Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך Published: May 30, 2016 doi: 10.3791/54099
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2
1O'Brien Institute Department, St Vincent's Institute of Medical Research, 2Department of Surgery, University of Melbourne, 3Faculty of Health Sciences, Australia Catholic University
* These authors contributed equally

Abstract

ב ניתוח שחזור, יש צורך רפואי אלטרנטיבת השיטות הקיימות של שחזור אוטולוגי שהן מורכבות, יקרים פגם סחר אחת באחרת. הנדסת רקמות ולפוטנציאל להתייחס הביקוש הגובר הזה. עם זאת, רוב אסטרטגיות הנדסת הרקמות תצלחנה לייצר תחליפי רקמות יציבים פונקציונליים בגלל כלי דם עניים. מאמר זה מתמקד מודל קאמרי הנדסת in vivo רקמה של כלי דם הפנימיים שבו עורק perfused וריד או כפי בלופ arteriovenous או תצורת pedicle זרימת דרך מופנה בתוך חדר חלול מוגן. במערכת תא מבוסס זה הנבטת angiogenic מתרחשת מכלי arteriovenous ומערכת המושך מונע איסכמית דלקתי נדידת תאי אנדוגני אשר ממלאת את החלל הקאמרי בהדרגה עם רקמת פיברו-וסקולרית. תא אקסוגניים / השתלת מטריקס בעת הבנייה קאמרית משפרת sur תאvival וקובע הספציפיות של רקמות מהונדסות אשר לפתח. המחקרים שלנו הראו כי מודל תא זה יכול ליצור שונים ברקמות בהצלחה כגון שומן, שריר לב, כבד ועוד. עם זאת, שינויים וחידודים נדרשים על מנת להבטיח רקמות יעד ההיווצרות היא עקבית לשחזור. מאמר זה מתאר פרוטוקול סטנדרטי עבור הייצור של שני מודלים קאמרי הנדסת רקמות כלי דם שונים in vivo.

Introduction

בודה רקמות כלי דם תפקודיות באמצעות גישת הנדסת רקמות הוא פרדיגמה המתעורר ברפואה רגנרטיבית. 1,2 גישות רבות להנדס רקמה חדשה ובריאה להחלפת רקמות פגועות או איברים פגומים פותח, 3-6 בניסוי במודלים של בעלי חיים קטנים עם פוטנציאל קליני מבטיח. 7,8 עם זאת, כלי הדם נשאר אחד האתגרים הגדולים עבור הנדסת רקמות הגבלת הפוטנציאל שלה לגדול רקמות בגודל משמעות קלינית. 9

גישות שוטפות vascularize רקמות אחרי או לא ודאית חיצוניים שבו כלי דם חדשים לגדול ממיטת הנמען וסקולרית ולפלוש ברחבי הרקמה המושתלת בונת 10 או מסלול כלי דם פנימי שבו כלי הדם גדל ומרחיבה ביחד עם הרקמות בפיתוח החדשה. 11 הגישה החיצונית באופן מסורתי כרוך תאי זריעה על פיגוםבמבחנה להשתיל את המבנה השלם לתוך החי מתוך הציפייה כי חומרים מזינים, שסופקו בעבר על ידי תקשורת ותרבות, יהיה שמקורו מן במחזור. 12,13 הרעיון הוא פשטני כפי ingrowth וסקולרית הוא איטי מדי ורק שתלים דקים מאוד (< 1-2 מ"מ עובי) יישאר קיימא. מתן חומרי מזון וחמצן באמצעות כלי דם מספיק ומהירים נמצאת בליבה של ניסיונות מוצלחים בכל לגדול יותר מורכבים ויותר תחליפי רקמות מהונדסות כגון עצמות, שרירים, שומן ואיברים מוצקים. 14,15 כלי דם פנימי מציע פוטנציאל בונה גדולה לפתח ידי גידול רקמות מתקדם בקנה אחד עם אספקת דם ההרחבה שלה. עיצוב אחת מהן היא השתלת in vivo לתוך תא של pedicle וסקולרית עם או בלי פיגום תא זרע. 5,6 זה סלל את הדרך נהלים חדשים עבור הדור של רקמות כלי דם עבה מיסודם. 16,17 </ P>

לאחרונה, פותחו אסטרטגיות טרום vascularize שתלי רקמה, לפני ההשתלה. רשתות כלי דם משולבים אלה מכוונות inosculate עם כלי מארח בהשרשה המאפשר למתן המהיר של אספקת דם מלאה כדי לשפר את ההישרדות של כל החלקים של שתל רקמה עבה מושתלת. 18

