Abstract
Myocardiaal infarct geïnduceerd door coronaire ligatie werd gebruikt in vele dierlijke modellen een middel om de mechanismen van cardiale herstel en regeneratie te bestuderen en om nieuwe aangrijpingspunten voor therapeutica. Al tientallen jaren, modellen van complete hart regeneratie bestond in amfibieën en vissen, maar een zoogdier tegenhanger was niet beschikbaar. De recente ontdekking van een postnatale venster waarin muizen bezitten regeneratieve capaciteiten heeft geleid tot de oprichting van een zoogdier model van cardiale regeneratie. Een chirurgische model van zoogdieren hartregeneratie in de neonatale muis wordt hierin gepresenteerd. In het kort, postnatale dag 1 (P1) muizen worden verdoofd door isofluraan en geplaatst op een ijs pad om onderkoeling te veroorzaken. Nadat de borstkas geopend en het linker voorste dalende kransslagader (LAD) wordt gevisualiseerd, wordt een hechting geplaatst rond de LAD myocardiale ischemie toebrengen in de linker ventrikel. De chirurgische procedure duurt 10-15 min. Het visualiseren van de kransslagader wordtcruciaal voor nauwkeurige plaatsing hechtdraad en reproduceerbaarheid. Myocardinfarct en cardiale dysfunctie worden bevestigd door trifenyl-tetrazolium chloride (TTC) kleuring en echocardiografie, respectievelijk. Volledige regeneratie 21 dagen na een myocardinfarct wordt gecontroleerd door histologie. Dit protocol kan worden gebruikt als een instrument om mechanismen van zoogdieren hartregeneratie helderen na myocardiaal infarct.
Introduction
Myocardinfarct (MI) is een belangrijke doodsoorzaak wereldwijd, en blijft verantwoordelijk voor ongeveer eenderde van hartfalen gevallen 1. Terwijl de komst van percutane interventie en continue optimalisatie van het gebruik van trombolytica toegenomen reperfusie na MI, cardiomyocyt dood en verlies van contractiele myocardium toch optreedt. Er blijven ook grote aantallen "no-optie 'patiënten die geen kandidaat zijn voor of zie niet profiteren van deze interventies. Deze patiënten blijven invaliderende ischemie leidt tot de vorming van schadelijke en ventriculaire remodeling litteken als een mechanisme van infarct healing ervaren. Dit proces leidt uiteindelijk tot hartfalen, waarvoor de prognose slecht, ondanks optimale farmacologische beheer met angiotensine converting enzyme (ACE) remmers en bètablokkers blijft. Helaas, de één-jaar sterftecijfer voor patiënten met een ernstig verminderde linker ventrikel functie nog steeds alsoplopen tot 26% 2. Harttransplantatie is de laatste behandelingsoptie voor patiënten met hartfalen. Echter, de beperkte donor zwembad voor harttransplantatie niet maken dit een haalbare optie is voor de meeste patiënten. Zo is de ontdekking van nieuwe therapeutische middelen voor de beschadigde hartspier te herstellen blijft cruciaal belang voor het oplossen van het probleem hartziekte. Betrouwbare diermodellen van cardiale schade moeten daarom als een essentieel onderdeel van dit proces.
De traditionele dogma heeft gedicteerd dat volwassen hartspiercellen zijn post-mitotische, terminaal gedifferentieerde cellen, niet in staat om te delen of de-differentiëren om de beschadigde hartspier 3 te vervangen. Als zodanig kan een zoogdier hart volwassene nooit volledig te herstellen van een blessure, en verloren hartspiercellen zouden worden vervangen door vezelig weefsel. Zo heeft onderzoek richtte zich vooral op therapeutische middelen om infarct expansie te minimaliseren en te verminderen littekenvorming. Meer recent heeft echter een paradigmaverschuiving plaatsgevondenin het denken rondom cardiale genezing en vele onderzoeksinspanningen zijn omgeleid om zich te concentreren op het potentieel voor cardiale regeneratie 4.
