Summary
La criosfera ofrece acceso a los organismos conservados que persistieron en las condiciones ambientales del pasado. Un protocolo se presentará a recoger y descontaminar los núcleos de permafrost de suelos y hielo. La ausencia de colonias exógenos y el ADN sugiere que los microorganismos detectados representan el material, en lugar de la contaminación de la perforación o de procesamiento.
Introduction
La criosfera (por ejemplo, los suelos de permafrost, características hielo, nieve glacial, firn y hielo) ofrece una visión de qué tipos de organismos persistido en las condiciones ambientales del pasado. Dado que estos sustratos pueden ser de decenas a cientos de miles de años de antigüedad, sus comunidades microbianas, cuando se conservan congeladas desde el depósito, reflejar las condiciones ambientales antiguos. Para analizar adecuadamente estos ecosistemas y extraer información biológica significativa de los suelos congelados y el hielo, la correcta recogida y procesamiento de las muestras congeladas es necesario. Esto es de suma importancia que las proyecciones climáticas para el siglo 21 indican la posibilidad de un calentamiento pronunciado en las regiones árticas y subárticas 1. En concreto, se espera que Alaska interior y Groenlandia para calentar aproximadamente a 5 ° C y 7 ° C, respectivamente, para el año 2100 2,3. Se espera que un impacto significativo en el suelo y las comunidades microbianas acuáticos y, por tanto, relacionadaprocesos biogeoquímicos. Se espera que las temperaturas más cálidas y alteración del régimen de precipitación para iniciar la degradación del permafrost en muchas áreas 2-5 que podría dar lugar a una más gruesa, descongelado estacionalmente (activo) capa 6,7, el deshielo de los suelos congelados, y el derretimiento del hielo cuerpos masivos como hielo del suelo, cuñas de hielo, y la segregación de hielo 8. Esto cambiaría drásticamente los atributos biogeoquímicos, además de la biodiversidad de plantas y animales en estos ecosistemas.
El hielo glaciar y las características de los sedimentos del permafrost y hielo syngenetic han atrapado evidencia biológica de un entorno que representa lo que vivía allí en el momento de las características químicas y forman. Por ejemplo, en Alaska interior, tanto Illinoisan y Wisconsin permafrost de edades están presentes, y dicha permafrost, en particular, ofrece lugares únicos que datan de lo moderno a 150.000 años antes del presente (aap) que contienen evidencia biológica y geoquímica de la IMPAct de los cambios climáticos pasados en la biodiversidad. Como resultado, estos sedimentos proporcionan un registro de la biogeoquímica y la biodiversidad durante muchos miles de años. Puesto que el área tiene bajas tasas de sedimentación y nunca se ha glaciación, muestras inalteradas son accesibles para la recogida y el análisis, ya sea de perforación vertical en el perfil del suelo o de perforación horizontal en los túneles. Más importante aún, existen extensos registros que, sobre todo resaltar las características únicas de permafrost biogeoquímicos en esta región 9-14. En concreto, la aplicación del análisis de ADN para estimar la presencia y extensión de la biodiversidad en las dos muestras de hielo y permafrost existentes y antiguas permite la exploración de la conexión entre las condiciones ambientales y de hábitat antiguos de ocupación por parte de organismos específicos.
Estudios previos han identificado los impactos climáticos en mamíferos, plantas y microorganismos de muestras que datan de 50k aap 11, 15-19, aunque cada estudio utilizó una diferent metodología para recolectar y descontaminar el permafrost o hielo núcleos. En algunos casos, los núcleos de perforación se esterilizaron 16, 20-21, aunque la metodología específica no aclaró si los ácidos nucleicos extranjeros también fueron eliminados de las muestras. En otros estudios, aislamientos bacterianos 15 (por ejemplo, Serratia marcescens), así como microesferas fluorescentes 22 se han utilizado para medir la eficacia de los procedimientos de descontaminación.
Este experimento fue parte de un estudio más amplio que investiga las comunidades microbianas de muestras de permafrost que datan de aproximadamente 40k aap. El objetivo específico de esta parte del estudio era para descontaminar éxito de hielo y permafrost núcleos. Hasta donde sabemos, no existe una metodología ha integrado el uso de soluciones diseñadas para eliminar los ácidos nucleicos extraños y nucleasas asociados de la parte exterior de los núcleos congelados. Esto a pesar del hecho de que estas soluciones son commonly utilizado para descontaminar el equipo de laboratorio para experimentos moleculares.
