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Biology

Rimozione di materiali esogene dalla parte esterna della congelati core per Indagare sulla antica comunità biologiche ospitava Dentro

doi: 10.3791/54091 Published: July 3, 2016

Summary

La criosfera offre l'accesso a organismi conservati che persiste in condizioni ambientali del passato. Un protocollo è presentato per raccogliere e decontaminare nuclei permafrost di suoli e ghiaccio. L'assenza di colonie esogeni e del DNA suggeriscono che i microrganismi rilevate rappresentano il materiale, piuttosto che la contaminazione da perforazione o di trasformazione.

Introduction

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La criosfera (ad esempio, permafrost, caratteristiche ghiaccio, neve glaciale, firn e ghiaccio) offre uno sguardo in quali tipi di organismi persistito in condizioni ambientali del passato. Dal momento che questi substrati possono essere decine a centinaia di migliaia di anni, le loro comunità microbiche, quando conservati congelati dal deposito, riflettere antiche condizioni ambientali. Per analizzare in modo appropriato questi ecosistemi ed estrarre informazioni biologiche significative da terreni congelati e ghiaccio, la raccolta corretta e il trattamento dei campioni congelati è necessario. Questo è della massima importanza come proiezioni climatiche per il 21 ° secolo, indicano la possibilità di un riscaldamento accentuato in regioni artiche e subartiche 1. In particolare, Interno dell'Alaska e la Groenlandia sono attesi per riscaldare circa 5 ° C e 7 ° C, rispettivamente, nel 2100 2,3. Questo dovrebbe avere un impatto significativo comunità microbiche acquatiche suolo e, quindi, relativiprocessi biogeochimici. Le temperature più calde e regime delle precipitazioni alterata si prevede di avviare la degradazione del permafrost in molte zone 2-5 che potrebbe condurre ad una più spessa, stagionalmente scongelati (attivo) strato 6,7, lo scongelamento dei terreni congelati, e lo scioglimento dei corpi di ghiaccio enormi, come ghiaccio a terra, cunei di ghiaccio, e la segregazione ghiaccio 8. Questo sarebbe radicalmente modificare gli attributi biogeochimici, oltre alla biodiversità di piante e animali in questi ecosistemi.

ghiaccio glaciale e le caratteristiche del permafrost sedimenti e ghiaccio syngenetic hanno intrappolato chimica e prove biologiche di un ambiente che rappresenta ciò che ha vissuto lì al momento le caratteristiche formate. Per esempio, in Alaska interna, sia Illinoisan e Wisconsin età del permafrost sono presenti e questo strato di ghiaccio permanente, in particolare, offre luoghi unici risalenti moderno a 150.000 anni prima del presente (YBP) che contengono prove biologiche e geochimiche del IMPAct dei cambiamenti climatici sulla biodiversità del passato. Come risultato, questi sedimenti forniscono una registrazione della biogeochimica e biodiversità corso di migliaia di anni. Dal momento che la zona ha tassi di sedimentazione bassi e non è mai stato glaciale, campioni indisturbati sono accessibili per la raccolta e l'analisi, sia di perforazione verticalmente nel profilo del suolo o la perforazione orizzontale in galleria. Ancora più importante, i record estesi esistono che soprattutto evidenziare le caratteristiche uniche di biogeochimici del permafrost in questa regione 9-14. In particolare, l'applicazione di analisi del DNA per stimare la presenza e l'entità della biodiversità in entrambi i campioni di ghiaccio e permafrost esistenti e antiche consente esplorazione del legame di antichi condizioni ambientali e habitat per occupazione da organismi specifici.

Precedenti studi hanno identificato impatti climatici sui mammiferi, piante e microrganismi da campioni risalenti a 50k YBP 11, 15-19, anche se ogni studio ha usato un differemetodologia nt per raccogliere e decontaminare il permafrost o ghiaccio core. In alcuni casi, i nuclei di perforazione sono state sterilizzate 16, 20-21, anche se la metodologia specifica non ha chiarito se gli acidi nucleici estranei sono stati eliminati anche dai campioni. In altri studi, batteri isolati 15 (ad esempio, Serratia marcescens) e microsfere fluorescenti 22 sono stati utilizzati per misurare l'efficacia delle procedure di decontaminazione.

Questo esperimento è stato parte di un più ampio studio indaga le comunità microbiche da campioni permafrost che risalgono a circa 40k YBP. L'obiettivo specifico di questa parte dello studio è stato quello di decontaminare successo di ghiaccio e permafrost core. A nostra conoscenza, metodologia ha integrato l'uso di soluzioni progettate per eliminare gli acidi nucleici estranei e nucleasi associati dalla porzione esterna dei nuclei congelati. Questo nonostante il fatto che queste soluzioni sono commonly utilizzata per decontaminare attrezzature di laboratorio per esperimenti molecolari.

