Summary
Kryosfæren tilbyr tilgang til bevarte organismer som vedvarte etter siste miljøforhold. En protokoll er presentert for å samle og rense permafrost kjerner av jord og is. Fraværet av eksogene DNA-kolonier og antyder at mikroorganismer som detekteres representerer materialet i stedet for forurensning fra boring eller foredling.
Introduction
Kryosfæren (f.eks permafrost jord, is funksjoner, glacial snø, firn og is) gir et innblikk i hva slags organismer vedvarte etter siste miljøforhold. Siden disse underlag kan være titalls til flere hundre tusen år gamle, deres mikrobielle samfunn, når bevarte frosset siden deponering, reflektere gamle miljøforhold. For å riktig analysere disse økosystemene og trekke ut menings biologisk informasjon fra frossen jord og is, forsvarlig innsamling og behandling av de frosne prøvene er nødvendig. Dette er av største betydning som klima anslag for det 21. århundre indikerer potensialet for en markant oppvarming i Arktis og sub-arktiske strøk 1. Spesielt interiør Alaska og Grønland er forventet å varme ca 5 ° C og 7 ° C, henholdsvis 2100 2,3. Dette forventes å ha betydelig innvirkning jord og vannlevende mikrobielle samfunn, og derfor relatertbiogeokjemiske prosesser. Jo varmere temperaturer og endrede nedbørsregime er forventet å starte permafrost nedbrytning i mange områder 2-5 potensielt kan føre til en tykkere, sesong tint (aktiv) lag 6,7, tining av frosne jord, og smeltingen av massive isen organer som bakken is, iskiler, og segregering is 8. Dette vil dramatisk endre biogeokjemiske egenskaper i tillegg til det biologiske mangfoldet av planter og dyr i disse økosystemene.
Breis og syngenetic permafrost sediment og is egenskaper har fanget kjemiske og biologiske bevis for et miljø som representerer hva bodde der på den tiden funksjonene dannet. For eksempel, i Interior Alaska, både Illinoisan og Wisconsin i alderen permafrost er til stede, og dette permafrost i bestemte gir unike steder som daterer seg fra moderne til 150.000 år før nåtid (YBP) som inneholder biologiske og geokjemiske bevis for impact av tidligere klimaendringer på biologisk mangfold. Som et resultat av disse sedimentene gi en oversikt over den biogeokjemi og biologisk mangfold gjennom mange tusen år. Siden området har lav sedimentasjonsratene og har aldri vært isbreer, uforstyrrede prøver er tilgjengelige for innsamling og analyse, enten boring vertikalt i jordsmonnet eller boring horisontalt i tunneler. Enda viktigere, omfattende poster finnes som spesielt fremheve de unike biogeokjemiske funksjoner i permafrosten i denne regionen 9-14. Spesielt til bruk av DNA-analyse anslår tilstedeværelse og omfang av biologisk mangfold i både nålevende og gamle isen og permafrostprøver gjør utforskning av sammenhengen av gamle miljøforhold og habitat til okkupasjon av bestemte organismer.
Tidligere studier har identifisert klimatiske virkninger på pattedyr, planter og mikroorganismer fra prøver datert til 50k YBP 11, 15-19, selv om hver studie brukte en different metode for å samle og rense permafrosten eller iskjerner. I noen tilfeller ble borkjerner sterilisert 16, 20-21, skjønt den spesifikke metoden ikke avklare om fremmede nukleinsyrer ble også fjernet fra prøvene. I andre studier, isolerer bakterie 15 (f.eks, Serratia marcescens) samt fluorescerende mikrosfærer 22 har blitt brukt for å måle effekten av dekontaminering prosedyrer.
Dette eksperimentet var en del av en større studie som undersøkte bakteriesamfunn fra permafrostprøver dateres tilbake til ca 40k YBP. Den spesifikke målet med denne delen av studien var å kunne rense is og permafrost kjerner. Så vidt vi vet, har ingen metode integrert bruken av løsninger som er utviklet for å eliminere fremmede nukleinsyrer og tilhørende nukleaser fra den ytre del av de frosne kjerner. Dette er til tross for det faktum at disse løsningene er commonly brukes til å rense laboratorieutstyr for molekylære eksperimenter.