אנחנו חלוצים מודל הנדסת רקמות in vivo vascularized בחיות קטנות המערב בתא סגור חצי קשיח מושתל מתחת לעור המכיל pedicle וסקולרית perfused וחומרים ביולוגי תא המכיל. התא יוצר סביבת איסכמי שמגרה הנבטת angiogenic מכלי המושתל. 3 pedicle וסקולרית או יכול להיות לולאת arteriovenous משוחזרת או עורק זרימת דרך ללא פגע וריד. 3-6,19 זה ניבט pedicle וסקולרית תפקוד ו עורק נרחב רשת -capillary-ורידי המקשרת בשתי האמנותeriole ו ורידים ונגמרו pedicle וסקולרית. 3,20 יתר על כן, תא התמיכה החלול שמסביב מגן על הרקמות בפיתוח מן עיוות כוחות מכאניים פוטנציאל ומאריך את כונן איסכמי כדי לשפר כלי דם. 3,21,22 אם pedicle הכלי מושתל פשוט אל רקמות בריאות ולא בתוך המרחב המוגן של החדר, הנבטת angiogenic מפסיקה לאורך ציר הזמן הזהה פצע רגיל ולא רקמה חדשה תצטבר ברחבי pedicle. חוקרים השתמשו בתצורת in vivo זה לייצר תלת ממדי בונת רקמת כלי דם תפקודית עם כלי דם תומכים בגודל משמעות קלינית. 4,23 יתר על כן, בונת רקמת כלי דם המהונדסת עם pedicle וסקולרית השלמים שלה ניתן לקצור להשתלה בהמשך בבית במקום פציעה . 24,25 תרחיש ריאלי יותר קליני יהיה יצירת התא באתר המוחלט לשיקום היםUch כמו שד. לפיכך, גישת הנדסת דה נובו רקמה זו יכולה להיות פוטנציאל קליני לספק מקור חדש של רקמת יעד פונקציונלית עבור ניתוח שחזור. 26-28

הפרוטוקול הבא יספק מדריך כללי לבנות תא הנדסת רקמות in vivo vascularized בחולדה, אשר יכול להיות מותאמת במודלים של בעלי חיים שונים והעסיקה לבחון את התהליכים המורכבים של אנגיוגנזה, ייצור מטריקס, וגירת הסלולר בידול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקולים המתוארים כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חי מלבורן חולי סנט וינסנט, אוסטרליה, נערכו תחת הקפדה על מחקר הבריאות הממלכתית האוסטרליות רפואי הנחיות המועצה.

הערה: שני פרוטוקולים קאמריים מתוארים להלן. שני הדגמים השונים והעיצובים הקאמריים הספציפיים שלהם הם באיור 1. קאמרי (1) עשוי פוליקרבונט (עבור דגם תא לולאת העכברוש arteriovenous). זהו גלילי עם מ"מ פנימי בקוטר 13 וגובה 4 מ"מ. חלון בשלב מסוים בקיר מאפשר גישה ללא הפרעה עבור pedicle. במודל השני (עבור זרימה דרך עכברוש מודל קאמרי pedicle), התא עשוי polyacrylic והוא מלבני (10 x 8 x 4 מ"מ 3 ממדים פנימיים). יש לה שני פתחים 1.5 מ"מ משני צדי המתרס כדי להכיל את עורק הירך ווריד כפי שהם עוברים על קאמרית.

1. דגם לשכת Loop עכברוש arteriovenous (אחת צ'אםבער Animal Per)

הערה: לפני תחילת הניתוח, לוודא שכל המכשירים כבר מעוקרים כראוי. כמו כן, להבטיח את שאר המכשירים על מגבות סטרילי הם במרחק סביר מהשדה כירורגית כדי למנוע זיהום במהלך ההליך.