Una volta che i nuclei sono stati decontaminati, DNA genomico è stato estratto utilizzando i protocolli sviluppati da Griffiths et al. 23 e Towe et al. 24, quantificato utilizzando uno spettrofotometro, e diluito con acqua sterile, priva di DNA per ottenere 20 ng per reazione. Batteriche 16S rRNA geni sono stati amplificati con i primer 331F e 797R e sonda BacTaq 25 e 16S archeali rRNA geni sono stati amplificati con i primer Arch 349F e Arco 806R e sonda TM Arch 516F 26 alle seguenti condizioni: 95 ° C per 600 secondi seguiti da 45 cicli di 95 ° C per 30 sec, 57 ° C per 60 sec e 72 ° C per 25 sec con estensione finale a 40 ° C per 30 sec. Tutte le reazioni qPCR sono state condotte in duplicato. I 20 volumi di reazione microlitri incluse 20 ng di DNA, 10 mM di primer, 5 mM della sonda, e 10 ml di miscela di reazione qPCR. standard FOr batterico e dell'archea qPCR sono stati preparati utilizzando DNA genomico da Pseudomonas fluorescens e Halobacterium salinarum, rispettivamente. Entrambi sono stati coltivati ​​a fase di login. conteggio delle piastre sono state condotte e il DNA è stato isolato dalle colture. DNA genomico è stato quantificato con uno spettrofotometro con l'assunzione di uno e sei copie del gene 16S rRNA per genoma per H. salinarum e P. fluorescens, rispettivamente, 27-28. numero di copie dei geni batterici e archeali sono stati calcolati sulla base della curva standard, log-trasformati per tenere conto di varianze ineguali tra i trattamenti, e valutati da ANOVA.

Composizione della Comunità è stato determinato dal sequenziamento del gene 16S rRNA utilizzando celle di flusso e le tecnologie di amplificazione del ponte e l'analisi delle comunità con 'intuizioni quantitativi in ecologia microbica' (QIIME) 29. Avanti e retromarcia legge sono state riunite insieme e poi le sequenze sono stati filtrati, indicizzati,e rappresentanti di alta qualità sono stati selezionati per de novo unità tassonomiche operative (OTU) Assegnazione attraverso l'allineamento di sequenze, con un database di riferimento. sequenze allineate sono stati confrontati con un database di riferimento separata per l'assegnazione tassonomica. Una tabella OTU livello phylum è stato creato per determinare la composizione generale della comunità.

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Protocol

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1. apparecchiature Preparazione e Permafrost Collezione Core

  1. preparazione attrezzature e la raccolta del campione campo e gli attrezzi di conservazione
    1. Assemblare coclea per la raccolta del campione inserendo l'adattatore azionamento nella parte superiore della canna e ruotando la leva per bloccarla in posizione. Pin il tubo adattatore sull'adattatore unità e il perno del motore sul tubo adattatore. Inserire le frese sulla canna.
    2. Indossare abiti leggeri dovere, guanti di nitrile, e maschere per ridurre qualsiasi contaminazione ai campioni. Indossare protezioni per le orecchie e un cappello duro per la sicurezza entrando nel permafrost Tunnel (Figura 1).
    3. Entrate nel tunnel e selezionare una posizione per raccogliere i campioni (Figura 1B).
      Nota: Per la posizione di foratura verticale o orizzontale, seleziona una zona dove non è noto evidenza che il materiale è congelato (ad esempio, ghiaccio o permagelo), non ci sono grandi sistemi radice noti, e non c'è ghiaia noto. Rimuovi tuttovivente materiale vegetale dalla zona prima di raccogliere un campione. Se la perforazione verticale o in orizzontale, selezionare una zona che è relativamente piatta e accessibile con la coclea.
    4. Preparare una stazione di lavoro stratificando il terreno con un materiale plastico che è stato sterilizzato con il 70% di isopropanolo, soluzione decontaminante DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi.
    5. Posizionare di 10 cm di diametro cloruro di polivinile (PVC) taglio del tubo a metà longitudinalmente sulla workstation per fornire un trogolo per contenere i nuclei in cui sono rimossi dalla coclea. Decontaminare il tubo in PVC con il 70% di isopropanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi.
    6. Nei pressi della stazione di lavoro, decontaminare l'coclea a spruzzo con il 70% di isopropanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi. Rimuovere le soluzioni dalla coclea con un wipe.
  2. Ghiaccio e del permafrost raccolta core e lo stoccaggio
    1. Selezionare un'area della parete di campione (vedi 1.2.1Nota).
    2. Decontaminare di circa 10 cm di diametro della superficie della parete congelata strofinandola con il 70% di isopropanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi.
    3. Sollevare la coclea decontaminato la zona di interesse, che è perpendicolare alla superficie del campione e iniziare la perforazione della faccia pulita della parete (Figura 1C, D).
    4. Rimuovere con attenzione la coclea dalla zona di raccolta del campione. Scollegare la trivella dal motore e posizionare la coclea sopra il tubo di PVC sterile nella stazione di lavoro pulito. Inclinare con cautela coclea in modo che i nuclei congelati scivolare fuori sul tubo in PVC sterile (Figura 1E).
    5. Decontaminare guanti con il 70% di isopropanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi.
    6. Raccogliete le carote di ghiaccio e permafrost con i guanti sterili e metterli in sacchetti sterili.
    7. Mettere i nuclei in una stanza più fresca o fredda fino a quando non vengono spediti o trattati.
    8. Ship i nuclei congelati utilizzando ghiaccio secco di mantenere ad una temperatura inferiore a 0 ° C.
    9. archiviare immediatamente i nuclei a -80 ° C.

