Abstract
Nella chirurgia ricostruttiva, vi è una necessità clinica di un'alternativa ai metodi attuali di ricostruzione autologo che sono complessi, costosi e commercio un difetto per un altro. L'ingegneria dei tessuti mantiene la promessa di affrontare questa crescente domanda. Tuttavia, la maggior parte delle strategie di ingegneria tissutale non riescono a generare sostituti stabili e funzionali dei tessuti a causa della scarsa vascolarizzazione. Questo documento si concentra su una ingegneria dei tessuti modello in vivo della camera di vascolarizzazione intrinseca in cui un'arteria perfusione e una vena o come un ciclo artero o di una configurazione peduncolo a flusso continuo è diretto all'interno di una camera cava protetta. In questo sistema camerale basato germinazione angiogenica verifica dai vasi arterovenose e questo sistema attrae migrazione cellulare endogena ischemica e infiammatoria motore che riempie progressivamente spazio della camera con tessuto fibro-vascolare. cellula esogena / matrice impianto al momento della costruzione della camera migliora sur cellularevivenza e determina la specificità dei tessuti ingegnerizzati che si sviluppano. I nostri studi hanno dimostrato che questo modello camera può generare con successo diversi tessuti come grasso, muscolo cardiaco, fegato e altri. Tuttavia, sono necessarie modifiche e perfezionamenti per garantire tessuto bersaglio formazione è coerente e riproducibile. Questo articolo descrive un protocollo standardizzato per la realizzazione di due differenti modelli a camera ingegneria tissutale vascolarizzate in vivo.
Introduction
Fabbricazione del tessuto vascolarizzato funzionale utilizzando un approccio di ingegneria dei tessuti è un paradigma emergente nel campo della medicina rigenerativa. 1,2 Molti approcci di ingegnerizzare tessuti nuovi e sani per la sostituzione di tessuto danneggiato o organi difettosi sono stati sviluppati, 3-6 sperimentalmente in modelli animali di piccole dimensioni con promettente potenziale clinico. 7,8 Tuttavia, vascolarizzazione rimane una delle grandi sfide per l'ingegneria dei tessuti che limitano il potenziale per crescere tessuti di dimensioni clinicamente rilevante. 9
Gli attuali approcci per vascolarizzano tessuto seguire sia una via estrinseca in cui i nuovi vasi crescono da letto vascolare destinatario e invadono tutto il tessuto impiantato costruisce 10 o un percorso di vascolarizzazione intrinseca dove il sistema vascolare cresce e si espande in sintonia con il tessuto di recente sviluppo. 11 L'approccio estrinseca coinvolge tradizionalmente le cellule di semina su una impalcaturain vitro e impiantare il costrutto completo nella animale vivente con l'aspettativa che i nutrienti, in precedenza forniti da terreni di coltura, sarà acquistato dalla circolazione. 12,13 Il concetto è semplice come crescita interna vascolare è troppo lento e solo gli impianti molto sottili (< di spessore 1-2 mm) rimane valida. Fornire sostanze nutritive e ossigeno per mezzo di una vascolarizzazione sufficiente e rapida è al centro di tutti i tentativi riusciti a crescere sostituti tissutale più complesse e più grandi, come ossa, muscoli, grasso e gli organi solidi. 14,15 vascolarizzazione intrinseca offre il potenziale per costrutti più grandi per lo sviluppo dalla crescita di tessuto progressiva compatibile con la sua espansione apporto di sangue. Un disegno è l'impianto in vivo in una camera di un peduncolo vascolare con o senza un ponteggio seminato cellule. 5,6 Questo ha aperto la strada a nuove procedure per la generazione di tessuti intrinsecamente vascolarizzati spessi. 16,17 </ P>
Più recentemente, sono state sviluppate strategie di pre-vascolarizzano innesti di tessuto, prima dell'impianto. Queste reti dei vasi sanguigni incorporate hanno lo scopo di inosculate con vasi di accoglienza presso l'impianto consentono la rapida fornitura di un apporto di sangue completo per migliorare la sopravvivenza di tutte le parti di un innesto di tessuto spesso trapiantato. 18
