Abstract
L'infarctus du myocarde induite par la ligature de l'artère coronaire a été utilisé dans de nombreux modèles animaux comme un outil pour étudier les mécanismes de réparation et la régénération cardiaque, et pour définir de nouvelles cibles thérapeutiques. Pendant des décennies, les modèles de régénération complète du cœur existait chez les amphibiens et les poissons, mais un homologue de mammifère était pas disponible. La découverte récente d'une fenêtre post-natale au cours de laquelle les souris possèdent des capacités de régénération a conduit à la création d'un modèle de mammifère de la régénération cardiaque. Un modèle chirurgical de régénération cardiaque de mammifère chez la souris néonatale est présentée ici. En bref, le jour 1 (P1) des souris postnatale sont anesthésiés par l'isoflurane et placé sur un socle de glace pour induire une hypothermie. Après la poitrine est ouverte, et la descendante antérieure gauche de l'artère coronaire (LAD) est visualisé, un fil de suture est placé autour de la LAD pour infliger une ischémie myocardique dans le ventricule gauche. La procédure chirurgicale prend 10-15 min. Visualiser l'artère coronaire estcruciale pour le placement de suture précise et la reproductibilité. L'infarctus du myocarde et l'insuffisance cardiaque sont confirmés par le chlorure de triphényl-tétrazolium (TTC) coloration et l'échocardiographie, respectivement. régénération complète 21 jours après l'infarctus du myocarde est vérifiée par histologie. Ce protocole peut être utilisé comme un outil pour élucider les mécanismes de régénération cardiaque après un infarctus du myocarde chez les mammifères.
Introduction
L' infarctus du myocarde (MI) est une cause majeure de décès dans le monde, et reste responsable d'environ un tiers des cas d'insuffisance cardiaque 1. Alors que l'apparition d'une intervention percutanée et une optimisation continue de l'utilisation des thrombolytiques a augmenté reperfusion après un infarctus, la mort des cardiomyocytes et la perte de contractilité du myocarde se produit néanmoins. Il reste aussi un grand nombre de patients «non-option" qui ne sont pas candidats à ou ne voient pas bénéficier de ces interventions. Ces patients continuent de subir une ischémie invalidantes conduisant à la formation de cicatrice et délétère remodelage ventriculaire comme un mécanisme d'infarctus guérison. Ce processus aboutit finalement à une insuffisance cardiaque, dont le pronostic reste faible malgré une gestion pharmacologique optimal avec l'enzyme (ECA) de conversion de l'angiotensine et des bêta-bloquants. Malheureusement, le taux de mortalité à un an pour les patients dont la fonction ventriculaire gauche sévèrement altérée reste toujours aussiélevé que 26% 2. Transplantation cardiaque est l'option de traitement final pour les patients souffrant d'insuffisance cardiaque. Cependant, la piscine limitée des donateurs pour la transplantation cardiaque ne fait pas cette option viable pour la plupart des patients. Ainsi, la découverte de nouveaux agents thérapeutiques pour restaurer le myocarde endommagé reste primordial de résoudre le problème de la maladie cardiaque. modèles animaux fiables de lésions cardiaques sont donc nécessaires comme un élément essentiel de ce processus.
Le dogme traditionnel a dicté que des cardiomyocytes adultes sont post-mitotique, les cellules différenciées, incapable de diviser ou de-différenciation pour remplacer le myocarde endommagé 3. En tant que tel, un coeur de mammifère adulte ne pourrait jamais récupérer complètement d'une blessure, et cardiomyocytes perdus serait remplacé par du tissu fibreux. Ainsi, les recherches ont porté principalement sur des agents thérapeutiques afin de minimiser l'expansion de l'infarctus et de réduire la formation de cicatrice. Plus récemment, cependant, un changement de paradigme a eu lieudans la pensée entourant la guérison cardiaque et de nombreux efforts de recherche ont été réorientées pour se concentrer sur le potentiel de régénération cardiaque 4.