  1. הכנת בעלי חיים לכירורגיה
    1. השתמש חולדות במשקל לפחות 250 גרמו במשך הגודל הגדול שלהם של כלי ליצירה של לולאת arteriovenous.
    2. לטשטש את החיה עם שאיפת isoflurane 4%. לאשש עומק נאות של הרדמה על ידי הערכת חוסר תגובה אל קמצוץ בוהן. לאחר הרדמה, לשמור על בעלי החיים הרדימו כראוי לאורך כל ההליך עם 2% isoflurane.
    3. מניח את החיה במצב שכיבה על כרית חימום ולהחיל סיכה סטרילי על העיניים כדי למנוע התייבשות במהלך ניתוח.
    4. באמצעות מכונת גילוח חשמלית, לגלח הן במפשעה ולהסיר שיער עם פיסת גזה לח.
    5. הכן באתרים כירורגית עם chlorhexidine/ 70% פתרון אתנול לעטוף את החיה עם מגבות סטרילי. נהל מנה בודדת של Carprofen (5 מ"ג / ק"ג, תת עורי) כמו משכך כאבים.
  2. קציר של ירך וריד שתל
    1. באמצעות סכין # 15, לעשות חתך בעור באורך 4 ס"מ על ההקבלה במפשעה השמאלית על רצועה מפשעתי. זה חושף את כרית השומן מפשעתי.
    2. חותך דרך כרית שומן circumferentially במספריים עוזבים אותו מחובר pedicle וסקולרית שלו מבוסס על הכלי ברום הבטן.
    3. בעזרת מספרי מייקרו, לשחרר את הידבקויות רקמת חיבור הקרומיות בין דופן הבטן וכלי ירך בסיסית.
    4. מניחים מפשק על דופן הבטן ולמשוך מדיאלית. זה חושף את הרצועה מפשעתי ואת אורכו של כלי הירך.
    5. בעזרת מלקחיים מיקרו ומספריים מעוקל לנתח הווריד ברום הבטן ולבודד אותו משומן סביב שלו על ידי משיכת וחיתוך בעדינות. ברוח זו פועלת כמו לקשור בעת בניית הלולאה.
    6. usinמלקחי מיקרו גרם ומספרי מייקרו מעוקלים לפתוח את נדן perivascular המכיל את כלי ירך ועצבה כל הדרך מן הרצועה מפשעתי כדי דיסטלי ההסתעפות שלו לסניף ברום הבטן.
    7. בעזרת מלקחיים מיקרו, להרים וריד הירך ידי adventitia שלה בעדינות להפריד בינו לבין הרקמות הסובבות וליווי העורק. האם זה עם מלקחיים מיקרו ומספריים מיקרו עגול הצביע מעוקל על ידי משיכת הרקמה בנפרד וחיתוך דרכו.
      הערה: לעולם לתפוס את כל רובד קיר הווריד שכן הדבר עלול לגרום טראומה אינטימה מה שהופך אותו נוטה פקק.
    8. ענפים בצד ולקשור שנמצאו במהלך דיסקציה עם תפר 10/0 ניילון או להקריש אותם עם coagulator דו קוטבי.
    9. עם וריד הירך לגמרי בחינם, ולקשור הפרוקסימלי שלה מסתיים דיסטלי עם 4/0 תפרי משי. הקפד לקבל שתל וריד של אורך 10 מ"מ לפחות ולכלול כ אורך 0.5 ס"מ של הסניף ברום הבטן כדי לשמש לקשור חבל בחורלהחזיק את הלולאה פתוחה בתא.
    10. בעזרת מלקחיים מיקרו ומספריים מיקרו ישר, חתוך את adventitia מקצות של השתל על ידי משיכת וחיתוך בעדינות. זה יכול להיעשות גם לאחר מכן, לפני anastomoses מיקרו.
    11. שטוף את השתל וריד עם תמיסת מלח heparinized (10 U / ml של הפרין) ולהשאיר אותה לנוח הפתרון. סגור את הפצע באמצעות ריצה רציפה 4/0 תפר משי פלוס שניים או שלושה תפרים קטע פשוט נוספות.
  3. יצירת arteriovenous Loop ההשרשה של לשכה
    1. חזור על שלבי 1.2.1 עד 1.2.4 ב באותו אופן בדיוק על הגפה הנגדית.
    2. בעזרת מלקחי מייקרו, לנתח ולבודד הוא עורק ברום בטן וריד מהווה את כרית השומן שמסביב. עושים זאת על ידי משיכת הרקמה בעדינות הרחק כלי
