Summary
Kryosfæren giver adgang til bevarede organismer, der varede under tidligere miljøforhold. En protokol præsenteres til at indsamle og rense permafrost kerner af jord og is. Fravær af exogene kolonier og DNA tyder på, at mikroorganismer detekteret repræsenterer materialet, snarere end forurening fra boring eller forarbejdning.
Introduction
Den kryosfære (f.eks permafrost jord, is funktioner, iskold sne, firn og is) giver et indblik i, hvilke typer af organismer varede under tidligere miljøforhold. Da disse substrater kan være ti til hundrede tusinder af år gamle, deres mikrobielle samfund, når konserverede frosne siden aflejring, afspejler gamle miljøforhold. For passende analysere disse økosystemer og udtrække meningsfulde biologiske oplysninger frosne jord og is, korrekt indsamling og behandling af de frosne prøver er nødvendig. Dette er af allerstørste betydning, da klima- fremskrivninger for det 21. århundrede viser potentiale for en markant opvarmning i Arktis og subarktiske områder 1. Konkret Interiør Alaska og Grønland forventes at varme ca. 5 ° C og 7 ° C, henholdsvis i 2100 2,3. Dette forventes at få væsentlig indvirkning jorden og vandområder mikrobielle samfund, og derfor relateretbiogeokemiske processer. De varmere temperaturer og ændret nedbør regime forventes at indlede permafrost nedbrydning i mange områder 2-5 kan føre til en tykkere, sæsonmæssigt optøet (aktiv) lag 6,7, optøning af frosne jord, og smeltning af massive is organer såsom jorden is, is kiler, og segregation is 8. Dette ville dramatisk ændre de biogeokemiske attributter ud over den biologiske mangfoldighed af planter og dyr i disse økosystemer.
Glacial is og syngenetic permafrost sediment og is funktioner har fanget kemiske og biologiske beviser for et miljø, der repræsenterer, hvad der boede der på det tidspunkt, de funktioner dannet. For eksempel i Interior Alaska, både Illinoisan og Wisconsin alderen permafrost er til stede, og denne permafrost især giver unikke steder stammer fra moderne til 150.000 år før den nuværende (YBP), der indeholder biologiske og geokemiske dokumentation for IMPAct af tidligere klimatiske ændringer på biodiversiteten. Som et resultat, disse sedimenter giver en rekord i biogeokemisk og biodiversitet gennem mange tusinde år. Da området har lav sedimentation satser og har aldrig været isdækkede, uforstyrrede prøver er tilgængelige for indsamling og analyse, enten boring lodret i jorden profil eller boring horisontalt i tunneler. Endnu vigtigere er, findes der omfattende registre, at især fremhæve de unikke biogeokemiske funktioner i permafrost i denne region 9-14. Konkret til anvendelsen af DNA-analyse estimere tilstedeværelse og omfanget af den biologiske mangfoldighed i både bevarede og gamle is og permafrost prøver muliggør udforskning af sammenkædning af gamle miljøforhold og levested til besættelse af særlige organismer.
Tidligere undersøgelser har identificeret klimatiske påvirkninger af pattedyr, planter og mikroorganismer fra prøver dating til 50k YBP 11, 15-19, selvom hver undersøgelse brugte en Forskelnt metodologi til at indsamle og rense permafrosten eller iskerner. I nogle tilfælde blev borekerner steriliseret 16, 20-21, selvom den specifikke metode ikke afklare, om fremmede nukleinsyrer blev også slået fra prøverne. I andre undersøgelser bakterielle isolater 15 (fx Serratia marcescens) samt fluorescerende mikrokugler 22 er blevet anvendt til at måle effekten af rensningsprocesser.
Dette eksperiment var en del af en større undersøgelse undersøger mikrobielle samfund fra permafrosten prøver dateres tilbage til ca. 40 k YBP. Det specifikke mål med denne del af undersøgelsen var at succes rense is og permafrost kerner. Så vidt vi ved, har ingen metode integreret anvendelse af løsninger designet til at eliminere fremmede nukleinsyrer og associerede nukleaser fra den ydre del af de frosne kerner. Dette er til trods for, at disse løsninger er commonly anvendes til dekontaminering af laboratorieudstyr til molekylære eksperimenter.