Tot voor kort in vivo cardiaal herstel beperkt tot ongewervelde modellen, zoals in Urodela amfibieën en beenvissen 5-7. De ontdekking van de capaciteit voor cardiale regeneratie in de neonatale muis heeft geleid tot de ontwikkeling van twee chirurgische modellen van zoogdieren hartregeneratie: resectie van de apex cardiale en coronaire occlusie myocardinfarct 8,9 induceren. In 2011, werd een muis apex resectie model dat wordt gebruikt om aan te tonen dat volledige cardiale regeneratie is mogelijk op postnatale dag 1 (P1). Echter, deze capaciteit daalt snel na de eerste neonatale periode. De zoogdieren hart verliest zijn regeneratieve potentieel kort na de geboorte bij P7 als voorlopercellen cel aantallen dalen, en hartspiercellen raken binucleaire, verliezenhun proliferatieve competentie, en permanent verlaten de celcyclus 10,11. Inzicht in de fundamentele verschillen tussen de neonatale en volwassen zoogdieren hart kan leiden tot nieuwe inzichten in cardiale regeneratie.
Terwijl apex resectie inderdaad geeft inzicht in hergroei van contractiele weefsel, kan het model niet simuleren typisch menselijke cardiale schade, en dus niet zelf en geven aan de ontwikkeling van therapeutica. De kransslagader occlusie model echter directer simuleert de pathofysiologische aspecten van MI pathologie, en dus kan nuttiger inzichten in de mechanismen die welke voor therapeutische vooruitgang voor menselijk gebruik zijn.
Chirurgische coronaire ligatie werd gebruikt als een bruikbare experimentele techniek in vele dierlijke modellen 12-14. In de volwassen kransslagader ligatie model worden de dieren verdoofd en geïntubeerd het openen van de borstholte mogelijk behoud respiratiop. Het hart blijft regelmatig te verslaan, waardoor visualisatie van de coronaire vaatstelsel en het toestaan voor een nauwkeurige hechtdraad plaatsing. Bovendien, het hart blijft roze als perfusie blijft, en na ligatie het ischemische myocard verschijnt bleke, wat aangeeft succesvolle kransslagader ligatie. De beschreven neonatale muizen protocol is echter minder betrouwbaar als de kransslagader niet gevisualiseerd en de chirurg moet evalueren wanneer de hechtdraad 15 te plaatsen. Hoewel de algemene anatomie van de coronaire vasculatuur is hetzelfde, individuele dier variabiliteit richting en vertakking van de LAD bestaat 16. Dus, als "going blind," de slagader kan gemakkelijk worden gemist. Andere technieken zoals echocardiografie Hierbij moeten succesvolle inductie van MI bevestigen en te garanderen dat alle operaties leiden tot een soortgelijke infarctgrootte. Hier beschreven is een verbetering ten opzichte van een recent gepubliceerde werkwijze 15, waarbij de positie van de LAD kan worden vastgesteld en derhalve LAD worden geligeerd reproduceerbaar induceren MI.
Deze techniek geen endotracheale intubatie of mechanische ventilatie, zoals thoracotomie in onderkoelde toestand in de neonatale muis vereisen niet tot longcollaps. In de hiervoor beschreven werkwijze, ernstige hypothermie moet worden geïnduceerd tot het punt van zowel complete apnoe en beëindiging van het hartritme 15. De belangrijkste beperking van deze benadering is dat de kransslagader niet meer doorbloede en het hart wordt bleke nog voordat LAD ligatie. In de aanpak hierin beschreven, kransslagader visualisatie is mogelijk op een punt van de verdoving vóór diepe onderkoeling en hartritme stoppen, met volledig herstel van de neonatale muis na de operatie. Deze methode biedt een groot voordeel van 100% reproduceerbaarheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Broedparen van C57BL / 6 en CD-1 IG-S muizen werden gekocht van Charles River. Dieren die in deze studie werden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en studie protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Gebruik Subcommissie aan Western University, London, Canada.