    3. בעזרת מלקחיים מיקרו, להרים את עורק הירך ידי adventitia שלה ולשחררו מן הרקמות הסובבות. האם זה עם מלקחיים מיקרו מיקרופון מעוגל מסביב מחודדמספריים ro על ידי משיכת הרקמה בנפרד וחיתוך דרכו. ולקשור או להקריש סניפים צדו.
    4. ולקשור את עורק הירך ואת וריד דיסטלי הופעתה של כלי ברום הבטן באמצעות תפר משי 4/0.
    5. מניחים מהדק יחיד proximally על כל אחד עורק וריד הירך. באמצעות מספריים מיקרו ישר חדה, לבצע רוחבי נקי לחתוך בכל דיסטלי כלי הופעתה של הענפים ברום הבטן. מניח רקע בניגוד פלסטיק סטרילי תחת הכלי.
    6. שטוף את הכלי נמרץ עם כמויות נדיבות של מלח heparinized עד שכל הדם יוסר לומן.
    7. תביא את שתל הווריד לתוך שדה הניתוח וסר adventitia מיותר 'קצות הכלי לפי צעד 1.2.10, במידת צורך.
    8. בצע הן anastomoses מיקרו עם תפר ניילון 10/0. Anastomose סוף הפרוקסימלי של שתל הווריד אל וריד הירך ואת הקצה הדיסטלי עורק הירך. זה יאפשר לדם לזרום fROM עורקי אל צד הוורידים ללא התנגדות מצד שסתום בתוך שתל הווריד.
      הערה: ודא כלי הירך ושאר שתלו וריד בעמדה הטבעית שלהם ללא כל פיתולים.
    9. בדוק דליפות הן באתרים anastomotic. לפתור דליפות קטנות, שנראות כמו דם שאינו פועמים יוצא באתר anastomotic, על ידי הצבת חתיכה קטנה של שומן על גבי הדחיסה בעדינות במשך 5-10 דקות. גדולות יותר דליפות פועמות להציף את השדה כולו במהירות תצטרכנה תפרים נוספים.
    10. בדוק patency של הלולאה arteriovenous. חסימה עדינה של עורק הירך צריכה לעשות את זה להתכווץ בעוד אותו ב וריד הירך צריך להצטבר זה.
    11. מניחים את הבסיס של החדר הנדסת רקמות תחת לולאה arteriovenous עם המנוחה האחרונה ב לעמדה הטבעית שלו ללא פיתולים או סטיות.
    12. אבטח את הבסיס של החדר אל הרצועה מפשעתי ו fascia שריר הבסיסי עם תפרי ניילון 6/0.
    13. מניחים את המכסה עלבסיס כך שכלי הירך להיכנס לחדר דרך חריץ (חלון בצד של החדר). כאשר סוגר את המכסה, לוודא שהוא תופס את הסניפים ברום הבטן, בין הבסיס הקאמרי והמכסה, אשר פועל כמו רצועות להחזיק את לולאת arteriovenous למקומו.
    14. סגור את הפצע באמצעות ריצה רציפה 4/0 תפר משי פלוס שניים או שלושה תפרים קטע פשוט נוספות.
    15. אפשר החיה להתאושש מההרדמה על כרית חימום.
    16. אין להשאיר את החיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. כמו כן, לא לחזור בעל חיים אשר עבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים עד התאושש לחלוטין. 24 שעות מאוחר יותר, לנהל עוד מנה בודדת של Carprofen (5 מ"ג / ק"ג, תת עורי) כמו משכך כאבים.
    17. פנקו את הפצע עם משחה אנטיביוטית מקומית במשך 5 ימים. אם הפצע נפתח, להרדים את החיה כמו בשלב 1.1.2 דרך 1.1.5 ולסגור את הפצע כמו 1.3.14. פיקוח על הבריאות של בעלי חיים מדי יום. להרדימו באמצעות מנה קטלנית של הזרקת lethabarb הזרקה (163 מ"ג / ק"ג 0.25 מ"ל ב -23 מחט G) אם החיה מראה יותר מאחד סימנים מתונים של inacitivity, חוסר תיאבון, ירידה במשקל וירידה של צבע.