Når kjernene ble dekontaminert, ble genomisk DNA ekstrahert ved hjelp av de protokoller som er utviklet av Griffiths et al., 23 og hå et al. 24, kvantifisert ved anvendelse av et spektrofotometer, og fortynnet med sterilt, DNA-fritt vann for å oppnå 20 ng pr reaksjon. Bakterielle 16S rRNA gener ble forsterket med primere 331F og 797R og undersøke BacTaq 25 og archaeal 16S rRNA gener ble forsterket med primere Arch 349F og Arch 806R og sonden TM Arch 516F 26 under følgende betingelser: 95 ° C i 600 sek etterfulgt av 45 sykluser på 95 ° C i 30 sek, 57 ° C i 60 sek, og 72 ° C i 25 sek med endelig forlengelse ved 40 ° C i 30 sek. Alle qPCR reaksjonene ble utført i duplikat. De 20 ul reaksjonsvolumer inkludert 20 ng DNA, 10 pM av primere, 5 uM av sonden, og 10 pl av qPCR reaksjonsblandingen. standarder for bakteriell og archaeal qPCR ble fremstilt ved anvendelse av genomisk DNA fra Pseudomonas fluorescens og Halobacterium salinarum, respektivt. Begge ble dyrket for å logge fase. Platetellinger ble utført, og DNA ble isolert fra kulturene. Genomisk DNA ble kvantifisert med et spektrofotometer med forutsetningen om en og seks kopier av 16S rRNA-genet per genom for H. salinarum og P. fluorescens, henholdsvis 27-28. Kopier antall bakterie og archaeal genene ble beregnet ut fra standardkurven, log-transformeres til å gjøre rede for ulike avvik mellom behandlingene, og vurdert av ANOVA.
Fellesskapet sammensetning ble bestemt ved sekvensering av 16S rRNA-genet ved hjelp av flyt celler og bro forsterkerteknologi og analysere samfunn med kvantitative innsikt i mikrobiell økologi "(QIIME) 29. Forover og revers leser ble slått sammen og deretter sekvenser ble filtrert, indeksert,og representanter høy kvalitet ble valgt for de novo operative taksonomiske enheter (Otu) oppdraget gjennom sekvenssammenstillingen med en referansedatabase. Innrettede sekvenser ble sammenlignet med en separat referansedatabase for taksonomisk oppdrag. En Otu tabellen phylum nivå ble opprettet for å avgjøre generelle samfunnet sammensetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utstyr Forberedelse og Permafrost kjernesamling
- Utstyr forberedelse og felt prøvetaking og bevaring utstyr
- Monter skrue for prøvetaking ved å sette stasjonsadapteren inn i toppen av sylinderen og vri spaken for å låse den på plass. Fest adapteren rør på stasjonsadapteren og pin motoren på adapteren røret. Sett skjærene på fat.
- Bruk lette varebiler dresser, nitrilhansker, og masker for å redusere forurensning til prøvene. Bruk hørselvern og hjelm for sikkerhet ved å skrive inn Permafrost Tunnel (figur 1).
- Inn i tunnelen, og velg en plassering for å samle inn prøver (Figur 1b).
Merk: For vertikal eller horisontal boring beliggenhet, velge et område der det er kjent bevis for at materialet er frosset (for eksempel is eller permafrost), er det ingen kjente store rotsystemer, og det er ingen kjent grus. Fjern allelevende plantemateriale fra området før samle en prøve. Dersom boring vertikalt eller horisontalt, velge et område som er relativt flat og tilgjengelig med skruen. - Forbered en arbeidsstasjon ved lagdeling i bakken med et plastmateriale som er blitt sterilisert med 70% isopropanol, DNA dekontaminering løsning, og RNase dekontaminering løsning.
- Plasser en 10 cm diameter polyvinylklorid (PVC) rør kuttet i to på langs på arbeidsstasjonen for å tilveiebringe et trau for å holde kjernene som de er fjernet fra mateskruen. Dekontaminer PVC-rør med 70% isopropanol, DNA dekontaminering løsning, og RNase dekontaminering løsning.
- Nær arbeidsstasjon, decontaminate skruen ved å spraye den med 70% isopropanol, DNA dekontaminering løsning, og RNase dekontaminering løsning. Fjern løsninger fra skruen med en tørk.
- Is og permafrost kjerne innsamling og lagring
- Velg et område av veggen for å prøve (se 1.2.1Notat).
- Dekontaminere ca 10 cm diameter på frossen vegg området ved å tørke den med 70% isopropanol, DNA dekontaminering løsning, og RNase dekontaminering løsning.
- Heve dekontaminert mateskruen til området av interesse, slik at det er vinkelrett på prøveområdet og begynne boring i den rengjorte flate av veggen (figur 1C, D).
- Fjern forsiktig skruen fra prøvetakingen området. Koble skruen fra motoren og plasser skruen over den sterile PVC-rør i rene arbeidsstasjonen. Vippe auger nøye slik at de frosne kjerner glir ut mot den sterile PVC-rør (figur 1E).
- Dekontaminere hansker med 70% isopropanol, DNA dekontaminering løsning, og RNase dekontaminering løsning.
- Plukk opp isen og permafrostkjerner med sterile hansker og plassere dem i sterile poser.