Jusqu'à une date récente, l' étude in vivo de la régénération cardiaque a été limitée à des modèles non-vertébrés, tels que ceux chez les amphibiens et les poissons téléostéens urodèles poisson 5-7. Cependant, la découverte de la capacité de régénération cardiaque chez la souris néonatale a conduit à l'élaboration de deux modèles chirurgicaux de régénération cardiaque chez les mammifères: résection de l'occlusion de l' artère coronaire cardiaque sommet et à induire un infarctus du myocarde 8,9. En 2011, un modèle de résection apex de la souris a été utilisé pour démontrer que la régénération cardiaque complet est disponible à jour postnatal 1 (P1). Cependant, cette capacité diminue rapidement après la période néonatale initiale. Le coeur de mammifère perd son potentiel de régénération peu après la naissance à P7 que le nombre de cellules progénitrices déclin, et les cardiomyocytes devenir binucléées, perdreleur capacité proliférative, et de façon permanente quitter le 10,11 du cycle cellulaire. Comprendre les différences fondamentales entre le nouveau-né et coeur de mammifère adulte peut conduire à de nouveaux aperçus sur la régénération cardiaque.
Bien que la résection apex offre en effet un aperçu de re-croissance du tissu contractile, le modèle ne simule pas la lésion cardiaque humain typique, et donc ne se prête pas aussi bien pour le développement de thérapies. Le modèle d'occlusion de l'artère coronaire, cependant, simule plus directement les aspects physiopathologiques de MI pathologie, et peut donc fournir des indications plus utiles dans les mécanismes qui peuvent être applicables à l'avancement thérapeutique à usage humain.
La ligature coronaire chirurgicale a été utilisée comme une technique expérimentale utile dans de nombreux modèles animaux de 12-14. Dans l'artère coronaire modèle de ligature des adultes, les animaux sont anesthésiés et intubé pour permettre l'ouverture de la cavité de la poitrine tout en maintenant respiratisur. Le cœur continue de battre régulièrement, ce qui permet la visualisation de la vascularisation coronaire et permettant le placement de suture précise. En outre, le cœur reste rose comme perfusion continue, et après ligature du myocarde ischémique apparaît pâle, indiquant la réussite ligature de l'artère coronaire. Le protocole décrit pour les souris néonatales, cependant, est moins fiable que l'artère coronaire n'a pas été visualisé et le chirurgien doit estimer l' endroit où placer le fil de suture 15. Bien que l'anatomie générale de la vasculature coronaire est la même, la variabilité individuelle des animaux dans la direction et la ramification de la DAL existe 16. Ainsi, lorsque «aller en aveugle," l'artère pourrait facilement être manquée. D'autres techniques telles que l'échocardiographie sont alors nécessaires pour confirmer l'induction réussie de MI, et d'assurer toutes les interventions chirurgicales entraînent une taille de l'infarctus similaire. Décrite ici est une amélioration sur une méthode récemment publiée 15, où la position de la LAD peut être établies et donc LAD peuvent être ligaturées à induire reproductible MI.
Cette technique ne nécessite pas l'intubation endotrachéale ou une ventilation mécanique, comme thoracotomie dans un état hypothermique chez la souris néonatale ne conduit pas à l'effondrement du poumon. Cependant, dans le procédé décrit précédemment, l' hypothermie sévère doit être induite au point à la fois l' apnée complète et la cessation du rythme cardiaque 15. La principale limite de cette approche est que l'artère coronaire est plus perfusé et le cœur apparaît pâle avant même LAD ligature. Dans l'approche décrite ici, la visualisation de l'artère coronaire est possible à un point de torpeur avant l'hypothermie profonde et du rythme cardiaque cessation, avec le rétablissement complet de la souris néonatale après la chirurgie. Cette méthode offre un avantage majeur de reproductibilité à 100%.
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Protocol
Les couples reproducteurs de C57BL / 6 et souris CD-1 IG-S ont été achetés auprès de Charles River. Les animaux utilisés dans cette étude ont été traitées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux, et des protocoles d'étude ont été approuvés par le Sous-Comité utilisation des animaux à l'Université Western, London, Canada.
1. Animal Care
- Après l'accouchement est terminée et les chiots ont été initialement nourris au sein par leur mère pendant quelques heures, placez-les dans une autre cage avec un CD-1 mère nourricière. CD-1 mères afficher un phénotype plus calme avec un instinct de promotion forte, et ont une moindre tendance à cannibaliser les petits blessés 15.