Una vez que se descontaminan los núcleos, se extrajo ADN genómico utilizando los protocolos desarrollados por Griffiths et. Al 23 y Töwe et al. 24, cuantificado usando un espectrofotómetro, y se diluyó con agua estéril, libre de ADN para lograr 20 ng por reacción. Bacterianas 16S rRNA genes se amplificaron con cebadores 331F y 797R y la sonda BacTaq 25 y 16S arqueas rRNA genes se amplificaron con cebadores Arco 349F y Arco 806R y sondear TM Arco 516F 26 bajo las siguientes condiciones: 95 ° C durante 600 segundos seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 60 seg, y 72 ° C durante 25 seg con extensión final a 40 ° C durante 30 seg. Todas las reacciones de qPCR se llevaron a cabo por duplicado. Los volúmenes de reacción de 20 l incluyeron 20 ng de DNA, 10 mM de los cebadores, 5 mM de la sonda, y 10 l de la mezcla de reacción qPCR. normas for qPCR bacteriano y archaeal se prepararon utilizando el ADN genómico de Pseudomonas fluorescens y salinarum Halobacterium, respectivamente. Ambos fueron cultivadas hasta la fase logarítmica. Los recuentos de placas se llevaron a cabo y se aisló el ADN de los cultivos. El ADN genómico se cuantificó con un espectrofotómetro con la suposición de uno y seis copias del gen 16S rRNA por genoma de H. salinarum y P. fluorescens, respectivamente 27-28. número de copias de los genes bacterianos y archaeal se calcularon sobre la base de la curva estándar, log-transformados para dar cuenta de desigualdad de las diferencias entre los tratamientos, y se evaluaron mediante ANOVA.
Composición de la comunidad se determinó mediante la secuenciación del gen 16S rRNA utilizando células de flujo y las tecnologías de amplificación de puentes y el análisis de las comunidades con las ideas 'cuantitativos en la ecología microbiana' (QIIME) 29. Hacia adelante y hacia atrás dice estaban unidas entre sí y luego secuencias se filtraron, se indexan,y se seleccionaron los representantes de alta calidad para la asignación de novo unidades taxonómicas operacionales (OTU) a través de la alineación de secuencias con una base de datos de referencia. Alineado secuencias se compararon con una base de datos de referencia independiente para la asignación taxonómica. Una tabla OTU nivel phylum fue creado para determinar la composición de la comunidad en general.
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Protocol
1. Equipo de Preparación y Core Collection permafrost
- la preparación del equipo y la recogida de muestras de campo y equipo de conservación
- Montar la barrena para la recogida de muestras insertando el adaptador de unidad en la parte superior del barril y la rotación de la palanca para bloquearlo en su sitio. Pin el tubo adaptador en el adaptador de la unidad y el pin del motor sobre el anillo adaptador. Inserte los cortadores en el cañón.
- Llevar trajes ligeros Los guantes de nitrilo, y máscaras para reducir la contaminación de las muestras. Use protección para los oídos y un casco de seguridad al entrar en el túnel del permafrost (Figura 1).
- Entrar en el túnel y seleccione una ubicación para recoger las muestras (Figura 1B).
Nota: Para la ubicación de la perforación vertical u horizontal, seleccione una zona donde no se conoce evidencia de que el material se congela (por ejemplo, el hielo o permafrost), no hay grandes sistemas de raíces conocidas, y no hay grava conocida. Eliminar todoviviendo material vegetal de la zona antes de obtener la muestra. Si la perforación vertical u horizontalmente, seleccione un área que es relativamente plana y accesible con la barrena. - Preparar una estación de trabajo por capas de suelo con un material plástico que ha sido esterilizada con 70% de isopropanol, la solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa.
- Colocar un 10 cm de diámetro de cloruro de polivinilo (PVC) de corte del tubo en la mitad longitudinalmente en la estación de trabajo para proporcionar un canal para contener los núcleos, ya que se eliminan de la barrena. Descontaminar el tubo de PVC con un 70% de isopropanol, solución descontaminante de ADN, y la solución de descontaminación RNasa.
- Cerca de la estación de trabajo, la descontaminación de la barrena rociándolo con isopropanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa. Retire las soluciones de la barrena con un trapo.
- El hielo y el permafrost recogida y almacenamiento de núcleos
- Seleccionar un área de la pared de la muestra (véase 1.2.1Nota).
- Descontaminar aproximadamente 10 cm de diámetro del área de la pared congelada frotándola con isopropanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa.
- Elevar la barrena descontaminado para el área de interés tal que es perpendicular a la zona de la muestra y comenzar la perforación en la cara limpia de la pared (Figura 1C, D).
- Retirar con cuidado el tornillo de la zona de recogida de muestras. Desconectar la barrena desde el motor y colocar el tornillo sin fin por encima de la tubería de PVC estéril en la estación de trabajo limpia. Incline con cuidado la barrena de tal manera que los núcleos congelados se deslizan sobre el tubo de PVC estéril (Figura 1E).
- Descontaminar los guantes con isopropanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa.
- Recoger los núcleos de hielo y permafrost con guantes estériles y colocarlos en bolsas estériles.
- Coloque los núcleos en una habitación más fresca o fría hasta que sean enviados o procesados.