- Plasser kjernene i en kjøligere eller kaldt rom før de sendes eller behandles.
- ship de frosne kjerner ved anvendelse av tørr is for å holde dem ved en temperatur under 0 ° C.
- Umiddelbart lagre kjernene ved -80 ° C.
2. Permafrost and Ice core behandling
- Materiale Forberedelse
- Fremstille sterile, nukleinsyre fri heavy duty aluminiumsfolie, metallholdere, glass, metall, tang, og glassull ved baking i en ovn ved 450 ° C i 4 timer. Sett av disse materialene til bruk.
- Steril 95% etanol og ultrarent vann ved å føre oppløsningene gjennom et 0,22 um filter.
- Lagres etanolløsning ved -20 ° C og vann ved 4 ° C.
- Sterilisere en plast hersker ved å spraye det med 70% etanol, DNA-rensing løsning, og RNase dekontaminering løsning og umiddelbart tørke etter hver oppløsning.
- Bakteriell Kultur Forberedelse
- Forbered buljong og plater til å vokse Serratia marcescens.
- For kjøttkraft, kombinere 5 g prøveptone, 1 g glukose, 5 g gjærekstrakt, og en g kaliumfosfat dibasisk, og deretter legge destillert vann for å nå en L. Å lage plater, tilsett 15 g agar til ovennevnte mix. For kjøttkraft og plater, justere pH til 7 og autoklav ved 121 ° C i 15 min.
- Forbered 1x fosfat polert saltoppløsning (PBS) ved å kombinere 8 g natriumklorid, 0,2 g kaliumklorid, 1,44 g natriumfosfat dibasisk, og 0,24 g monobasisk kaliumfosfat og tilsett destillert vann for å nå 800 ml. Juster pH til 7,4 og destillert vann for å oppnå en L. autoklav ved 121 ° C i 15 min.
- Vaksinere buljong med en steril løkke ved å dyppe inn i S. marcescens kultur som tidligere ble lagret frosset ved -80 ° C. Under aseptiske forhold, serie fortynnet kulturen ved å tilsette 1 ml av kulturen til 9 ml PBS og manuelt invertere oppløsningen. Tilsett 1 ml av denne fortynning til 9 ml PBS og manuelt invertere oppløsningen. Gjenta åtte ganger inntil 10 -9 Dilusjon er nådd.
- Spre 10 -6 10 -7, 10 -8, -9 og 10 løsninger bort på agar-plater ved å fordele 1 ml av kjøttkraft på platen og sprer seg med en celle sprederen. Gjør dette i tre eksemplarer per fortynning. Lagre det opprinnelige kulturen ved 4 ° C.
- Inkuber platene ved 30 ° C i 24 timer. Tell antall kolonier for å beregne antall celler i den opprinnelige kultur. Merk: Antallet kolonier i den opprinnelige kultur vil være avhengig av veksthastigheten til bakterier.
- Pipetter 250 ul av den opprinnelige kulturen til et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Fortynn opprinnelige kultur ved tilsetning av tilstrekkelig volum av 1 x PBS for å oppnå omtrent 10 9 celler / ml som bestemt ved kimtall i det foregående trinn. Pellet cellene i et mikrosentrifugerør ved sentrifugering ved 2500 xg i 10 min.
Merk: Volumet av 1x PBS vil variere avhengig av veksten av bakterier. - I et sterilt biohood, Pipettér av kjøttkraft og resuspender cellene i 1 ml 1x PBS buffer. Oppbevar ved 4 ° C til bruk eller om lag to måneder.
- På dagen for behandling, fortynne S. marcescens kulturen fra trinn 2.2.7 ved å tilsette 1 ml av den opprinnelige S. marcescens kultur til 39 ml 1 x PBS-buffer i et 50 ml sentrifugerør.
- Forbered buljong og plater til å vokse Serratia marcescens.
- Forbered kaldt rom plass til kjernen behandling og bevaring utstyr
- Før chilling kaldt rom, rene vegger, gulv og bord av metall med en 1% blekemiddel.
- Still temperaturen i kjølerommet til ca -11 ° C.
- Når kjølerommet har nådd ønsket temperatur, slitasje lys plikt dresser, nitrilhansker, og masker for å redusere forurensning til kjølerommet og prøvene.
Merk: To ordentlig kledd individer er nødvendig for at denne prosedyren. - Ta med sterile materialer (f.eks aluminiumsfolie, metallstativ, glass, brett, S. marcescens kultur og mitomens blad) og prøver i det kalde rommet og plass på det sterile bordet.
- Permafrost og iskjerne behandling i et kaldt rom anlegget
- Plasser en permafrost kjerne på en steril, nukleinsyre fri ark av aluminiumsfolie.
- Lett inokulere utsiden av kjernen med den fortynnede kultur av S. marcescens ved bruk av en steril skumplugg (figur 2B).