Når kernerne blev dekontamineret, blev genomisk DNA ekstraheret under anvendelse af de protokoller, der er udviklet af Griffiths et al. 23 og Towe et al. 24, kvantificeret ved anvendelse af et spektrofotometer, og fortyndet med sterilt, DNA-frit vand for at opnå 20 ng per reaktion. Bakterielle 16S rRNA-generne blev forstærket med primere 331F og 797R og sonde BacTaq 25 og arke 16S rRNA-generne blev forstærket med primere Arch 349F og Arch 806R og sonde TM Arch 516F 26 under følgende betingelser: 95 ° C i 600 sek efterfulgt af 45 cykler på 95 ° C i 30 sek, 57 ° C i 60 sek og 72 ° C i 25 sek med endelig ekstension ved 40 ° C i 30 sek. Alle qPCR Reaktionerne blev udført in duplo. De 20 pi reaktionsvolumener inkluderet 20 ng DNA, 10 pM af primerne, 5 pM af sonden, og 10 pi af qPCR reaktionsblandingen. standarder for bakteriel og archaeorganisme qPCR blev fremstillet under anvendelse af genomisk DNA fra Pseudomonas fluorescens og Halobacterium salinarum hhv. Begge blev dyrket til logaritmisk fase. Pladetællinger blev udført, og DNA blev isoleret fra kulturerne. Genomisk DNA blev kvantificeret med et spektrofotometer under antagelse af en og seks kopier af 16S rRNA-genet pr genom for H. salinarum og P. fluorescens, henholdsvis 27-28. Kopier numrene på de bakterielle og arke gener blev beregnet på grundlag af standardkurven, log-transformeret til regnskab for ulige afvigelser mellem behandlingerne, og vurderet af ANOVA.
EF-sammensætning blev bestemt ved sekventering af 16S rRNA-genet ved hjælp af flow celler og bro forstærkning teknologier og analysere de samfund med »kvantitative indsigt i mikrobiel økologi" (QIIME) 29. Frem og bak læser blev forenet sammen og derefter sekvenser blev filtreret, indekseret,og repræsentanter af høj kvalitet blev udvalgt til de novo operationelle taksonomiske enheder (OTU) opgave gennem sekvens alignment med en reference-database. Opstillede sekvenser blev sammenlignet med en separat referencedatabase for taksonomisk opgave. En phylum niveau OTU tabel blev oprettet for at bestemme generelle samfund sammensætning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargøring af udstyr og Permafrost Core Collection
- forberedelse Udstyr og felt prøvetagning og bevarelse gear
- Saml snegl til prøvetagning ved at indsætte drevet adapteren i toppen af tønden og dreje håndtaget for at låse den på plads. Pin adapter rør på drevet adapter og pin motoren på adapteren rør. Sæt knivene på tønden.
- Bær lette dragter, nitrilhandsker, og masker for at reducere enhver forurening til prøverne. Brug høreværn og en hård hat til sikkerhed ved ankomsten til Permafrost Tunnel (figur 1).
- Indtast tunnelen og vælg en placering til at indsamle prøverne (Figur 1B).
Bemærk: Til lodret eller vandret boring position ved at vælge et område, hvor der er kendt bevis for, at materialet er frosset (fx is eller permafrost), er der ingen kendte stort rodsystem, og der er ingen kendt grus. Fjern altlevende plantemateriale fra området før opsamling af en prøve. Hvis bore lodret eller vandret, skal du vælge et område, der er forholdsvis flad og tilgængelig med sneglen. - Der fremstilles en arbejdsstation ved lagdeling jorden med et plastmateriale, der er blevet steriliseret med 70% isopropanol, DNA dekontaminering opløsning, og RNase dekontaminering opløsning.
- Placer en 10 cm polyvinyl diameter chlorid (PVC) rør skåret i halve på langs på arbejdsstationen at tilvejebringe et trug til at holde kernerne, efterhånden som de fjernes fra sneglen. Dekontaminering af PVC rør med 70% isopropanol, DNA dekontaminering opløsning, og RNase dekontaminering opløsning.
- Nær arbejdsstationen, dekontaminere sneglen ved at sprøjte den med 70% isopropanol, DNA dekontaminering opløsning, og RNase dekontaminering opløsning. Fjern løsninger fra sneglen med en serviet.
- Is og permafrost kerne indsamling og opbevaring
- Vælge et område af væggen til prøven (se 1.2.1Note).
- Dekontaminér ca. 10 cm i diameter af frosne væg område ved at tørre den med 70% isopropanol, DNA dekontaminering løsning, og RNase dekontaminering løsning.
- Hæve dekontamineres snegl til området af interesse, såsom at den er vinkelret på prøveområdet og begynde boring i den rensede flade af væggen (figur 1C, D).
- Fjern forsigtigt snegl fra prøvetagningen område. Afbryd snegl fra motoren og placere sneglen over den sterile PVC rør i ren arbejdsstation. Vippe forsigtigt snegl sådan, at de frosne kerner glider ud på det sterile PVC-rør (figur 1E).