Siamo stati pionieri di un vascolarizzato vivo modello in ingegneria dei tessuti nei piccoli animali che coinvolge una via sottocutanea impiantato semirigido camera chiusa contenente un peduncolo vascolare perfusione e biomateriali cellulari contenenti. La camera crea un ambiente ischemico che stimola sprouting angiogenico dai vasi impiantati. 3 Il peduncolo vascolare può essere un ciclo arterovenosa ricostruite o un'arteria flusso continuo intatta e vena. 3-6,19 This vascolari germogli peduncolari un funzionamento ed estesa artero rete -capillary-venosa che collega sia l'arteeriole e venoso si conclude con il peduncolo vascolare. 3,20, inoltre, la circostante camera di supporto cava protegge il tessuto in via di sviluppo da potenzialmente deformare forze meccaniche e prolunga l'unità ischemico per migliorare la vascolarizzazione. 3,21,22 Se il peduncolo nave è semplicemente impiantato in tessuto normale e non all'interno dello spazio protetto della camera, germinazione angiogenico cessa lungo la stessa timeline come una ferita normale e nessun nuovo tessuto si accumulano intorno al peduncolo. Gli investigatori hanno utilizzato questa configurazione in vivo per produrre costrutti di tessuto tridimensionali funzionali vascolarizzati con vascolarizzazione di sostegno e di dimensioni clinicamente rilevante. 4,23 Inoltre, i costrutti di tessuto vascolarizzate ingegnerizzati con il suo peduncolo vascolare intatto possono essere raccolti per il successivo trapianto presso il sito della lesione . 24,25 Uno scenario più clinicamente fattibile sarebbe la creazione della camera presso il sito definitivo per la ricostruzione sale come il petto. Così, questa de novo tessuto approccio ingegneristico potrebbe avere potenziale clinico di fornire una nuova fonte di tessuto bersaglio funzionale per la chirurgia ricostruttiva. 26-28
Il seguente protocollo fornirà una guida generale per costruire un vascolarizzati camera di ingegneria tissutale in vivo nel ratto, che potrebbe essere adattato in diversi modelli animali e impiegato per esaminare i processi complicati dell'angiogenesi, produzione della matrice, e la migrazione e la differenziazione cellulare.
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Protocol
I protocolli descritti qui sono stati approvati dal Comitato Etico Animal Hospital di Melbourne di San Vincenzo, in Australia, e sono state condotte in stretta aderenza alle linee guida Australian National sanità e ricerca medica del Consiglio.
NOTA: due protocolli della camera sono descritti di seguito. I due modelli diversi e loro disegni camera specifici sono illustrati in Figura 1. Sezione (1) è realizzato in policarbonato (per il modello camera di ciclo di ratto artero). È cilindrico con diametro interno 13 mm e altezza 4 mm. Una finestra a un certo punto nel muro consente l'accesso senza ostacoli per il peduncolo. Nel secondo modello (per flusso continuo ratto modello camera peduncolo), la camera è realizzata poliacrilici e è rettangolare (10 x dimensioni 8 x 4 mm 3 interne). Ha due aperture 1,5 mm sui lati opposti per accogliere l'arteria femorale e la vena quanto trasgrediscono la camera.
1. Rat artero-Loop Modello Camera (One Chamber per animale)
NOTA: Prima di iniziare l'intervento chirurgico, assicurarsi che tutti gli strumenti siano stati correttamente sterilizzati. Allo stesso modo, assicurano il resto strumenti su asciugamani sterili e sono ad una distanza ragionevole dal campo operatorio per evitare la contaminazione durante la procedura.
- Preparazione del Animal per la chirurgia
- Utilizzare ratti peso di almeno 250 g per le grandi dimensioni delle navi per la realizzazione del ciclo artero.
- Anestetizzare l'animale con il 4% inalazione isoflurano. Corroborare un'adeguata profondità dell'anestesia valutando refrattarietà alla punta-pizzico. Dopo l'anestesia, tenere l'animale adeguatamente anestetizzato durante tutta la procedura con il 2% isoflurano.
- Posto l'animale in posizione supina su un blocco riscaldante e applicare il lubrificante sterile per gli occhi per prevenire l'essiccamento durante l'intervento chirurgico.
- L'utilizzo di un rasoio elettrico, la barba sia inguini e rimuovere i capelli con un pezzo di garza umida.