2. Surgery
- Provoquer l' anesthésie en plaçant le chiot dans une chambre étanche isoflurane (environ 500 pi de 100% v / v isoflurane a permis de dissiper plus de 1.300 cm 3 chambre). Gardez la souris dans la chambre jusqu'à ce que l'arrêt du mouvement (environ 30 secondes).
- Retirer moutiliser de la chambre isoflurane et induire une anesthésie hypothermiques en plaçant la souris sur la glace mouillée. Pour éviter les engelures, mettre de la glace dans un gant chirurgical stérile, envelopper la souris dans le gant et couvrir le gant avec de la glace ou de la pellicule la souris dans une gaze humide stérile et placez-le sur la glace.
NOTE: Les souris refroidir plus rapidement en cas de contact avec de la glace est sur une plus grande surface, et en tant que telle glace fondue peuvent réduire l'hypothermie temps d'induction. - Confirmer l'anesthésie par l'absence de réponse du mouvement aux pieds et la queue pincée.
NOTE: Cessation du mouvement provoqué se produit à une température corporelle de 15 ° C et 8 ° C. (Le temps de refroidissement à cette température environ 1 min). L' apnée complète et asystolie est pas nécessaire pour LAD ligature. - Déplacer le lit de glace dans la zone chirurgicale équipée d'un microscope opératoire. Assurez-vous que le chiot de la souris reste sur la glace au cours de la procédure chirurgicale ensemble.
NOTE: La zone chirurgicale, la gaze et les instruments chirurgicaux doivent être stérilisés. Maintadans le champ stérile tout au long de la procédure, et l'usure à usage unique, gants chirurgicaux stériles. Pommade ophtalmique n'est pas nécessaire que les souris sont nés avec les yeux fermés 17. - Placez le chiot de la souris dans la position latérale droite de décubitus. Désinfecter la poitrine en essuyant doucement avec une solution de povidone-iode suivi par un tampon imbibé d'éthanol.
- Effectuer l'incision de la peau sur la poitrine gauche le long de la ligne mi-axillaire en coupant la peau entre le xiphoïde et l'aisselle gauche de quelques millimètres en dessous de la patte avant gauche. Également utiliser des ciseaux pour couper à travers la couche de muscle pectoral sous-jacent.
- Effectuer une thoracotomie gauche dans la 4 ème espace intercostal en séparant les côtes et les muscles intercostaux avec une pince.
REMARQUE: les côtes néonatales sont très fragiles et peuvent être facilement brisées. Pour éviter cela, doucement nervures séparées par l'ouverture des pinces le long du muscle intercostal (plutôt que de saisir les côtes). - Visualisez la descendante antérieure gauche artère coronaire (LAD) sortant de la aur gaucheIcle derrière la veine pulmonaire et descendant au-delà de la grande veine cardiaque.
NOTE: Dans cette fenêtre néonatale précoce, le thymus est souvent visualisée et peut couvrir une partie de la base cardiaque. La DAL est visible à côté de la position émergente du thymus, en fonction de l'angle d'incision thoracique. - Ligaturer l'artère interventriculaire antérieure en faisant passer un fil de suture en nylon 11-0 (0,007 mm de l' aiguille de diamètre) au- dessous de l'artère à travers le ventricule milieu en dessous de l'oreillette gauche (figure 1C). L' ischémie est confirmée par blanchissement du myocarde en aval du site de suture (figure 1G).
- Fermer l'incision thoracique 8-0 en utilisant des sutures en nylon (aiguille de 0,15 mm de diamètre). Utilisez deux sutures pour fermer les côtes. Placer les deux fils de suture à nervure avant ligation pour assurer que l'aiguille ne pas percer les poumons lors du passage à travers la cavité corporelle.
- Après la fermeture des côtes, retirer la souris du lit de glace. Gardez la souris dans la zone chirurgicale et le placer directement sur le stérile chirurgicalwel sur un coussin chauffant chaud à 37 ° C pour commencer le réchauffement.
