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Biology

Remoção de materiais exógenos da parte exterior dos núcleos congelados para investigar a antiga comunidades biológicas abrigava Dentro

doi: 10.3791/54091 Published: July 3, 2016

Summary

A criosfera oferece acesso a organismos preservados que persistiram sob condições ambientais do passado. Um protocolo é apresentada para recolher e descontaminar núcleos permafrost de solos e gelo. A ausência de colónias exógenas e DNA sugerem que os microrganismos detectados representam o material, em vez de contaminação de perfuração ou de processamento.

Introduction

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A criosfera (por exemplo, solos de permafrost, características gelo, neve glacial, firn e gelo) oferece um vislumbre do que tipos de organismos persistiu em condições ambientais do passado. Uma vez que estes substratos pode ser dezenas a centenas de milhares de anos de idade, suas comunidades microbianas, quando preservado congeladas desde a deposição, refletem as condições ambientais antigos. Para analisar adequadamente estes ecossistemas e extrair informação biológica significativa de solos congelados e gelo, coleta adequada e processamento das amostras congeladas é necessário. Isto é de extrema importância como projeções climáticas para o século 21 indicam o potencial para um aquecimento acentuado em regiões árticas e sub-árticas 1. Especificamente, Interior do Alasca e Groenlândia são esperados para aquecer cerca de 5 ° C e 7 ° C, respectivamente em 2100 2,3. Isto é esperado para afetar significativamente o solo e comunidades microbianas aquáticos, e, portanto, relacionadaprocessos biogeoquímicos. As temperaturas mais quentes e regime de precipitação alterados são esperados para iniciar a degradação do permafrost em muitas áreas 2-5 potencialmente levando a uma mais grossa, sazonalmente descongelado (ativo) camada 6,7, o degelo dos solos congelados, ea fusão de corpos de gelo enormes, tais como gelo no solo, cunhas de gelo, e segregação de gelo 8. Isto mudaria drasticamente os atributos biogeoquímicos além da biodiversidade de plantas e animais nestes ecossistemas.

gelo glacial e características de sedimentos permafrost e gelo singenéticos ter aprisionado química e evidência biológica de um ambiente representando o que viveu lá no momento as características formado. Por exemplo, no Interior do Alasca, tanto Illinoisan e Wisconsin permafrost com idades estão presentes e este permafrost em particular fornece os locais únicos que datam de moderno a 150.000 anos antes do presente (YBP) que contêm evidência biológica e geoquímica do impact das mudanças climáticas passadas sobre a biodiversidade. Como resultado, estes sedimentos fornecem um registro da biogeoquímica e da biodiversidade ao longo de muitos milhares de anos. Uma vez que a área tem taxas de sedimentação baixos e nunca foi glaciar, as amostras não perturbadas são acessíveis para recolha e análise, tanto de perfuração verticalmente no perfil do solo ou de perfuração horizontal em túneis. Mais importante ainda, existem extensos registros que, especialmente destacar as características únicas de biogeoquímicos permafrost nessa região 9-14. Especificamente, a aplicação da análise de DNA para estimar presença e extensão da biodiversidade em ambas as amostras de gelo e permafrost existentes e antigas permite a exploração da ligação das condições ambientais antigas e habitat para a ocupação por organismos específicos.

Estudos anteriores identificaram impactos climáticos sobre mamíferos, plantas e microorganismos de amostras datando de 50k YBP 11, 15-19, embora cada estudo utilizou uma differemetodologia nt para recolher e descontaminar as permafrost ou gelo núcleos. Em alguns casos, os núcleos de perfuração foram esterilizados 16, 20-21, embora a metodologia específica não esclarecer se os ácidos nucleicos estranhos, foram igualmente eliminadas a partir das amostras. Em outros estudos, 15 isolados bacterianos (por exemplo, Serratia marcescens), bem como as microesferas fluorescentes 22 foram utilizadas para medir a eficácia de processos de descontaminação.

Este experimento foi parte de um estudo maior investigando comunidades microbianas a partir de amostras de permafrost que datam YBP cerca de 40k. O objectivo específico desta parte do estudo foi para descontaminar com sucesso de gelo e permafrost núcleos. Para nosso conhecimento, nenhuma metodologia tem integrado o uso de soluções concebidas para eliminar os ácidos nucleicos estranhos e nucleases associados a partir da porção exterior dos núcleos congelados. Isto apesar do fato de que estas soluções são commonly usado para descontaminar equipamentos de laboratório para experimentos moleculares.

Uma vez que os núcleos foram descontaminadas, o DNA genómico foi extraído utilizando os protocolos desenvolvidos por Griffiths et al. 23 e TOWE et al. 24, quantificado utilizando um espectrofotómetro, e diluiu-se com água estéril, isenta de ADN para atingir 20 ng por reacção. Bacterianas genes 16S rRNA foram amplificadas com primers 331F e 797R e sonda BacTaq 25 e 16S archaeal genes rRNA foram amplificadas com primers Arch 349F e Arch 806R e a sonda TM Arch 516F 26 sob as seguintes condições: 95 ° C durante 600 segundos seguido por 45 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 60 segundos, e 72 ° C durante 25 seg, com extensão final a 40 ° C durante 30 seg. Todas as reacções foram conduzidas qPCR em duplicado. Os volumes de reacção de 20 ul incluídos 20 ng de ADN, 10 pM de iniciadores, 5 uM de sonda, e 10 ul da mistura de reacção qPCR. normas for qPCR bacteriana e archaea foram preparadas usando ADN genómico de Pseudomonas fluorescens e Halobacterium salinarum, respectivamente. Ambos foram cresceu até à fase log. As contagens foram realizadas e o ADN foi isolado a partir das culturas. O ADN genómico foi quantificada com um espectrofotómetro com o pressuposto de um e seis cópias do gene 16S rRNA por genoma de H. salinarum e P. fluorescens, respectivamente 27-28. número de cópias dos genes de bactérias e archaea foram calculados com base na curva padrão, log-transformada em conta as especificidades desiguais entre tratamentos, e avaliados por análise de variância.