- Preparare i siti chirurgici con clorexidina/ Soluzione di etanolo al 70% e drappeggio l'animale con teli sterili. Somministrare una singola dose di Carprofen (5 mg / kg, per via sottocutanea) come analgesico.
- Raccolta di vena femorale Graft
- Utilizzando una lama # 15, fare un lungo 4 cm incisione cutanea sulla all'inguine sinistro parallelo al legamento inguinale. Ciò espone il cuscinetto adiposo inguinale.
- Tagliare il cuscinetto adiposo circonferenziale con le forbici lasciandola attaccata al suo peduncolo vascolare sulla base dei vasi epigastrici.
- Utilizzando le forbici micro, liberare le aderenze del tessuto connettivo vaporosi tra la parete addominale e vasi femorali sottostanti.
- Posizionare un divaricatore sulla parete addominale e tirare mediale. Ciò espone il legamento inguinale e tutta la lunghezza dei vasi femorali.
- Utilizzando micro pinze e forbici curve sezionare la vena epigastrica e isolarlo dal suo grasso circostante tirando e taglio con delicatezza. Questa vena agisce come un tether nel costruire il ciclo.
- usinG Micro pinze e micro forbici curve aprire la guaina perivascolare che contiene i vasi femorali e dei nervi tutta la strada dal legamento inguinale alla sua distale biforcazione al ramo epigastrica.
- Utilizzando micro pinze, prendere la vena femorale per la sua avventizia e delicatamente separarlo dai tessuti circostanti e di accompagnamento delle arterie. Fare questo con una pinza micro e curve micro forbici rotonde punte tirando il tessuto a parte e taglio attraverso di essa.
NOTA: Non afferrare tutto lo spessore della parete venosa come questo potrebbe causare traumi alla intima che lo rende incline alla trombosi. - rami laterali legare trovato durante la dissezione con 10/0 sutura in nylon o coagulano con un coagulatore bipolare.
- Con la vena femorale completamente libero, legare la sua estremità prossimale e distale con 4/0 punti di sutura in seta. Assicurarsi di ottenere una vena innesto di almeno 10 mm di lunghezza e comprende circa 0.5 cm Lunghezza del ramo epigastrica per essere usato come un tether corda ragazzoper tenere l'anello aperto nella camera.
- Utilizzando pinze micro e micro forbici diritte, tagliare l'avventizia dalla estremità del trapianto tirando e tagliando delicatamente. Questo può essere fatto anche in seguito, prima di anastomosi microchirurgiche.
- Lavare l'innesto della vena con soluzione fisiologica eparinizzata (10 U / ml di eparina) e lasciare riposare nella soluzione. Chiudere la ferita con funzionamento continuo 4/0 sutura di seta più due o tre ulteriori semplici punti interrotti.
- Creazione di arterovenose Loop e l'impianto della Camera
- Ripetere i passaggi da 1.2.1 a 1.2.4 in esattamente allo stesso modo sull'arto controlaterale.
- Utilizzando micro pinze, sezionare e isolare sia l'arteria epigastrica e la vena formare il cuscinetto adiposo circostante. Per fare ciò, tirando delicatamente il tessuto lontano da vasi
- Utilizzando micro pinze, prendere l'arteria femorale dal suo avventizia e liberarla dai tessuti circostanti. Fare questo con una pinza micro e curvo mic rotonda punteforbici ro tirando il tessuto a parte e taglio attraverso di essa. Legare o coagulare i suoi rami laterali.
- Legare l'arteria femorale e la vena distale alla nascita dei vasi epigastrici utilizzano 4/0 di seta di sutura.
- Posizionare un morsetto prossimalmente su ciascuna arteria femorale e la vena. Utilizzando un forte dritto micro forbice, fare una trasversale pulito tagliato in ogni distale nave alla nascita dei rami epigastrico. Posizionare un contrasto di fondo di plastica sterile sotto i vasi.
- Lavare le navi energicamente con abbondante soluzione salina eparinizzata finché tutto il sangue viene rimosso dal lume.
- Portare l'innesto della vena nel campo operatorio e rimuovere eventuali avventizia esubero dalle estremità delle navi di cui al punto 1.2.10, se necessario.