- Plasser kjernen på sterile metall rack som sitter over et brett.
- Sterilstål mikrotomen blad med 70% etanol, DNA-rensing løsning, og RNase dekontaminering løsning.
- Har enkelte en ren nitrilhansker med 70% etanol, DNA dekontaminering løsning, og RNase dekontaminering løsning og holde kjernen i en 45 ° vinkel over skuffen.
- Ha en person B forsiktig skrape ca 5 mm på utsiden av hele kjernen, herunder ender ved hjelp av sterile bladet mens individ En fikk kjernen etter hvert skrape (
- Ha en person B helle filtersterilisert 95% etanol over kjernen forsiktig og hurtig, mens en person A slår kjerne som helles oppløsningen (figurene 2D, 3C).
- Har Individuell B umiddelbart skylle kjernen med filter-sterilisert vann.
- Bytt brukt metall rack på brett med en ny steril metall rack.
- Har individ En ren hans eller hennes nitrilhansker med 70% etanol, DNA dekontaminering løsning, og RNase dekontaminering løsning og holde kjernen i en 45 ° vinkel over skuffen.
- Har Individuell B spray hele kjernen med DNA rensing løsning.
- Har Individuell B umiddelbart skylle kjernen med filter-sterilisert vann.
- Har Individuell B spray hele kjernen med RNase dekontaminering løsning.
- har Individual B straks skylle kjerne med filter-sterilisert vann.
- Plasser kjernen på en steril ark av aluminiumsfolie og lett brytes.
- Thaw ytre kjerne
- Plasser en steril metall rack over et sterilt glass rett i en steril biohood med laminær.
- Plasser to agarskåler spesifikke for S. marcescens i glasset rett under sterile stativet for å samle væske fra kjernen (figur 2E).
- Plasser kjernen på sterile metall rack.
- Tillat ca. 2-5 mm fra den ytre overflate av kjernen for å tine ved 23 ° C (i gjennomsnitt, vil dette skje i løpet av ca. 10 min). Slå kjernen omtrent 90 ° hver 2 min.
- Vattpinne hele overflaten av kjernen ved hjelp av sterile pinsetter og steril glassull og inokulere to agarplater bestemt til S. marcescens ved pensling disse materialene til overflaten av platene. Inokulere to nye plater med den opprinnelige kulturen brukt til å dope utsiden avkjerne, som ble utsatt for de lave temperaturene i kjølerommet.
- Mål ytre dimensjoner av tines sylindrisk kjerne ved å anbringe en steril hersker nær, men ikke berører kjernen.
- Plasser kjernen i store steril pose og lagre det ved -80 ° C.
- Sjekk for vekst
- Inkuber agarskåler ved 23 ° C i en uke.
- Undersøk agarplater for vekst av S. marcescens kolonier.
- Hvis det er ingen synlige kolonier på tallerkenen, fortsett til trinn 2.5.3.
- Hvis kolonier vises på plate, gjenta fra trinn 2.1.1 i del 2 "Permafrost og iskjerne behandling".
- Skaff kjernen fra fryseren og aseptisk overføre den til en steril pose.
- Oppbevar kjernen i en steril pose ved 4 ° C i ca. 24-48 timer for å tine hele kjernen.
3. Skaff subsample for Nucleic Acid Utvinning fra iskjerner og Permafrost
- Nukleinsyre utvinning fra iskjerner
- Bland det tinte materiale fra iskjernen ved forsiktig omrøring av posen (figur 2G).
- Hell den tinte materiale inn i en steril beholder med et 0,22 um filter under vakuum for å samle mikroorganismer.
- Aseptisk fjerne filteret med steril pinsett og legg den i en steril 2 ml keramiske perle tube (1,4 mm).
- Oppbevar filteret ved -80 ° C.
- Nukleinsyre utvinning fra permafrost kjerner
- Bland tint materiale fra permafrost kjernen ved forsiktig elting posen.
- Etter at permafrosten har blitt godt blandet, få en subsample på ca 0,5 g bulk jord med en steril scoopula og legg den i en tared sterile 2 ml keramiske perle skrukork (1,4 mm) som sitter oppreist på en balanse.
- Oppbevar delprøver ved -80 ° C.
- Skaff gravimetrisk vanninnholdet i prøvene.
- Mål 10 g av permafrosten med en sterile scoopula og plasser i en tarert tinn på en balanse. Mål våt masse av permafrost og tinn.
- Inkuber permafrost i en ovn innstilt på 105 ° C i 24 timer. Mål tørr masse av permafrost og tinn.
- Beregn gravimetrisk vanninnhold ved å subtrahere den våte massen av permafrosten ved den tørre massen av permafrosten og dividere med den tørre massen av permafrosten.