- Une fois sur la zone stérile chauffée, fermer les couches musculaires et de la peau en utilisant 8-0 sutures en nylon (aiguille 0,15 mm de diamètre). Utilisez une suture pour la couche musculaire et utiliser deux sutures pour l'incision de la peau.
NOTE: Muscle et couches de la peau peuvent être fermées sur un coussin chauffant pour réduire l'hypothermie temps d'exposition. la température de la souris commence à monter une fois placé sur le coussin chauffant, mais reste suffisamment bas pour l'entretien de l'anesthésie pendant le muscle et la peau de fermeture.
3. Récupération chirurgicale
- Continuer réchauffement rapide sur un coussin chauffant chaud jusqu'à ce que le retour du mouvement spontané. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Retirer povidone-iode et le sang en essuyant doucement site de la lésion avec de l'éthanol-tige.
- Après une récupération suffisante de l'anesthésie, retirez-le de la zone chirurgicale stérile, étaler avec une literie de famille d'la cage de la mère, et le retour chiot à la mère adoptive. Cela permet d'éviter le rejet de la mère ou de la cannibalisation.
REMARQUE: Ne pas retourner les chiots dans une cage avec d'autres animaux jusqu'à guérison complète. Si une portée entière n'a pas été utilisé, et littermates rester avec la mère adoptive, placer les chiots récupérés dans le milieu de la litière. Si vous effectuez plus d'une intervention chirurgicale, complète toutes les interventions chirurgicales nécessaires à une portée individuelle avant de retourner les souris à leur mère adoptive. - Observer le comportement de la mère nourricière vers le chiot tous les 10 - 15 min pour les 2 - 3 heures pour assurer l'acceptation du chiot. Si la mère affiche l'agressivité envers le chiot blessé, retirer le chiot et euthanasier par overdose isoflurane (> 5%, jusqu'à ce que l'arrêt de la respiration), suivie par décapitation. NOTE: Perioperative médicaments analgésiques ne sont pas nécessaires car les réflexes de douleur centralisées ne sont pas complètement développés à ce début de 15 ans.
4. Mesure de la taille de l'infarctus du myocarde 4 -6 h Post-MI
- Permettre aux chiots de récupérer dans les soins d'un CD-1 mère nourricière pour une période de 4-6 heures. Retirer le chiot de la cage avec la mère et l'euthanasier par overdose isoflurane suivi par décapitation avec de grands ciseaux.
- Exciser le coeur sous microscope à dissection, attention à ne pas déchirer le myocarde.
- Couper la peau du processus xiphoïde vers le haut du thorax. Ouvrir la paroi abdominale en dessous de la cage thoracique. Attrapez la cage thoracique inférieure et couper à travers les nervures et la musculature longitudinalement le long de la ligne mi-axillaire gauche du diaphragme à l'aisselle.
- Tenir des ciseaux dans le plan transversal et soigneusement couper à travers la membrane de gauche à droite. Assurez-vous de placer des ciseaux en dessous du niveau du cœur afin d'éviter tout dommage à l'apex.
- Attrapez cage thoracique et couper côté droit de côtes et de la musculature long de la ligne mi-axillaire droite. Retirer toutes les connexions vasculaires au coeur avec des ciseaux. Retirer le cœur de la cavité thoracique en saisissantla base.
- La section du coeur en trois morceaux en utilisant une lame de rasoir en acier au carbone chirurgical. Faire la première coupe le long de l'axe court du cœur à mi-chemin entre la suture et l'apex cardiaque. Faire la deuxième coupe au niveau de la suture (figure 3A).
NOTE: Cela laisse une section apex environ 0,75 mm d'épaisseur pesant 0,0018 g; une section mi-base d'environ 1 mm d'épaisseur, pesant 0,0065 g; et la base du coeur. - Placer les sections cardiaques à 1% de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) à la température ambiante pendant 10 - 15 min. Surveillez attentivement l'échantillon pour éviter une coloration.
- Pour augmenter le contraste, fixer des tranches cardiaques colorées avec 4% de paraformaldehyde pendant une nuit à 4 ° C. Pour calculer% de la surface de l'infarctus, sections cardiaques photographie et mesurer la zone de l'infarctus sur le logiciel d'imagerie. Le myocarde viable tache rouge , tandis que la zone de l' infarctus est délimité en blanc 18.