- Eseguire entrambe le anastomosi microchirurgiche con 10/0 sutura in nylon. Anastomose l'estremità prossimale della vena graft alla vena femorale e l'estremità distale all'arteria femorale. Questo permetterà al sangue di fluire fROM arterioso al lato venoso senza resistenza dalle valvole all'interno del trapianto vena.
NOTA: Assicurarsi che i vasi femorali e della vena trapianto resto nella loro posizione naturale, senza colpi di scena. - Controllare eventuali perdite in entrambi i siti anastomosi. Risolvere piccole perdite, che sembrano non pulsante il sangue che esce dal sito anastomotico, mettendo un piccolo pezzo di grasso sulla parte superiore e delicatamente compressione per 5-10 min. Grandi perdite pulsanti che rapidamente inondano l'intero campo avranno bisogno di punti di sutura aggiuntivi.
- Controllare la pervietà del ciclo artero-venosa. occlusione Gentle dell'arteria femorale dovrebbe rendere termoretraibile mentre la stessa nella vena femorale dovrebbe engorge esso.
- Posizionare la base della camera di ingegneria dei tessuti sotto il ciclo arterovenosa con quest'ultimo riposo nella sua posizione naturale senza torsioni o piegature.
- Fissare la base della camera al legamento inguinale e sottostante fascia muscolare con 6/0 punti di sutura in nylon.
- Mettere il coperchio sopra ilbase in modo che i vasi femorali entrano nella camera attraverso una tacca (finestra nel lato della camera). Quando si chiude il coperchio, assicurarsi che cattura i rami epigastrico, tra la base e il coperchio della camera, che agiscono come pastoie di tenere l'anello artero-venosa in posizione.
- Chiudere la ferita con funzionamento continuo 4/0 sutura di seta più due o tre ulteriori semplici punti interrotti.
- Lasciare che l'animale per recuperare da anestesia su un blocco di riscaldamento.
- Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Allo stesso modo, non restituiscono un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. 24 ore più tardi, somministrare un'altra dose singola di Carprofen (5 mg / kg, per via sottocutanea) come analgesico.
- Trattare la ferita con attualità pomata antibiotica per 5 giorni. Se la ferita è aperta, anestetizzare l'animale come al punto 1.1.2 tramite 1.1.5 e chiudere la ferita come in 1.3.14. Monitorare la salute di animali al giorno. Eutanasia l'animale con una dose letale di iniezione lethabarb intraperitoneale (163 mg / kg a 0,25 ml per 23 ago G) se l'animale mostra più di segni moderati di inacitivity, scarso appetito, perdita di peso e perdita di colore.
2. flusso continuo Pedicle Camera (due camere per animale)
- Preparazione del Animal per la chirurgia
- Ripetere i passaggi 1.1.1 tramite 1.1.4. Due camere possono essere impiantati in entrambe le regioni all'inguine di un singolo topo.
- Isolamento di vasi femorali e inserimento di sezione
- Ripetere i passaggi 1.2.1 tramite 1.2.8.
- Con entrambi arteria e vena completamente liberata tessuti circostanti e loro rami ligato, portare la camera nel campo operatorio.
- Mettere ciascuno dei vasi femorali intatte sulla corrispondente feritoia della base della camera assicurandosi che non vi siano torsioni o curvature.
- Chiudere la camera da attaching il coperchio alla base. Chiudere la ferita utilizzando funzionamento continuo 4/0 sutura seta più di due o tre ulteriori semplici punti interrotti e permettere all'animale di recuperare come precedentemente descritto.
3. Raccolta delle Camere e la lavorazione dei tessuti
- Una volta punti di tempo dell'esperimento (4-6 settimane post-impianto) vengono raggiunti, anestetizzare l'animale come al punto 1.1.2 e 1.1.3 ripetere i passaggi attraverso 1.1.5.
- Aprire la ferita con una lama # 15 e tagliare i tessuti con le forbici finché la camera è completamente esposto.
- Esporre i vasi femorali prossimale al costrutto e di prova per la pervietà vascolare: occlude delicatamente il vaso con due microforceps, poi il latte il sangue in una direzione distale e, infine, rilasciare il forcipe prossimali. Se la nave si riempie di sangue nuovo, ciò conferma la pervietà. Legare i vasi femorali prossimalmente nel caso del ciclo artero ed entrambi prossimale e distale nel caso di the flow-through configurazione e rimuovere le camere con il tessuto contenente in blocco.