Composição da comunidade foi determinada por sequenciamento do gene 16S rRNA usando células de fluxo e tecnologias de amplificação ponte e analisar as comunidades com insights quantitativos em ecologia microbiana "(QIIME) 29. Para a frente e reverso lê foram unidas e depois sequências foram filtrados, indexado,e representantes de alta qualidade foram selecionados para unidades taxonômicas operacionais (OTU) cessão de novo através de um alinhamento de sequência com uma base de dados de referência. sequências alinhadas foram comparados com um banco de dados de referência separado para atribuição taxonômica. Uma tabela OTU nível filo foi criado para determinar a composição da comunidade em geral.

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Protocol

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1. Preparação Equipamentos e Permafrost Coleção Núcleo

  1. Preparação de equipamento e coleta de amostra de campo e equipamentos de preservação
    1. Montar trado para coleta de amostras, inserindo o adaptador de unidade no topo do barril e girando a alavanca para travá-lo no lugar. Pin o tubo de adaptador para o adaptador de unidade e fixe o motor no tubo adaptador. Insira os cortadores no barril.
    2. Usar ternos de luz dever, luvas de borracha nitrílica e máscaras para reduzir qualquer contaminação das amostras. Use protetores de ouvido e um capacete de segurança para a segurança ao entrar no túnel do Permafrost (Figura 1).
    3. Entre no túnel e selecione um local para recolher as amostras (Figura 1B).
      Nota: Para a localização da perfuração vertical ou horizontal, seleccionar uma área onde não é conhecida a evidência de que o material é congelado (por exemplo, gelo ou gelo permanente), não há grande sistemas radiculares conhecidas, e não há cascalho conhecida. Deletar tudovivendo material vegetal da área antes de coletar uma amostra. Se a perfuração vertical ou horizontalmente, selecionar uma área que é relativamente plana e acessível com a broca.
    4. Prepara-se uma estação de trabalho por camadas do solo com um material plástico que foi esterilizada com isopropanol a 70%, solução de ADN de descontaminação, e a solução de descontaminação de RNase.
    5. Coloque um diâmetro de 10 centímetros de cloreto de polivinilo (PVC) de corte de tubos em meio longitudinalmente na estação de trabalho para proporcionar uma calha para segurar os núcleos à medida que são removidos a partir do sem-fim. Descontaminar o tubo de PVC com 70% de isopropanol, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase.
    6. Perto da estação de trabalho, descontaminar o trado por aspersão com 70% isopropanol, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase. Remover soluções do sem-fim com um wipe.
  2. Gelo e permafrost coleta e armazenamento do núcleo
    1. Escolha de uma área da parede de amostra (ver 1.2.1Nota).
    2. Descontaminar cerca de 10 cm de diâmetro da área de parede congelada esfregando-o com 70% isopropanol, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase.
    3. Elevar a verruma descontaminado para a área de interesse tal que é perpendicular à área da amostra e começar a perfurar a face feita de a parede (Figura 1C, D).
    4. Remova cuidadosamente a broca da área de coleta de amostras. Desligue a broca do motor e coloque o trado acima do tubo de PVC estéril na estação de trabalho limpa. Cuidadosamente incline trado de tal forma que os núcleos congelados deslizar para fora sobre o tubo de PVC estéril (Figura 1E).
    5. Descontaminar luvas com 70% isopropanol, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase.
    6. Pegar os núcleos de gelo e permafrost com luvas estéreis e colocá-los em sacos estéreis.
    7. Coloque os núcleos em um quarto mais frio ou frio até que sejam enviados ou processados.
    8. ShPI, os núcleos congeladas usando gelo seco para mantê-las a uma temperatura inferior a 0 ° C.
    9. Imediatamente armazenar os núcleos a -80 ° C.