2. זרימה דרך לשכת pedicle (שני חדרים לכל חיה)

  1. הכנת בעלי חיים לכירורגיה
    1. חזור על שלבים 1.1.1 דרך 1.1.4. שני תאים אפשר להשתיל לשני האזורים במפשעה של חולדה אחת.
  2. בידוד של כלי ירך קלטי הלשכה
    1. חזור על שלבים 1.2.1 דרך 1.2.8.
    2. בשני עורק לוריד משוחרר לגמרי של רקמות הסובבות ושלוחותיהן ligated, להביא את התא לתוך שדה הניתוח.
    3. מניח כל כלי הירך ללא פגעו על החריץ המתאים של הבסיס הקאמרי מוודא אין פיתולים או סטיות.
    4. סגור את החדר על ידי attaching את המכסה לבסיס. סגור את הפצע באמצעות ריצה רציפה 4/0 תפר משי פלוס שניים או שלושה תפרים קטע פשוט נוספות ולאפשר החיה להתאושש כפי שתואר לעיל.

קציר 3. לשכות ועיבוד רקמות

  1. לאחר מועדים לפי שעון של הניסוי (4-6 שבועות לאחר ההשתלה) הם הגיעו, להרדים את החיה כמו בשלב 1.1.2 וחזרו על צעדים 1.1.3 דרך 1.1.5.
  2. פתח את הפצע באמצעות סכין # 15 לחתוך דרך הרקמות במספריים עד לתא חשוף לחלוטין.
  3. לחשוף את כלי הירך הפרוקסימלי לבנות ולבדוק patency וסקולרית: בעדינות לחסום את כלי עם שני microforceps, אז לחלוב את הדם לכיוון דיסטלי ולבסוף לשחרר מלקחיים הפרוקסימלי. אם הכלי מתמלא דם שוב, זה מאשש patency. ולקשור את כלי הירך proximally במקרה של הלולאה arteriovenous ושניהם proximally ו distally במקרה של הדואר הזרימה דרך תצורה, ולהסיר את התאים עם הרקמה המכילה כמקשה אחת.
  4. בסוף הניסוי, להרדימו באמצעות מנה קטלנית של הזרקת lethobarb הזרקה (163 מ"ג / ק"ג 0.25 מ"ל ב -23 מחט G).
  5. תקן רקמות paraformaldehyde 4% בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. רקמות לְסַעֵף הרוחבי מרובה (1-2 מ"מ עובי) להטביע פרפין או תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית עבור חלקי פרפין (5 מיקרומטר) או חלקים קפואים (10 מיקרומטר), בהתאמה. 3,4,8,17,22, 24
  6. בצע מכתים שגרת היסטולוגית כגון hematoxylin ו eosin לבחון את המורפולוגיה הכללית של רקמות. בצע מכתים immunohistochemical עם נוגדן ספציפי לזהות סוג התא של עניין, 3,4,8,17,22,24,29 למשל immunostaining T לב טרופונין עבור cardiomyocytes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יצירת מיקרו של תאי הנדסת רקמות בוצע כמתואר בפרוטוקול לעיל. רקמות שנוצרו בתוך החדרים ניתן לבדוק בהיסטולוגיה כמו לתאר צעד פרוטוקול 3. סוגי רקמות שונים הונדסו בהצלחה באמצעות תא vascularized in vivo (איור 2). אלה כוללים ברקמת הלב עם cardiomyocytes עכברוש בילוד (איור 2 א), רקמת שריר עם myoblasts השלד חולדה (איור 2 ב), ורקמת השומן עם הידרוג'ל נגזר מטריקס רקמת שומן (איור 2 ג).

הערכת morphometric של הרקמות יכולה להתבצע גם עם מערכת חוקר סטריאו או תוכנת ImageJ. 3,4,8,17,22,29 בנוסף הערכה איכותנית של רכיבי רקמות שונים, מערכת stereology גם מאפשרת משוחד quantification של נפח רקמות ספציפי. לדוגמא, לקטינים (סמן לתאי אנדותל מכרסם) מוכתמים סעיפים רוחביים (איור 3) ניתן להשתמש כדי לאמוד את היקף כלי הדם של מבני רקמות שנקטפו באמצעות מיקרוסקופ וידאו עם מערכת stereology. ניתן ליישם שיטות כימות בדומה לאמוד את היקף סוגי רקמות אחרות.

תאי הנדסת רקמות יכולים גם להיות מועסקים כדי לעקוב אחר גורל התא בא השתלת vivo. תאים ניתן מראש שכותרתו עם צבעי ניאון כגון DiI, PKH26 או נקודות קוונטיות לפני ההשתלה. לדוגמה, cardiomyocytes עכברוש בילוד מראש שכותרתו עם DiI ניתן להבחין בונה רקמות שנקטפו ב 3 ימים לאחר ההשתלה (איור 4 א). יש לנו גם במעקב בהצלחה תאים מושתלים כי כבר מראש שכותרתו עם DiI עד 4 שבועות השתלה פוסט. לחלופין, נוגדנים ספציפיים מינים שניתן להשתמש בהם כדי identify תאים מושתלים במחקרי השתלה שלא מבן-מינה. לדוגמה, תאי גזע מושרים אדם מושתל בתוך תאי הנדסת רקמות בחולדות immunocompromized יכול להיות מזוהים בונה רקמות שנקטפו על ידי immunostaining עם נוגדן Ku80 אדם ספציפי (איור 4B).