- Alla fine dell'esperimento, eutanasia l'animale con una dose letale di iniezione lethobarb intraperitoneale (163 mg / kg in 0,25 ml per 23 ago G).
- Fissare tessuti in paraformaldeide 4% a temperatura ambiente per 24 ore. Tessuti dividere in più sezioni trasversali (1-2 mm di spessore) e incorporare in cera di paraffina o composto ottimale temperatura di taglio per le sezioni di paraffina (5 micron) o sezioni congelate (10 micron), rispettivamente. 3,4,8,17,22, 24
- Eseguire routine di colorazione istologica come ematossilina ed eosina esaminare la morfologia generale dei tessuti. Eseguire la colorazione immunoistochimica con anticorpi specifici per identificare il tipo cellulare di interesse, 3,4,8,17,22,24,29 per T immunostaining esempio, la troponina cardiaca per cardiomiociti.
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Representative Results
La creazione microchirurgico di camere ingegneria tissutale è stata eseguita come descritto nel protocollo di cui sopra. I tessuti generati all'interno delle camere possono essere esaminate istologicamente come descritto nel passaggio protocollo 3. Vari tipi di tessuto sono stati progettati con successo utilizzando la camera vascolarizzata in vivo (Figura 2). Questi includono tessuto cardiaco con cardiomiociti neonatali di ratto (Figura 2A), tessuto muscolare con ratto mioblasti scheletrici (Figura 2B) e tessuto adiposo con idrogel derivati da tessuto adiposo matrice extracellulare (Figura 2C).
Valutazione morfometrica dei tessuti può essere effettuata sia con un sistema investigatore stereo o software ImageJ. 3,4,8,17,22,29 Oltre alla valutazione qualitativa dei vari componenti del tessuto, il sistema Stereology permette anche imparziale quantizione del volume del tessuto specifico. Ad esempio, lectina (un marcatore per le cellule endoteliali roditori) macchiati sezioni trasversali (Figura 3) può essere utilizzato per stimare il volume vascolare dei costrutti tissutali raccolti utilizzando microscopia video con il sistema stereology. metodi di quantificazione simili possono essere applicati per valutare il volume di altri tipi di tessuto.
Le camere di ingegneria dei tessuti possono anche essere impiegati per monitorare il destino della cellula seguendo l'impianto vivo. Le celle possono essere pre-etichettati con coloranti fluorescenti, come DII, PKH26 o punti quantici prima dell'impianto. Ad esempio, cardiomiociti di ratto neonatale pre-etichettati con DII possono essere rilevati nelle costruzioni di tessuto raccolti in tre giorni post-impianto (Figura 4A). Abbiamo anche monitorato con successo cellule impiantate che sono stati pre-etichettati con DII per fino a 4 settimane dopo l'impianto. In alternativa, anticorpi specie-specifici possono essere utilizzati per identify cellule impiantate negli studi xenotrapianto. Ad esempio, le cellule staminali pluripotenti indotte umane impiantate all'interno di camere di ingegneria tissutale nei ratti immunocompromessi possono essere identificate nei costrutti di tessuto raccolti da immunocolorazione con anticorpi specifici umano Ku80 (Figura 4B).