2. Permafrost and Ice núcleo de processamento

  1. preparação do material
    1. Prepare, folha estéril nucleico ácido livre de pesados ​​de alumínio, prateleiras de metal, vidro, pinças metálicas e lã de vidro por aquecimento em um forno a 450 ° C durante 4 h. Separe estes materiais até ser utilizado.
    2. Esterilizar 95% de etanol e água ultrapura, passando as soluções através de um filtro de 0,22 um.
    3. solução de etanol Armazenar a -20 ° C e água a 4 ° C.
    4. Esterilizar uma régua de plástico por aspersão com etanol a 70%, solução de ADN de descontaminação, e uma solução de ARNase a descontaminação e limpando imediatamente depois de cada solução.
  2. Preparação Cultura bacteriana
    1. Prepare caldo e placas de crescer Serratia marcescens.
      1. Para o caldo, misture 5 g tryptone, 1 g de glucose, 5 g de extracto de levedura, e 1 g de fosfato dibásico de potássio, e em seguida, adicionar água destilada para atingir um L. Para fazer placas, adicionar 15 g de ágar à mistura acima. Para caldo e placas, ajustar o pH a 7 e autoclave a 121 ° C durante 15 min.
    2. Preparar a solução salina de fosfato desbastado 1x (PBS) através da combinação de 8 g de cloreto de sódio, 0,2 g de cloreto de potássio, 1,44 g de fosfato dibásico de sódio, e 0,24 g de fosfato monobásico de potássio e adicionando água destilada para atingir 800 ml. Ajustar o pH para 7,4 e adicionando água destilada, para chegar a um L. autoclave a 121 ° C durante 15 min.
    3. Inocular caldo com uma ansa estéril por imersão na S. marcescens cultura que foi previamente armazenado congelado a -80 ° C. Sob condições assépticas, diluído em série da cultura através da adição de 1 ml de cultura a 9 ml de PBS e manualmente inverter a solução. Adicionar 1 ml desta diluição para 9 ml de PBS e inverter manualmente a solução. Repita mais oito vezes até que um Dilu 10 -9ção é atingido.
    4. Espalhe os 10 -6, 10 -7, 10 -8, -9 e 10 soluções em placas de agar com a distribuição de 1 ml de caldo na placa e espalhar com um espalhador de célula. Faça isso em triplicado por diluição. Armazenar a cultura original a 4 ° C.
    5. Incubar as placas a 30 ° C durante 24 h. Contar o número de colónias para calcular o número de células na cultura original. Nota: O número de colónias em cultura original vai depender da taxa de crescimento das bactérias.
    6. Pipetar 250 ul da cultura original para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril. Dilui-se a cultura original por adição de um volume suficiente de 1x PBS para se obter aproximadamente 10 9 culas / ml, tal como determinado por contagem de colónias na etapa anterior. Agregar as células num tubo de microcentrífuga por centrifugação a 2500 xg durante 10 min.
      Nota: O volume de PBS 1x irá variar dependendo da taxa de crescimento das bactérias.
    7. Numa biohood estéril, Pipeta fora do caldo e voltar a suspender as células em 1 ml de 1x tampão PBS. Armazenar a 4 ° C até à sua utilização ou cerca de dois meses.
    8. No dia de processamento, dilui-se a S. marcescens cultura a partir do passo 2.2.7, adicionando 1 ml de S. inicial marcescens cultura para 39 mL de 1x tampão PBS num tubo de centrífuga de 50 ml.
  3. Prepare espaço da sala fria para processamento de núcleo e engrenagem preservação
    1. Antes de refrigeração da câmara fria, paredes limpas, pisos e mesa de metal com uma solução de água sanitária 1%.
    2. Ajustar a temperatura da sala fria para cerca de -11 ° C.
    3. Uma vez que a sala fria atingiu a temperatura desejada, usam ternos leves dever, luvas de borracha nitrílica e máscaras para reduzir qualquer contaminação para o quarto frio e as amostras.
      Nota: Dois indivíduos adequadamente vestidos são necessários para este procedimento.
    4. Traga os materiais estéreis (por exemplo, uma folha de alumínio, prateleiras de metal, vidros, bandeja, S. marcescens cultura e milâmina crotome) e as amostras para a sala fria e coloque sobre a mesa estéril.
  4. Permafrost e processamento núcleo de gelo em uma instalação de sala fria
    1. Coloque um núcleo permafrost em uma folha estéril, nucleico ácido livre de papel alumínio.
    2. Levemente inocular o exterior do núcleo com a cultura diluída de S. marcescens usando um tampão de espuma estéril (Figura 2B).
    3. Coloque o núcleo no rack de metal estéril que fica acima de uma bandeja.
    4. Esterilizar a lâmina de aço micrótomo com etanol a 70%, solução de ADN de descontaminação, e a solução de descontaminação de RNase.
    5. Tem Individual A borracha nitrílica limpo luvas com etanol a 70%, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase e mantenha núcleo em um ângulo de 45 ° acima da bandeja.
    6. Tem Pessoa B raspe cerca de 5 mm do lado de fora de todo o núcleo, incluindo as extremidades, usando a lâmina estéril, enquanto Individual A transforma o núcleo depois de cada raspagem ( 3A, B). Limpar a lâmina com etanol a 70%, solução de ADN de descontaminação, e a solução de descontaminação de RNase conforme necessário.
    7. Tem Pessoa B derramar esterilizada por filtração de 95% de etanol sobre o núcleo com cuidado e rapidamente, enquanto Individual A transforma o núcleo como a solução é vertida (Figuras 2D, 3C).
    8. Tem Individual B lavar imediatamente o núcleo com água esterilizada por filtração.
    9. Substitua rack de metal usado na bandeja com um novo rack de metal estéril.
    10. Tem Individual A limpar suas luvas de borracha nitrílica com etanol 70%, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase e mantenha o núcleo em um ângulo de 45 ° acima da bandeja.
    11. Tem Individual B pulverizar todo o núcleo com uma solução de DNA de descontaminação.
    12. Tem Individual B lavar imediatamente o núcleo com água esterilizada por filtração.
    13. Tem Individual B pulverizar todo o núcleo com uma solução de descontaminação RNase.
    14. tem Individual B lavar imediatamente o núcleo com água esterilizada por filtração.
    15. Coloque o núcleo em uma folha estéril de papel alumínio e leve embrulhar.
  5. núcleo externo Thaw
    1. Colocar uma armação de metal estéril sobre um prato de vidro esterilizada num biohood estéril com fluxo laminar.
    2. Colocar duas placas de agar específicos para S. marcescens no prato de vidro abaixo da cremalheira estéril para recolher o líquido a partir do núcleo (Figura 2E).
    3. Coloque o núcleo no rack de metal estéril.
    4. Permitir que cerca de 2-5 mm da superfície exterior do núcleo a descongelar a 23 ° C (em média, isto irá ocorrer dentro de cerca de 10 min). Ligue o núcleo de aproximadamente 90 ° a cada 2 min.
    5. Swab toda a superfície do núcleo usando uma pinça estéril e lã de vidro estéreis e inocular duas placas de ágar específico para S. marcescens por raspagem estes materiais na superfície das placas. Inocular duas novas placas com a cultura original utilizado para lubrificar o exterior donúcleo, que foi exposta às temperaturas baixas da sala fria.
    6. Medir as dimensões exteriores do núcleo cilíndrico descongeladas colocando uma régua estéril perto, mas não tocar o núcleo.
    7. Coloque o núcleo em grande saco estéril e armazená-lo a -80 ° C.
  6. Verifique para o crescimento
    1. Incubar as placas de agar a 23 ° C durante uma semana.
    2. Examine placas de ágar para o crescimento de S. colónias marcescens.
      1. Se não houver colónias visíveis na placa, vá para o passo 2.5.3.
      2. Se colónias aparecem na placa, repita a partir do passo 2.1.1 na secção 2 "Permafrost e processamento núcleo de gelo".
    3. Obter o núcleo do congelador e assepticamente transferi-lo para um saco estéril.
    4. Armazenar o núcleo num saco estéril, a 4 ° C durante cerca de 24-48 h para descongelar todo o núcleo.