איור 1
איור 1: הנדסת רקמות לב עם תא vascularized in vivo גישת כלי דם פנימי עם מודל קאמרי לולאת arteriovenous ודגם קאמרי pedicle זרימה דרך.. התאים נעשו משני פוליקרבונט או polyacrylic, חומרים אלה נבדקו כדי להיות הלא דלקתיים ולא רעילים in vivo. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. Re מודפס באישור 30. טיעון se לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. רקמות מהונדסות מתאי vascularized in vivo (א) ברקמת הלב עם cardiomyocytes עכברוש בילוד. Cardiomyocytes היו immunostained עם נוגדן T טרופונין לבבי (חום). (ב) רקמת שריר עם myoblasts שלד חולדה. תאי שריר היו immunostained עם נוגדן desmin (חום). (ג) רקמת שומן עם הידרוג'ל נגזר מטריקס רקמת השומן. 31 Haematoxylin והכתים eosin. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/files/ftp_upload/54099/54099fig3.jpg "/>
איור 3: כלי דם של בונת רקמות שנקטפה ב 4 שבועות לאחר השתלה נציג תמונות סעיפים מוכתמים לקטינים.. כלי הדם המבצבצים עורק הירך (*) תויגו עם לקטינים (חום). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (משמאל) ו -100 מיקרומטר (מימין). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. זיהוי של התאים המושתלים בתוך מבנים רקמות (א) cardiomyocytes עכברוש בילוד DiI-label (אדום חצים לבנים) בתוך מבנה עכברוש רקמות שנקטפו ב 3 ימים לאחר ההשתלה. (ב) דמות אנושית ספציפית Ku80 מוכתם היסטולוגיה נציג של מבנה רקמות שנקטפו מן tissu עכברושתא הנדסת דואר מושתל עם תאי גזע מושרים אדם ב 28 ימים לאחר השתלה. גרעיני אדם היו שכותרתו חיסוני עכברוש חום immunocompromized שמשו כדי למנוע דחייה של תאים אנושיים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הנדסה של מיקרו כיום נחקרת בעצם דרך שתי גישות. הראשונה כוללת פיתוח רשת כלי דם זו בזו קשר הדוק בתוך המבנה במבחנה כך שכאשר מושתלת, נימים מהמיטה וסקולרית מארח להתחבר עם אלה של המושתלים לבנות דרך inosculation תהליך הנקרא, ובכך להבטיח את האספקה ​​של חומרים מזינים לא רק בפריפריה אלא גם עד היסוד. 21,32,33 זה נקרא-כלי דם מראש. הגישה השנייה מנסה לשפר את כלי דם של המארח עצמו ישירות in vivo, כך הנבטת הנימים מתרחשת לפני או לאחר התייעצות משותפת עם התמיינות תאים מושתלת גידול רקמות. 17,34

הפרוטוקול הקאמרי הנדסת in vivo רקמה המוצג כאן מנצל את הרעיון האחרון על ידי צבת עורק וריד, אם במסגרת לולאת arteriovenous או תצורת pedicle זרימת דרך,בתוך חלל ריק מוגן, המאפשר הנבטת היווצרות משמעותיות של נימים חדשות לאורך זמן 3 יתרונות של החדר כולל (1) העדר מניפולציות במבחנה.; (2) את הדור של רשת כלי דם עצמית לחלוטין אשר לא תידחה על ידי המארח; ו (3) העובדה שזה לא צריך תקופת inosculation אשר יכול לקחת בין 1 עד 7 ימי טיוח הרקמה לבנות נוטה איסכמיה. 35,36

אף על פי כן, יש לציין כי זה לוקח בערך 3-7 ימים עבור נימים משמעותיות הנבטה להתרחש, תקופה שבמהלכתה הרקמות המושתל גם מסופקות גרועות. 3 השתלת תא מושהה פעם לתא היא vascularized כראוי יש למעשה לראות שיפור בהישרדות. 17 יתרון נוסף כולל את biocompatibility ו-החיסונית אי החומר כתאים (פוליקרבונט כלומר ו polyacrylic). בנוסף, צ'אם הלא מתקפל הנוקשהבער מספק מרחב מוגן עבור רקמות כלי הדם לגדול בלי מיזוג ושילוב עם הסביבה, שאחרת לעכב הרחבה ולעשות קציר של רקמה שהוקמה זה עתה קשה. וחשוף, העובדה תא סגורות עלולה להגביל גידול רקמות. זה, לעומת זאת, כבר התייחס במודל לולאת arteriovenous, אשר משתמש כעת בתא מחורר כי הוכח לגדל רקמות בצורה יעילה יותר מזו הסגורה. 37

הפרוטוקולים קאמרי רקמות ההנדסה המוצגים כאן הם מאוד לשחזור אך יש להדגיש כי תאי לעתים רחוקות למלא להשלמה, בדרך כלל כ קיבולת 70%. תוצאות עקביות מושגות ובלבד כמה צעדים קריטיים בעיות טכניות נלקחים בחשבון. patency pedicle הוא המטרה האולטימטיבית כשעובדים עם כלי דם, במיוחד אם anastomoses microsurgical מבוצעות. מצאנו בעקביות לא רקמות גדלו אם vascthromboses pedicle תואר בלבד מוקדם שלאחר הניתוח. גורמים המשפיעים patency ניתן לקבץ רחב לארבע קטגוריות, כלומר כירורגית טכנית, זרימת דם, פקקת והתכווצויות.