2. Il permafrost e del ghiaccio core di elaborazione

  1. Preparazione del materiale
    1. Preparare sterili, nucleico gratuito stagnola acido pesante alluminio, scaffalature metalliche, vetro, pinze di metallo, e lana di vetro per la cottura in forno a 450 ° C per 4 ore. Mettere da parte di questi materiali fino al momento dell'utilizzo.
    2. Sterilizzazione 95% di etanolo e acqua ultrapura passando le soluzioni attraverso un filtro di 0,22 micron.
    3. soluzione di etanolo Conservare a -20 ° C e acqua a 4 ° C.
    4. Sterilizzare un righello di plastica a spruzzo con il 70% di etanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione RNasi decontaminazione e subito pulire dopo ogni soluzione.
  2. Batterica cultura Preparazione
    1. Preparare il brodo e le piastre a crescere Serratia marcescens.
      1. Per il brodo, unire 5 g provaptone, 1 g di glucosio, 5 g di estratto di lievito, e 1 g di fosfato di potassio bibasico, e acqua quindi aggiungere distillata per raggiungere 1 L. Per fare piatti, aggiungere 15 g di agar a quanto sopra mix. Per brodo e piatti, aggiustare il pH a 7 e in autoclave a 121 ° C per 15 min.
    2. Preparare 1x fosfato tamponato soluzione salina (PBS) combinando 8 g di sodio cloruro, 0,2 g di cloruro di potassio, 1,44 g di fosfato di sodio dibasico, e 0,24 g di potassio fosfato monobasico e aggiungere acqua distillata per raggiungere 800 ml. Regolare il pH a 7,4 e aggiungere acqua distillata per raggiungere 1 L. autoclave a 121 ° C per 15 min.
    3. Seminare brodo con un'ansa sterile per immersione in S. cultura marcescens che è stato precedentemente congelati a -80 ° C. In condizioni asettiche, diluito seriale cultura aggiungendo 1 ml di coltura a 9 ml di PBS e capovolgere la soluzione. Aggiungere 1 ml di questa diluizione a 9 ml di PBS e invertire manualmente la soluzione. Ripetere più otto volte fino a quando una diluizione 10 -9zione è raggiunto.
    4. Stendere le 10 -6, -7 10, 10 -8 e 10 -9 soluzioni su piastre di agar distribuendo 1 ml di brodo sulla piastra e la diffusione con una spatola cellulare. Fate questo in triplice copia per ogni diluizione. Conservare la cultura d'origine a 4 ° C.
    5. Incubare le piastre a 30 ° C per 24 ore. Contare il numero di colonie per calcolare il numero di cellule nella coltura originale. Nota: Il numero di colonie nella cultura originale dipenderà dal tasso di crescita dei batteri.
    6. Dispensare 250 microlitri della cultura d'origine in una sterile 1,5 ml provetta. Diluire coltura originale aggiungendo un volume sufficiente di 1x PBS per ottenere circa 10 9 cellule / ml come determinato dal conteggio delle colonie nel passaggio precedente. Agglomerare le cellule in una provetta per centrifugazione a 2.500 xg per 10 min.
      Nota: Il volume di PBS 1x varierà a seconda del tasso di crescita dei batteri.
    7. In un biohood sterile, Pipettare fuori il brodo e risospendere le cellule in 1 ml di 1x tampone PBS. Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso o circa due mesi.
    8. Il giorno della trasformazione, diluire il S. cultura marcescens dal punto 2.2.7 con l'aggiunta di 1 ml dell'originale S. cultura marcescens a 39 ml 1x tampone PBS in una provetta da centrifuga da 50 ml.
  3. Preparare spazio della stanza fredda per core e l'ingranaggio di conservazione
    1. Prima di raffreddando la stanza fredda, le pareti pulite, pavimenti, e tavolo di metallo con una soluzione di candeggina 1%.
    2. Impostare la temperatura di cella frigorifera a circa -11 ° C.
    3. Una volta che la cella ha raggiunto la temperatura desiderata, indossare abiti leggeri duty, guanti nitrile e maschere di ridurre qualsiasi contaminazione della cella e campioni.
      Nota: Due individui correttamente vestiti sono necessari per questa procedura.
    4. Portare i materiali sterili (ad esempio, un foglio di alluminio, scaffalature metalliche, vetro, vassoio, S. marcescens cultura, e milama microtomo) e campioni nella camera fredda e posto sul tavolo sterile.
  4. Il permafrost e la lavorazione carota di ghiaccio in una struttura di cella frigorifera
    1. Posizionare un nucleo permafrost in una sterile, l'acido nucleico foglio privo di un foglio di alluminio.
    2. Leggermente inoculare il esterna del nucleo con la cultura diluita di S. marcescens utilizzando un tampone in spugna sterile (Figura 2B).
    3. Posizionare il nucleo sulla griglia metallica sterile che si trova sopra un vassoio.
    4. Sterilizzare la lama microtomo inossidabile con etanolo al 70%, soluzione decontaminante DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi.
    5. Avere privato Un guanti di nitrile pulita con il 70% di etanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi e tenere core a un angolo di 45 ° al di sopra del cassetto.
    6. Avere Persona B raschiare delicatamente circa 5 mm di lato esterno del intero nucleo, tra le estremità, utilizzando la lama sterile mentre Persona A si nucleo dopo ogni raschiatura ( 3A, B). Pulire la lama con il 70% di etanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi come necessario.
    7. Avere Persona B versare sterilizzata per filtrazione, etanolo al 95% sopra il nucleo accuratamente e rapidamente, mentre Persona A si nucleo come la soluzione viene versata (figure 2D, 3C).
    8. Avere individuale B lavare immediatamente il nucleo con acqua sterilizzata per filtrazione.
    9. Sostituire cremagliera metallico utilizzato su vassoio con un nuovo rack di metallo sterile.
    10. Avere privato Un pulire i suoi guanti di nitrile con il 70% di etanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi e tenere premuto il core a un angolo di 45 ° al di sopra del cassetto.
    11. Avere individuale B spruzzare l'intero nucleo con una soluzione di decontaminazione DNA.
    12. Avere individuale B lavare immediatamente il nucleo con acqua sterilizzata per filtrazione.
    13. Avere individuale B spruzzare l'intero nucleo con una soluzione di decontaminazione RNasi.
    14. avere IndividuAl B lavare immediatamente il nucleo con acqua sterilizzata per filtrazione.
    15. Posizionare il nucleo su un foglio di alluminio sterile e avvolgere leggermente.
  5. nucleo esterno Thaw
    1. Posizionare un telaio metallico sterili su un piatto di vetro sterile in un biohood sterile con flusso laminare.
    2. Inserire due piastre di agar specifici per S. marcescens nel piatto di vetro sotto del rack sterile per raccogliere il liquido dal nucleo (figura 2E).
    3. Posizionare il nucleo sulla griglia metallica sterile.
    4. Lasciare circa 2-5 mm della superficie esterna del nucleo scongelare a 23 ° C (in media, questo avverrà entro circa 10 min). Ruotare il nucleo di circa 90 ° ogni 2 min.
    5. Tamponare tutta la superficie del nucleo con pinza sterile e lana di vetro sterile e inoculare due piastre di agar specifico per S. marcescens tamponando questi materiali sulla superficie delle piastre. Seminare due nuove piastre con coltura originale utilizzato per drogare all'esterno dellanucleo, che è stato esposto a basse temperature della stanza fredda.
    6. Misurare le dimensioni esterne del nucleo cilindrico scongelato inserendo un righello sterile vicino, ma non tocca il nucleo.
    7. Posizionare il nucleo in grande borsa sterile e conservarlo a -80 ° C.
  6. Controllare per la crescita
    1. Incubare le piastre di agar a 23 ° C per una settimana.
    2. Esaminare le piastre di agar per la crescita di S. colonie marcescens.
      1. Se non ci sono colonie visibili sulla piastra, procedere al punto 2.5.3.
      2. Se le colonie appaiono sulla piastra, ripetere dal punto 2.1.1 della sezione 2 "Permafrost e l'elaborazione carota di ghiaccio".
    3. Ottenere il nucleo dal congelatore e asetticamente trasferirlo ad un sacchetto sterile.
    4. Conservare il nucleo in una sacca sterile a 4 ° C per circa 24-48 ore per scongelare l'intero nucleo.