5. Mesure deFonction cardiaque par échocardiographie Post-MI
- Permettre aux chiots de récupérer dans les soins d'un CD-1 mère nourricière pour une période de 24-48 heures. Provoquer l'anesthésie en plaçant le chiot dans une chambre étanche isoflurane (5% de l'isoflurane). Gardez la souris dans la chambre jusqu'à ce que l'arrêt du mouvement (environ 30 secondes).
- Fixer le chiot dans la position couchée sur un quai chauffé (température 37 ° C) avec son nez dans un cône pour fournir 0,5 à 1% d'isoflurane (pour l'entretien de l'anesthésie). Placez gel d'écho préchauffé sur la zone thoracique gauche.
- Obtenir une vue à long axe parasternale du ventricule gauche (VG). Assurer que les images sont obtenues en dessous du niveau de la suture dans le VG. Après l'acquisition de la position, tourner la sonde à ultrasons (40 MHz) 90 ° pour obtenir une vue parasternale petit axe, et enregistrer en mode M images échographiques.
- Mesurer la tension diastolique final et fin ventriculaire gauche systolique diamètres intérieurs des court-axe des images en mode M. Calculer la fraction d'éjection et fractioshortening nal.
6. Mesure de la taille de l'infarctus du myocarde 24 h Post-MI
- Permettre aux chiots de récupérer dans les soins d'un CD-1 mère adoptive pendant une période de 24 heures. Retirer le chiot de la cage avec la mère et l'euthanasier par overdose isoflurane suivi par décapitation avec de grands ciseaux.
- Ouvrir la cavité thoracique comme à l'étape 4.2. Avant exciser le cœur, saisir attentivement l'aorte thoracique juste au-dessus du diaphragme avec une pince fine. Tenir des ciseaux fins dans le plan coronal, à plat contre la paroi thoracique, et couper l'aorte thoracique au large de la paroi thoracique postérieure mouvement des ciseaux dans le sens crânien.
- Couper l'aorte libre de la paroi thoracique, ainsi que d'autres connexions jusqu'à ce qu'il atteigne le coeur. Exciser le cœur en le saisissant par la veine cave supérieure et couper toutes les autres connexions vasculaires au corps.
- Rincer le coeur (avec l'aorte ci-joint) dans une solution saline. canuler soigneusement l'aorte thoracique avec une aiguille de calibre 30 et attacher uneorta à canule avec du fil de suture 8-0 en nylon.
- Perfuser le cœur avec 1 ml de solution saline dans l'aorte par l'intermédiaire d'une aiguille de calibre 30 à un débit de 1 ml / min. Perfuser le cœur avec 150 ul de 2% solution de bleu Evans à un débit de 1 ml / min. Retirer le cœur de la canule, section en trois morceaux et tacher avec TTC, comme décrit dans la section 4.
- Pour calculer la taille de l'infarctus, sections cardiaques photographie et mesurer la zone de l'infarctus sur le logiciel d'imagerie. Le myocarde viable taches bleu, la zone à des taches de risque rouge, et la zone de l'infarctus est délimité en blanc.
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Representative Results
La procédure d'infarctus du myocarde à P1 peut être achevée en 10-15 min et a un taux de 7,8% (de petits 5 sur 64) de la mortalité. Après la chirurgie, les souris se remettre de l'anesthésie hypothermiques dans les 5 prochaines - 20 min (temps de récupération dépend de la température du corps atteint au cours de l'anesthésie et de la vitesse du chirurgien). Lors de l'utilisation des chiots P7 (par comparaison avec un myocarde non régénératif), une période de refroidissement plus longue est nécessaire pour accéder à la torpeur. chiots P7 sont beaucoup plus grandes et ont plus de difficulté à récupérer à la fois les lésions cardiaques et d'hypothermie, ce qui entraîne un taux de mortalité beaucoup plus élevé de 26,9% (de chiots 14 sur 52).
