Abstract
אוטם שריר לב הנגרמת על ידי קשירת עורקים כלילית נעשה שימוש במודלים של בעלי חיים רבים ככלי ללמוד את המכניזם של תיקון לב והתחדשות, ולהגדיר מטרות חדשות עבור רפוי. במשך עשרות שנים, מודלים של התחדשות לב מלאה קיימים דו-חיים ודגים, אבל עמיתו יונק לא היה זמין. התגלית האחרונה של חלון לאחר לידה שבמהלכה עכברים בעלי יכולות משובים הובילה להקמת מודל יונק של התחדשות לב. מודל כירורגית של התחדשות לב יונקת העכבר בילוד מוצג במסמך זה. בקצרה, היום לאחר לידה 1 (P1) בעכברים מורדמים על ידי isoflurane והניחו על כרית קרח כדי לגרום היפותרמיה. לאחר החזה נפתח, ואת השמאלי הקדמי היורד לב כלילי (LAD) הוא מדמיין, תפר ממוקם סביב LAD לגרום איסכמיה לבבית בחדר השמאלי. ההליך הכירורגי לוקח 10-15 דקות. לדמיין את העורקים הכליליים הואחיוני עבור מיקום ואת שחזור תפר מדויק. אוטם שריר הלב וחוסר תפקוד הלב יאושרו על ידי כלוריד triphenyl-tetrazolium (TTC) מכתים אקוקרדיוגרפיה, בהתאמה. התחדשות מלאה 21 ימים לאחר אוטם שריר לב מאומת על ידי היסטולוגיה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ככלי להבהיר מנגנונים של התחדשות לב יונקת לאחר אוטם שריר לב.
Introduction
אוטם שריר הלב (MI) הוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם, ונשאר אחראי כשליש מהמקרים אי ספיקת לב 1. בעוד כניסתו של התערבות מלעורית ואופטימיזציה מתמדת של שימוש thrombolytics גדלה reperfusion הבא MI, מות cardiomyocyte ואובדן שריר לב התכווצות בכל זאת מתרחשת. יש גם להישאר מספר רב של "אין-אפשרות" לחולים שאינם מועמדים או לא רואים תועלת התערבויות אלה. חולים אלה ממשיכים לחוות איסכמיה השבתת מוביל צלקת היווצרות שיפוץ חדרית מזיק כמנגנון של ריפוי אוטם. תהליך זה בסופו של דבר התוצאות אי ספיקת לב, אשר הפרוגנוזה נשאר עני למרות ניהול תרופתי אופטימלי עם מעכבי אנגיוטנסין-המרת אנזים (ACE) וחוסמי בטא. למרבה הצער, שיעור התמותה לשנה עבור חולים עם תפקוד חדר שמאל נפגע קשה עדיין נשארגבוה ככל 26% 2. השתלת לב היא אופציית הטיפול הסופי עבור חולים עם כשל לבבי. עם זאת, את מאגר התורמים המוגבל השתלת לב לא להפוך את זה אפשרות מעשית עבור רוב החולים. לפיכך, חשיפת סוכנים טיפוליים חדשניים כדי לשחזר את שריר לב הניזוק נשארת עליונה לפתרון הבעיה מהחלות-הלב. במודלים של בעלי חיים אמינים של פגיעה לבבית ולכן נדרשים כמרכיב קריטי של תהליך זה.
דוגמא מסורתית כתיב כי cardiomyocytes המבוגר הם-mitotic פוסט, תאים מובחנים סופנים, מסוגל חלוקתם או דה-הבחנה להחליף את שריר הלב הפגוע 3. ככזה, לב יונקי בוגרים לא יכול להחלים לגמרי מפציעה, ו cardiomyocytes אבד יוחלף עם רקמה סיבית. לפיכך, מחקר התמקד בעיקר בתרופות כדי למזער התרחבות אוטמת ולהפחית היווצרות צלקת. לאחרונה עם זאת, שינוי פרדיגמה התרחשבחשיבה סביב ריפוי לב מאמצי מחקר רבים כבר מנותב להתמקד פוטנציאל התחדשות לב 4.
עד לאחרונה, in vivo המחקר של התחדשות לב הוגבל דגמים שאינם חוליות, כגון אלה דו חיים urodele ו teleost דגים 5-7. אולם גילוי יכולת התחדשות לב של העכבר בילוד הוביל להתפתחות של שני מודלים כירורגית של התחדשות לב יונקת: כריתה של הספיגה העורק איפקס הכליליים של הלב לגרום לאוטם שריר לב 8,9. בשנת 2011, מודל כריתת איפקס עכבר שמש על מנת להוכיח כי התחדשות לב מלאה אפשרית יום לאחר לידת 1 (P1). אולם, קיבולת זו צונחת בתוך זמן קצר לאחר תקופת בילוד הראשונית. הלב היונק מאבד פוטנציאל ההתחדשות שלה זמן קצר לאחר לידה ב P7 כמו ירידה במספרי תא אב, ואת cardiomyocytes הופך binucleated, לאבדכשירות השגשוג שלהם, ולצמיתות לצאת 10,11 מחזור התא. הבנת ההבדלים הבסיסיים בין בילוד ולב יונק בוגרים עשויה להוביל לתובנה רומן לתוך התחדשות לב.