- Dekontaminér handsker med 70% isopropanol, DNA dekontaminering løsning, og RNase dekontaminering løsning.
- Saml isen og permafrost kerner med sterile handsker og placere dem i sterile poser.
- Placer kernerne i et køligere eller koldt værelse, indtil de er afsendt eller forarbejdet.
- Ship de frosne kerner bruger tøris til at fastholde dem ved en temperatur under 0 ° C.
- Umiddelbart gemme kernerne ved -80 ° C.
2. Permafrost og Ice Core Processing
- Klargøring
- Fremstille sterile, nukleinsyre fri tunge aluminiumsfolie, metal stativer, glas, metal pincet, og glasuld ved bagning i en ovn ved 450 ° C i 4 timer. Braklægning disse materialer indtil anvendelse.
- Sterilisere 95% ethanol og ultrarent vand ved at passere opløsningerne gennem et 0,22 um filter.
- Store ethanol opløsning ved -20 ° C, og vand ved 4 ° C.
- Sterilisere en plastlineal ved at sprøjte den med 70% ethanol, DNA dekontaminering opløsning, og RNase dekontaminering opløsning og umiddelbart tørre efter hver opløsning.
- Bakteriekultur Fremstilling
- Forbered bouillon og plader til at vokse Serratia marcescens.
- For bouillon, kombinere 5 g prøveptone, 1 g glucose, 5 g gærekstrakt, og 1 g kalium dibasisk, og derefter tilføje destilleret vand for at nå en L. For at gøre plader, tilsættes 15 g agar til ovenstående mix. For bouillon og plader, justere pH til 7 og autoklave ved 121 ° C i 15 min.
- Forbered 1x phosphat buffed saltopløsning (PBS) ved at kombinere 8 g natriumchlorid, 0,2 g kaliumchlorid, 1,44 g dibasisk natriumphosphat, og 0,24 g monobasisk kaliumphosphat og tilsæt destilleret vand for at nå 800 ml. Indstil pH til 7,4 og tilsæt destilleret vand til at nå 1 L. autoklav ved 121 ° C i 15 min.
- Inokulering af bouillon med en steril løkke ved at dyppe i S. marcescens kultur, der er tidligere opbevaret frosset ved -80 ° C. Under aseptiske betingelser, seriel fortyndet kulturen ved at tilsætte 1 ml kultur til 9 ml PBS og manuelt vende løsningen. Tilsæt 1 ml af denne fortynding til 9 ml PBS og manuelt vendes opløsningen. Gentag otte gange mere, indtil en 10 -9 Dilution er nået.
- Spred 10 -6, 10 -7, 10 -8, og 10 -9 løsninger på agarplader ved at distribuere 1 ml bouillon på pladen og spredning med en celle sprederen. Gør dette i tre eksemplarer pr fortynding. Opbevar den oprindelige kultur ved 4 ° C.
- Pladerne inkuberes ved 30 ° C i 24 timer. Tæl antallet af kolonier til at beregne antallet af celler i den oprindelige kultur. Bemærk: Antallet af kolonier i den oprindelige kultur vil afhænge af vækstraten af bakterierne.
- Pipetter 250 pi af den oprindelige kultur i en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør. Fortynd oprindelige kultur ved tilsætning nok volumen af 1x PBS til opnåelse cirka 10 9 celler / ml som bestemt ved kim i det foregående trin. Pelletere cellerne i et mikrocentrifugerør ved centrifugering ved 2.500 xg i 10 min.
Bemærk: Mængden af 1x PBS vil variere afhængigt af vækstraten af bakterierne. - I en steril biohood, Pipetteres off bouillon og cellerne resuspenderes i 1 ml 1x PBS-buffer. Opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse eller cirka to måneder.
- På dagen for behandlingen fortyndes S. marcescens kultur fra trin 2.2.7 ved tilsætning af 1 ml af det oprindelige S. marcescens kultur til 39 ml 1x PBS-buffer i et 50 ml centrifugerør.
- Forbered bouillon og plader til at vokse Serratia marcescens.
- Forbered kølerum plads til core forarbejdning og konservering gear
- Forud for nedkøling det kolde rum, rene vægge, gulve, og metal bord med en 1% blegeopløsning.
- Indstil temperaturen i kølerum til ca. -11 ° C.
- Når det kolde rum har nået den ønskede temperatur, slid lette dragter, nitrilhandsker, og masker for at reducere enhver forurening til det kolde rum og prøverne.
Bemærk: To ordentligt klædt individer er nødvendige for denne procedure. - Bring sterile materialer (f.eks aluminiumsfolie, metal stativer, glas, bakke, S. marcescens kultur, og microtome blad), og prøver i det kolde rum og sted på den sterile bordet.