- Oppbevares permafrost ved -80 ° C.
4. Pakk nukleinsyrer fra permafrost og iskjerner
- Materiale forberedelse
- Forbered gule ampuller for å holde oppløsninger ved behandling med 0,1% dietylpyrokarbonat (DEPC), inkubering O / N ved 37 ° C, og autoklavering.
- Forbered 240 mM kaliumfosfatbufferoppløsning. Legg 2. 5 g av monobasisk kaliumfosfat og 38,7 g kaliumfosfat dibasisk. Justere sluttvolumet til 500 ml ved tilsetning av sterilt vann.
- Forbered heksadecyltrimetylammoniumbromid (CTAB) ekstraksjon buffer ved oppløsning av 4,1 g natriumklorid i 80 ml vann og langsomt å tilsette 10 g CTAB under oppvarming og omrøring. Justere sluttvolumet til 100 ml ved tilsetning av sterilt vann.
- Legg like volumer av fosfatbufferoppløsning og CTAB buffer og sterilisere filter med en 0,22 um filter. Dekk flaske med aluminiumsfolie og oppbevar ved romtemperatur.
- Fremstille 1,6 M natriumklorid-løsning (NaCl) ved å kombinere 9,35 g NaCl og 100 ml sterilt vann. Tilsett 10 g polyetylenglykol 8000 i 1,6 M NaCl-oppløsning og filtersteriliser. Oppbevar ved 4 ° C.
- Nukleinsyre ekstraksjon i henhold til en modifisert versjon av Griffiths et al. 22 og hå et al. 23
- Bruk lette varebiler dresser, nitrilhansker, og masker. Rent laboratorieplass og pipetter med 70% etanol, DNA dekontaminering løsning, og RNase dekontaminering løsning.
- Fjern subsample (filter fra iskjerne eller permafrost jordprøve) i 2 ml keramiske perle skrue-cap rør fra -80 ° C fryser og opptining ved romtemperatur.
- Legg 0,5 ml heksadecyltrimetylammoniumbromid (CTAB) utvinning buffer og vortex kort.
- Tilsett 0,5 ml fenol-kloroform-isoamylalkohol (25: 24: 1) (pH 8) og rist rør horisontalt i 10 minutter ved hjelp av et flatt panel adapter på en vortex.
- Etter perle-juling, sentrifugerør på 16 100 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Fjern vandige lag i et nytt sterilt 1,5 ml rør og blandes med et like stort volum av kloroform-isoamylalkohol (24: 1). Sentrifuger ved 16100 x g i 5 min ved 4 ° C.
- Fjern vandige lag i et nytt sterilt 1,5 ml rør og legge til to volumer av 30% polyetylenglykol 8000 og 1,6 M NaCl. Inkuber i 2 timer ved 4 ° C.
- Sentrifuger ved 16100 x g i 10 min ved 4 ° C.
- Vask nukleinsyre pellet med omtrent 500 ul iskald 70% etanol og sentrifuger ved 16 100 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Luft, tørr pellet i et sterilt biohood i 2 timer. Resuspender i 50 ul DNase / RNase-fri TE-buffer (pH 8,0). DNA er klar for nedstrøms applikasjoner som PCR og qPCR.
- Bestem konsentrasjonen av DNA med et spektrofotometer.
- Fortynn DNA med sterilt, DNA-fritt vann for å oppnå 20 ng pr reaksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den presenterte metoden kan brukes til å rense frosne prøver samlet inn fra ulike kryosfære miljøer, fra breis til permafrost. Her presenterer vi data spesielt innhentet fra is og permafrost prøver samlet fra Engineering Research and Development Center - Cold Regions Research and Engineering Laboratory (ERDC-CRREL) Permafrost Tunnel ligger i Fox, AK (figur 1A og 1B). Den Permafrost Tunnel strekker seg ca 110 m inn i siden av Goldstream dalen og gir tilgang til is rike silt og alluvium 30-31. Prøver fra en is kile og frossen jord ble omhyggelig samlet i tre eksemplarer fra veggene i tunnelen 24. oktober 2014. Ved tidspunktet for prøvetaking, temperaturen av permafrosten veggen var -2,9 ° C. Prøvene ble samlet inn fra en iskiler funksjon ca 27 m fra portal av tunnelen, og frossen jord på 35 m og 60 m fraportalen av tunnelen (figur 1C og 1D). Spesiell omsorg ble tatt under prøvetakingen for å begrense forurensning av is og permafrost kjerner (figur 1E). De frosne kjerner ble håndtert i henhold til vår dekontaminering protokollen (figur 2) og transporteres på tørris til CRREL jord mikrobiologisk laboratorium i Hanover, NH for behandling.