ראשית, טכניקה כירורגית עדינה הוא המפתח להצלחה. במובן זה, יש לציין כי נהלים אלו, ובמיוחד האחד מעורבים ביצירת בלופ arteriovenous דורשים רמה מסוימת של מיומנות כירורגית אשר ניתן לרכוש בקלות על ידי התרגול הראשון במודלים שאינם חיים וכפועל יוצא מזה כלי הירך של העכברוש הבא העקרונות והטכניקות המתואר כאן ובמקומות אחרים. 38 פגיע בדפנות כלי הדם, במיוחד אינטימה, יש להימנע בכל העת על ידי טיפול הולם על כלי השיט, הכולל אף פעם לא משך למלוא עוביו של קיר הכלי, מניעת יתר מתיחה, בעל שיקול דעת שימוש coagulator דו הקוטבי, ובמקרה של לולאת arteriovenous, ביצועים של anastomoses microsurgical מוקפד atraumatic. למרות שטיפה עם תמיסת מלח heparinized עוזר למנוע קרישה, זה לעולם לא להחליף טכניקה כירורגית בסדר. שנית, גורמי זרימת הדם מתייחסים בעיקר טלטלות קיפאון. זרימה טורבולנטית משנית פיתולים, מתכופפת או סטיות של כלי מקדם היווצרות פקיק. לכן זרימה לייעל מוגבל יש להבטיח הן את הלולאה arteriovenous והמודלים הזרימה דרך. במובן זה, השפעת כבילת הענפים ברום הבטן במודל לולאת arteriovenous חיונית כדי למנוע כיפוף; אם מסיבה כלשהי בענפים אלו לא ניתן להשתמש, פשוט 10/0 תפרי ניילון מן בדפנות כלי הדם אל הרקמות הסובבות יש למקם בזהירות במקום. דם סטטי באתר anastomotic במהלך הליך לולאת arteriovenous גם thrombogenic מאוד יש למנוע על ידי שטיפת הספינה נמרצות עם מלוחים heparinized לפני וברחבי ההשקה. שלישית, גורמים פרו-תרומבוטיים כגון מזהמים מהשדה פעיל ורוב importantly בנוכחות פיסות adventitia בתוך ההשקה יש להימנע. הכנת הכלי מסתיימת כראוי לפני תפירת microsurgical ושמירה למגרש ההשקה נקיה על ידי שטיפה בקביעות הם היבטים חשובים שיש להביא בחשבון בעת ​​בניית לולאת arteriovenous. ואחרון חביב, יש את הנושא של התכווצות כלי. למרות בפתופיזיולוגיה של התכווצות כלי לא הואר לגמרי, היא עשויה לנבוע הן מגורמים מקומיים מערכתית. גורמים מקומיים כוללים טראומת כלי, נוכחות של דם התייבשות השדה ורקמות האופרטיבית. גורמים מערכתיים, מצד שני, מהווים טמפרטורת הליבה נמוכה, תת לחץ דם ותגובה אוהדת לכאב. 38

לפיכך, בשני לולאת arteriovenous ומודלי זרימה דרך, טיפול הולם והכנת החיה יחד עם טכניקה כירורגית עדינה לא יכול להדגיש יתר על מידה. אסטרטגיות לפתרון התכווצות כוללות השקיה עם מי מלח חמים או חי1% Xylocaine ויש להם תקופת מנוחה של 5-10 דקות. התרחבות ואת הפשטת כלי של adventitia יכול גם לעזור כדי להקל על התכווצות עקב אפקט העצב הסימפתטי המקומי שלה. 38 כדי לעקוף את הצורך לבצע anastomoses מיקרו ואת האתגר הטכני זה מרמז, הטכניקה השרוול יכול להיות מועסק כמתואר במקום אחר. 39 טכניקה זו מורכבת של החדרה אחד של כלי השיט מסתיימת לתוך שרוול, אוורט אותו לאבטח אותו עם תפר היקפי 6/0 ניילון. לאחר מכן, בסוף הכלי האחר הוא החליק על השרוול ומאובטח בצורה דומה.