3. Obter Subamostra de Ácido Nucleico Extração de gelo Cores e Permafrost

  1. extração de ácidos nucléicos de núcleos de gelo
    1. Misturar o material descongelado a partir do núcleo de gelo agitando suavemente o saco (Figura 2G).
    2. Deite o material descongelado para um recipiente estéril com um filtro de 0,22 um sob vácuo para recolher os microrganismos.
    3. Assepticamente remover o filtro com uma pinça estéril e colocá-lo em um 2 ml talão tubo de cerâmica estéril (1,4 mm).
    4. Armazenar o filtro a -80 ° C.
  2. extração de ácidos nucléicos de núcleos de permafrost
    1. Misturar o material descongelado a partir do núcleo permifrost por amassar suavemente o saco.
    2. Após o permafrost tem sido bem misturada, obter uma subamostra de solo em massa aproximadamente 0,5 g com um scoopula estéril e colocá-lo em um estéril 2 ml tubo de cerâmica talão tampa de rosca tarado (1,4 mm) que fica em pé sobre uma balança.
    3. subsamples armazenar a -80 ° C.
    4. Obter conteúdo de água gravimétrica de amostras.
      1. Medir 10 g do permafrost com um sterile scoopula e coloque em uma lata tarado numa balança. Medir a massa molhada do permafrost e estanho.
      2. Incubar permifrost num forno regulado a 105 ° C durante 24 h. Medir a massa seca de permafrost e estanho.
      3. Calcular o teor de água gravimétrica subtraindo a massa húmida de permifrost por a massa seca do permifrost e dividindo pela massa seca de gelo permanente.
    5. permifrost armazenar a -80 ° C.