- ship los núcleos congelados utilizando hielo seco para mantenerlos a una temperatura por debajo de 0 ° C.
- Inmediatamente almacenar los núcleos a -80 ° C.
2. El permafrost y Procesamiento de núcleo de hielo
- Preparación de materiales
- Preparar, libre de lámina estéril de ácido nucleico de aluminio de alta resistencia, bastidores de metal, vidrio, unas pinzas de metal, y lana de vidrio por cocción en un horno a 450 ° C durante 4 horas. Ponga a un lado estos materiales hasta su uso.
- Esterilizar 95% de etanol y agua ultrapura haciendo pasar las soluciones a través de un filtro de 0,22 micras.
- Almacenar la solución de etanol a -20 ° C y agua a 4 ° C.
- Esterilizar una regla de plástico mediante pulverización con etanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de RNasa descontaminación y limpiar inmediatamente después de cada solución.
- Preparación bacteriana Cultura
- Preparar el caldo y placas de crecer Serratia marcescens.
- Para el caldo, se combinan 5 g intentoptone, 1 g de glucosa, 5 g de extracto de levadura, y 1 g de fosfato dibásico de potasio, y agua destilada a continuación, añadir para llegar a 1 L. Para hacer las placas, añadir 15 g de agar a la mezcla anterior. Para caldo y placas, ajustar el pH a 7 y autoclave a 121 ° C durante 15 min.
- Preparar la solución salina pulimentado fosfato 1x (PBS) mediante la combinación de 8 g de cloruro de sodio, 0,2 g de cloruro de potasio, 1,44 g de fosfato dibásico de sodio, y 0,24 g de fosfato de potasio monobásico y añadir agua destilada para llegar a 800 ml. Ajustar el pH a 7,4 y añadir agua destilada hasta llegar a 1 L. autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
- Inocular caldo con un asa estéril mediante la sumersión en el S. cultura marcescens que anteriormente se almacenaron congeladas a -80 ° C. En condiciones asépticas, diluido en serie del cultivo mediante la adición de 1 ml de cultivo a 9 ml de PBS y se invierte manualmente la solución. Añadir 1 ml de esta dilución a 9 ml de PBS e invertir manualmente la solución. Repita ocho veces más hasta un Dilu 10 -9ción se alcanza.
- Extender los 10 -6, -7 10, 10 -8, -9 y 10 soluciones sobre discos de agar mediante la distribución de 1 ml de caldo sobre la placa y la difusión con un esparcidor de células. Para ello, por triplicado por cada dilución. Almacenar la cultura original a 4 ° C.
- Incubar las placas a 30 ° C durante 24 horas. Contar el número de colonias para calcular el número de células en el cultivo original. Nota: El número de colonias en el cultivo original dependerá de la tasa de crecimiento de las bacterias.
- Pipetear 250 l de la cultura original en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Diluir cultivo original mediante la adición de un volumen suficiente de la 1x PBS para obtener aproximadamente 10 9 células / ml como se determina por recuento de colonias en el paso anterior. Sedimentar las células en un tubo de microcentrífuga por centrifugación a 2500 xg durante 10 min.
Nota: El volumen de PBS 1x variará en función de la tasa de crecimiento de las bacterias. - En una biohood estéril, Pipetear fuera el caldo y resuspender las células en 1 ml de 1x tampón de PBS. Almacenar a 4 ° C hasta su uso o aproximadamente dos meses.
- En el día del tratamiento, se diluye la S. cultura marcescens de la etapa 2.2.7 mediante la adición de 1 ml de la S. originales cultura marcescens a 39 ml de 1x tampón de PBS en un tubo de centrífuga de 50 ml.
- Preparar el caldo y placas de crecer Serratia marcescens.
- Preparar el espacio cuarto frío para el procesamiento de núcleo y equipo de conservación
- Antes de enfriar la habitación fría, paredes limpias, plantas, y una mesa de metal con una solución de lejía al 1%.
- Ajuste la temperatura de la habitación fría a aproximadamente -11 ° C.
- Una vez que el cuarto frío ha alcanzado la temperatura deseada, llevar trajes servicio liviano, guantes de nitrilo, y máscaras para reducir cualquier contaminación a la sala fría y las muestras.
Nota: Se requieren dos individuos vestidos adecuadamente para este procedimiento. - Trae los materiales estériles (por ejemplo, papel de aluminio, bastidores de metal, vidrio, bandeja, S. marcescens cultura, y microtomo cuchilla) y muestras en la cámara frigorífica y el lugar en la mesa estéril.
- Permafrost y procesamiento de muestras de hielo en una instalación de cuarto frío
- Coloque un núcleo de permafrost en una hoja estéril, libre de ácido nucleico de papel de aluminio.
- Ligeramente inocular el exterior del núcleo con el cultivo diluido de S. marcescens usando un tapón de espuma estéril (Figura 2B).