תא הנדסת הרקמות נפתח חלון חדש של אפשרויות במחקר ניסיוני מתקדם והולכים לעבר מטרה קלינית פוטנציאלית. עד עכשיו, את המודלים שהוצגו כאן שימשו בעיקר עבור הדור של רקמות של שושלות שונות. 4,7,8,17,22,, 24,25,27-29,37,40 עם זאת, יש להם מספר יישומים פוטנציאליים אחרים. לדוגמה, אנחנו חההשתמש בתא הזרימה דרך כמודל יעיל יחסית מהר להיווצרות teratoma לאחר ההשתלה של תאי גזע מושרים אנושיים. 41,42 לכן, גישה זו עשויה לשמש ככלי "בקרת איכות" להשיג הנדסת רקמות ללא גידול עם תאי גזע פלוריפוטנטיים. כמו כן, מחקרי רעלי תרופה יכולים להיחקר ברקמות אנושיות הגדלות בתוך החדר. כמו כן, הדור של רקמת פתולוגיים יכולה להניב גישה מעניינת כלפי מודלים למחלות בדיקות סמים. לבסוף, התא-הנדסת רקמות עלול להיות גם מודל פוטנציאלי ללמוד צמיחה של רקמות מעקב של גורל תא in vivo.

לסיכום, תיארנו פרוטוקול לערב את המיקום של תא תת עורית בחיות באמצעות שתי גישות שונות: באמצעות לולאה arteriovenous מיקרו, או תצורה pedicle זרימה דרך. הטכניקה היא מאוד לשחזור ומניבה תוצאות עקביות. h השימוש בוכמו נוצלו בעיקר בתחום של הנדסת רקמות עד כה, עם זאת, ישנם תחומי מחקר פוטנציאלי אחרים עבורו תאים אלה עשויים להיות של יישום נהדר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מענק מטעם NHMRC ו סטאפורד פוקס רפואי קרן. המחברים מודים בסיוע כירורגית של סו מקיי, ליליאנה פפה, אנה Deftereos ואמנדה Rixon של רפואי הניסיון יחידת כירורגים, חולי סנט וינסנט, מלבורן. התמיכה ניתנת גם על ידי מחלקת המדינה הממשלה ויקטוריאני של חדשנות, התעשייה תוכנית תמיכה תשתית מבצעית של אזורי פיתוח.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 15 Blade Scalpel Braun BB515
1 Toothed Adson Forceps Braun BD527R
1 Needle Holder Braun BM201R
1 Bipolar Coagulator  Braun US335
1 Micro Needle Holder B-15-8.3 S & T 00763
1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 S & T 00125
1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 S & T 00108
1 Micro Scissors - Straight SAS-11 S & T 00098
1 Micro Scissors - Curved SDC-11 S & T 00090
2 Single Clamps B-3 S & T 00400
2 10/0 nylon suture S & T 03199
1 6/0 nylon suture Braun G2095469
2 4/0 Silk Sutures Braun C0760145
Xilocaine 1% Dealmed 150733 10 mg/ml
Heparin Sodium Dealmed 272301 5,000 UI/ml
Ringer Lactate Baxter JB2323 500 ml
1 dome-shaped tissue engineering chamber custom made
1 flow-through chamber custom made
Lectin I, Griffonia Simplicifolia  Vector Laboratories B-1105 1.67 μg/ml
Troponin T antibody Abcam Ab8295 4 μg/ml
Human-specific Ku80 antibody Abcam Ab80592 0.06 μg/ml
Desmin antibody Dako M0760 2.55 μg/ml
Cell Tracker CM-DiI dye Thermo Fisher Scientific C-7000 3 mg/106 cells
Lethabarb (sodium pentobarbitone) Virbac Animal Health LETHA450 325 mg/ml
Heat pad flexible Redzone Heating RZ/Medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
  2. Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
  3. Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
  4. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
  5. Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
  6. Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
  7. Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
  8. Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
  9. Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
  10. Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
  11. Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
  12. Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
  13. Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
  14. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 169-187 (2010).
  15. Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
  16. Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
  17. Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
  18. Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
  19. Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
  20. Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
  21. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 87-103 (2008).
  22. Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
  23. Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
  24. Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
  25. Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
  26. Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, (14 Suppl) 145-152 (2008).
  27. Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
  28. Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
  29. Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
  30. Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
  31. Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
  32. Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
  33. Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
  34. Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
  35. Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
  36. Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
  37. Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
  38. Wei, F. C., Lin Tay, S. K. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. Neligan, P. C., Gurtner, G. C. , Elsevier. Chapter 26 587-620 (2013).
  39. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
  40. Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
  41. Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
  42. Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).

Tags

Bioengineering גיליון 111 הנדסת רקמות pedicle וסקולרית לולאת arteriovenous כלי דם המיקרו-כירורגיה כלי עצם ירך אנגיוגנזה נימי
הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך<em&gt; In vivo</em&gt; הנדסת רקמות קאמרית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, W., Marre, D., Mitchell, G.… More

Zhan, W., Marre, D., Mitchell, G. M., Morrison, W. A., Lim, S. Y. Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber. J. Vis. Exp. (111), e54099, doi:10.3791/54099 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter