschrieben wurden. Andere Studien Dekontamination Protokolle im Detail beschrieben wurden, aber noch nicht mit hohem Durchsatz angewendet analysiert 15 die Wirksamkeit der Methode zu testen, 32. Daher ist eine detaillierte Screening von intakten Bakterien und exogener DNA durch Wachstum auf Petrischalen und qPCR wurde verwendet , zu bestimmen , ob die Probenentnahme, Erhaltung und Analyseverfahren waren genug sterile mikrobiellen Gemeinschaften in den gefrorenen Materialien zu identifizieren.
Dieses Protokoll wurde geändert, um erfolgreich genetische Material von Interesse aus dem alten Kerne zu isolieren. Pflege wie spezifische Gang tragen und Dekontaminieren von Lieferungen müssen bei der Erhebung, Verarbeitung und Extrakt werdenIonen von den Kernen, da eine Kontamination bei jedem Schritt auftreten könnte. Weiterhin mit Trockeneis oder einem vergleichbaren Kühlmittel die Kerne Versand ist zwingend notwendig, weil, wenn die Kerne während des Transports auftauen, dann gibt es eine höhere Neigung, die Verunreinigungen aus dem äußeren Bereich des Kerns zu dem inneren Abschnitt des Kerns wandern können. Um die Möglichkeit einer Verunreinigung zu minimieren, sollten größere Kerne mit einem motorisierten Schnecke zu sammeln, anstatt einen Push-Kern. Wir fanden heraus, dass die Push-Kerne zu klein waren, richtig in der Schaben Schritt zu dekontaminieren. Alternativ könnte ein größeres Volumen der Probe von den größeren Kernen extrahiert werden, die für Proben mit geringer Häufigkeit von biologischem Material besonders wichtig ist. Zusätzlich bietet das größere Volumen mehr Raum für Fehler , so daß , wenn Serratia marcescens Kolonien auf Platten festgestellt werden, dann wird der Kern groß genug ist , wieder verarbeitet werden.
Verschiedene Verbrauchsmaterialien wurden getestet, um die effizientesten zu bestimmenVerfahren um die Kerne zu dekontaminieren. Zum Beispiel sterile Aluminiumfolie, anstatt Glasschalen oder Kunststoffmaterialien, für den Kern erlaubt, schnell und einfach auf eine sterile Oberfläche gelegt werden. Auch nicht-traditionellen Verbrauchsmaterialien wie eine Metallstange und ein Tablett erwies sich als vorteilhaft, die abgekratzt äußeren Materialien zu ermöglichen, von dem Kern zu akkumulieren entfernt, mindert das Risiko der erneuten Kontaminierung der Kerne. In früheren Iterationen des Protokoll trat das Abschaben auf einer ebenen Fläche, die das Risiko einer Kontamination erhöht. Schließlich sterile Beutel, anstatt Glasschalen wurden die Proben werden förderlich für das Mischen und Speichern gefunden.
Dieses Protokoll wurde gezielt Mikroorganismen und Nukleinsäuren auf dem äußeren Teil der gefrorenen Kerne zu eliminieren. Während Isopropanol und Ethanol wirksame Desinfektionsmittel sind, entfernen Sie sie nicht Nukleinsäuren. Daher Lösungen, die Nucleinsäuren und assoziierte Enzyme aus dem äußeren Bereich der Kerne entfernen, wurden verwendet. Diese Lögen sind häufig zu entfernen Nukleinsäuren und die damit verbundenen Nukleasen aus Labormaterial und Ausrüstung verwendet. Wenn ihre Wirksamkeit testen auf Oberflächen im Labor, RNA Dekontaminationslösung mehr exogene Materialien als die DNA - Dekontaminationslösung 34 entfernt. Verwendung Nukleasen den äußeren Teil des Kerns zu dekontaminieren möglicherweise nicht immer die bevorzugte Methode, da genetische Material von Interesse auch aus Proben mit geringer Abundanz eines bestimmten Organismus entfernt werden. Insbesondere gespeicherte genetische Material im Permafrost und Eis für längere Zeit durchlaufen Abbau. Da Mikroorganismen in hoher Abundanz in diesen Alaska Proben sind, dass die Sorge die Lösungen einen hohen Anteil an endogenen genetischen Materialien zu entfernen würde, wurde stark reduziert. Vorsicht ist jedoch geboten, wenn Lösungen verwenden, die Nukleasen enthalten, um sicherzustellen, dass die Nukleinsäuren, die stark degradiert wurden oder von Organismen in geringer Menge nicht entfernt werden durchdie Nukleasen.