Les résultats des études précédentes sont confirmées ici, ce qui indique l' induction de l' anesthésie hypothermique à près de 10 ° C (entre 8 ° C et 15 ° C) 19. Dans cette fenêtre de température, le rythme cardiaque ne lent,mais le rythme continue à des taux compris entre 24 bpm et 11 bpm. La fréquence cardiaque faible à ce niveau de refroidissement réduit considérablement peropératoire saignement. La DAL peut être facilement visualisés et ligaturé à ces températures (figure 1). La LAD reste visible jusqu'à ce que la température du corps atteignent entre 9,6 ° C et 4,9 ° C, ce qui provoque l' abaissement de la fréquence cardiaque à 2 bpm ou asystolie.
Après LAD ligature au niveau P1, les chiots se rétablissent complètement et atteignent une taille corporelle comparable à celle des témoins de la même portée. Une fois placé en arrière avec leur mère adoptive, chiots à retrouver les capacités de sensibilisation et d'alimentation comparables à littermates dans environ 10 min. Après examen histologique 3 jours post-IM, il existe des preuves de l' infarctus, avec infiltration de cellules inflammatoires, une réponse post-infarctus typique (Figure 2). Au jour 7 post-MI, tissu ventriculaire gauche semble normal. Par jour 21 post-MI, c complètela régénération ardiac a eu lieu.
2,3,5-triphényltétrazolium chlorure (TTC) coloration 4-6 h post-MI a été utilisé comme une confirmation de l'induction cohérente de MI. La zone rouge représente myocardique viable et la zone blanche représente le tissu mort ischémique. Sur un total de 13 LAD chirurgies de ligature, 100% des coeurs étaient infarci, avec une taille de l' infarctus moyenne de 36% (figure 3). TTC coloration avec Evans perfusion bleu a également été effectuée à 24 heures post-MI pour démontrer la persistance du tissu infarci et mesurer la taille de l' infarctus sur la base de la zone à risque (Figure 4). Dans ces coeurs, myocarde viable taches bleu, la zone à taches rouges de risque, et la zone de l'infarctus est délimité en blanc. la taille de l'infarctus a été calculée en pour cent de la zone à risque. Dans 4 LAD chirurgies de ligature, 100% des coeurs étaient infarci, avec une taille de l' infarctus moyenne de 49% de la zone à risque (Figure 4).
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Pour confirmer Infarctus induction, échocardiographie a été réalisée à 24 et 48 heures post-MI. À 24 h post-infarctus, la fraction d'éjection (EF) a été significativement réduite de 84% à 74% et la fraction de raccourcissement (FS) significativement réduite de 50% à 40% (figure 5). Par 48 heures post-MI, EF a été réduite à 46% contre 80% chez les témoins et FS a également été réduite de manière significative à 25%, contre 50% chez les témoins. En outre, il y avait une réduction significative du diamètre interne systolique du ventricule gauche à 48 heures (figure 6). LV épaisseur de la paroi antérieure n'a pas été significativement diminué à 24 ou 48 heures post-MI (figures 5 et 6).