3. Ottenere sottocampione per estrazione degli acidi nucleici da Ice Cores e Permafrost

  1. estrazione degli acidi nucleici da carote di ghiaccio
    1. Mescolare il materiale sciolto dal nucleo di ghiaccio agitando delicatamente la borsa (Figura 2G).
    2. Versare il materiale scongelato in un contenitore sterile con un filtro da 0,22 micron sotto vuoto per raccogliere microrganismi.
    3. Asetticamente rimuovere il filtro con una pinza sterile e posizionarlo in un 2 ml tubo tallone ceramica sterile (1,4 mm).
    4. Conservare il filtro a -80 ° C.
  2. estrazione degli acidi nucleici da nuclei permafrost
    1. Mescolare il materiale sciolto dal nucleo del permafrost da impastare delicatamente la borsa.
    2. Dopo che il permafrost è stato ben miscelato, ottenere un sottocampione di terreno massa circa 0,5 g con un scoopula sterile e collocarlo in una sterile 2 ml tubo ceramico tallone tappo a vite tarata (1,4 mm) che si trova in posizione verticale su una bilancia.
    3. sottocampioni conservare a -80 ° C.
    4. Ottenere contenuto d'acqua gravimetrica dei campioni.
      1. Misura 10 g del permafrost con una sterilee scoopula e mettere in un barattolo tarato su una bilancia. Misurare la massa umida del permafrost e stagno.
      2. Incubare permafrost in forno a 105 ° C per 24 ore. Misurare la massa secca del permafrost e stagno.
      3. Calcolare il contenuto d'acqua gravimetrico sottraendo la massa umida del permafrost dalla massa secca del permafrost e dividendo per la massa secca del permafrost.
    5. Conservare permafrost a -80 ° C.