Das Fehlen von S. marcescens Kolonien auf den Petrischalen vorgesehen Vertrauen , dass die intakten Zellen aus dem äußeren Bereich der Permafrostkerne entfernt wurden. Darüber hinaus Analyse von Eisbohrkernen, die das gleiche Protokoll unterzog zeigte keine nachweisbaren Sequenzen S. bezogen marcescens. Sequence Ergebnisse zeigten , dass Pseudomonas nur in diesen Proben festgestellt wurden, obwohl beide Pseudomonas sp. und Serratia sp. Gammaproteobacteria sind innerhalb der Klasse. Zusammen bilden die Abwesenheit des S. marcescens Kolonien auf Petri - Platten und die Abwesenheit von DNA - Amplikons aus qPCR legen nahe , dass die gefrorenen Kerne erfolgreich dekontaminiert wurden. Daher erfasst die Mikroorganismen wurden in dem gefrorenen Material wahrscheinlich eingebettet, anstatt eine Kontamination durch Bohren oder die Kerne verarbeitet. Andere Bohrtechniken umfassen hydraulischen Bohr-Boden oder Eis in größeren Tiefen zu durchdringen. Obwohl diese Methode would vorteilhaft sein, geringe mikrobielle Hülle und Fülle in diesen oligotrophe Umgebungen zu untersuchen, ist es nicht offenbaren, ob Bohrflüssigkeiten erfolgreich entfernt werden würde. Außerdem, wenn Hochdurchsatz - Sequenzierung nicht Teil der Downstream - Analyse ist, spezifische PCR - Reaktionen S. Targeting marcescens sollte die extrahierte DNA zu verstärken , verwendet werden.
Die Ergebnisse aus unserem Beispiel-Datensatz zeigte, dass intakte genomische DNA erfolgreich aus den gefrorenen Materialien extrahiert wurde. Zudem stellen sowohl die Permafrost und Eiskeil beherbergte Bakterien, wie qPCR und Sequenzierung belegt sind. Der Alaskan diskontinuierlichen Permafrost aus dieser Studie enthielten ähnliche Bakterienzahlen als Permafrost in der kanadischen Arktis 35, obwohl die Alaskan Proben eine Größenordnung weniger Bakterien als Permafrost aus dem tibetischen Hochland in der Provinz Qinghai enthalten, China 36 und der aktiven Schicht / Permafrostböden aus Nunavut, Kanada 37. Ähnlich einem ice Keil gesammelt in Nunavut, Kanada 37, Sequenzen zu Gammaproteobacteria bezogen, insbesondere Pseudomonas, die Böden häufig und metabolisch vielfältig, dominierten die Alaskan Eiskeil in dieser Studie. In der Tat, Katayama et al. 11 isolierten Bakterien im phyla Actinobacteria, Bazillen und Gammaproteobacteria von einem der Eiskeile vom ERDC-CRREL Permafrost - Tunnel. Diese Studien bestätigen die Detektion von Gammaproteobacteria in dieser Studie. Planctomycetia, die für Wasser Probe gemeinsam sind, wurden auch in der Eiskeil detektiert. Diese Organismen wurden in der aktiven Schicht Böden über Permafrost in Nordosten Sibiriens 38, zusätzlich zu den Permafrost in der tibetischen Hochebene in Qinghai, China 39 gefunden.
Viele Studien haben das Vorhandensein von Archaea, insbesondere methanogens, im Permafrost, mit dem Begriff untersucht, dass als Permafrost taut, wird methanogens wahrscheinlich aktiver werden, ContriButing zum Ausströmen von Methan in der Atmosphäre 21, 33-34. Überraschenderweise, obwohl auch in Permafrost beide Euryarchaeota und Crenarchaeota wurden gefunden Archaea wurden nicht von der kanadischen Arktis 17 in den alaskischen Eiskeil oder Permafrostproben nachgewiesen und methanogens wurden in Permafrostproben aus der arktischen Tundra in Russland 21 gefunden.
Gefrorene Materialien beherbergen alte Mikroorganismen, eine Aufzeichnung von biogeochemischen Prozessen bietet, die vor vielen tausend Jahren aufgetreten. Diese Artenvielfalt ist von großem Interesse bei der derzeitigen Regelung der Klimaerwärmung, weil Mikroorganismen, die einmal in der Kryosphäre Umgebung beschränkt wurden, können freigesetzt werden, wenn die gefrorenen Materialien aufzutauen. Um in diesen gefrorenen Materialien, die gefrorenen Böden und Eisproben beherbergte getrost die Artenvielfalt identifizieren müssen ordnungsgemäß behandelt und dekontaminiert. Hier präsentieren wir ein Protokoll fremde Zellen und DNA aus gefrorenen Proben ensu zu entfernenerneut, dass die detektierten Mikroorganismen aus dem Material, anstatt Kontamination durch Bohren oder Verarbeitung der Kerne wurden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | ||
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | ||
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | ||
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | ||
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | |||
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22 µm | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 ml Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
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