- Coloque el núcleo de la rejilla de metal estéril que se encuentra por encima de una bandeja.
- Esterilizar la hoja microtomo de acero con 70% de etanol, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa.
- Tener individuo una guantes de nitrilo limpia con etanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa y mantenga núcleo en un ángulo de 45 ° por encima de la bandeja.
- Tiene individual B raspar suavemente aproximadamente 5 mm de la parte exterior de todo el núcleo, incluyendo los extremos, utilizando la cuchilla estéril mientras Particular Un gira el núcleo después de cada raspadura (
- Tiene individual B verter etanol al 95% esterilizada por filtración sobre el núcleo cuidadosa y rápidamente, mientras Particular Un gira el núcleo como se vierte la solución (Figuras 2D, 3C).
- Tiene individual B enjuague inmediatamente el núcleo con agua esterilizada por filtración.
- Instale la parrilla de metal utilizado en la bandeja con una nueva rejilla de metal estéril.
- Tiene particular Un limpiar sus guantes de nitrilo con etanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa y mantener el núcleo en un ángulo de 45 ° por encima de la bandeja.
- Tiene individual B rociar todo el núcleo con una solución descontaminante de ADN.
- Tiene individual B enjuague inmediatamente el núcleo con agua esterilizada por filtración.
- Tiene individual B rociar todo el núcleo con una solución de descontaminación RNasa.
- tener IndividuAl B enjuague inmediatamente el núcleo con agua esterilizada por filtración.
- Coloque el núcleo en una hoja de papel de aluminio estéril y ligeramente envolver.
- núcleo externo deshielo
- Coloque una rejilla metálica estéril sobre una placa de vidrio estéril en un biohood estéril con flujo laminar.
- Coloque dos placas de agar específicos para S. marcescens en el plato de cristal por debajo de la rejilla estéril para recoger el líquido del núcleo (Figura 2E).
- Coloque el núcleo de la rejilla de metal estéril.
- Deje aproximadamente 2-5 mm de la superficie exterior del núcleo se descongele a 23 ° C (en promedio, esto ocurrirá dentro de aproximadamente 10 minutos). Gire el núcleo de aproximadamente 90 ° cada 2 min.
- Limpie toda la superficie del núcleo usando pinzas estériles y lana de vidrio estéril e inocular dos placas de agar específico para S. marcescens en muestras de secreciones de estos materiales sobre la superficie de las placas. Inocular dos nuevas placas con la cultura original utilizado para dopar el exterior de lanúcleo, que se expuso a las bajas temperaturas de la cámara fría.
- Medir las dimensiones exteriores de núcleo cilíndrico descongelado mediante la colocación de una regla estéril cerca de, pero sin tocar el núcleo.
- Coloque el núcleo en gran bolsa estéril y almacenarlo a -80 ° C.
- Compruebe para el crecimiento
- Incubar las placas de agar a 23 ° C durante una semana.
- Examinar las placas de agar para crecimiento de S. colonias marcescens.
- Si no hay colonias visibles en la placa, continúe en el paso 2.5.3.
- Si colonias aparecen en la placa, repita desde el paso 2.1.1 de la sección 2 "permafrost y procesamiento de muestras de hielo".
- Obtener el núcleo del congelador y asépticamente transferirlo a una bolsa estéril.
- Almacenar el núcleo en una bolsa estéril a 4 ° C durante aproximadamente 24-48 horas para descongelar todo el núcleo.
3. Obtener la submuestra para la extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras de hielo y permafrost
- extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras de hielo
- Mezclar el material descongelado a partir del núcleo de hielo agitando suavemente la bolsa (Figura 2G).
- Verter el material descongelado en un recipiente estéril con un filtro de 0,22 micras a vacío para recoger microorganismos.
- Asépticamente quitar el filtro con pinzas estériles y colocarlo en un tubo estéril de grano de cerámica 2 ml (1,4 mm).
- Guarde el filtro a -80 ° C.
- Extracción de ácido nucleico a partir de núcleos de permafrost
- Mezclar el material descongelado desde el núcleo permafrost amasando suavemente la bolsa.
- Después de que el permafrost se ha mezclado bien, obtener una submuestra de aproximadamente 0,5 g de suelo con una mayor scoopula estéril y colocarlo en un estériles de 2 ml tubo de cerámica del grano con tapón de rosca tarado (1,4 mm) que se encuentra en posición vertical sobre una balanza.
- submuestras almacenar a -80 ° C.
- Obtener el contenido de agua gravimétrica de muestras.
- Medir 10 g del permafrost con una estérile scoopula y colocar en un molde tarado en una balanza. Medir la masa húmeda de permafrost y estaño.
- Incubar permafrost en un horno a 105 ° C durante 24 horas. Medir la masa seca del permafrost y estaño.