Figura 1: ingegneria dei tessuti cardiaci con la camera vascolarizzato in vivo approccio intrinseca vascolarizzazione con il modello di camera di ciclo artero-venosa e il modello di camera di peduncolo a flusso continuo.. Le camere sono state fatte policarbonato o polimetilmetacrilato, questi materiali sono stati testati per essere non-infiammatoria e non tossici in vivo. Barra di scala = 5 mm. Ristampato con il permesso di 30. Plea SE Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Tessuti ingegnerizzati dalle camere vascolarizzate in vivo (A) tessuto cardiaco con cardiomiociti neonatali di ratto. Cardiomiociti sono stati immunostained con T anticorpi troponina cardiaca (marrone). (B) Il tessuto muscolare con il ratto mioblasti scheletrici. Le cellule muscolari sono stati immunostained con l'anticorpo desmina (marrone). Tissue (C) grasso con un idrogel derivato dalla matrice extracellulare del tessuto adiposo. 31 ematossilina ed eosina. Barra di scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3: vascolarizzazione di un tessuto costrutti raccolte a 4 settimane post-impianto Immagini rappresentative della sezioni lectina-macchiato.. I vasi sanguigni che spuntano dalla arteria femorale (*) sono stati etichettati con lectina (marrone). Scala bar = 200 micron (a sinistra) e 100 micron (a destra). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. L'identificazione delle cellule trapiantate nei costrutti di tessuto (A) DII-label cardiomiociti neonatali di ratto (rosso e frecce bianche) in un costrutto tessuto di ratto raccolto a 3 giorni post-impianto. (B) Un'immagine istologia rappresentante umano specifico Ku80 macchiato di un costrutto tessuto raccolto da un tissu topoda camera e di ingegneria impiantato con le cellule staminali pluripotenti indotte umane a 28 giorni post-impianto. nuclei umani sono stati ratto marrone e immunocompromessi immuno-marcato è stato utilizzato per prevenire il rigetto delle cellule umane. Barra di scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ingegneria della microcircolazione è attualmente in fase di studio essenzialmente attraverso due approcci. La prima comporta lo sviluppo di una rete vascolare altamente interconnessa all'interno del costrutto in vitro in modo che quando impiantato, capillari dal letto vascolare ospitante collegano con quelli del trapiantato costruire attraverso un processo chiamato inosculation, garantendo così la consegna di nutrienti non solo la periferia ma anche al nucleo. 21,32,33 Questo è chiamato pre-vascolarizzazione. Il secondo approccio cerca di migliorare il proprio sistema vascolare del padrone di casa direttamente in vivo, così si verifica che capillare germinazione prima o in concomitanza con la differenziazione delle cellule impiantati e la crescita dei tessuti. 17,34
L'ingegneria tissutale protocollo in vivo camera qui presentato sfrutta quest'ultima nozione mettendo un'arteria e una vena, sia come un ciclo arterovenosa o una configurazione peduncolo a flusso continuo,all'interno di uno spazio vuoto protetta, permettendo germinazione significativo e formazione di nuovi capillari nel tempo 3 Vantaggi della camera comprendono (1) assenza di manipolazioni in vitro.; (2) la generazione di una rete vascolare completamente autologo che non sarà respinto dal conduttore; e (3) il fatto che non ha bisogno di un periodo inosculation che può durare da 1 a 7 giorni rendendo il tessuto costrutto inclini a ischemia. 35,36
Tuttavia, si deve notare che ci vogliono circa 3-7 giorni per la capillare significativo germinazione a verificarsi, un periodo durante il quale il tessuto impiantato è anche poco fornito. 3 ritardato l'impianto delle cellule una volta che la camera sia adeguatamente vascolarizzato ha infatti dimostrato un miglioramento della sopravvivenza. 17 Un ulteriore vantaggio include la biocompatibilità e non immunogenicità di materiale camere '(cioè policarbonato e poliacrilico). Inoltre, la rigida cham non pieghevoleber fornisce uno spazio protetto per il tessuto e vascolarizzazione di crescere senza la fusione e l'integrazione con l'ambiente circostante, che altrimenti ostacolare espansione e di effettuare raccolta del tessuto neoformato difficile. Contrastingly, il fatto che le camere sono chiuse può limitare la crescita dei tessuti. Questo, tuttavia, è stato affrontato nel modello ciclo arterovenosa, che ora utilizza una camera perforato che ha dimostrato di crescere tessuto più efficace di quella chiusa. 37
I protocolli camera di tessuto-ingegneria qui presentati sono altamente riproducibili, ma va sottolineato che le camere si riempiono di rado a compimento, di solito alla capacità di circa il 70%. Risultati costanti si ottengono a condizione che alcuni passaggi critici e le questioni tecniche sono presi in considerazione. Pedicle pervietà è l'obiettivo finale quando si lavora con i vasi sanguigni, in particolare se vengono eseguite anastomosi microchirurgiche. Abbiamo sempre trovato alcuna tessuto cresce se il Vasctrombosi peduncolo Ular post-chirurgia precoce. Fattori che influenzano la pervietà possono essere sostanzialmente raggruppati in quattro categorie, vale a dire chirurgica tecnica, il flusso di sangue, trombosi e lo spasmo.