בעוד כריתת איפקס אכן מציעה תובנה מחדש הצמיחה של רקמת התכווצות, המודל אינו לדמות פציעת לב אנושית טיפוסית, ולכן אינו להשאיל עוצמה כמו גם אל בפיתוח התרופה. המודל חסימה של העורקים הכליליים, אולם, באופן ישיר יותר המדמה את ההיבטים pathophysiologic של פתולוגיה MI, ובכך עשויה לספק תובנות מועילות יותר לתוך המנגנונים שעשויים לחול על קידום טיפולי לשימוש בבני אדם.
קשירת כלילית כירורגי נעשה שימוש כטכניקה ניסיוני שימושי במודלים של חיות רבות 12-14. בשנת מודל הקשירה כלילית עורק המבוגרים, בעלי חיים מורדמים חובר לצינור לאפשר פתיחת בית החזה תוך שמירת respiratiעַל. הלב ממשיך לפעום באופן סדיר, המתיר ההדמיה של כלי הדם הכליליים ומאפשר עבור מיקום תפר מדויק. יתר על כן, הלב נשאר ורוד כמו זלוף ממשיך, ואחרי קשירת שריר לב איסכמי מופיע חיוור, המציין קשירת עורקים כלילית מוצלחת. הפרוטוקול המתואר לעכברים ילודים, אולם הוא פחות אמין כמו העורקים כליליים לא דמיינו והמנתח חייב להעריך היכן למקם את התפר 15. למרות האנטומיה כללית של כלי הדם הכליליים זהה, השתנות חיה הפרט בכיוון הסתעפות של LAD קיים 16. לפיכך, כאשר "הולך עיוור," העורק יכול בקלות לפספס. טכניקות אחרות כגון אקו הם מכן נדרשו לאשר אינדוקציה מוצלחת של MI, ועל מנת להבטיח את כל הניתוחים לגרום גודל אוטם דומה. המתואר כאן הוא שיפור על שיטה שפורסמו לאחרונה 15, שם עמדת LAD ניתן established ובכך LAD ניתן ligated לגרום MI reproducibly.
טכניקה זו אינה דורשת אינטובציה endotracheal או אוורור מכני, כמו פתיחת בית החזה במצב היפותרמיה בתוך העכבר הילוד לא לגרום לקריסת הריאות. עם זאת, בשיטה שתוארה לעיל, היפותרמיה חמורה חייבת להיגרם עד לנקודה של שני להשלים דום נשימה והפסקה של קצב לב 15. המגבלה העיקרית של גישה זו היא כי העורק הכלילי הוא perfused כבר לא והלב מופיע חיוור עוד לפני קשירת LAD. לפי הגישה המתוארת כאן, ויזואליזציה עורק כלילי אפשרי בנקודה של קהות חושים לפני היפותרמיה עמוק והפסקת קצב לב, עם החלמה מלאה של העכבר בילוד לאחר הניתוח. שיטה זו מציעה יתרון גדול של שחזור 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
זוגות מקננים של C57BL / 6 ועכברים CD-1 IG-S נרכשו צ'ארלס ריבר. בעלי חיים המשמשים במחקר זה טופלו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים, ופרוטוקולים המחקר אושרו על ידי ועדת המשנה שימוש בבעלי חיים באוניברסיטת Western, לונדון, קנדה.
1. טיפול בבעלי חיים
- לאחר הלידה היא מלאה גורים כבר בתחילה הניקו ידי אמם במשך כמה שעות, למקם אותם בכלוב שונה עם אמו מאמצת CD-1. CD-1 אמהות להציג פנוטיפ יותר רגוע עם אינסטינקט טיפוח חזק, ויש לי נטייה נמוכה יותר קניבליזציה גורים פצועים 15.
2. כירורגיה
- להשרות הרדמה על ידי הצבת את הגור בתא isoflurane אטום (כ 500 μl של isoflurane 100% v / v מותר לפזר מעל 1,300 ס"מ 3 קאמרית). שמור את העכבר בתא עד להפסקת התנועה (כ -30 שניות).