Alle kjernene ble behandlet ved anvendelse av protokollen beskrevet i seksjon 2 ved hjelp av sterile mikrotom bladene og løsningene (figur 3A, B og C). Målet med denne studien var å kunne trekke endogene nukleinsyrer fra de frosne prøver å bestemme mikrobielle samfunn til stede på det tidspunktet at materialet ble avsatt. Dekontaminering protokollen ble vurdert ved å dope kjernene med en fortynnet kultur av Serratia marcescens og deretter undersøke petriplater for vekst akterere kjernene ble behandlet 31. Fraværet av S. marcescens kolonier indikerte at de eksogene mikroorganismer ble tatt vekk fra det ytre parti av kjernen. Imidlertid ville fraværet av koloniene ikke indikere hvorvidt eksogent DNA ble fjernet fra den ytre del av kjernen. Derfor sekvensert vi prøver fra iskjerner for å sjekke DNA fra Serratia sp. Fordi mikrobiell overflod i iskiler var trolig betydelig lavere enn i permafrosten, brukte vi iskjernene for å avgjøre om DNA fra S. marcescens ville være til stede etter dekontaminering protokollen. Hvis kjernene ikke ble riktig dekontaminert, deretter sekvenser beslektet med S. marcescens ville forventes å være til stede i prøvene. Figur 4 viser den lave bakterie diversitet innenfor iskjernen fra 16S rRNA-genet sekvenseringsresultater. Sekvenser relatert til Pseudomonas sp., Av phylum Gammaproteobacteria, dominert isen samples. Medlemmene i forbindelse med Planctomycetia var også tilstede i isen, men i mindre grad. Legg spesielt merke er fraværet av Serratia sp. I sekvense resultater, noe som tyder på at dekontaminering protokollen tilstrekkelig fjernet eksogent DNA.
Videre er det en ytterligere risiko for forurensning ved utvinning av nukleinsyrer. Negative ekstraksjon blanks ble anvendt for å åpenbare forurensninger fra eksogene nukleinsyrer. DNA fra prøvene og negative kontroller ble amplifisert ved hjelp av qPCR. qPCR data viste at permafrosten næret bakterier, men archaea ble ikke oppdaget i permafrosten (tabell 1). Vellykket dekontaminering ble ytterligere dokumentert av mangel på bakterie- eller archaeal amplikonene i utvinning blanks, i forbindelse med positiv forsterkning av kontrollene, fluorescens Pseudo og Halobacterium salinarum (tabell 1). den abundkrings målinger viste at det var ingen signifikante forskjeller i bakterie overflod mellom kjernene samles på 35 m fra portalen i forhold til de 60 m kjerner (tabell 1). Pågående forskning blir gjennomført for å avgjøre om mikrobiell samfunnet sammensetning var forskjellig mellom kjernene.
Figur 1. Eksempel på områder i nærheten av Fairbanks, AK. (A) Kart over Fairbanks, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html), (B) ERDC-CRREL Permafrost Tunnel, (C) samling av permafrost kjerner bruker SIPRE auger, (D) syn på auger taste permafrost vegg, og (E) forbereder kjernen for arkivering. klikk her for å se et større version av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk av dekontaminering frosset materiale. (A) Den frosne materiale (f.eks iskjerne eller permafrost kjerne) er behandlet i et kaldt rom. (B) Den er målrettet forurenset med en bakteriekultur. (C) Kjernen ble barbert med en steril mikrotom blad for å fjerne det ytterste 5 mm porsjon. (D) En serie oppløsninger anvendes for ytterligere å rense den ytre del av prøven. DDS viser DNA dekontaminering løsning og RDS indikerer RNase dekontaminering løsning. (E) Ved å anbringe kjernen i en steril biohood holdt ved RT, den ytre 2-5 mm av materialet tiner. Den væske som drypper fra isen eller permafrosten oppsamles i Petri-plater og kjernen blir penslet og belagt for å kontrollere at kjernen var ordentlig rengjort. (F og G) Hvis bakterievekst ikke blir oppdaget, da kjernen er tint ved 4 ° C i en steril beholder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Behandling av permafrost kjerner i kaldt rom under sterile forhold. (A) Fjern det ytterste laget av permafrosten kjerne med en metall mikrotom blad ved skraping. (B) En nærmere oversikt over en skrape. (C) løsning skyll å rense det ytterste laget av kjernen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Mikrobielle sekvenser fra iskiler prøvene. Stolpediagram som viser den gjennomsnittlige relative overflod av bakteriell phyla stede i iskiler prøvene av prosent. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Bakteriell overflod i permafrosten. QPCR resultatene viser overflod av bakterier i permafrosten prøver og tilhørende utvinnings mellomrom. Verdier i tabellen er angitt som gjennomsnitt ± standardfeil. n er antall prøver. ND indikerer ikke oppdaget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kryosfæren tilbyr tilgang til bevarte organismer som vedvarte etter siste miljøforhold. Selv om den gjen taxa ikke kan representere hele historiske fellesskapet, kan de som utvinnes fra analyse av breis og permafrost prøver gi verdifull historisk informasjon om utvalgte tidsperioder 15-16. For eksempel har menings biologisk informasjon er hentet fra isen studier som undersøker anaerob aktivitet i isdekket på Grønland 20 og permafrost studier som undersøker karbon sykkel prosesser som følge av tøvær 33 og har gitt innsikt i sopp mangfold fra permafrost i Beringia 16. Riktig prøvetaking og dekontaminering må skje før gjennomføring nedstrøms analyser for å undersøke biologiske samfunn innenfor disse frosne materialer. Selv om disse trinnene ha betydelige konsekvenser for tolking av data, er det mange studier som ikke gir spesifikke detaljer om hvordan prøvene were samlet inn og behandlet eller bilder som viser hvordan man skal håndtere de frosne materialer. For eksempel har tidligere undersøkelser dopet den ytre del av kjerner med fluorescerende mikrosfærer eller kjente bakterier 15, selv om de eksakte konsentrasjoner av disse materialene ikke er beskrevet. Andre studier har beskrevet dekontaminering protokoller i detalj, men er ikke anvendt høy gjennomstrømning analyser for å teste effekten av metodikken 15, 32. Derfor er en detaljert screening av intakte bakterier og eksogent DNA ved vekst på Petri-plater og qPCR ble anvendt for å bestemme hvorvidt prøvetakingen, bevaring, og analytiske prosedyrer var sterilt nok til å identifisere bakteriesamfunn som finnes i de frosne materialer.
Denne protokollen er blitt modifisert for å kunne isolere genetisk materiale av interesse fra gamle kjerner. Omsorg for eksempel på seg spesifikt utstyr og dekontaminering forsyninger må tas under innsamling, bearbeiding, og ekstraktion fra kjernene siden forurensning kan oppstå på alle trinn. Videre sender kjernene med tørris eller tilsvarende kjølemiddel er viktig, fordi hvis kjernene tine under transport, da det er en høyere tilbøyelighet som forurensninger fra den ytre regionen av kjernen kan migrere til den indre del av kjernen. For ytterligere å minimere muligheten for forurensning, vurdere å samle større kjerner med en motordrevet mateskrue i stedet for en push kjerne. Vi fant at kjøre kjernene var for liten til å rense i skraping trinn. Alternativt kan et større volum av prøven ekstraheres fra de større kjerner, noe som er spesielt viktig for prøver med en lav mengde av biologisk materiale. I tillegg gir den større volum mer rom for feil slik at hvis Serratia marcescens kolonier blir detektert på platene, da kjernen er stor nok til å behandles på nytt.
Ulike forsyninger ble testet for å finne den mest effektivemetode for å rense kjernene. For eksempel, sterilt aluminiumsfolie i stedet for glass retter eller plastmaterialer, som er tillatt for kjernen å bli plassert på et sterilt underlag raskt og enkelt. Også ikke-tradisjonelle leverer for eksempel et metallstativ og en skuff viste seg å være gunstig å la de avskrapede ytre materialer for å akkumulere bort fra kjernen, reduseres risikoen for re-forurensende kjernene. I tidligere gjentakelser av protokollen, skjedde skraping på et flatt underlag, noe som økte risikoen for forurensning. Til slutt, sterile poser, i stedet for glass retter, ble funnet å være som bidrar til blanding og lagring av prøvene.
Denne protokollen ble rettet for å eliminere mikroorganismer og nukleinsyrer på den ytre del av de frosne kjerner. Mens isopropanol og etanol er effektive desinfeksjonsmidler, har de ikke fjerne nukleinsyrer. Derfor ble løsninger som fjerner nukleinsyrer og tilhørende enzymer fra den ytre del av kjernene anvendes. disse oppløsesjoner blir ofte brukt til å fjerne nukleinsyrer og tilknyttede nukleaser fra laboratoriet forsyninger og utstyr. Når du skal teste deres effekt på laboratorie overflater, RNA dekontaminering løsning fjernet flere eksogene materialer enn DNA dekontaminering løsning 34. Ved hjelp av nukleaser for å rense det ytre parti av kjernen kan ikke alltid være den foretrukne fremgangsmåte på grunn av genetiske materialer av interesse kan også bli fjernet fra prøvene med en lav mengde av en bestemt organisme. Spesielt genetisk materiale lagret i permafrost og is i lengre perioder av gangen gjennomgå degradering. Fordi mikroorganismer er i en høy overflod i disse Alaska prøvene, ble det bekymring for at de løsninger som ville fjerne en høy andel av endogent genetisk materiale sterkt redusert. Men forsiktighet bør utvises ved bruk løsninger som inneholder nukleaser å sikre at nukleinsyrer som har vært alvorlig svekket eller er fra organismer i lav overflod ikke fjernes avde nukleaser.
Fraværet av S. marcescens kolonier på petriplatene forutsatt tillit til at de intakte celler ble fjernet fra den ytre del av permafrosten kjerner. Videre analyse av is kjerner som gjennomgikk den samme protokollen viste ingen påviselige sekvenser beslektet med S. marcescens. Sekvens Resultatene viste at bare Pseudomonas ble påvist i disse eksemplene, selv om begge Pseudomonas sp. og Serratia sp. er i klassen Gammaproteobacteria. Sammen fravær av S. marcescens kolonier på Petri plater og fravær av DNA amplikonene fra qPCR tyder på at de frosne kjerner ble vellykket rengjort. Derfor mikroorganismene detekterte ble sannsynlig innleiret i det frosne materiale, i stedet for forurensning fra boring eller behandling av kjernene. Andre boreteknikker inkluderer hydraulisk bore å trenge ned i jorda eller is på større dyp. Selv om denne metoden kilo for tungd være gunstig å undersøke lav mikrobiell overflod i disse oligotrofe miljøer, betyr det ikke avsløre om borevæsker vil bli fjernet. Videre, dersom høy gjennomstrømning sekvensering er ikke en del av nedstrøms-analyse, spesifikke PCR-reaksjoner målretting S. marcescens skal brukes for å forsterke det ekstraherte DNA.
Resultatene fra vårt eksempel datasettet viste at intakt genomisk DNA ble vellykket hentet fra de frosne materialer. Videre både permafrosten og iskiler næret bakterier, som dokumentert av henholdsvis qPCR og sekvensering,. The Alaskan diskontinuerlige permafrost fra denne studien inneholdt tilsvarende bakterietall som permafrost i nordlige Canada 35, selv om Alaskan prøvene inneholdt en størrelsesorden færre bakterier enn permafrost fra den tibetanske platået i Qinghai-provinsen, Kina 36 og aktive lag / permafrost jord fra Nunavut, Canada 37. I likhet med en jegce kile samlet i Nunavut, Canada 37, sekvenser knyttet til Gammaproteobacteria, spesielt Pseudomonas, som er felles for jord og metabolsk mangfoldig, dominerte Alaskan iskiler i denne studien. Faktisk Katayama et al. 11 isolerte bakterier i phyla aktinobakterier, basiller, og Gammaproteobacteria fra en av de iskiler fra ERDC-CRREL Permafrost Tunnel. Disse studiene bekrefte påvisning av Gammaproteobacteria i denne studien. Planctomycetia, som er felles for vannprøven, ble også detektert i iskiler. Disse organismene har blitt funnet i aktive lag jord over permafrost i det nordøstlige Sibir 38, i tillegg til permafrost i den tibetanske platået i Qinghai, Kina 39.
Mange studier har undersøkt forekomst av archaea, særlig metanogener, i permafrosten, med forestillingen om at som permafrosten tiner, vil metanogener trolig bli mer aktiv, avgiftspliktig-skinne til utstrømningen av metan til atmosfæren 21, 33-34. Overraskende, archaea ble ikke oppdaget i Alaskan iskiler eller permafrostprøver selv om både Euryarchaeota og Crenarchaeota ble funnet i permafrost fra nordlige Canada 17 og metanogener ble funnet i permafrostprøver fra den arktiske tundraen i Russland 21.
Frosne materialer havn gamle mikroorganismer, noe som gir en oversikt over biogeokjemiske prosesser som fant sted for flere tusen år siden. Dette biologiske mangfoldet er av stor interesse under dagens klima oppvarming regime fordi mikroorganismer som en gang var begrenset i kryosfæren miljøet kan bli frigjort når de frosne materialer tine. For å trygt identifisere det biologiske mangfoldet skjult i disse frosne materialer, må de frosne jordsmonn og isprøver være riktig behandlet og renset. Her presenterer vi en protokoll for å fjerne fremmede celler og DNA fra frosne prøver til ensure at mikroorganismene detekterte var fra materialet, i stedet for forurensning fra boring eller behandling av kjernene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | ||
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | ||
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | ||
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | ||
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | |||
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22 µm | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 ml Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2007: The Physical Science Basis. Solomon, S., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom. (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. University of Alaska Fairbanks, 29, 1125-1130 (2008).
- Intergovernmental Panel on Climate Change. Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Pachauri, R. K., Meyer, L. A. , Intergovernmental Panel on Climate Change. Geneva, Switzerland. (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska's forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , New Hampshire. (1967).
- Sellmann, P. V. Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