In primo luogo, una tecnica chirurgica delicata è la chiave del successo. In questo senso, si deve notare che tali procedure, in particolare quella che prevede la creazione di un ciclo artero richiedono un certo livello di abilità chirurgica che può essere facilmente acquisita da praticare prima in modelli non viventi e successivamente nei vasi femorali del ratto seguente i principi e le tecniche descritte qui e altrove. 38 i danni alla parete del vaso, in particolare l'intima, deve essere evitata in ogni momento da una corretta gestione dei vasi, che include mai afferrare l'intero spessore della parete del vaso, evitando un eccessivo allungamento, giudizioso uso del coagulatore bipolare, e nel caso del ciclo arterovenosa, prestazioni di anastomosi microchirurgici meticolosi e atraumatiche. Anche se il lavaggio con soluzione salina eparinizzata aiuta a prevenire la coagulazione, non potrà mai sostituire una tecnica chirurgica bene. In secondo luogo, i fattori di flusso di sangue si riferiscono principalmente alla turbolenza e stasi. flusso turbolento secondaria a colpi di scena, si piega o pieghe dei vasi favorisce la formazione di trombi. Pertanto, un flusso illimitato streamline deve essere assicurata sia nel ciclo artero ed i modelli a flusso continuo. In questo senso, l'effetto tethering dei rami epigastriche nel modello ciclo arterovenosa è essenziale per evitare di piegare; se per qualsiasi motivo questi rami non possono essere utilizzati, semplici 10/0 punti di sutura in nylon dalla parete del vaso ai tessuti circostanti devono essere attentamente posizionati invece. sangue statica al sito anastomotico durante la procedura ciclo arterovenosa è anche altamente trombogenico e deve essere impedito mediante flussaggio nave vigorosamente con soluzione salina eparinizzata prima e durante l'anastomosi. Fattori In terzo luogo, pro-trombotici, come contaminanti dal campo operatorio e più importante la presenza di pezzi di avventizia all'interno anastomosi sono da evitare. Preparare la nave si conclude correttamente prima di sutura microchirurgica e mantenere il campo e anastomosi pulita da vampate di calore regolarmente sono aspetti importanti da considerare quando si costruisce il ciclo artero-venosa. Ultimo ma non meno importante, c'è la questione di spasmo dei vasi. Anche se la fisiopatologia dello spasmo nave non è stato completamente chiarito, è probabilmente dovuto sia a fattori locali e sistemici. Fattori locali includono il trauma vasale, presenza di sangue nel campo e tessuti operatorio essiccazione. Fattori sistemici, invece, comprendono temperatura interna bassa, ipotensione e risposta simpatica al dolore. 38
Così, sia in ciclo artero-venosa e modelli di flusso-through, la corretta manipolazione e la preparazione dell'animale insieme ad una tecnica chirurgica delicata non può essere sottovalutata. Le strategie per risolvere spasmo includono l'irrigazione con soluzione salina calda o non diluito1% xylocaina e avendo un periodo di riposo di 5-10 min. Vaso dilatazione e stripping della avventizia possono anche aiutare ad alleviare spasmi grazie al suo effetto simpaticectomia locale. 38 Per aggirare la necessità di eseguire anastomosi microchirurgiche e la sfida tecnica implica, la tecnica bracciale può essere impiegato come descritto altrove. 39 Questa tecnica consiste di inserire uno della nave si conclude in un bracciale Evert e fissarlo con una circonferenza di sutura 6/0 in nylon. Successivamente, l'altra estremità recipiente viene fatto scorrere sopra la cuffia e fissato in un modo simile.