- הסר מולהשתמש מחדר isoflurane ולגרום הרדמה היפותרמיה ידי הצבת העכבר על קרח רטוב. כדי למנוע כוויות קור, למקם קרח בתוך כפפה כירורגית סטרילית, לעטוף את העכבר בתוך כפפה ולכסות את הכפפה עם קרח או לעטוף את העכבר גזה רטוב סטרילית ומניחים אותו על קרח.
הערה: עכברים לקרר מהר יותר כאשר במגע עם קרח הוא על פני שטח פנים גדול יותר, וכתוצאה קרח נמס כזה יכול לקצר את זמן אינדוקציה היפותרמיה. - אשר הרדמה על ידי חוסר תגובת תנועת קמצוץ בוהן וזנב.
הערה: הפסקת תנועה עוררה מתרחשת בטמפרטורת גוף בין 15 ° C ו -8 מעלות צלזיוס. (קירור הזמן בטמפרטורה זו כ 1 דק '). דום נשימה ו asystole שלמים אינה נדרשו עבור קשירת LAD. - הזיזו את המיטה קרח על אזור הניתוח מאובזר עם מיקרוסקופ ההפעלה. ודא כי גור העכבר נשאר על קרח במהלך ההליך הכירורגי כולו.
הערה: אזור הניתוח, גזה מכשירי ניתוח צריך להיות מעוקר. Maintaבשדה סטרילי לאורך כל ההליך, וללבוש ליחד, כפפות מנתחים סטרילית. משחת עיניים אינו נדרש כעכברים נולדים בעיניים עצומות 17. - מניח את גור העכבר במצב משכוב לרוחב הנכון. לחטא החזה ידי מנגב בעדינות עם פתרון povidone יוד ואחריו ספוגית אתנול.
- בצע חתך בעור על החזה השמאלי לאורך קו אמצע השחי על ידי חיתוך העור בין xyphoid ו השחי השאירה כמה מילימטרים מתחת רגלה השמאלית הקדמית. כמו כן להשתמש במספריים לחתוך את שכבת השריר הבסיסית החזה.
- בצע פתיחת בית חזה שמאלית במרחב 4 th צלעי ידי הפרדת צלעות ושרירי צלעי עם מלקחיים.
הערה: צלעות ילודים הן שבירות מאוד ניתן לשבור בקלות. כדי למנוע זאת, צלעות נפרדות בעדינות על ידי פתיחת מלקחיים לאורך שריר צלעי (ולא אחיזת צלעות). - דמיינו את השמאלי הקדמי היורד לב כלילית (LAD) המתעוררים משמאל Auricle מאחורי עורק הריאה ויורד מעבר וריד לב הרב.
הערה: בחלון בילוד מוקדם זה, התימוס הוא מדמיין לעתים קרובות עשוי לכסות חלק מבסיס הלב. הנער ניתן לראות העולה ליד עמדת התימוס, בהתאם לזווית של חתך בית החזה. - ולקשור את LAD ידי העברת תפר ניילון 11-0 (0.007 מ"מ מחט בקוטר) מתחת העורק דרך החדר באמצע מתחת אפרכסת שמאל (תרשים 1C). איסכמיה הוא אישר עם הלבנה של שריר הלב שמתחת לאזור תפר (איור 1G).
- סגירת חתך החזה באמצעות 8-0 תפרי ניילון (מחט בקוטר 0.15 מ"מ). השתמש בשני תפרים כדי לסגור את הצלעות. מניח שני תפרי הצלעות לפני ligating כדי להבטיח את המחט לא לנקב את הריאות כאשר עוברים דרך חלל הגוף.
- לאחר סגירת הצלעות, הסר את העכבר מן המיטה קרח. שמור את העכבר בתוך אזור הניתוח, ולמקם אותו ישירות על ניתוח סטרילי כדיwel על כרית חימום חמה ב 37 מעלות צלזיוס להתחיל התחממות.
- לאחר על האזור המחומם סטרילי, לסגור את שכבות שריר ועור באמצעות 8-0 תפרי ניילון (מחט בקוטר 0.15 מ"מ). השתמש תפר אחד עבור שכבת השריר ולהשתמש שני התפרים עבור החתך בעור.
הערה: שרירים ושכבות עור עלולים להיות סגורים על כרית חימום כדי לקצר את זמן חשיפה היפותרמיה. טמפרטורת העכבר מתחילה לעלות להציב פעם על כרית החימום, אבל נשארה מספיק נמוך מספיק עבור תחזוקת הרדמה במהלך סגר שרירים ועור.
3. שחזור כירורגי
- משך התחממות מהירה על כרית חימום חמה עד להשבת תנועה ספונטנית. אל תשאירו חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. הסר povidone יוד ודם ידי מנגב פגיעה באתר בעדינות עם ספוגית אתנול.