4. Estrarre acidi nucleici dal permafrost e del ghiaccio Cores

  1. preparazione del materiale
    1. Preparare fiale ambrate per contenere soluzioni trattando con 0,1% dietilpirocarbonato (DEPC), incubazione O / N a 37 ° C, e la sterilizzazione in autoclave.
    2. Preparare 240 mM tampone fosfato di potassio. Aggiungere 2. 5 g di potassio fosfato monobasico e 38,7 g di potassio fosfato bibasico. Regolare il volume finale a 500 ml con l'aggiunta di acqua sterile.
    3. Preparare il bromuro di esadeciltrimetilammonio (CTAB) estrazione buffer sciogliendo 4,1 g di cloruro di sodio in 80 ml di acqua e aggiungere lentamente 10 g CTAB durante il riscaldamento e agitazione. Regolare il volume finale a 100 ml con l'aggiunta di acqua sterile.
    4. Aggiungere volumi uguali di soluzione tampone fosfato e tampone CTAB e filtro sterilizzare con un filtro da 0,22 micron. Coprire bottiglia con un foglio di alluminio e conservare a temperatura ambiente.
    5. Preparare 1,6 M soluzione di cloruro di sodio (NaCl) combinando 9,35 g di NaCl e 100 ml di acqua sterile. Aggiungere 10 g di polietilenglicole 8000 alla soluzione e filtro sterilizzare 1.6 M NaCl. Conservare a 4 ° C.
  2. Estrazione Acido nucleico secondo una versione modificata di Griffiths et al. 22 e Towe et al. 23
    1. Indossare abiti leggeri dovere, guanti di nitrile, e maschere. spazio di laboratorio pulito e pipette con il 70% di etanolo, soluzione di decontaminazione DNA, e la soluzione di decontaminazione RNasi.
    2. Rimuovere sottocampione (filtro dal nucleo di ghiaccio o campione di suolo permafrost) in 2 ml di perline di ceramica a vite catubo p da -80 ° C freezer e scongelare a RT.
    3. Aggiungere 0,5 ml di esadeciltrimetilammonio bromuro (CTAB) tampone di estrazione e vortex brevemente.
    4. Aggiungere 0,5 ml di alcool di fenolo-cloroformio-isoamilico (25: 24: 1) (pH 8) e agitare provette orizzontalmente per 10 minuti utilizzando un adattatore pannello piatto su un vortex.
    5. A seguito di bead-battito, provette da centrifuga a 16.100 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    6. Rimuovere fase acquosa in una nuova provetta sterile da 1,5 ml e mescolare con un uguale volume di cloroformio-alcool isoamilico (24: 1). Centrifugare a 16.100 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    7. Rimuovere fase acquosa in una nuova provetta sterile da 1,5 ml e aggiungere due volumi di 30% di polietilene glicole 8000 e 1,6 M NaCl. Incubare per 2 ore a 4 ° C.
    8. Centrifugare a 16.100 xg per 10 min a 4 ° C.
    9. Lavare pellet acido nucleico con circa 500 ml di ghiacciata etanolo al 70% e centrifugare a 16.100 xg per 10 min a 4 ° C.
    10. Aria pellet secco in un biohood sterile per 2 ore. Risospendere in 50 microlitri DNasi / RNasi-free tampone TE (pH 8,0). DNA è pronto per le applicazioni a valle, come la PCR e qPCR.
    11. Determinare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro.
    12. Diluire il DNA con acqua sterile, priva di DNA per ottenere 20 ng per reazione.

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Representative Results

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Il metodo presentato potrebbe essere utilizzato per decontaminare campioni congelati raccolti da vari ambienti criosfera, dal ghiaccio glaciale al permafrost. Qui vi presentiamo i dati specificamente raccolti da campioni di ghiaccio e permafrost raccolti dalla ricerca di Ingegneria e Centro Sviluppo - Cold Regions Research and Laboratory Engineering (ERDC-CRREL) Permafrost tunnel situato a Fox, AK (Figura 1A e 1B). Il permafrost tunnel si estende a circa 110 m sul lato della valle Goldstream e fornisce l'accesso al ricco limo ghiaccio e alluvioni 30-31. I campioni di un cuneo di ghiaccio e terra ghiacciata stati accuratamente raccolti in triplicato dalle pareti del tunnel, il 24 ottobre 2014. Al momento del campionamento, la temperatura della parete permagelo era -2.9 ° C. I campioni sono stati raccolti da una funzione di cuneo di ghiaccio di circa 27 m dal portale del tunnel, e il suolo ghiacciato a 35 metri e 60 metri dallail portale del tunnel (Figure 1C e 1D). Particolare cura è stata presa durante la raccolta dei campioni di limitare la contaminazione delle carote di ghiaccio e permafrost (Figura 1E). I nuclei congelati sono state gestite secondo il nostro protocollo di decontaminazione (Figura 2) e trasportati in ghiaccio secco al laboratorio di microbiologia del suolo CRREL in Hanover, NH per l'elaborazione.

Tutti i nuclei sono stati elaborati utilizzando il protocollo descritto nella Sezione 2 utilizzando lame sterili microtomo e soluzioni (Figura 3A, B, e C). L'obiettivo di questo studio era di estrarre correttamente acidi nucleici endogeni dai campioni congelati per determinare le comunità microbiche presenti al momento che il materiale è stato depositato. Il protocollo di decontaminazione è stata valutata dal doping i nuclei con una coltura diluita di Serratia marcescens e quindi esaminare le piastre di Petri per la crescita di poppaer i nuclei sono stati trattati 31. L'assenza di S. colonie marcescens indicato che i microrganismi esogeni sono stati correttamente rimossi dalla porzione esterna del nucleo. Tuttavia, l'assenza di colonie non indicherebbe se DNA esogeno è stato rimosso dalla porzione esterna del nucleo. Pertanto, abbiamo sequenziato campioni dal nucleo di ghiaccio per verificare la presenza di DNA da Serratia sp. Perché l'abbondanza microbica del cuneo ghiaccio era probabilmente significativamente inferiore nel permafrost, abbiamo usato le carote di ghiaccio per determinare se il DNA da S. marcescens sarebbe presente seguendo il protocollo di decontaminazione. Se i nuclei non erano adeguatamente decontaminati, quindi le sequenze relative al S. marcescens sarebbe dovrebbe essere presente nei campioni. La Figura 4 mostra la diversità batterica basso all'interno del nucleo di ghiaccio da 16S rRNA risultati gene sequenziamento. Le sequenze correlate a Pseudomonas sp., Del phylum Gammaproteobacteria, ha dominato la sampl ghiaccioes. Utenti collegati Planctomycetia erano presenti anche nel ghiaccio, ma in misura minore. Di particolare nota è l'assenza di Serratia sp. Nei risultati di sequenziamento, suggerendo che il protocollo di decontaminazione sufficientemente rimosso DNA esogeno.