La camera di ingegneria tessutale ha aperto una nuova finestra di possibilità nella ricerca sperimentale ed è in costante avanzare verso un potenziale scopo clinico. Fino ad ora, i modelli presentati qui sono stati utilizzati principalmente per la produzione di tessuti di diverse linee. 4,7,8,17,22,, 24,25,27-29,37,40 Tuttavia, essi hanno un certo numero di altre applicazioni potenziali. Per esempio, abbiamo HAve utilizzato la camera di flusso attraverso un modello efficace e relativamente veloce per formazione teratoma dopo impianto di cellule staminali pluripotenti indotte umane. 41,42 Pertanto, questo approccio può essere utilizzato come strumento di "controllo di qualità" per ottenere ingegneria tissutale libera da tumore con le cellule staminali pluripotenti. Inoltre, studi tossicologici farmaci potrebbero essere esplorati in tessuti umani coltivati all'interno della camera. Allo stesso modo, la generazione di tessuto patologico potrebbe produrre un interessante approccio verso la modellazione della malattia e test anti-droga. Infine, la camera di ingegneria tessutale potrebbe anche diventare un modello potenziale per studiare la crescita dei tessuti e il monitoraggio del destino delle cellule in vivo.
In conclusione, abbiamo descritto un protocollo che coinvolge il posizionamento di una camera sottocutanea negli animali attraverso due approcci diversi: utilizzando un ciclo arterovenosa microchirurgico, oppure una configurazione peduncolo a flusso continuo. La tecnica è altamente riproducibile e produce risultati coerenti. Il suo utilizzo hcome stata sfruttata principalmente nel campo dell'ingegneria dei tessuti finora, tuttavia, ci sono altri campi potenziale di ricerca per cui queste camere possono essere di grande applicazione.
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Disclosures
Gli autori dichiarano interessi in gioco.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti provenienti NHMRC e Stafford Fox Medical Foundation. Gli autori riconoscono l'assistenza chirurgica di Sue McKay, Liliana Pepe, Anna Deftereos e Amanda Rixon del Medical Sperimentale e l'Unità Chirurgia, Ospedale di St. Vincent, Melbourne. Il supporto è fornito anche dal Dipartimento del Governo dello Stato del Victoria di innovazione, l'industria e il Programma delle infrastrutture di supporto operativi per lo sviluppo regionale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 15 Blade Scalpel | Braun | BB515 | |
| 1 Toothed Adson Forceps | Braun | BD527R | |
| 1 Needle Holder | Braun | BM201R | |
| 1 Bipolar Coagulator | Braun | US335 | |
| 1 Micro Needle Holder B-15-8.3 | S & T | 00763 | |
| 1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 | S & T | 00125 | |
| 1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 | S & T | 00108 | |
| 1 Micro Scissors - Straight SAS-11 | S & T | 00098 | |
| 1 Micro Scissors - Curved SDC-11 | S & T | 00090 | |
| 2 Single Clamps B-3 | S & T | 00400 | |
| 2 10/0 nylon suture | S & T | 03199 | |
| 1 6/0 nylon suture | Braun | G2095469 | |
| 2 4/0 Silk Sutures | Braun | C0760145 | |
| Xilocaine 1% | Dealmed | 150733 | 10 mg/ml |
| Heparin Sodium | Dealmed | 272301 | 5,000 UI/ml |
| Ringer Lactate | Baxter | JB2323 | 500 ml |
| 1 dome-shaped tissue engineering chamber | custom made | ||
| 1 flow-through chamber | custom made | ||
| Lectin I, Griffonia Simplicifolia | Vector Laboratories | B-1105 | 1.67 μg/ml |
| Troponin T antibody | Abcam | Ab8295 | 4 μg/ml |
| Human-specific Ku80 antibody | Abcam | Ab80592 | 0.06 μg/ml |
| Desmin antibody | Dako | M0760 | 2.55 μg/ml |
| Cell Tracker CM-DiI dye | Thermo Fisher Scientific | C-7000 | 3 mg/106 cells |
| Lethabarb (sodium pentobarbitone) |  Virbac Animal Health |
LETHA450 | 325 mg/ml |
| Heat pad flexible | Redzone Heating |
RZ/Medium |
References
- Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
- Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
- Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
- Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
- Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
- Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
- Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
- Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
- Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
- Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
- Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 169-187 (2010).
- Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
- Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
- Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
- Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
- Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 87-103 (2008).
- Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
- Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
- Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
- Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, (14 Suppl) 145-152 (2008).
- Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
- Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
- Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
- Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
- Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
- Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
- Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
- Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
- Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
- Wei, F. C., Lin Tay, S. K. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. Neligan, P. C., Gurtner, G. C. , Elsevier. Chapter 26 587-620 (2013).
- Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
- Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
- Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).