Figure 1. Coronary Artery est visible lors de la procédure néonatale LAD. P1 af de la souris néonataleter anesthésie hypothermique, incision de la peau, l' incision musculaire et thoracotomie latérale dans le quatrième espace intercostal. A) antérieure gauche artère coronaire descendante (DAL) est visible. BD) 11-0 suture en nylon est passé à travers le milieu ventricule. E) LAD est ligaturé et le blanchissement observé en dessous du site de suture. F) et G) sont des grossissements de A) et E) , respectivement. Occ. LAD, antérieure occlus gauche de l'artère. LA, oreillette gauche. LV, le ventricule gauche. GCV, grande veine coronaire. flèche blanche, LAD. tête de flèche noire, reflets de l'éclairage. Les barres d'échelle sont 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Preuve de Complete Cardiac Régénération Après LAD Ligation chez la souris néonatale. trichrome de coloration de Masson après ligature LAD chez les souris P1. les cœurs et les grossissements entiers dans les zones d'infarctus sont présentés le jour 3, 7 et 21 après LAD ligature. Notez la perte de myocytes et de cellules inflammatoires s'infiltrer dans la région de l'infarctus au jour 3 post-MI (flèche blanche). zone Infarctus complète régénération commençant au jour 7 post-MI. Peu de preuves de la fibrose a noté au jour 21 post-MI. Les barres d'échelle sont de 200, 100 et 50 um pour 40X, grossissements 200X et 630X, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Neonatal LAD Ligation est 100% reproductible. A) Lignes de tronçonnage de tout coeur pour créer une pièce apex 0,75 mm et une pièce de 1 mm à mi-base pour TTCcoloration. B) images représentatifs de TTC teinté contrôle factice et LAD ligaturé cœurs. Les barres d'échelle sont 1 mm. La taille C) de l' infarctus dans 13 ligatures LAD chez les souris néonatales P1. Coeurs collectés 4-6 heures post-MI et la taille de l'infarctus mesurée après coloration TTC. Le rouge indique myocardique viable; blanc indique une nécrose. Les données sont la moyenne ± SEM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Neonatal LAD Ligation Résultats dans Reliable Infarction. A) la taille de l' infarctus en tant que% de la zone ischémique après ligature LAD chez les souris néonatales P1 (n = 4). Coeurs ont été recueillies 24 heures post-MI et la taille de l'infarctus a été mesurée après Evans coloration au bleu et TTC. Bleu indique myocardique viable; rouge indique la zone à risque; blanc indique necrosis. Les données sont la moyenne ± SEM. B) images représentatifs de Evans bleu et TTC LAD teinté coeurs ligaturées après LAD ligature. Barre d' échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Neonatal LAD ligatures Résultats dans cardiaque Dysfonction à 24 h post-MI. La fonction cardiaque a été évaluée par échocardiographie. A) Représentant en mode M images pour les deux souris sham exploité et LAD ligaturé. Fin de diastole et de fin de systole sont indiqués par des flèches. B) Les mesures de la matière grasse fractionnée, une fraction d'éjection et le diamètre interne du ventricule gauche à la fois une diastole et une systole. Les données sont la moyenne ± SEM. N = 8 et 7 pour imposture et la ligature de l'artère coronaire (CAL), respectivement. * P <0. 05. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Neonatal LAD ligatures Résultats dans cardiaque Dysfonction à 48 h post-MI. La fonction cardiaque a été évaluée par échocardiographie. A) Représentant en mode M images montrant la fin de diastole (flèches longues) et de fin de systole (flèches courtes) pour les deux sham exploité et LAD ligaturé souris. B) mesures fonctionnelles cardiaques par échocardiographie , y compris la fraction de raccourcissement, la fraction d'éjection, et le diamètre interne du ventricule gauche à la fois diastole et systole. Les données sont la moyenne ± SEM. N = 4 et 6 pour imposture et la ligature de l'artère coronaire (CAL), respectivement. * P <0,05, ** P <0,01.target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La ligature de LAD chirurgicale démontré ici est une méthode fiable pour produire MI chez les souris néonatales. Ce modèle fournit aux chercheurs un modèle reproductible avec lequel pour étudier les mammifères la régénération cardiaque. Visualisation de la vasculature coronaire est un élément clé de cette méthode, assurant le placement de suture correcte et garantissant ainsi la reproductibilité. Alors que les souris adultes ne possèdent pas les capacités poïkilothermes, la température du corps et le taux métabolique de souris néonatale est étroitement associée à la température ambiante. En outre, la petite taille des souris néonatale les rend idéales pour l'induction hypothermique par un refroidissement de la surface. Le moment de la chirurgie et la température du corps de la souris sont cruciales pour la précision dans la reproduction de cette procédure et doit donc être surveillée attentivement. Ligation dès que possible après la torpeur est atteinte offre la possibilité de visualiser blanchissement du myocarde post-ligation, confirmant le succès chirurgical.
Il y a muméthodes ltiple qui peuvent être utilisés pour confirmer l'induction MI. Ceux-ci incluent la coloration TTC, l'échocardiographie et l'analyse histologique. coloration TTC est à faible coût, reproductible et fiable, et facile à réaliser avec un débit élevé. Pour toutes ces raisons, la coloration TTC a été largement utilisé. L'échocardiographie peut être utilisé pour surveiller l'évolution de manière non invasive de la fonction cardiaque post-MI au fil du temps. la preuve définitive de MI peut être démontré par l'analyse histologique. Dans la présente étude, les trois techniques ci-dessus ont été utilisées pour vérifier l'induction réussie de MI.