Inoltre, vi è un rischio aggiuntivo di contaminazione durante l'estrazione degli acidi nucleici. sbozzati estrazione negativi sono stati usati per rivelare la contaminazione da acidi nucleici esogeni. Il DNA dei campioni e dei controlli negativi sono stati amplificati utilizzando qPCR. i dati qPCR hanno mostrato che il permafrost batteri ospitava, ma archeobatteri non sono stati rilevati nel permafrost (Tabella 1). Decontaminazione di successo è stato ulteriormente dimostrato dalla mancanza di ampliconi batteriche o archeali a sbozzati di estrazione, in combinazione con l'amplificazione positivo dei controlli, Pseudomonas fluorescens e Halobacterium salinarum (Tabella 1). il abundmisurazioni ANCE hanno rivelato che non vi erano differenze significative in abbondanza batterica tra i nuclei raccolti a 35 m dal portale, rispetto ai 60 m nuclei (Tabella 1). La continua ricerca è in corso per determinare se composizione della comunità microbica era differente tra i core.

Figura 1
Figura 1. siti campione vicino a Fairbanks, AK. (A) Mappa di Fairbanks, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html), (B) ERDC-CRREL Permafrost Tunnel, (c) Raccolta di nuclei permafrost che utilizzano la coclea SIPRE, (D) vista della coclea entrare parete del permafrost, e (e) preparare il nucleo per l'archiviazione. cliccate qui per visualizzare un grande versione di questa figura.

figura 2
Figura 2. Schema di decontaminare materiale congelato. (A) Il materiale congelato (ad esempio, carota di ghiaccio o nucleo permagelo) viene elaborato in una camera fredda. (B) Si è volutamente contaminato da una coltura batterica. (C) Il nucleo è rasato con una lama microtomo sterile per rimuovere la porzione esterna 5 mm. (D) Una serie di soluzioni sono applicati per decontaminare ulteriormente la porzione esterna del campione. DDS indica soluzione di decontaminazione DNA e RDS indica soluzione di decontaminazione RNasi. (E) Posizionando il nucleo in un biohood sterile presso RT, l'esterno 2-5 mm del materiale si scioglie. Il liquido che gocciola dal ghiaccio o del permafrost è raccolto in piastre di Petri e il nucleo viene tamponato e placcato per controllare che il nucleo è stato adeguatamente decontaminato. (F e G) Se non viene rilevata la crescita batterica, poi il nucleo è scongelato a 4 ° C in un contenitore sterile. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Decontaminazione di nuclei permafrost in camera fredda in condizioni sterili. (A) Rimuovere lo strato esterno del nucleo permagelo con una lama metallica microtomo mediante raschiatura. (B) Una visione più ravvicinata di un graffio. (C) soluzione di risciacquo per decontaminare lo strato esterno del nucleo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

contenuti "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 4
Figura 4. sequenze microbiche dai campioni cuneo di ghiaccio. Grafico a barre che mostra l'abbondanza relativa media del phyla batterica presente nei campioni di ghiaccio con zeppa per percentuale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1
Tabella 1. abbondanza batterica nel permafrost. QPCR risultati mostrano l'abbondanza di batteri nei campioni permafrost e spazi vuoti di estrazione associati. I valori in tabella sono riportati come media ± errore standard. n è il numero di campioni. ND non indica rilevato.

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La criosfera offre l'accesso a organismi conservati che persiste in condizioni ambientali del passato. Anche se il taxa recuperato non può rappresentare la comunità storica completa, quelli recuperati dalle analisi di campioni di ghiaccio e permafrost glaciali possono produrre preziose informazioni storiche su Select periodi di tempo 15-16. Per esempio, informazioni biologiche significativa è stata elaborata da studi di ghiaccio che studiano l'attività anaerobica nella calotta glaciale della Groenlandia 20 e studi di permafrost che indagano i processi ciclo del carbonio a causa del disgelo 33 e hanno fornito spaccato della diversità fungina dal permafrost in Beringia 16. La corretta raccolta dei campioni e la decontaminazione deve avvenire prima di condurre a valle di analisi per indagare comunità biologiche all'interno di questi materiali congelati. Anche se questi passaggi hanno implicazioni significative sui interpretazione dei dati, molti studi non offrono dettagli specifici su come i campioni were raccolti e trattati o immagini che mostra come gestire i materiali congelati. Per esempio, studi precedenti hanno drogato la porzione esterna del core con microsfere fluorescenti o batteri noti 15, se le concentrazioni esatte di questi materiali non sono stati descritti. Altri studi hanno descritto protocolli di decontaminazione in dettaglio, ma non hanno applicato high throughput analisi per verificare l'efficacia della metodologia 15, 32. Pertanto, uno screening dettagliato di batteri intatti e DNA esogeno attraverso la crescita su piastre Petri e qPCR è stato usato per determinare se la raccolta del campione, la conservazione, e le procedure di analisi erano abbastanza sterile per identificare le comunità microbiche presenti nei materiali congelati.

Questo protocollo è stato modificato per isolare con successo materiale genetico di interesse da antichi nuclei. Cura come ad esempio indossare attrezzi specifici e la decontaminazione forniture deve essere presa durante la raccolta, l'elaborazione e l'estrattoion dalle anime da contaminazione potrebbe avvenire in qualsiasi fase. Inoltre, la spedizione delle anime con ghiaccio secco o un agente di raffreddamento paragonabile è indispensabile perché se i nuclei disgelo durante il transito, allora vi è una maggiore propensione che i contaminanti dalla regione esterna del nucleo possono migrare verso la porzione interna del nucleo. Per ridurre ulteriormente il rischio di contaminazione, prendere in considerazione la raccolta di nuclei di grosse dimensioni con una coclea motorizzata, piuttosto che un nucleo di spinta. Abbiamo trovato che i nuclei di spinta erano troppo piccoli per decontaminare correttamente nella fase di raschiatura. In alternativa, un volume maggiore di campione può essere estratto dalle anime più grandi, che è particolarmente importante per campioni con una bassa abbondanza di materiale biologico. Inoltre, il volume maggiore offre maggiore spazio per errore tale che, se vengono rilevate colonie Serratia marcescens su piastre, allora il nucleo è abbastanza grande per essere elaborato ancora.