1. Animal Care
- Na de geboorte is compleet en pups hebben aanvankelijk borstvoeding door hun moeder voor een paar uur geweest, plaats ze in een andere kooi met een CD-1 pleegmoeder. CD-1 moeders vertonen een rustiger fenotype met een sterke bevordering instinct, en hebben een lagere neiging om gewonde pups 15 kannibaliseren.
2. Chirurgie
- Induceren anesthesie door het plaatsen van de pup in een afgesloten isofluraan kamer (ongeveer 500 pi van 100% v / v isofluraan mogen verdrijven meer dan 1.300 cm 3 kamer). Houd de muis in de kamer tot stopzetting van de beweging (ongeveer 30 sec).
- Verwijder moGebruik van isofluraan kamer en induceren onderkoeld verdoving door het plaatsen van de muis op nat ijs. Om bevriezing te voorkomen, plaatst ijs in een steriele chirurgische handschoenen, wikkel de muis binnen de handschoen en hebben betrekking op de handschoen met ijs of wikkel de muis in steriele natte gaas en plaats het op ijs.
LET OP: Muizen sneller afkoelen als het contact met ijs is over een groter oppervlak, en als zodanig gesmolten ijs kan onderkoeling inductie verkorten. - Bevestig verdoving door gebrek aan beweging respons tot teen en de staart knijpen.
OPMERKING: Beëindiging van uitgelokt beweging optreedt bij een lichaamstemperatuur tussen 15 ° C en 8 ° C. (Koeltijd deze temperatuur ongeveer 1 min). Compleet apneu en asystolie is niet vereist voor LAD ligatie. - Verplaats het ijs bed op de chirurgische ruimte die is uitgerust met een operationele microscoop. Zorg ervoor dat de muis pup blijft op ijs gedurende de hele chirurgische ingreep.
LET OP: De chirurgische gebied, gaas en chirurgische instrumenten moeten worden gesteriliseerd. maintain steriele veld gedurende de procedure, en slijtage eenmalig gebruik, steriele chirurgische handschoenen. Oogzalf is niet vereist als muizen worden geboren met hun ogen 17 gesloten. - Plaats de muis pup in de rechter laterale decubitus positie. Ontsmet de borst door het voorzichtig af te vegen met povidonjood-oplossing, gevolgd door een ethanol wattenstaafje.
- Voer de huid incisie op de linkerborst langs de mid-axillaire lijn door te snijden huid tussen de xyphoid en linker oksel een paar millimeter onder de linker voorpoot. Ook gebruik maken van een schaar door de onderliggende borstspier laag te snijden.
- Voer een linker thoracotomie in de 4e intercostale ruimte door het scheiden van ribben en intercostale spieren met een pincet.
OPMERKING: Neonatale ribben zijn zeer kwetsbaar en kan gemakkelijk worden gebroken. Om dit te voorzichtig afzonderlijke ribben te voorkomen door het openen van een tang langs de intercostale spieren (in plaats grijpen ribben). - Visualiseer de linker anterieure dalende kransslagader (LAD), die uit de linker aurkel achter de longslagader en dalen dan de grote cardiale ader.
LET OP: In dit vroege neonatale venster, wordt de thymus vaak gevisualiseerd en kan een deel van de cardiale basis te dekken. De LAD zichtbaar ontstaan naast de positie van de thymus, afhankelijk van de hoek van thoracale incisie. - Afbinden de LAD door het passeren van een 11-0 nylon hechtdraad (0,007 mm diameter naald) in de slagader door het midden van de ventrikel onder het linker oorschelp (figuur 1C). Ischemie wordt bevestigd blancheren van het myocardium onder de hechtdraad (figuur 1G).
- Sluit de thoracale incisie met behulp van 8-0 nylon hechtingen (0,15 mm diameter naald). Met twee hechtingen aan de ribben sluiten. Plaats beide rib hechtingen voor ligeren om de naald te verzekeren niet de longen lek bij het passeren van de lichaamsholte.
- Na het sluiten van de ribben, verwijder de muis van het ijs bed. Houd de muis binnen de chirurgische gebied en plaats deze direct op de steriele chirurgische omwel over een warme verwarming pad bij 37 ° C om te beginnen met de aarde.