- Calcular el contenido de agua gravimétrica restando la masa húmeda del permafrost por la masa seca del permafrost y dividiendo por la masa seca del permafrost.
- permafrost almacenar a -80 ° C.
4. Extraer los ácidos nucleicos de permafrost y hielo Núcleos
- preparación de la materia
- Preparar viales de color ámbar para contener soluciones mediante el tratamiento con 0,1% de dietilo (DEPC), incubando O / N a 37 ° C, y la esterilización en autoclave.
- Preparar la solución tampón de fosfato de potasio 240 mM. Añadir 2. 5 g de fosfato monobásico de potasio y 38,7 g de fosfato dibásico de potasio. Ajustar el volumen final de 500 ml mediante la adición de agua estéril.
- Preparar bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) buf extracciónfer disolviendo 4,1 g de cloruro de sodio en 80 ml de agua y añadiendo lentamente 10 g CTAB mientras se calienta y se agita. Ajustar el volumen final de 100 ml mediante la adición de agua estéril.
- Añadir volúmenes iguales de solución de tampón fosfato y tampón CTAB y esterilizar por filtración con un filtro de 0,22 micras. Cubra la botella con papel de aluminio y se almacena a temperatura ambiente.
- Preparar la solución de 1,6 M de cloruro de sodio (NaCl) mediante la combinación de 9,35 g de NaCl y 100 ml de agua estéril. Añadir 10 g de polietilenglicol 8000 a la solución y filtro esterilizar 1,6 M NaCl. Almacenar a 4 ° C.
- Extracción de ácido nucleico de acuerdo con una versión modificada de Griffiths et al. 22 y Töwe et al. 23
- Llevar trajes ligeros Los guantes de nitrilo, y máscaras. espacio de laboratorio limpia y pipetas con etanol al 70%, solución de descontaminación de ADN, y la solución de descontaminación RNasa.
- Retire submuestra (filtro de núcleo de hielo o muestra de suelo permafrost) en 2 ml de perlas de cerámica de tornillo-cap tubo de -80 ° C congelador y descongelar a temperatura ambiente.
- Añadir 0,5 ml de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) de tampón de extracción y agitar brevemente.
- Añadir 0,5 ml de alcohol de fenol-cloroformo-isoamílico (25: 24: 1) (pH 8) y agitar los tubos en posición horizontal durante 10 min utilizando un adaptador de panel plano en un vórtice.
- Después de grano-late, tubos de centrifugación a 16.100 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Eliminar la capa acuosa a un nuevo tubo estéril de 1,5 ml y se mezcla con un volumen igual de cloroformo-alcohol isoamílico (24: 1). Centrifugar a 16.100 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Eliminar la capa acuosa a un nuevo tubo estéril de 1,5 ml y añadir dos volúmenes de 30% de polietilenglicol 8000 y 1,6 M NaCl. Incubar durante 2 horas a 4 ° C.
- Centrifugar a 16.100 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Lavar pellet de ácido nucleico con aproximadamente 500 l de etanol al 70% enfriado en hielo y centrifugar a 16.100 xg durante 10 min a 4 ° C.
- pellet se seque al aire en un biohood estéril durante 2 horas. Resuspender en / tampón TE RNasa libre de DNasa 50 l (pH 8,0). ADN está listo para aplicaciones posteriores tales como PCR y qPCR.
- Determinar la concentración de ADN con un espectrofotómetro.
- Diluir ADN con agua estéril, libre de ADN para lograr 20 ng por reacción.
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Representative Results
El método presentado podría ser utilizado para la descontaminación de muestras congeladas recogidas de varios ambientes criosfera, de hielo glacial a permafrost. A continuación, presentamos los datos recogidos específicamente a partir de muestras de hielo y permafrost recogidos de la Investigación Centro de Ingeniería y Desarrollo - Regiones de Investigación Fría y Laboratorio de Ingeniería (ERDC-CRREL) permafrost túnel situado en Fox, AK (Figura 1A y 1B). El túnel del permafrost se extiende aproximadamente 110 m en el lado de Goldstream valle y proporciona acceso a hielo ricos sedimentos y aluviones 30-31. Las muestras de una cuña de hielo y suelo congelado fueron cuidadosamente recogidos por triplicado de las paredes del túnel, el 24 de octubre de 2014. En el momento del muestreo, la temperatura de la pared del permafrost era -2.9 ° C. Se recogieron muestras de una característica de cuña de hielo de aproximadamente 27 m de la entrada al túnel, y el suelo congelado a 35 my 60 m deel portal del túnel (Figura 1C y 1D). Se tuvo especial cuidado durante la recogida de muestras para limitar la contaminación del hielo y permafrost núcleos (Figura 1E). Los núcleos congelados se trataron según el protocolo de descontaminación (Figura 2) y transportado en hielo seco al laboratorio de microbiología del suelo CRREL en Hanover, NH para su procesamiento.