Vari accessori sono stati testati per determinare il più efficientemetodo per decontaminare i nuclei. Per esempio, un foglio di alluminio sterile, piuttosto che piatti di vetro o materiali plastici, consentiti per il nucleo per essere posti su una superficie sterile rapidamente e facilmente. Inoltre, le forniture non tradizionali come ad esempio un telaio metallico e un vassoio dimostrato di essere utile per consentire i materiali esterni raschiate di accumulare lontano dal nucleo, diminuendo il rischio di ri-contaminare i nuclei. Nelle precedenti iterazioni del protocollo, la raschiatura si è verificato su una superficie piana, che ha aumentato il rischio di contaminazione. Infine, sacchetti sterili, anziché vetro piatti, sono risultati essere favorevole alla miscelazione e la memorizzazione dei campioni.

Questo protocollo è stata mirata ad eliminare i microrganismi e acidi nucleici sulla parte esterna dei nuclei congelati. Mentre isopropanolo ed etanolo sono disinfettanti efficaci, essi non rimuovere acidi nucleici. Pertanto, sono stati usati soluzioni che rimuovono acidi nucleici ed enzimi associati da parte esterna dei nuclei. questi Soluzioni sono comunemente utilizzati per rimuovere gli acidi nucleici e nucleasi associati da forniture e attrezzature di laboratorio. Durante il test la loro efficacia su superfici di laboratorio, soluzione RNA decontaminazione rimosso materiali più esogeni rispetto alla soluzione di decontaminazione DNA 34. Utilizzando nucleasi per decontaminare la porzione esterna del nucleo potrebbe non essere sempre il metodo preferito in quanto i materiali genetici di interesse possono essere rimossi da campioni con una bassa abbondanza di un particolare organismo. In particolare, il materiale genetico conservato nel permafrost e ghiaccio per periodi di tempo prolungati subiscono degradazione. Perché i microrganismi sono in una grande abbondanza in questi campioni dell'Alaska, la preoccupazione che le soluzioni sarebbero rimuovere una percentuale elevata di materiale genetico endogene è stato notevolmente ridotto. Tuttavia, si deve usare cautela quando si usano le soluzioni che contengono nucleasi al fine di garantire che gli acidi nucleici che sono stati pesantemente degradati o provengono da organismi in bassa abbondanza non vengono rimossi dallale nucleasi.

L'assenza di S. colonie marcescens sulle piastre Petri condizione fiducia che le cellule intatte sono state rimosse dalla porzione esterna dei nuclei permafrost. Inoltre, l'analisi di carote di ghiaccio che hanno subito lo stesso protocollo non ha mostrato sequenze rilevabili relativi a S. marcescens. Risultati di sequenza ha rivelato che soltanto Pseudomonas sono stati rilevati in questi campioni, anche se entrambi Pseudomonas sp. e Serratia sp. sono all'interno della classe Gammaproteobacteria. Insieme, l'assenza del S. colonie marcescens su piastre di Petri e l'assenza di amplificati di DNA da qPCR suggeriscono che i nuclei congelati sono stati decontaminati con successo. Pertanto, i microrganismi identificati erano probabilmente incorporati nel materiale congelato, che per la contaminazione da perforazione o l'elaborazione dei nuclei. Altre tecniche di perforazione comprendono la perforazione idraulica per penetrare nel suolo o di ghiaccio a profondità maggiori. Anche se questo metodo would essere utile per indagare bassa abbondanza microbica in questi ambienti oligotrofici, non rivela se fluidi di perforazione sarebbe stato rimosso con successo. Inoltre, se alta sequenziamento produttività non è parte dell'analisi valle, specifiche reazioni PCR mira S. marcescens dovrebbero essere utilizzati per amplificare il DNA estratto.

I risultati del nostro esempio di dati hanno mostrato che il DNA genomico intatto è stato estratto con successo dai materiali congelati. Inoltre, sia il permafrost e del ghiaccio cuneo nutrito batteri, come evidenziato da rispettivamente qPCR e sequenziamento,. Il permafrost discontinuo dell'Alaska da questo studio conteneva i numeri di batteri simili a quelle del permafrost in Canada Artico 35, anche se i campioni dell'Alaska contenevano un ordine di grandezza meno batteri rispetto permafrost dal Plateau tibetano nella provincia di Qinghai, Cina 36 e attivi terreni strato / permafrost da Nunavut, Canada 37. Simile a un ice cuneo raccolti in Nunavut, Canada 37, le sequenze relative al Gammaproteobacteria, in particolare Pseudomonas, che sono comuni ai terreni e metabolicamente diversificata, ha dominato il cuneo di ghiaccio dell'Alaska in questo studio. Infatti, Katayama et al. 11 batteri isolati all'interno phyla Actinobacteria, Bacilli, e Gammaproteobacteria da uno dei cunei di ghiaccio dalla ERDC-CRREL Permafrost Tunnel. Questi studi confermano la rilevazione di Gammaproteobacteria in questo studio. Planctomycetia, che sono comuni a campione acquatica, sono state rilevate anche nel cuneo di ghiaccio. Questi organismi sono stati trovati nei terreni strato attivi sopra del permafrost in Siberia nordorientale 38, oltre al permafrost nel Plateau tibetano in Qinghai, Cina 39.