- Eenmaal op de steriele verwarmde ruimte, sluit de spier en de huid lagen met behulp van 8-0 nylon hechtingen (0,15 mm diameter naald). Gebruik een hechtdraad voor de spierlaag en gebruik maken van twee hechtingen voor de huid incisie.
LET OP: Spier en huid lagen kunnen op een verwarmingselement te verminderen onderkoeling belichtingstijd worden gesloten. Mouse temperatuur begint te stijgen eenmaal op de verwarming pad geplaatst, maar blijft voldoende laag genoeg voor anesthesie onderhoud tijdens spieren en huid sluiting.
3. Chirurgische Recovery
- Doorgaan snelle opwarming op een warme verwarming pad tot terugkeer van spontane beweging. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Verwijder povidonjood en bloed door zachtjes te vegen letsel site met ethanol wattenstaafje.
- Na voldoende herstel van de anesthesie, verwijderen uit steriele chirurgische gebied, smeer het met beddengoed van pleeggezinmoeder kooi, en de terugkeer jong moeder te bevorderen. Dit helpt de moeder afwijzing of kannibalisatie te voorkomen.
NB: Niet pups terug te keren naar een kooi met andere dieren tot ze volledig hersteld. Als een hele nest niet is gebruikt, en nestgenoten blijven bij pleegmoeder, plaatsen teruggevonden pups in het midden van het nest. Als het uitvoeren van meer dan een chirurgische ingreep, voltooi alle operaties die nodig zijn voor een individuele nest alvorens terug te keren muizen om hun pleegmoeder. - Observeer het gedrag van de pleegmoeder in de richting van de pup om de 10 - 15 min voor 2-3 uur tot aanvaarding van de pup te waarborgen. Als de moeder toont agressie tegenover de gewonde pup, verwijder de pup en euthanaseren door isofluraan overdosis (> 5%, tot ademstilstand), gevolgd door onthoofding. LET OP: Peri-operatieve analgesie medicijnen zijn niet nodig als de gecentraliseerde pijn reflexen niet volledig in dit vroege leeftijd 15 worden ontwikkeld.
4. Meting van hartinfarct Maat 4 -6 uur na MI
- Laat pups te herstellen in de zorg van een CD-1 pleegmoeder voor een periode van 4-6 uur. Haal de pup uit kooi met moeder en euthanaseren door isofluraan overdosis gevolgd door onthoofding met grote schaar.
- Accijnzen het hart onder ontleden microscoop, Pas op dat u het myocard rippen.
- Snijd de huid van xyphoid proces om de top van de thorax. Open buikwand onder de ribbenkast. Pak de onderste rib kooi en dwars door de ribben en spieren in lengterichting langs de linker mid-axillaire lijn vanuit het middenrif naar de oksel.
- Houd schaar in transversale vlak en zorgvuldig snijden door het membraan van links naar rechts. Zorg ervoor dat schaar onder het niveau van het hart plaatsen om schade aan de apex voorkomen.
- Pak ribbenkast en snijd rechterzijde van ribben en spieren langs de rechter mid-axillaire lijn. Verwijder alle vasculaire verbindingen naar het hart met een schaar. Verwijder het hart uit borstholte door vast te pakkende basis.
- Sectie het hart in drie stukken met behulp van een chirurgische koolstofstaal scheermesje. Maak de eerste snede langs de korte-as van het hart in het midden tussen de hechting en de cardiale apex. Maak de tweede snede ter hoogte van de hechtdraad (figuur 3A).
LET OP: Dit laat een top sectie van ongeveer 0,75 mm dik met een gewicht van 0,0018 g; een mid-basisdeel ongeveer 1 mm dik, met een gewicht van 0,0065 g; en de basis van het hart. - Plaats het hart secties 1% 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) bij kamertemperatuur gedurende 10-15 min. kijk specimen zorgvuldig te over-vlekken te voorkomen.
- Om contrast overnacht bij 4 ° C te verhogen, te repareren lood hart plakjes met 4% paraformaldehyde. Om% infarct gebied, foto hart secties te berekenen en te meten infarct gebied op imaging software. De levensvatbare myocard kleurt rood, terwijl het infarct gebied is afgebakend als witte 18.