- Permafrost og iskerne forarbejdning i et koldt rum facilitet
- Placer en permafrost kerne på et sterilt, nukleinsyre fri af aluminiumsfolie.
- Let pode ydersiden af kernen med den fortyndede kultur af S. marcescens anvendelse af en steril skum prop (figur 2B).
- Placer kernen på den sterile metal rack, der sidder over en bakke.
- Steriliser stål mikrotom klinge med 70% ethanol, DNA dekontaminering opløsning, og RNase dekontaminering opløsning.
- Har Individuel A clean nitrilhandsker med 70% ethanol, DNA dekontaminering løsning, og RNase dekontaminering løsning og holde kernen i en 45 ° vinkel over bakken.
- Har individuelle B forsigtigt skrabe ca. 5 mm fra ydersiden af hele kernen, herunder enderne, ved hjælp af den sterile klinge mens enkeltperson En fik kernen efter hver skrabe (
- Har individuelle B pour filtersteriliseret 95% ethanol over kernen omhyggeligt og hurtigt, mens enkeltperson En fik kernen som løsningen hældes (figurerne 2D, 3C).
- Har Individuel B straks skylle kernen med filter-steriliseret vand.
- Udskift brugte metal rack på bakken med en ny steril metal rack.
- Har enkeltperson En rense hans eller hendes nitrilhandsker med 70% ethanol, DNA dekontaminering løsning, og RNase dekontaminering løsning og holde kernen i en 45 ° vinkel over bakken.
- Har Individuel B spray hele kernen med DNA dekontaminering løsning.
- Har Individuel B straks skylle kernen med filter-steriliseret vand.
- Har Individuel B spray hele kernen med RNase dekontaminering løsning.
- har indival B straks skylle kernen med filter-steriliseret vand.
- Placer kernen på et sterilt stykke aluminiumsfolie og let wrap.
- Thaw ydre kerne
- Placer en steril metal rack over en steril glasfad i et sterilt biohood med laminar strømning.
- Placer to agarplader specifikke for S. marcescens i glasset skålen under sterile rack at opsamle væske fra kernen (Figur 2E).
- Placer kernen på den sterile metal rack.
- Tillad ca. 2-5 mm af den ydre overflade af kernen at optø ved 23 ° C (i gennemsnit, vil dette ske inden for ca. 10 min). Drej kernen ca. 90 ° hver 2 min.
- Svaber hele overfladen af kernen med sterile pincetter og steril glasuld og pode to agarplader specifikke for S. marcescens ved pensling disse materialer på overfladen af pladerne. Pode to nye plader med den oprindelige kultur anvendes til at dope ydersiden afkerne, som blev udsat for de lave temperaturer i det kolde rum.
- Måle ydre dimensioner af optøet cylindrisk kerne ved at anbringe en steril lineal nær, men ikke rører kernen.
- Placer kernen i store steril pose og opbevar det ved -80 ° C.
- Check for vækst
- Inkubér agarplader ved 23 ° C i en uge.
- Undersøg agarplader for vækst af S. marcescens kolonier.
- Hvis der ikke er nogen synlige kolonier på pladen, gå videre til trin 2.5.3.
- Hvis kolonier vises på plade Gentag fra trin 2.1.1 i afsnit 2 "Permafrost og iskerne behandling".
- Få kernen fra fryseren og aseptisk overføre det til en steril pose.
- Opbevar kernen i en steril pose ved 4 ° C i ca. 24-48 timer at tø hele kernen.
3. Få delprøve for Nucleic Acid Udsugning fra iskerner og Permafrost
- Nukleinsyre ekstraktion fra iskerner
- Bland den optøede materiale fra iskernen ved forsigtig omrøring posen (fig 2G).
- Hæld den optøede materiale i en steril beholder med et 0,22 um filter under vakuum til opsamling mikroorganismer.
- Aseptisk fjerne filteret med steril pincet og placere den i et sterilt 2 ml keramisk perle rør (1,4 mm).
- Opbevar filter ved -80 ° C.
- Nukleinsyre-ekstraktion fra permafrost kerner
- Bland den optøede materiale fra permafrost kerne ved forsigtigt at ælte posen.
- Efter permafrosten er blevet godt blandet, få en delprøve på ca. 0,5 g bulk-jord med en steril scoopula og læg den i en tareret sterile 2 ml keramiske perle skruelåg rør (1,4 mm), der sidder oprejst på en balance.
- Opbevar delprøver ved -80 ° C.
- Opnå gravimetrisk indhold af prøver vand.
- Mål 10 g permafrosten med en sterile scoopula og sted i en tareret dåse på en balance. Måle våde masse af permafrost og tin.