Visualisation de LAD est essentielle à la réussite de l'induction MI. Si l'enquêteur connaît la difficulté à visualiser la LAD (probablement en raison de profonde induction de l'hypothermie), l'oreillette gauche peut être levée légèrement avec une pince, comme la racine principale de la LAD est plus grande que les segments plus distale et peut être plus facilement visible. Si la LAD ne peut pas être visualisé, l'enquêteur ne devrait pas présumer de l'artère location. Ce chiot ne doit pas être utilisé pour la ligature expérimentale et pourrait plutôt être utilisé comme un simulacre actionné contrôle.
Corriger l' entrée dans la cavité de la poitrine au 4 ème espace intercostal est important d'obtenir une visualisation optimale et l' espace pour LAD ligature. Ceci peut être réalisé par le comptage minutieux des espaces intercostaux. En outre, si une quantité mineure d'un saignement se produit au cours de la procédure, il peut être éliminé avec de la gaze stérile. Si le saignement est important, cependant, le chirurgien a probablement pas refroidi la souris suffisamment avant de commencer la procédure, et un refroidissement supplémentaire est nécessaire. S'il vous plaît noter que le degré de refroidissement doit être soigneusement contrôlée afin d'assurer la fréquence cardiaque à environ 20 bpm pour visualiser l'artère coronaire.
En raison de la petite taille des souris néonatales, haute résolution échocardiographie est nécessaire pour obtenir des images en mode M claires pour l'analyse de la fonction cardiaque. Pour de meilleurs résultats, assurez-vous de la fréquence cardiaque auenviron 400 bpm avec une anesthésie légère (0,5 à 1% d'isoflurane par inhalation) et maintenir la température normale du corps (quai chauffé et chauffé gel d'écho). Les images sont mieux acquises si le corps est légèrement incliné vers l'épaule droite (~ 5 ° crânialement et 5 ° vers la droite). Assurez-gel d'écho suffisant est appliqué pour minimiser le bruit.
Bien que cette approche ne propose reproductibilité à 100%, la taille de l'infarctus peut être quelque peu variable en fonction de l'artère coronaire de ramification anatomie de l'individu nouveau - né (figure 3). Par conséquent, le nombre de n plus élevées peuvent être nécessaires pour atteindre une signification statistique pour déterminer les effets des différents traitements ou manipulations génétiques sur la régénération cardiaque. Cependant, cette approche tient à la fois des avantages majeurs sur la résection apex néonatale et cryolésion que la physiopathologie de ces mécanismes de blessure peut être tout à fait différent de MI et peut donc pas re avec précisionprésente humaine MI 8,20. Cette approche imite plus directement blessure humaine typique, et peut être utilisé pour étudier la régénération cardiaque dans le cadre d'un mammifère MI.
Ce modèle est unique car elle permet l'étude des différences dans les mécanismes de récupération d'une lésion cardiaque entre la non-régénérative (adulte) et la régénération (néonatale) myocardique de mammifère. Par exemple, la souris adulte résultats du modèle MI dans la formation de cicatrice permanente. la rupture ventriculaire se produit souvent à la suite de l'expansion de l'infarctus. Dans notre expérience avec ce modèle (> 100 interventions chirurgicales; données non publiées), une régénération complète est évidente 21 jours après l'infarctus et ventriculaire rupture n'a pas été observée. Les informations courus de l'utilisation de ce modèle peut offrir de nouvelles perspectives sur les mécanismes qui peuvent favoriser la régénération cardiaque chez l'adulte.
Des données récentes indiquent la prolifération des cardiomyocytes est un contributeur majeur à la régénération cardiaque 9 4,21. D'autres recherches en utilisant le protocole présenté ici peut pointer vers des cibles thérapeutiques pour l'induction de la régénération cardiaque post-infarctus du myocarde.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
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