5. Meting vanHartfunctie door echocardiografie Post-MI
- Laat pups te herstellen in de zorg van een CD-1 pleegmoeder voor een periode van 24 - 48 uur. Induceren anesthesie door het plaatsen van de pup in een afgesloten isofluraan kamer (5% isofluraan). Houd de muis in de kamer tot stopzetting van de beweging (ongeveer 30 sec).
- Zet de pup in rugligging op een verwarmde dock (temperatuur 37 ° C) met zijn neus in een kegel tot 0,5 leveren - 1% isofluraan (voor anesthesie onderhoud). Plaats voorverwarmde echo gel links borstkas.
- Verkrijgen van een parasternale view lange as van de linker ventrikel (LV). Zorgen de beelden verkregen onder het niveau van de hechtdraad in de LV. Na het verkrijgen van de positie, draai de ultrasone sonde (40 MHz) 90 ° naar een parasternale view korte-as te verkrijgen, en opnemen M-mode echocardiografische beelden.
- Meet het einde diastolische en eind systolische linker ventrikel inwendige diameter van de korte-as M-modus beelden. Bereken ejectiefractie en fractioneringnal verkorten.
6. Meting van hartinfarct Size 24 uur Post-MI
- Laat pups te herstellen in de zorg van een CD-1 pleegmoeder voor een periode van 24 uur. Haal de pup uit kooi met moeder en euthanaseren door isofluraan overdosis gevolgd door onthoofding met grote schaar.
- Open de borstholte zoals in stap 4,2. Vóór het uitsnijden van het hart, zorgvuldig te begrijpen van de thoracale aorta net boven het membraan met fijne pincet. Houd fijne schaar in het frontale vlak, plat tegen de borstwand, en snijd de thoracale aorta van de achterste thoraxwand bewegen een schaar in de craniale richting.
- Snijd de aorta vrij van de borstwand en andere verbindingen totdat het hart bereikt. Uitsnijden van het hart grijpen de superior vena cava en snijden van alle andere vasculaire verbindingen aan het lichaam.
- Spoel het hart (met aorta bijlage) in een zoutoplossing. canule voorzichtig de thoracale aorta met een naald 30 en bind eenorta naar canule met 8-0 nylon hechtdraad.
- Perfuseren het hart met 1 ml zoutoplossing door de aorta via een 30 gauge naald met een snelheid van 1 ml / min. Perfuseren het hart met 150 gl 2% Evans blauwe oplossing met een snelheid van 1 ml / min. Verwijder het hart van de canule, deel het in drie stukken en vlekken op het met TTC zoals beschreven in paragraaf 4.
- Om infarctgrootte, foto hart secties te berekenen en te meten infarct gebied op imaging software. De levensvatbare myocard kleurt blauw, het gebied in gevaar vlekken rood, en het infarct gebied is afgebakend als wit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De myocardinfarct procedure bij P1 kan in 10 worden afgerond - 15 min en heeft een sterftecijfer van 7,8% (5 van de 64 pups). Na de operatie, muizen herstellen van onderkoeld verdoving binnen de komende 5-20 min (tijd van herstel is afhankelijk van de lichaamstemperatuur bereikt tijdens de anesthesie en de snelheid van de chirurg). Bij gebruik P7 pups (ter vergelijking met een niet-regeneratieve myocardium), is een langere periode van koeling noodzakelijk om verdoving te bereiken. P7 pups veel groter en hebben meer moeite herstellen van zowel cardiale letsels en hypothermie, wat resulteert in een veel hogere mortaliteit van 26,9% (14 van 52 pups).