4. Extraia Nucleic Acids de permafrost e gelo Cores

  1. preparação do material
    1. Prepare frascos âmbar para manter soluções por tratamento com 0,1% de dietilpirocarbonato (DEPC), incubação O / N a 37 ° C, e autoclavagem.
    2. Preparar tampão 240 mM de solução de fosfato de potássio. Adicionar 2. 5 g de fosfato monobásico de potássio e 38,7 g de fosfato de potsio dibico. Ajustar o volume final para 500 ml por adição de água estéril.
    3. Prepare brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB) buf extracçãofer por dissolução de 4,1 g de cloreto de sódio em 80 ml de água e adicionando lentamente 10 g de CTAB, aquecendo e agitando. Ajustar o volume final para 100 ml por adição de água estéril.
    4. Adicionar igual volume de solução de tampão fosfato e tampão CTAB e filtro de esterilização com um filtro de 0,22 um. Cobrir garrafa com folha de alumínio e armazenar a RT.
    5. Preparar solução 1,6 M de cloreto de sódio (NaCl) pela combinação de 9,35 g de NaCl e 100 ml de água estéril. Adiciona-se 10 g de polietileno glicol 8000 para a solução e filtra-se esterilizar de NaCl 1,6 M. Armazenar a 4 ° C.
  2. Extracção de ácido nucleico de acordo com uma versão modificada de Griffiths et al. 22 e TOWE et al. 23
    1. Usar ternos de luz dever, luvas de borracha nitrílica, e máscaras. espaço de laboratório limpo e pipetas com etanol a 70%, solução de DNA descontaminação e solução de descontaminação RNase.
    2. Remover subamostra (filtro de núcleo de gelo ou amostra de solo permafrost) em 2 ml talão de cerâmica parafuso-catubo de p de -80 ° C congelador e descongelar à temperatura ambiente.
    3. Adicionar 0,5 ml de brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB) tampão de extração e vortex brevemente.
    4. Adicionar 0,5 ml de álcool-fenol-clorofórmio isoamílico (25: 24: 1) (pH 8) e agitar tubos horizontalmente durante 10 minutos utilizando uma placa de painel plano em um agitador.
    5. Seguindo-grânulo batimento, tubos de centrífuga a 16.100 xg durante 5 min a 4 ° C.
    6. Remover a camada aquosa para um novo tubo esterilizado de 1,5 mL e misturar com um volume igual de clorofórmio-álcool isoamílico (24: 1). Centrifuga-se a 16100 xg durante 5 min a 4 ° C.
    7. Remover a camada aquosa para um novo tubo esterilizado de 1,5 mL e adicionar dois volumes de 30% de polietileno glicol 8.000 e 1,6 M de NaCl. Incubar durante 2 horas a 4 ° C.
    8. Centrifuga-se a 16100 xg durante 10 min a 4 ° C.
    9. Lave o peletizado de ácido nucleico com cerca de 500 mL de gelo-etanol frio a 70% e centrifugar a 16100 xg durante 10 min a 4 ° C.
    10. Ar sedimento seco num biohood estéril durante 2 hr. Ressuspender em 50 ul de tampão TE de DNase / RNase-free (pH 8,0). ADN está pronto para aplicações a jusante, tais como PCR e qPCR.
    11. Determinar a concentração de ADN com um espectrofotómetro.
    12. Dilui-se o ADN com água estéril, isenta de ADN para atingir 20 ng por reacção.

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Representative Results

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O método apresentado poderia ser utilizado para descontaminar amostras congeladas recolhidas de vários ambientes cryosphere, a partir de gelo glacial para permafrost. Aqui, apresentamos os dados especificamente recolhidos a partir de amostras de gelo e permafrost coletados a partir da Pesquisa de Engenharia e Centro de Desenvolvimento - Cold Regiões Laboratório de Pesquisa e Engenharia (ERDC-CRREL) Permafrost túnel localizado na Fox, AK (Figura 1A e 1B). O túnel Permafrost estende aproximadamente 110 m no lado de Goldstream vale e fornece acesso ao gelo rico silte e aluviões 30-31. Amostras de uma cunha de gelo e solo congelado foram cuidadosamente recolhidos em triplicado das paredes do túnel, em 24 de Outubro de 2014. No momento da amostragem, a temperatura da parede do permafrost era -2,9 ° C. As amostras foram coletadas a partir de um recurso cunha de gelo de aproximadamente 27 m do portal do túnel, e no solo congelado a 35 m e 60 m deo portal do túnel (Figura 1C e 1D). Um cuidado especial foi tomado durante a coleta de amostras para limitar a contaminação das amostras de gelo e permafrost (Figura 1E). Os núcleos congelados foram tratados de acordo com nosso protocolo de descontaminação (Figura 2) e transportadas em gelo seco para o laboratório de microbiologia do solo CRREL em Hanover, NH para processamento.

Todos os núcleos foram processados ​​utilizando o protocolo descrito na secção 2, utilizando lâminas estéreis micrótomo e as soluções (Figura 3A, B e C). O objectivo deste estudo foi o extracto com êxito os ácidos nucleicos endógenos das amostras congeladas para determinar as comunidades microbianas presentes no momento em que o material foi depositado. O protocolo de descontaminação foi avaliada por dopagem os núcleos com uma cultura diluída de Serratia marcescens e, em seguida, examinando as placas de Petri para o crescimento de popaer os núcleos foram tratados 31. A ausência de S. marcescens colónias indicam que os microrganismos exógenos foram adequadamente removidos a partir da porção exterior do núcleo. No entanto, a ausência de colónias não iria indicar se o ADN exógeno foi removido a partir da porção exterior do núcleo. Portanto, sequenciado amostras do núcleo de gelo para verificar se há DNA de Serratia sp. Porque abundância microbiana na cunha de gelo foi provavelmente significativamente menor do que no permifrost, foram utilizados os núcleos de gelo para determinar se o DNA a partir de S. marcescens estaria presente seguindo o protocolo de descontaminação. Se os núcleos não foram devidamente descontaminada, então sequências relacionadas com S. marcescens seria esperado estar presente nas amostras. A Figura 4 mostra a baixa diversidade bacteriana dentro do núcleo de gelo a partir de 16S rRNA resultados da sequenciação do gene. Sequências relacionadas com Pseudomonas sp., Do filo Gammaproteobacteria, dominou a sampl geloes. Membros relacionados com Planctomycetia também estavam presentes no gelo, mas em menor grau. De particular interesse é a ausência de Serratia sp. Nos resultados da sequenciação, indicando que o protocolo de descontaminação suficientemente removidos de DNA exógeno.