- Inkuber permafrost i en ovn indstillet til 105 ° C i 24 timer. Mål tørvægt permafrost og tin.
- Beregn den gravimetriske vandindhold ved at trække den våde masse af permafrost ved tørvægt af permafrost og dividere med tørvægt permafrost.
- Store permafrost ved -80 ° C.
4. Uddrag nukleinsyrer fra Permafrost og Iskerner
- Materiale forberedelse
- Forbered gule hætteglas til at holde løsninger ved behandling med 0,1% diethylpyrocarbonat (DEPC), inkubering O / N ved 37 ° C, og autoklavering.
- Forbered 240 mM kaliumphosphatbuffer opløsning. Tilføj 2. 5 g monobasisk kaliumphosphat og 38,7 g dibasisk kaliumphosphat. Juster endelige volumen til 500 ml ved tilsætning af sterilt vand.
- Forbered hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) ekstraktion buffer ved at opløse 4,1 g natriumchlorid i 80 ml vand og langsomt tilsætte 10 g CTAB under opvarmning og omrøring. Juster endelige volumen til 100 ml ved tilsætning af sterilt vand.
- Tilføj lige volumener af phosphatpufferopløsning og CTAB buffer og filter sterilisere med et 0,22 um filter. Dæk flaske med aluminiumfolie og opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered 1,6 M natriumchloridopløsning (NaCl) ved at kombinere 9,35 g NaCl og 100 ml sterilt vand. Tilsæt 10 g polyethylenglycol 8000 til 1,6 M NaCl-opløsning og Filtersteriliser. Opbevares ved 4 ° C.
- Nukleinsyre ekstraktion ifølge en modificeret version af Griffiths et al. 22 og Towe et al. 23
- Bær lette dragter, nitrilhandsker, og masker. Ren plads i laboratoriet og pipetter med 70% ethanol, DNA dekontaminering opløsning, og RNase dekontaminering opløsning.
- Fjern delprøve (filter fra iskerne eller permafrost jordprøve) i 2 ml keramiske perle skrue-cap røret fra -80 ° C fryser og tø ved stuetemperatur.
- Tilsæt 0,5 ml hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) ekstraktionsbuffer og vortex kortvarigt.
- Tilsæt 0,5 ml phenol-chloroform-isoamylalkohol (25: 24: 1) (pH 8) og ryst rørene horisontalt i 10 min under anvendelse af en fladskærm adapter på en vortexer.
- Efter perle-slå, centrifugeglas ved 16.100 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Fjern vandigt lag til et nyt sterilt 1,5 ml rør og blandes med et tilsvarende volumen af chloroform-isoamylalkohol (24: 1). Centrifuger ved 16.100 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Fjern vandigt lag til et nyt sterilt 1,5 ml rør, og der tilsættes to volumener 30% polyethylenglycol 8000 og 1,6 M NaCl. Inkuber i 2 timer ved 4 ° C.
- Centrifuger ved 16.100 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Vask nukleinsyre pellet med ca. 500 pi iskold 70% ethanol og centrifugeres ved 16.100 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Luft tør pellet i et sterilt biohood i 2 timer. Resuspender i 50 ul DNase / RNase-free TE puffer (pH 8,0). DNA er klar til downstream-applikationer såsom PCR og qPCR.
- Bestem koncentrationen af DNA med et spektrofotometer.
- Fortynd DNA med steril, DNA-frit vand for at opnå 20 ng per reaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne procedure kunne anvendes til dekontaminering frosne prøver indsamlet fra forskellige kryosfære miljøer, fra gletscheris til permafrost. Her præsenteres data specifikt indsamlet fra is og permafrost prøver indsamlet fra Engineering Research og Development Center - Cold Regioner Research and Engineering Laboratory (ERDC-CRREL) Permafrost Tunnel beliggende i Fox, AK (figur 1A og 1B). Den Permafrost Tunnel forlænger ca. 110 m ind i siden af Goldstream dalen og giver adgang til is rige silt og aflejringer 30-31. Prøver fra en is kile og frosne jord blev omhyggeligt indsamlet i tre eksemplarer fra væggene i tunnelen den 24. oktober 2014. På tidspunktet for prøveudtagningen, temperaturen af permafrost muren var -2,9 ° C. Prøver blev indsamlet fra en is kile funktionen ca 27 m fra portalen af tunnelen, og frosne jord ved 35 m og 60 m fraportalen af tunnelen (figur 1C og 1D). Særlig omhu blev taget under prøvetagningen at begrænse forurening af isen og permafrost kerner (figur 1E). De frosne kerner blev håndteret i overensstemmelse med vores dekontaminering protokol (figur 2) og transporteres på tøris til CRREL jord mikrobiologiske laboratorium i Hanover, NH til forarbejdning.
Alle kerner blev behandlet under anvendelse af protokollen beskrevet i afsnit 2 ved hjælp af sterile mikrotomknive og knive og løsninger (figur 3A, B, og C). Målet med denne undersøgelse var at succes ekstrahere endogene nukleinsyrer fra de frosne prøver at bestemme de mikrobielle samfund stede på det tidspunkt, hvor materialet blev deponeret. Den dekontaminering protokol blev vurderet ved doping kernerne med en fortyndet kultur af Serratia marcescens og derefter undersøge Petri plader til vækst agterudER kernerne blev behandlet 31. Fraværet af S. marcescens kolonier viste, at de exogene mikroorganismer blev korrekt fjernet fra den ydre del af kernen. Imidlertid ville fraværet af kolonier ikke oplyse, om exogent DNA blev fjernet fra den ydre del af kernen. Vi derfor sekventeret prøver fra iskernen at kontrollere for DNA fra Serratia sp. Fordi mikrobiel overflod i isen kile var sandsynligvis væsentligt lavere end i permafrosten, vi brugte iskernerne at afgøre, om DNA fra S. marcescens ville være til stede efter dekontaminering protokol. Hvis kernerne ikke var ordentligt dekontamineres, derefter af sekvenser beslægtet med S. marcescens ville forventes at være til stede i prøverne. Figur 4 viser den lave bakterielle mangfoldighed i iskernen fra 16S rRNA-genet sekventeringsresultaterne. Sekvenser relateret til Pseudomonas sp., Af phylum Gammaproteobacteria, domineret isen samples. Medlemmer i Planctomycetia var også til stede i isen, men i mindre omfang. Af særlig note er fraværet af Serratia sp. I sekventeringsresultaterne, hvilket tyder på, at dekontaminering protokollen tilstrækkeligt fjernet exogene DNA.
Endvidere er der yderligere risiko for kontaminering under udvinding af nukleinsyrer. Negative ekstraktionsmidler blanks blev anvendt til at afsløre forurening fra eksogene nukleinsyrer. DNA'et fra prøverne og negative kontroller blev amplificeret under anvendelse qPCR. qPCR data viste, at permafrost husede bakterier, men archaea blev ikke påvist i permafrosten (tabel 1). Vellykket dekontaminering blev yderligere dokumenteret ved manglen af bakterielle eller arke amplikoner i udvinding emner, sammen med positiv forstærkning af kontrollerne, Pseudomonas fluorescens og Halobacterium salinarum (tabel 1). Den abundance målinger viste, at der ikke var nogen signifikante forskelle i bakteriel overflod mellem kernerne indsamlet på 35 m fra portalen i forhold til de 60 m kerner (tabel 1). bliver gennemført igangværende forskning for at bestemme, om mikrobielle miljø sammensætning var forskellig mellem kernerne.
Figur 1. Prøveudtagningsstederne nærheden Fairbanks, AK. (A) Kort over Fairbanks, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html), (B) ERDC-CRREL Permafrost Tunnel, (C) samling af permafrost kerner bruger SIPRE sneglen, (D) visning af snegl ind permafrost væg, og (E) forberedelse kernen til arkivering. klik her for at se et større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk af dekontaminering frosne materiale. (A) Det frosne materiale (f.eks, iskerne eller permafrost kerne) bearbejdes i et koldt rum. (B) Den er målrettet forurenet med en bakteriekultur. (C) Kernen er barberet med en steril mikrotom kniv for at fjerne den ydre 5 mm portion. (D) En række løsninger anvendes til yderligere at rense den ydre del af prøven. DDS indikerer DNA dekontaminering opløsning og RDS indikerer RNase dekontaminering opløsning. (E) Ved at placere kernen i en steril biohood holdt ved stuetemperatur, den ydre 2-5 mm af materialet smelter. Den væske, der drypper fra isen eller permafrost opsamles i petriskåle og kernen er pensles og udpladet for at kontrollere, kernen var korrekt renset. (F og G) Hvis der ikke registreres bakterievækst, så kernen er optøet ved 4 ° C i en steril beholder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Dekontaminering af permafrost kerner i kølerum under sterile betingelser. (A) Slet det ydre lag af permafrost kerne med en metal mikrotom kniv ved skrabning. (B) Et tættere billede af en knibe. (C) Løsning skylning til dekontaminering det ydre lag af kernen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Mikrobielle sekvenser fra isen wedge prøver. Søjlediagram, der viser den gennemsnitlige relative forekomst af bakteriel phyla stede i isen wedge prøver ved procent. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Bakteriel overflod i permafrost. QPCR resultater, der viser den overflod af bakterier i permafrosten prøver og tilhørende udvinding emner. Værdier i tabellen er rapporteret som middelværdi ± standardafvigelse. n er antallet af prøver. ND indikerer ikke opdaget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kryosfæren giver adgang til bevarede organismer, der varede under tidligere miljøforhold. Selvom den genvundne taxa kan ikke repræsentere den fuldstændige historiske samfund, kan de inddrives fra analyse af glaciale is og permafrost prøver give værdifulde historiske oplysninger om udvalgte tidsperioder 15-16. For eksempel har meningsfuld biologisk information blevet trukket fra is studier undersøger anaerob aktivitet i Grønland indlandsis 20 og permafrost studier der undersøger kulstof cykling processer som følge af tø 33 og har givet indsigt i svampe mangfoldighed fra permafrost i Beringia 16. Korrekt prøvetagning og dekontaminering skal ske forud for udførelsen nedstrøms analyser til at undersøge biologiske samfund inden for disse frosne materialer. Selvom disse trin har betydelige konsekvenser for fortolkningen af data, at mange undersøgelser ikke tilbyde specifikke detaljer om, hvordan prøverne were indsamlet og behandlet eller billeder, der viser, hvordan man håndterer de frosne materialer. For eksempel har tidligere studier doteret den ydre del af kerner med fluorescerende mikrokugler eller kendte bakterier 15, selvom de nøjagtige koncentrationer af disse materialer ikke var beskrevet. Andre undersøgelser har beskrevet dekontaminering protokoller i detaljer, men har ikke anvendt high throughput analyser for at teste effektiviteten af metoden 15, 32. Derfor er en detaljeret screening af intakte bakterier og exogent DNA gennem vækst på petriskåle og qPCR blev anvendt til at bestemme, om prøvetagningen, konservering, og analytiske procedurer var sterile nok til at identificere mikrobielle samfund til stede i de frosne materialer.
Denne protokol er blevet ændret med succes isolere genetisk materiale af interesse fra gamle kerner. Pleje såsom iført specifik gear og dekontaminering forsyninger skal tages under indsamling, behandling og ekstraktion fra kernerne siden forurening kan forekomme på ethvert trin. Endvidere forsendelse kernerne med tøris eller en sammenlignelig kølemiddel er bydende nødvendigt, fordi hvis kernerne tø under transit, så er der en højere tilbøjelighed at forurenende stoffer fra det ydre område af kernen kan migrere til den indre del af kernen. For yderligere at minimere risikoen for forurening, overveje at indsamle større kerner med en motoriseret snegl snarere end en push kerne. Vi fandt, at push-kerner var for lille til korrekt dekontaminere i skrabning trin. Alternativt kunne et større volumen af prøven ekstraheres fra de større kerner, hvilket er særligt vigtigt for prøver med en lav tæthed af biologisk materiale. Derudover større volumen giver mere plads til fejl, således at hvis der konstateres Serratia marcescens kolonier på plader, så kernen er stor nok til at blive behandlet igen.
Forskellige forsyninger blev testet for at bestemme den mest effektiveFremgangsmåde til dekontaminering kernerne. For eksempel sterilt aluminiumfolie, snarere end glas retter eller plastmaterialer, fik lov til kernen skal placeres på en steril overflade hurtigt og nemt. Også ikke-traditionelle forsyninger såsom en metal rack og en bakke viste sig at være en fordel at lade de skrabet ydre materialer at akkumulere væk fra kernen, mindske risikoen for re-forurener kernerne. I tidligere gentagelser af protokollen, skrabning skete på en flad overflade, hvilket har øget risikoen for forurening. Endelig sterile poser, snarere end glas retter, viste sig at være befordrende for blanding og opbevaring af prøverne.
Denne protokol blev målrettet til at fjerne mikroorganismer og nukleinsyrer på den ydre del af de frosne kerner. Mens isopropanol og ethanol er effektive desinfektionsmidler, de ikke fjerne nukleinsyrer. Derfor blev løsninger, der fjerner nukleinsyrer og associerede enzymer fra den ydre del af kernerne bruges. Disse Solutioner er almindeligt anvendt til at fjerne nukleinsyrer og associerede nukleaser fra laboratorium forsyninger og udstyr. Ved testning deres effektivitet på laboratorie overflader, RNA dekontaminering opløsning fjernet flere eksogene materialer end DNA dekontaminering opløsning 34. Brug nukleaser at rense den ydre del af kernen er måske ikke altid være den foretrukne metode, fordi genetisk materiale af interesse også kan fjernes fra prøver med en lav overflod af en bestemt organisme. Navnlig genetisk materiale lagret i permafrost og is i længere tid undergå nedbrydning. Fordi mikroorganismer er i en høj overflod i disse Alaska prøver blev bekymring, at løsningerne ville fjerne en høj andel af endogene genetisk materiale stærkt reduceret. Dog bør der udvises forsigtighed forsigtighed ved brug af løsninger, der indeholder nukleaser at sikre, at de nukleinsyrer, der har været stærkt nedbrudte eller er fra organismer i lav tæthed ikke fjernes vednukleaserne.
Fraværet af S. marcescens kolonier på petriskåle billede tillid til, at de intakte celler blev fjernet fra den ydre del af permafrosten kerner. Endvidere analyse af iskerner der undergik den samme protokol viste ingen påviselige sekvenser relateret til S. marcescens. Sekvensdata resultater viste, at kun Pseudomonas blev påvist i disse prøver, selv om de begge Pseudomonas sp. og Serratia sp. er inden klassen Gammaproteobacteria. Sammen fravær af S. marcescens kolonier på Petri plader og fraværet af DNA amplikoner fra qPCR tyder på, at de frosne kerner blev renset med succes. Derfor blev de detekterede mikroorganismer sandsynligvis indlejret i det frosne materiale, snarere end forurening fra boring eller behandling af kernerne. Andre boring teknikker omfatter hydraulisk boring til at trænge jord eller is på større dybder. Selv om denne metode Would være gavnligt at undersøge lav mikrobiel overflod i disse næringsfattige miljøer, er det ikke afsløre, om borevæsker ville blive fjernet. Desuden, hvis high throughput sekventering er ikke en del af den nedstrøms analyse, specifikke PCR-reaktioner målretning S. marcescens bør anvendes til at amplificere det ekstraherede DNA.
Resultaterne fra vores eksempel datasæt viste, at intakt genomisk DNA held blev ekstraheret fra de frosne materialer. Endvidere både permafrosten og is wedge nærede bakterier, som det fremgår af qPCR og sekventering hhv. Den Alaskan diskontinuerlige permafrost fra denne undersøgelse indeholdt lignende bakterielle tal som permafrost i det canadiske højarktiske 35, selvom Alaska prøver indeholdt en størrelsesorden færre bakterier end permafrost fra Det Tibetanske Plateau i Qinghai-provinsen, Kina 36 og aktive lag / permafrost jord fra Nunavut, Canada 37. Svarende til en ice kile indsamlet i Nunavut, Canada 37, sekvenser relateret til Gammaproteobacteria, specielt Pseudomonas, som er fælles for jord og metabolisk forskelligartet, dominerede Alaska is kile i denne undersøgelse. Faktisk Katayama et al. 11 isolerede bakterier i rækkerne aktinobakterier, Bacilli, og Gammaproteobacteria fra en af isen kiler fra ERDC-CRREL Permafrost Tunnel. Disse undersøgelser underbygger påvisning af Gammaproteobacteria i denne undersøgelse. Planctomycetia, som er fælles for vandlevende prøve, blev også påvist i isen kile. Disse organismer er blevet fundet i aktive lag jord over permafrost i det nordøstlige Sibirien 38, ud over at permafrost i Det Tibetanske Plateau i Qinghai, Kina 39.
Mange undersøgelser har undersøgt forekomsten af archaea, især methanogener, i permafrost, med den tanke, at som permafrost smelter, vil methanogener sandsynligvis blive mere aktive, contributing til udstrømningen af methan til atmosfæren 21, 33-34. Overraskende blev archaea ikke påvist i Alaska is kile eller permafrost prøver, selvom både Euryarchaeota og Crenarchaeota blev fundet i permafrost fra det canadiske højarktiske 17 og methanogener blev fundet i permafrosten prøver fra den arktiske tundra i Rusland 21.
Frosne materialer havnen gamle mikroorganismer, der giver et referat af biogeokemiske processer, der fandt sted mange tusinde år siden. Denne biodiversitet er af stor interesse under det nuværende klima opvarmning ordning, fordi mikroorganismer, der engang var begrænset i kryosfæren miljø kan blive befriet, når de frosne materialer tø. For trygt identificere biodiversiteten nærede i disse frosne materialer, skal de frosne jord og is prøver håndteres korrekt og dekontamineres. Her præsenterer vi en protokol til at fjerne fremmede celler og DNA fra frosne prøver til ensure, at de detekterede mikroorganismer var fra materiale, snarere end forurening fra boring eller behandling af kernerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | ||
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | ||
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | ||
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | ||
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | |||
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22 µm | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 ml Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
- Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