Resultaten van eerdere studies hierin bevestigd, wat aangeeft inductie van anesthesie hypotherme op bijna 10 ° C (tussen 8 ° C en 15 ° C) 19. Binnen deze temperatuur venster, hartslag doet langzaam,maar ritme gaat met een snelheid van tussen 24 bpm en 11 bpm. De lage hartslag op dit niveau van het koelen vermindert intraoperative bloeden. De LAD kan gemakkelijk worden gevisualiseerd en geligeerd bij deze temperaturen (figuur 1). De LAD blijft zichtbaar tot lichaamstemperatuur te bereiken tussen 9,6 ° C en 4,9 ° C, waardoor het verlagen van de hartslag tot 2 bpm of asystolie.
Na LAD ligatie op P1, jongen volledig herstellen en te groeien naar een lichaam omvang vergelijkbaar is met die van nestgenoot controles. Eenmaal terug geplaatst bij hun pleegmoeder, pups te herwinnen bewustzijn en voeden mogelijkheden vergelijkbaar met nestgenoten in ongeveer 10 minuten. Bij histologisch onderzoek 3 dagen na MI, er aanwijzingen infarct, infiltreren ontstekingscellen, een typische post-infarct respons (Figuur 2). Op dag 7 post-MI, linker ventrikel weefsel lijkt normaal. Per dag 21 post-MI, compleet cardiac regeneratie heeft plaatsgevonden.
2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring 4-6 uur na MI werd gebruikt als een bevestiging van consistente inductie van MI. Het rode gebied vertegenwoordigt levensvatbaar myocard en het witte gebied vertegenwoordigt ischemisch dood weefsel. In totaal 13 LAD ligatie operaties, 100% van de harten werden geïnfarceerde met een gemiddelde infarctgrootte van 36% (Figuur 3). TTC kleuring met Evans blauwe perfusie werd uitgevoerd bij 24 uur post-MI persistentie van geïnfarceerd weefsel te demonstreren en te meten infarctgrootte gebaseerd op risicogebied (figuur 4). In deze harten, levensvatbare myocard kleurt blauw, het gebied in gevaar vlekken rood, en het infarct gebied is afgebakend als wit. Infarctgrootte werd berekend als percentage van het risicogebied. In 4 LAD ligatie operaties, 100% van de harten werden geïnfarceerde met een gemiddelde infarctgrootte van 49% van het gebied dat risico (figuur 4).
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Om te bevestigen infarct inductie, echocardiografie werd uitgevoerd bij 24 en 48 uur post-MI. Op 24 uur na MI, werd ejectiefractie (EF) significant verlaagd van 84% tot 74%, en fractionele verkorting (FS) significant verlaagd van 50% tot 40% (figuur 5). Bij 48 uur na MI, EF werd verder verlaagd tot 46%, vergeleken met 80% in de controlegroep en FS was significant verlaagd tot 25%, vergeleken met 50% in de controlegroep. Verder was er een significante verlaging van de systolische linker ventriculaire inwendige doorsnede van 48 uur (Figuur 6). LV voorste wanddikte was niet significant verminderd bij 24 of 48 uur na MI (figuren 5 en 6).
Figuur 1. Coronaire is zichtbaar tijdens Neonatale LAD Procedure. P1 neonatale muis after onderkoeld anesthesie huidincisie, spier incisie en laterale thoracotomie in de vierde intercostale ruimte. A) Linker voorste dalende kransslagader (LAD) zichtbaar. BD) 11-0 nylon hechtdraad wordt door het midden ventrikel. E) LAD wordt geligeerd blancheren en onder de hechtdraad ter. F) en G) zijn vergrotingen van A) en E) waargenomen respectievelijk. Occ. LAD, afgesloten linker anterior dalende slagader. LA, linker atrium. LV, verliet ventrikel. GCV, grote coronaire ader. Witte pijl, LAD. Zwarte pijlpunt, schittering van verlichting. Schaal bars zijn 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Het bewijs van complete Cardiac Regeneration Na LAD Ligatie in pasgeboren muizen. Masson trichroomkleuring na LAD ligatie in P1 muizen. Hele hart en vergrotingen van het infarct gebieden worden op dag 3, 7 en 21 na LAD ligatie. Opmerking myocyten verlies en inflammatoire cellen infiltreren in infarct regio op dag 3 post-MI (witte pijl). Compleet infarct zone regeneratie te beginnen op dag 7 post-MI. Weinig bewijs van fibrose opgemerkt op dag 21 post-MI. Schaal bars zijn 200, 100 en 50 pm voor 40X, 200X en 630X vergrotingen, resp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Neonatale LAD Ligatie is 100% reproduceerbaar. A) De lijnen van het snijden van ganser harte een 0,75 mm apex stuk te maken en een 1 mm mid-base stuk voor TTCkleuring. B) Representatieve beelden van TTC gekleurd sham controle en LAD afgebonden harten. Schaal bars zijn 1 mm. C) Infarctgrootte in 13 LAD ligaties in P1 neonatale muizen. Hearts verzameld 4-6 uur na MI en de grootte van het infarct gemeten na TTC kleuring. Rood geeft levensvatbare myocard; wit geeft necrose. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Neonatale LAD Ligatie Resultaten in Betrouwbare infarct. A) Infarctgrootte in% van ischemische gebied na LAD ligatie P1 neonatale muizen (n = 4). Harten werden verzameld 24 uur na MI en de grootte van het infarct werd gemeten na Evans blauw en TTC kleuring. Blauw geeft levensvatbare myocard; rood geeft gebied in gevaar brengen; wit duidt necrosis. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM. B) Representatieve beelden van Evans blauw en TTC gekleurd LAD afgebonden harten na LAD ligatie. Scale Bar = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Neonatale LAD Ligatie Resultaten in Cardiac Dysfunction bij 24 uur na MI. Hartfunctie werd beoordeeld door echocardiografie. A) Vertegenwoordiger M-modus beelden voor zowel sham bediend en LAD afgebonden muizen. Eind diastole en systole-end zijn aangegeven met pijlen. B) Meting van fractionele verkorting, ejectiefractie en linker ventriculaire interne diameter aan beide diastole en systole. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM. N = 8 en 7 voor sham en coronaire ligatie (CAL) respectievelijk. * P <0. 05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Neonatale LAD Ligatie Resultaten in Cardiac Dysfunction bij 48 uur post-MI. Hartfunctie werd beoordeeld door echocardiografie. A) Vertegenwoordiger M-modus beelden die end-diastole (lange pijlen) en end-systole (korte pijlen) voor zowel sham bediend en LAD afgebonden muizen. B) Cardiac functionele metingen door echocardiografie waaronder fractionele verkorting, ejectiefractie en linker ventrikel inwendige diameter aan beide diastole en systole. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM. N = 4 en 6 voor sham en coronaire ligatie (CAL), respectievelijk. * P <0,05, ** P <0,01.target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De chirurgische LAD ligatie hierin gedemonstreerd is een betrouwbare methode om MI produceren neonatale muizen. Dit model biedt onderzoekers met een reproduceerbaar model waarmee zoogdieren hart regeneratie te bestuderen. Visualisatie van de coronaire vasculatuur is een belangrijk onderdeel van deze methode, de correcte plaatsing van hechtdraad en dus het garanderen van de reproduceerbaarheid. Terwijl volwassen muizen niet poikilothermic vermogens bezitten, wordt de lichaamstemperatuur en metabolisme van neonatale muizen nauw bij omgevingstemperatuur. Bovendien is de geringe omvang van neonatale muizen maakt ze ideaal voor onderkoelde inductie door oppervlaktekoeling. De timing van de operatie en de muis lichaamstemperatuur zijn essentieel voor nauwkeurigheid in deze procedure repliceren en dus moeten zorgvuldig worden gecontroleerd. Ligatie zo snel mogelijk na verdoving is bereikt het mogelijk maakt te visualiseren blancheren van het myocardium na ligatie, bevestigt chirurgische succes.
Er zijn multiple methoden die kunnen worden gebruikt voor inductie MI bevestigen. Deze omvatten TTC kleuring, echocardiografie en histologische analyse. TTC kleuring is goedkoop, reproduceerbaar en betrouwbaar en eenvoudig uit te voeren met een hoge throughput. Om deze redenen is TTC kleuring op grote schaal gebruikt. Echocardiografie kan worden gebruikt om niet-invasief scherm veranderingen in de hartfunctie na MI tijd. Definitief bewijs van MI kan worden aangetoond door middel van histologische analyse. In deze studie, alle drie de bovenstaande technieken werden toegepast om succesvolle inductie van MI controleren.
Visualisatie van LAD is van cruciaal belang voor een succesvolle MI inductie. Als de onderzoeker moeite heeft visualiseren van de LAD (waarschijnlijk door diepe onderkoeling inductie), kan de linker oorschelp iets worden opgetild met een pincet, de hoofdwortel van de LAD groter dan de meer distale segmenten en kunnen gemakkelijker toegankelijk zijn. Als de LAD niet kan worden gevisualiseerd, moet de onderzoeker niet de pretentie slagader lokation. Deze pup mag niet worden gebruikt voor experimentele ligatie en kon eerder gebruikt als schijn-geopereerde controle.
Juiste invoer in de borstholte van de 4 e intercostale ruimte is belangrijk voor optimale visualisatie en ruimte voor LAD ligatie te verkrijgen. Dit kan worden bereikt door reken- van de intercostale ruimten. Als bovendien een geringe hoeveelheid bloeden optreedt tijdens de procedure, kan worden verwijderd met steriel gaas. Als bloeden is belangrijk, maar de chirurg waarschijnlijk niet voldoende afgekoeld de muis voor het begin van de procedure, en na koeling nodig. Let op de mate van koeling zorgvuldige controle hartslag waarborgen ongeveer 20 bpm om de kransslagader visualiseren.
Door de geringe omvang van pasgeboren muizen is hoge resolutie echocardiografie moeten duidelijke M-modus beelden voor analyse van de cardiale functie. Voor het beste resultaat te garanderen hartslag opongeveer 400 bpm met lichte verdoving (0,5-1% isofluraan inademing) en behoud van een normale lichaamstemperatuur (verwarmd dock en opgewarmd echo gel). Beelden zijn het best verkregen indien het lichaam iets schuin naar rechts schouder (~ 5 ° craniaal en 5 ° naar rechts). Zorg voor voldoende echo gel wordt aangebracht om ruis te minimaliseren.
Hoewel deze aanpak biedt wel 100% reproduceerbaarheid, kan de omvang van het infarct enigszins variabel afhankelijk van de kransslagader vertakking anatomie van de individuele pasgeborene (figuur 3). Daardoor kunnen hogere getallen van verplicht statistisch significant bepaling van de effecten van verschillende behandelingen of genetische manipulaties op cardiale regeneratie. Deze benadering heeft belangrijke voordelen boven zowel neonatale apex resectie cryoinjury de pathofysiologie van deze mechanismen van schade kan totaal verschillend van MI en kan dus niet nauwkeurig rehuidige menselijke MI 8,20. Deze aanpak directer bootst typisch menselijke schade, en kunnen worden gebruikt voor cardiale regeneratie bij de vaststelling van zoogdieren MI bestuderen.
Dit model is uniek omdat het zorgt voor de studie van de verschillen in de mechanismen van herstel van hartletsel tussen de niet-regeneratieve (volwassenen) en de regeneratieve (pasgeborenen) zoogdierlijke myocardium. Bijvoorbeeld, de volwassen muis MI-model resulteert in permanente littekenvorming. Ventriculaire breuk komt vaak als gevolg van infarctexpansie. In onze ervaring met dit model (> 100 operaties; ongepubliceerde gegevens), volledige regeneratie is duidelijk 21 dagen na het infarct en ventriculaire breuk is niet waargenomen. De informatie opgebouwd uit het gebruik van dit model kan nieuwe inzichten bieden in de mechanismen die cardiale regeneratie in de volwassen kunnen bevorderen.
Recente gegevens blijkt cardiomyocyt proliferatie is een belangrijke bijdrage aan cardiale regeneratie 9 4,21. Verder onderzoek met behulp van het protocol hier gepresenteerde kunnen wijzen op therapeutische doelen voor de inductie van cardiale regeneratie post-MI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics--2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D'Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