Além disso, existe um risco adicional de contaminação durante a extracção de ácidos nucleicos. esboços de extracção negativos foram utilizados para revelar a contaminação a partir de ácidos nucleicos exógenos. O ADN das amostras e os controlos negativos foram amplificados usando qPCR. dados mostraram que o qPCR permifrost bactérias nutria, mas archaea não foram detectados na permifrost (Tabela 1). Descontaminação bem sucedida foi ainda evidenciado pela falta de produtos de amplificação bacterianas ou Archaea, em espaços de extracção, em conjunto com a amplificação positiva dos controlos, Pseudomonas fluorescens e Halobacterium salinarum (Tabela 1). a abundAnce medições revelaram que não houve diferenças significativas na abundância bacteriana entre os núcleos recolhidos a 35 m a partir do portal, em comparação com os 60 m de núcleos (Tabela 1). A pesquisa em curso está sendo conduzida para determinar se a composição da comunidade microbiana foi diferente entre os núcleos.

figura 1
Figura 1. Os pontos de amostragem perto de Fairbanks, AK. (A) Mapa de Fairbanks, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html), (B) ERDC-CRREL Permafrost Túnel, (C) coleção de núcleos permafrost usando a broca SIPRE, (D) vista do sem-fim de entrar parede permafrost, e (e) preparar o núcleo para arquivamento. por favor clique aqui para ver uma maior version desta figura.

Figura 2
Figura 2. Diagrama esquemático de descontaminação de material congelado. (A) O material congelado (por exemplo, núcleos de gelo ou gelo permanente do núcleo) é processada numa sala fria. (B) É propositadamente contaminado com uma cultura bacteriana. (C) O núcleo é raspada com uma lâmina de micrótomo estéril para remover a porção exterior de 5 mm. (D) Uma série de soluções são aplicadas para descontaminar ainda mais a porção exterior da amostra. DDS indica solução de DNA descontaminação e RDS indica solução de descontaminação RNase. (E) Ao colocar o núcleo em um biohood estéril realizada à RT, a 2-5 mm exterior do material descongela. O líquido que escorre do gelo ou permafrost é recolhido em placas de Petri e o núcleo é esfregada e banhado para verificar se o núcleo foi adequadamente descontaminados. (F e G) Se o crescimento bacteriano não for detectado, em seguida, o núcleo é descongelado a 4 ° C em um recipiente estéril. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Purificação dos núcleos de gelo permanente na sala fria sob condições estéreis. (A) Remover a camada exterior do núcleo permifrost com uma lâmina de metal micrótomo por raspagem. (B) Uma visão mais próxima de um arranhão. (C) Solução de lavagem para descontaminar a camada exterior do núcleo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

conteúdo "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Figura 4
Figura 4. sequências microbianas a partir das amostras de cunha de gelo. Gráfico de barras que mostra a abundância relativa média de filos de bactérias presentes nas amostras de cunha de gelo por porcentagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1
Tabela 1. A abundância bacteriana no permafrost. Resultados qPCR mostrando a abundância de bactérias nas amostras de permafrost e espaços de extração associados. Os valores na tabela são apresentados como média ± erro padrão. n é o número de amostras. ND indica não detectado.

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A criosfera oferece acesso a organismos preservados que persistiram sob condições ambientais do passado. Embora a taxa recuperado pode não representar a comunidade histórica completa, aqueles recuperados a partir de análise de amostras de gelo e permafrost glacial pode render valiosas informações históricas sobre seleccionar períodos de tempo 15-16. Por exemplo, a informação biológica significativa foi elaborado a partir de estudos de gelo que investigam atividade anaeróbica no gelo da Groenlândia 20 e estudos de permafrost que investigam processos de ciclagem de carbono como resultado do degelo 33 e forneceram uma visão sobre a diversidade fúngica de permafrost em Beringia 16. coleta de amostra adequada e descontaminação deve ocorrer antes de realizar a jusante análises para investigar as comunidades biológicas dentro destes materiais congelados. Mesmo que estas etapas têm implicações significativas na interpretação dos dados, muitos estudos não oferecem detalhes específicos sobre como as amostras were coletadas e processadas ou imagens mostrando como lidar com os materiais congelados. Por exemplo, estudos anteriores dopado a porção exterior de núcleos com microesferas fluorescentes ou bactérias conhecidas 15, embora as concentrações exactas de estes materiais não foram descritos. Outros estudos têm descrito protocolos de descontaminação em detalhe, mas não têm aplicado alto rendimento análises para testar a eficácia da metodologia 15, 32. Por conseguinte, um rastreio detalhado de bactérias intactas e ADN exógena através de crescimento em placas de Petri e qPCR foi usada para determinar se a recolha da amostra, preservação, e procedimentos analíticos foram estéril suficiente para identificar as comunidades microbianas presentes nos materiais congelados.

Este protocolo foi modificado para isolar com sucesso material genético de interesse a partir de núcleos antigos. Cuidados como usando equipamento específico e descontaminação suprimentos devem ser tomadas durante a coleta, processamento e extratoião de os núcleos já que a contaminação pode ocorrer em qualquer passo. Além disso, o transporte dos núcleos com gelo seco ou um agente de arrefecimento comparável é imperativa porque, se os núcleos de descongelar durante o trânsito, em seguida, há uma propensão mais elevada que os contaminantes da região externa do núcleo pode migrar para a porção interior do núcleo. Para minimizar ainda mais o potencial de contaminação, considere recolher núcleos maiores, com um sem-fim motorizada em vez de um núcleo de pressão. Descobrimos que os núcleos de pressão eram muito pequenos para descontaminar corretamente na etapa de raspagem. Alternativamente, um maior volume de amostra pode ser extraída a partir dos núcleos maiores, o que é especialmente importante para as amostras com uma baixa abundância de material biológico. Além disso, o volume maior proporciona mais espaço para o erro de tal modo que se Serratia marcescens são detectadas colónias em placas, em seguida o núcleo é suficientemente grande para ser processado de novo.