Molti studi hanno indagato la presenza di archeobatteri, in particolare methanogens, nel permafrost, con l'idea che, come si scongela il permafrost, methanogens probabilmente diventare più attivi, Contribuendo per l'efflusso del metano in atmosfera 21, 33-34. Sorprendentemente, Archea, non sono stati rilevati nei campioni dell'Alaska cuneo di ghiaccio o permafrost anche se entrambi Euryarchaeota e Crenarchaeota sono stati trovati nel permafrost dal canadese Artico 17 e methanogens sono stati trovati in campioni di permafrost della tundra artica in Russia 21.

materiali congelati porto antichi microrganismi, fornendo un record di processi biogeochimici che si sono verificati molti migliaia di anni fa. Questa biodiversità è di grande interesse sotto il regime di riscaldamento del clima attuale, perché i microrganismi che una volta erano limitati nell'ambiente criosfera possono diventare liberato quando il materiale congelato disgelo. Al fine di identificare con sicurezza la biodiversità ospitato in questi materiali congelati, i terreni congelati e campioni di ghiaccio devono essere adeguatamente gestiti e decontaminati. Qui, vi presentiamo un protocollo per rimuovere le cellule straniere e il DNA da campioni congelati a ensure che i microrganismi identificati erano dal materiale, che per la contaminazione da perforazione o l'elaborazione dei nuclei.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Auger Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% Isopropanol Walmart 551116880
95% Ethyl Alcohol (denatured)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA A407-4
DNA decontamination solution, DNA Away Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7010
RNase decontamination solution, RNase Away Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA  7002
Light Duty Suits Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 10606
Nitrile Gloves Fisher Scientific, Pittsburgh, PA FFS-700
Antiviral Masks Curad, Walgreens CUR3845
Sterile Sample Bags  Nasco, Fort Atkinson, WI B01445
Steel Microtome Blade  B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Metal Rack Fabricated at CRREL, Hanover, NH
Tray Handy Paint Products, Chanhassen, MN 7500-CC
Aluminum Foil Western Plastics, Temecula, CA
500 ml Bottle with 0.22 μm Filter Corning, Corning, NY 430513
Serratia marcescens ATCC, Manassas, VA 17991
Biosafety Hood NuAire, Plymouth, MN NU-425-400
Petri Dish Fisher Scientific, Pittsburgh, PA FB0875712
ATCC Agar 181- Tryptone Acros Organics, NJ 61184-5000
ATCC Agar 181- Glucose Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP381-500
ATCC Agar 181- Yeast Extract Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP1422-500
ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate JT Baker, Phillipsburg, NJ 3252-01
ATCC Agar 181- Agar Difco, Sparks, MD 214530
NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 System Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
Halobacterium salinarum American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescens American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Microbial DNA Isolation Kit MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 12224-50
Ear Protection Elvex EP-201
Hard Hat
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34705
Glass Wool Pyrex 430330
Ruler
Weighing Tin  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 08-732-100
Sodium chloride Sigma Aldrich, St Louis, MO S-9625
Potassium chloride JT Baker, Phillipsburg, NJ 3040-04
Potassium phosphate, monobasic JT Baker, Phillipsburg, NJ  3246-01
Potassium phosphate, dibasic JT Baker, Phillipsburg, NJ 3252-01
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP332-500
50 ml Centrifuge Tubes Corning, Corning, NY 4558
2 ml Microcentrifuge Tubes MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 1200-250-T
2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 13113-50
Scoopula Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE 1437520
Balance Ohaus, Parsippany, NJ E12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich, St Louis, MO D5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB)  Acros Organics, NJ 22716-5000
Polyethylene glycol 8000  Sigma Aldrich, St Louis, MO P5413-1KG
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP1752-400
Centrifuge Eppendorf, Hauppauge, NY 5417R
Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) Sigma Aldrich, St Louis, MO C0549-1PT
TE Buffer Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE AM9860
Pipets Rainin, Woburn, MA Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets
Pipet tips Rainin, Woburn, MA Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl
Vortexor Scientific Industries, Bohemia, NY G-560
Vortex Adaptor MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 13000-V1
Clear Bottle Corning, Corning, NY C1395500
Amber Bottle Corning, Corning, NY C5135250
Bottle Top Filters, 0.22 µm Corning, Corning, NY 430513
60 ml Syringe Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ BD 309653
Millex Syringe filters, 0.22 μm EMD Millipore, Billerica, MA SLGV033RB
70% Ethanol Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP2818-500 diluted & filter sterilized
Isotemp 100 L Oven Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 151030511
Cell Spreader Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 08-100-10
Disposable Inoculating Loops Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-363-602

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Rimozione di materiali esogene dalla parte esterna della congelati core per Indagare sulla antica comunità biologiche ospitava Dentro
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Barbato, R. A., Garcia-Reyero, N., Foley, K., Jones, R., Courville, Z., Douglas, T., Perkins, E., Reynolds, C. M. Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside. J. Vis. Exp. (113), e54091, doi:10.3791/54091 (2016).More

Barbato, R. A., Garcia-Reyero, N., Foley, K., Jones, R., Courville, Z., Douglas, T., Perkins, E., Reynolds, C. M. Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside. J. Vis. Exp. (113), e54091, doi:10.3791/54091 (2016).

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