Todos los núcleos se procesaron utilizando el protocolo descrito en la Sección 2 usando cuchillas de micrótomo estériles y soluciones (Figura 3A, B, y C). El objetivo de este estudio fue extraer con éxito los ácidos nucleicos endógenos de las muestras congeladas para determinar las comunidades microbianas presentes en el momento en que se deposita el material. El protocolo de descontaminación se evaluó mediante el dopado los núcleos con una cultura diluida de Serratia marcescens y luego examinar las placas de Petri para el crecimiento de popaer los núcleos fueron tratados 31. La ausencia de S. colonias marcescens indicaron que los microorganismos exógenos se eliminaron correctamente desde la parte exterior del núcleo. Sin embargo, la ausencia de colonias no indicaría si el ADN exógeno se eliminó de la parte exterior del núcleo. Por lo tanto, la secuencia de muestras del núcleo de hielo para comprobar si el ADN de Serratia sp. Debido a la abundancia microbiana en la cuña de hielo era probable es significativamente menor que en el permafrost, se utilizaron los núcleos de hielo para determinar si el ADN de S. marcescens estaría presente siguiendo el protocolo de descontaminación. Si los núcleos no fueron descontaminados correctamente, entonces secuencias relacionadas con S. sería de esperar marcescens a estar presentes en las muestras. La Figura 4 muestra la diversidad bacteriana bajo dentro del núcleo de hielo de 16S rRNA resultados de la secuenciación de genes. Secuencias relacionadas con Pseudomonas sp., Del phylum Gammaproteobacteria, dominó el sampl hieloES. Los miembros relacionados con Planctomycetia también estaban presentes en el hielo, pero en menor medida. De particular interés es la ausencia de Serratia sp. En los resultados de secuenciación, lo que sugiere que el protocolo de descontaminación suficientemente retirado de ADN exógeno.
Además, hay un riesgo adicional de contaminación durante la extracción de los ácidos nucleicos. espacios en blanco de extracción negativos se utilizan para revelar la contaminación de ácidos nucleicos exógenos. El ADN de las muestras y los controles negativos fueron amplificados utilizando qPCR. qPCR datos mostraron que el permafrost bacterias albergaba, pero arqueas no se detectaron en el permafrost (Tabla 1). Descontaminación exitosa se evidenció por la falta de amplicones bacterianas o archaeal en piezas en bruto de extracción, junto con la amplificación positiva de los controles, Pseudomonas fluorescens y Halobacterium salinarum (Tabla 1). el abundmediciones ANCE revelaron que no había diferencias significativas en la abundancia de bacterias entre los núcleos recogidos en 35 m desde el portal en comparación con los 60 m núcleos (Tabla 1). Se están llevando a cabo investigaciones en curso para determinar si la composición de la comunidad microbiana fue diferente entre los núcleos.
Figura 1. localizaciones de las muestras, cerca de Fairbanks, AK. (A) Mapa de colección, (B) ERDC-CRREL permafrost túnel, (C) de Fairbanks, AK (http://www.volunteer.noaa.gov/alaska.html) núcleos de permafrost utilizando el tornillo sin fin SIPRE, (D) vista de tornillo sin fin de entrar en la pared de permafrost, y (e) preparar el núcleo para su archivo. Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
Figura 2. Representación esquemática de la descontaminación de material congelado. (A) El material congelado (por ejemplo, núcleo de hielo o núcleo permafrost) se procesa en una habitación fría. (B) Se propósito contaminado con un cultivo bacteriano. (C) El núcleo se afeitó con una cuchilla de microtomo estéril para eliminar la parte exterior 5 mm. (D) una serie de soluciones se aplican a descontaminar aún más la parte exterior de la muestra. DDS indica solución de descontaminación ADN y RDS indica solución de descontaminación RNasa. (E) Al colocar el núcleo en una biohood estéril mantenido a TA, la exterior 2-5 mm del material se descongela. El líquido que gotea desde el hielo o el permafrost se recoge en placas de Petri y se limpió el núcleo y plateado para comprobar que el núcleo fue descontaminado correctamente. (F y G) Si no se detecta el crecimiento bacteriano, a continuación, el núcleo se descongela a 4 ° C en un recipiente estéril. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La descontaminación de los núcleos de permafrost en cámara frigorífica en condiciones estériles. (A) Eliminar la capa exterior del núcleo permafrost con una cuchilla de microtomo de metal raspando. (B) Una vista más cercana de una raspadura. (C) Solución de enjuague para descontaminar la capa exterior del núcleo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. secuencias microbianas a partir de las muestras de cuña de hielo. Gráfico de barras que muestra la abundancia relativa promedio de filos de bacterias presentes en las muestras de cuña de hielo en función del porcentaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. La abundancia bacteriana en el permafrost. QPCR resultados muestran la abundancia de bacterias en las muestras de permafrost y los espacios en blanco de extracción asociados. Los valores en la tabla se presentan como media ± error estándar. n es el número de muestras. ND indica no detectado.