Várias fontes foram testados para determinar a mais eficientemétodo para descontaminar os núcleos. Por exemplo, folha de alumínio estéril, em vez de pratos de vidro ou de materiais plásticos, que são autorizadas para o núcleo para ser colocado sobre uma superfície estéril rapidamente e facilmente. Além disso, fontes não-tradicionais, como uma prateleira de metal e uma bandeja provou ser benéfico para permitir que os materiais exteriores raspadas a acumular-se longe do núcleo, para diminuir o risco de contaminação de re-os núcleos. Nas iterações anteriores do protocolo, a raspagem ocorreu numa superfície plana, o que aumentou o risco de contaminação. Finalmente, sacos estéreis, em vez de pratos de vidro, verificou-se ser favorável para misturar e armazenar as amostras.

Este protocolo foi alvejado para eliminar microorganismos e ácidos nucleicos na porção exterior dos núcleos congelados. Enquanto o isopropanol e o etanol são desinfectantes eficazes, eles não remover os ácidos nucleicos. Portanto, foram usadas soluções que removem os ácidos nucleicos e enzimas associados a partir da porção exterior dos núcleos. estas soluções são comumente usados ​​para eliminar os ácidos nucléicos e nucleases associados de suprimentos e equipamentos de laboratório. Ao testar a sua eficácia em superfícies de laboratório, a solução de RNA descontaminação removido materiais mais exógenos do que a solução de descontaminação de DNA 34. Usando nucleases para descontaminar a parte externa do núcleo pode não ser sempre o método preferido porque materiais genéticos de interesse pode também ser removido a partir de amostras com uma baixa abundância de um organismo particular. Em particular, o material genético armazenado no gelo e no gelo durante períodos de tempo prolongados sofrem degradação. Uma vez que os microorganismos estão em uma abundância elevada nestas amostras do Alasca, a preocupação de que as soluções iria remover uma proporção elevada de materiais genéticos endógenos foi grandemente reduzido. No entanto, o cuidado deve ser tomado ao usar soluções que contêm nucleases para garantir que os ácidos nucléicos que foram severamente degradados ou são a partir de organismos em baixa abundância não são removidos poras nucleases.

A ausência de S. marcescens colónias nas placas de Petri fornecida confiança de que as células intactas foram removidas a partir da porção exterior dos núcleos de gelo permanente. Além disso, a análise de núcleos de gelo que foram submetidos ao mesmo protocolo não apresentaram sequências detectáveis ​​relacionados com S. marcescens. Resultados da sequência revelou que apenas Pseudomonas foram detectadas nestas amostras, apesar de ambos Pseudomonas sp. e Serratia sp. estão dentro da classe Gammaproteobacteria. Juntos, a ausência do S. marcescens colónias em placas de Petri e a ausência de produtos de amplificação de ADN de qPCR sugerem que os núcleos foram congelados descontaminado com êxito. Por isso, os microrganismos foram detectados provável incorporado no material congelado, em vez de contaminação a partir de perfuração ou o processamento dos núcleos. Outras técnicas de perfuração incluem a perfuração hidráulica para penetrar no solo ou gelo em maiores profundidades. Embora este método would seja benéfico para investigar baixa abundância microbiano nestes ambientes oligotrofismo, não revela se os fluidos de perfuração seria removida com sucesso. Além disso, se for alta sequenciação rendimento não é parte da análise a jusante, as reacções de PCR específicos de segmentação S. marcescens deve ser utilizada para amplificar o ADN extraído.

Os resultados do nosso exemplo de conjunto de dados mostrou que o DNA genómico intacto foi extraído com êxito a partir dos materiais congelados. Além disso, ambos os cunha abrigava bactérias gelo e no gelo, como evidenciado por qPCR e sequenciação, respectivamente. O permafrost descontínua do Alasca a partir deste estudo continha número de bactérias semelhantes como permafrost no ártico elevado canadense de 35, embora as amostras do Alasca continha uma ordem de magnitude menos bactérias do que o permafrost do planalto tibetano na província de Qinghai, China 36 e solos camada / permafrost ativos de Nunavut, Canadá 37. Semelhante a um icunha ce coletadas em Nunavut, Canadá 37, sequências relacionadas com Gammaproteobacteria, especificamente Pseudomonas, que são comuns aos solos e metabolicamente diversificada, dominou a cunha de gelo do Alasca neste estudo. Na verdade, Katayama et al. 11 bactérias isoladas dentro do filos Actinobacteria, Bacilos, e Gammaproteobacteria de uma das cunhas de gelo do permafrost Tunnel ERDC-CRREL. Estes estudos confirmam a detecção de Gammaproteobacteria neste estudo. Planctomycetia, que são comuns a amostra aquático, também foram detectados no cunha gelo. Estes organismos foram encontrados em solos camada ativa acima permafrost no nordeste da Sibéria 38, além de permafrost no planalto tibetano em Qinghai, China 39.

Muitos estudos têm investigado a presença de archaea, particularmente methanogens, no permafrost, com a noção de que, como o derretimento do permafrost, methanogens provavelmente vai se tornar mais ativo, contribuir para o efluxo de metano para a atmosfera 21, 33-34. Surpreendentemente, archaea não foram detectados nas amostras de cunha de gelo ou permafrost do Alasca embora ambos Euryarchaeota e Crenarchaeota foram encontrados no permafrost do ártico elevado canadense 17 e methanogens foram encontrados em amostras de permafrost da tundra ártica da Rússia 21.

materiais congelados abrigar microorganismos antigos, fornecendo um registro de processos biogeoquímicos que ocorreram muitos milhares de anos atrás. Esta biodiversidade é de grande interesse sob o regime de aquecimento do clima atual, porque os microorganismos que antes eram restritos no ambiente criosfera pode se libertar quando os materiais congelados descongelar. A fim de identificar com confiança a biodiversidade abrigado nestes materiais congelados, os solos congelados e amostras de gelo deve ser devidamente tratados e descontaminados. Aqui, apresentamos um protocolo para remover as células estrangeiras e DNA a partir de amostras congeladas para ensure que os microrganismos foram detectados a partir do material, em vez de contaminação a partir de perfuração ou o processamento dos núcleos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Auger Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK
70% Isopropanol Walmart 551116880
95% Ethyl Alcohol (denatured)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA A407-4
DNA decontamination solution, DNA Away Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA 7010
RNase decontamination solution, RNase Away Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA  7002
Light Duty Suits Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 10606
Nitrile Gloves Fisher Scientific, Pittsburgh, PA FFS-700
Antiviral Masks Curad, Walgreens CUR3845
Sterile Sample Bags  Nasco, Fort Atkinson, WI B01445
Steel Microtome Blade  B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC
Metal Rack Fabricated at CRREL, Hanover, NH
Tray Handy Paint Products, Chanhassen, MN 7500-CC
Aluminum Foil Western Plastics, Temecula, CA
500 ml Bottle with 0.22 μm Filter Corning, Corning, NY 430513
Serratia marcescens ATCC, Manassas, VA 17991
Biosafety Hood NuAire, Plymouth, MN NU-425-400
Petri Dish Fisher Scientific, Pittsburgh, PA FB0875712
ATCC Agar 181- Tryptone Acros Organics, NJ 61184-5000
ATCC Agar 181- Glucose Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP381-500
ATCC Agar 181- Yeast Extract Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP1422-500
ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate JT Baker, Phillipsburg, NJ 3252-01
ATCC Agar 181- Agar Difco, Sparks, MD 214530
NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE
Lightcycler 480 System Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN
Halobacterium salinarum American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Pseudomonas fluorescens American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
Microbial DNA Isolation Kit MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 12224-50
Ear Protection Elvex EP-201
Hard Hat
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34705
Glass Wool Pyrex 430330
Ruler
Weighing Tin  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 08-732-100
Sodium chloride Sigma Aldrich, St Louis, MO S-9625
Potassium chloride JT Baker, Phillipsburg, NJ 3040-04
Potassium phosphate, monobasic JT Baker, Phillipsburg, NJ  3246-01
Potassium phosphate, dibasic JT Baker, Phillipsburg, NJ 3252-01
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP332-500
50 ml Centrifuge Tubes Corning, Corning, NY 4558
2 ml Microcentrifuge Tubes MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 1200-250-T
2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 13113-50
Scoopula Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE 1437520
Balance Ohaus, Parsippany, NJ E12130
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich, St Louis, MO D5758
Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB)  Acros Organics, NJ 22716-5000
Polyethylene glycol 8000  Sigma Aldrich, St Louis, MO P5413-1KG
Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP1752-400
Centrifuge Eppendorf, Hauppauge, NY 5417R
Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) Sigma Aldrich, St Louis, MO C0549-1PT
TE Buffer Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE AM9860
Pipets Rainin, Woburn, MA Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets
Pipet tips Rainin, Woburn, MA Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl
Vortexor Scientific Industries, Bohemia, NY G-560
Vortex Adaptor MoBio Laboratories, Carlsbad, CA 13000-V1
Clear Bottle Corning, Corning, NY C1395500
Amber Bottle Corning, Corning, NY C5135250
Bottle Top Filters, 0.22 µm Corning, Corning, NY 430513
60 ml Syringe Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ BD 309653
Millex Syringe filters, 0.22 μm EMD Millipore, Billerica, MA SLGV033RB
70% Ethanol Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP2818-500 diluted & filter sterilized
Isotemp 100 L Oven Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 151030511
Cell Spreader Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 08-100-10
Disposable Inoculating Loops Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-363-602

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Remoção de materiais exógenos da parte exterior dos núcleos congelados para investigar a antiga comunidades biológicas abrigava Dentro
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Barbato, R. A., Garcia-Reyero, N., Foley, K., Jones, R., Courville, Z., Douglas, T., Perkins, E., Reynolds, C. M. Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside. J. Vis. Exp. (113), e54091, doi:10.3791/54091 (2016).More

Barbato, R. A., Garcia-Reyero, N., Foley, K., Jones, R., Courville, Z., Douglas, T., Perkins, E., Reynolds, C. M. Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside. J. Vis. Exp. (113), e54091, doi:10.3791/54091 (2016).

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