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Discussion
La criosfera ofrece acceso a los organismos conservados que persistieron en las condiciones ambientales del pasado. A pesar de los taxones recuperado puede no representar la comunidad histórica completa, los recuperados a partir del análisis de las muestras de hielo y glaciares de permafrost es posible obtener valiosa información histórica acerca seleccione un intervalo de tiempo de 15-16. Por ejemplo, la información biológica significativa ha sido elaborado a partir de estudios que investigan la actividad anaeróbica de hielo en la capa de hielo de Groenlandia y 20 estudios de permafrost que investigan los procesos de reciclaje de carbono como resultado de descongelación 33 y han proporcionado información sobre la diversidad fúngica del permafrost en Beringia 16. recogida de muestras y descontaminación adecuadas deben ocurrir antes de la realización de los análisis de aguas abajo para investigar comunidades biológicas de estos materiales congelados. A pesar de que estas medidas tienen implicaciones importantes sobre la interpretación de los datos, muchos estudios no ofrecen detalles específicos sobre cómo las muestras wantes de la recogida y tratamiento o imágenes que muestran cómo manejar los materiales congelados. Por ejemplo, estudios previos han dopado la porción externa de núcleos con microesferas fluorescentes o bacterias conocidos 15, aunque las concentraciones exactas de estos materiales no se describieron. Otros estudios han descrito protocolos de descontaminación en detalle, pero no han aplicado de alto rendimiento análisis para probar la eficacia de la metodología 15, 32. Por lo tanto, se utilizó un estudio detallado de las bacterias intactas y ADN exógeno a través de crecimiento en placas de Petri y qPCR para determinar si la recogida de muestras, preservación y procedimientos analíticos fueron suficientes estéril para identificar comunidades microbianas presentes en los materiales congelados.
Este protocolo se ha modificado para aislar con éxito material genético de interés a partir de núcleos antiguos. Atención, tales como el uso de equipo específico y la descontaminación de los suministros debe ser tomada durante la recolección, procesamiento, y el extractoion de los núcleos ya que la contaminación podría ocurrir en cualquier paso. Por otra parte, el envío de los núcleos con hielo seco o un agente de enfriamiento comparable es imperativo porque si los núcleos se descongelan durante el tránsito, entonces hay una mayor propensión que los contaminantes de la región exterior del núcleo pueden migrar a la parte interior del núcleo. Para minimizar aún más el potencial de contaminación, considerar la recogida de núcleos más grandes con un sinfín motorizado en lugar de un núcleo de empuje. Se encontró que los núcleos de empuje fueron demasiado pequeños para descontaminar adecuadamente en la etapa de raspado. Alternativamente, un mayor volumen de muestra puede ser extraído de los núcleos más grandes, lo cual es especialmente importante para las muestras con una baja abundancia de material biológico. Además, el volumen más grande proporciona más espacio para el error de tal manera que si se detectan Serratia marcescens colonias en placas, a continuación, el núcleo es lo suficientemente grande para ser procesada de nuevo.
Varias fuentes se ensayaron para determinar la forma más eficientemétodo para descontaminar los núcleos. Por ejemplo, papel de aluminio estéril, en lugar de platos de vidrio o materiales plásticos, se admiten para el núcleo para ser colocado sobre una superficie estéril rápido y fácil. Además, los suministros no tradicionales, tales como una rejilla de metal y una bandeja demostró ser beneficiosa para que los materiales exteriores raspados se acumulen fuera del núcleo, disminuyendo el riesgo de recontaminación de los núcleos. En iteraciones anteriores del protocolo, el raspado se produjo en una superficie plana, lo que aumenta el riesgo de contaminación. Finalmente, bolsas estériles, en lugar de los platos de cristal, se encontraron para ser propicio para la mezcla y el almacenamiento de las muestras.
Este protocolo fue dirigido a eliminar los microorganismos y ácidos nucleicos en la porción exterior de los núcleos congelados. Mientras isopropanol y etanol son desinfectantes eficaces, no eliminan los ácidos nucleicos. Por lo tanto, se usaron soluciones que eliminan los ácidos nucleicos y enzimas asociadas de la parte exterior de los núcleos. estos Soluciones se utilizan comúnmente para eliminar los ácidos nucleicos y nucleasas asociados de suministros y equipo de laboratorio. Cuando se prueba su eficacia en las superficies de laboratorio, solución de ARN de descontaminación retira más materiales exógenos que la solución de descontaminación ADN 34. El uso de nucleasas para descontaminar la parte exterior del núcleo podría no ser siempre el método preferido ya que los materiales genéticos de interés también pueden ser removidos de las muestras con una baja abundancia de un organismo particular. En particular, el material genético almacenado en el permafrost y el hielo durante periodos de tiempo prolongados sufre degradación. Debido a que los microorganismos se encuentran en una alta abundancia en estas muestras de Alaska, la preocupación de que las soluciones se retire una alta proporción de materiales genéticos endógenos se redujo en gran medida. Sin embargo, se debe tener cuidado al usar soluciones que contienen nucleasas para asegurar que los ácidos nucleicos que han sido gravemente degradadas o sea de organismos en baja abundancia no se eliminan porlas nucleasas.
La ausencia de S. colonias marcescens en las placas de Petri proporcionan confianza en que las células intactas se retiraron de la parte exterior de los núcleos de permafrost. Por otra parte, el análisis de las muestras de hielo que se sometieron al mismo protocolo no mostró secuencias detectables relacionadas con S. marcescens. Resultados de la secuencia reveló que sólo Pseudomonas fueron detectados en estas muestras, a pesar de que tanto Pseudomonas sp. y Serratia sp. se encuentran dentro de la clase Gammaproteobacteria. Juntos, la ausencia de la S. colonias en las placas de Petri marcescens y la ausencia de amplicones de ADN de qPCR sugieren que los núcleos congelados fueron descontaminados con éxito. Por lo tanto, los microorganismos detectados probablemente se incrustan en el material congelado, más que la contaminación de la perforación o el procesamiento de los núcleos. Otras técnicas de perforación incluyen la perforación hidráulica para penetrar en el suelo o el hielo a mayores profundidades. Aunque este método would ser beneficioso para investigar baja abundancia microbiana en estos ambientes oligotróficos, que no revela si los fluidos de perforación se han eliminado correctamente. Además, si secuenciación de alto rendimiento no es parte del análisis de aguas abajo, las reacciones PCR específicas dirigidas a S. marcescens se deben utilizar para amplificar el ADN extraído.
Los resultados de nuestro conjunto de datos ejemplo demostraron que el ADN genómico intacto se extrajo con éxito a partir de los materiales congelados. Por otra parte, tanto en el permafrost y hielo cuña albergado bacterias, como se evidencia por qPCR y secuenciación, respectivamente. El permafrost discontinuo de Alaska de este estudio figuran el número de bacterias similares a los de permafrost en el Ártico canadiense de 35 años, a pesar de las muestras de Alaska contenían un orden de magnitud menor número de bacterias que el permafrost de la meseta del Tíbet, en la provincia de Qinghai, China 36 y activas suelos / capa de permafrost de Nunavut, Canadá 37. Similar a un icuña ce recogido en Nunavut, Canadá 37, secuencias relacionadas con Gammaproteobacteria, concretamente Pseudomonas, que son comunes a los suelos y metabólicamente diversa, dominó la cuña de hielo de Alaska en este estudio. De hecho, Katayama et al. 11 bacterias aisladas dentro del phyla Actinobacteria, bacilos, y Gammaproteobacteria de una de las cuñas de hielo desde el permafrost túnel ERDC-CRREL. Estos estudios corroboran la detección de Gammaproteobacteria en este estudio. Planctomycetia, que son comunes a la muestra acuático, también se detectaron en la cuña de hielo. Estos organismos se han encontrado en los suelos capa activa por encima de permafrost en Siberia nororiental 38, además de permafrost en la meseta tibetana en Qinghai, China 39.
Muchos estudios han investigado la presencia de arqueas, en particular los metanógenos, en el permafrost, con la idea de que como permafrost se derrite, los metanógenos probablemente llegarán a ser más activo, contriButing al flujo de salida de metano a la atmósfera 21, 33-34. Sorprendentemente, las arqueas no se detectaron en las muestras de Alaska cuña de hielo o permafrost, aunque ambos Euryarchaeota y Crenarchaeota fueron encontrados en el permafrost del Ártico canadiense alta 17 y metanógenos se encontraron en las muestras de permafrost de la tundra ártica en Rusia 21.
materiales congelados albergan microorganismos antiguos, proporcionando un registro de los procesos biogeoquímicos que ocurrieron hace muchos miles de años. Esta biodiversidad es de gran interés en el marco del régimen de calentamiento climático actual porque los microorganismos que alguna vez fueron restringidos en el entorno de la criosfera pueden llegar a ser liberada cuando los materiales congelados se descongelen. Con el fin de identificar con seguridad la biodiversidad albergado en estos materiales congelados, los suelos congelados y muestras de hielo deben ser adecuadamente manejados y descontaminados. A continuación, se presenta un protocolo para eliminar las células extrañas y ADN a partir de muestras congeladas a ensure que los microorganismos detectados fueron a partir del material, en lugar de la contaminación de la perforación o el procesamiento de los núcleos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | ||
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | ||
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | ||
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | ||
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | |||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | |||
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, and 1,000 µl pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1,000 µl | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22 µm | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 ml Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
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