- לאחר התאוששות מספיק מן ההרדמה, להסיר אותו מאזור ניתוח סטרילי, למרוח אותה עם מצעים מ אומנהאמו של כלוב, ותשואת הגור לטפח אמא. זה עוזר למנוע דחייה או קניבליזציה אימהית.
הערה: אל תחזרו גורים לכלוב עם בעלי חיים אחרים עד התאושש לחלוטין. אם המלטה כולו לא נעשה שימוש, ואת להמלטה להישאר עם אמה המאמצת, למקם הגורים התאושש באמצע המלטה. אם ביצוע יותר מאשר ניתוח אחד, להשלים את כל הניתוחים הנדרשים המלטה בודדת לפני שחזר עכברים האם האומנת שלהם. - להתבונן בהתנהגות של אמה המאמצת לעבר הגור כל 10 - 15 דקות עבור 2 - 3 שעות כדי להבטיח קבלה של הגור. במידה והאם מציג בתוקפנות כלפי הגור הפצוע, להסיר את הגור ואת להרדים על ידי יתר isoflurane (> 5%; עד למועד הפסקת נשימה), ואחריו עריפת ראש. הערה: תרופות שיכוך כאבי Perioperative אינן נדרשות כמו רפלקסים כאב הריכוזיים אינם מפותחים בגיל מוקדם זה 15.
4. מדידה של שריר לב אוטם גודל 4 -6 שעות לאחר MI
- אפשר גורים להתאושש בטיפול אם אומנת CD-1 לתקופה של 4 - שעות 6. הסר את הגור מהכלוב עם אמו להרדים אותו על ידי יתר isoflurane ואחריו עריפת ראש במספריים גדולים.
- ובלו הלב תחת מיקרוסקופ לנתח, נזהר שלא לקרוע שריר הלב.
- חותכים את העור מתהליך xyphoid לחלק העליון של בית החזה. דופן הבטן להרחיב מתחת בית החזה. אחוז כלוב הצלעות התחתון ופצע דרך צלעות שרירי longitudinally לאורך הקו באמצע בית השחי השמאלי מן הסרעפת אל השחי.
- החזק מספריים מטוס רוחבי בזהירות לחתוך דרך הסרעפת משמאל לצד ימין. הקפד למקם מספריים מתחת לרמה של הלב כדי למנוע נזק הקודקוד.
- אחוז כלוב צלעות וחתך צד ימין של צלעות שרירות לאורך קו אמצע השחי הימני. הסר את כל החיבורים של כלי הדם אל הלב במספריים. הסר את הלב מתוך חלל החזה תוך כדי אחיזההבסיס.
- סעיף בלב לשלושה חלקים באמצעות סכין גילוח פלדת פחמן כירורגית. הפוך את החתך הראשון לאורך הציר הקצר של הלב בנקודת האמצע בין התפר ואת חוד הלב. עובר את הסינון השני ברמה של התפר (איור 3 א).
הערה: זה משאיר קטע איפקס כ 0.75 מ"מ עובי במשקל 0.0018 גרם; קטע באמצע בסיס כ 1 מ"מ עובי, במשקל 0.0065 גרם; והבסיס של הלב. - מניחים את הסעיפים לב 1% כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium (TTC) בטמפרטורת החדר למשך 10 - 15 דקות. בזהירות לצפות דגימה להימנע מכתים מעל.
- כדי להגביר את הניגודיות, לתקן פרוסות הלב מוכתם paraformaldehyde 4% בין לילה ב 4 ° C. כדי לחשב שטח אוטם%, סעיפי לב תצלום ולמדוד אזור אוטם על תוכנת הדמיה. שריר לב קיימא כתמים אדום ואילו באזור האוטם הוא תחום כמו 18 לבנים.
5. מדידהתפקוד הלב על ידי אקו לאחר MI
- אפשר הגורים להתאושש בטיפול אם אומנת CD-1 לתקופה של 24 - 48 שעות. להשרות הרדמה על ידי הצבת את הגור בתא isoflurane אטום (isoflurane 5%). שמור את העכבר בתא עד להפסקת התנועה (כ -30 שניות).
- Secure את הגור בעמדת פרקדן על מזח מחומם (C ° טמפרטורת 37) עם האף שלה חרוט כדי לספק 0.5 - 1 isoflurane% (לצורך תחזוקת הרדמה). מניחים ג'ל חימם מראש הד על אזור החזה השמאלי.
- השג ראייה ארוכת ציר parasternal של החדר השמאלי (LV). ודא את התמונות מתקבלות מתחת לרמה של תתפור את LV. לאחר שרכש את העמדה, להפוך בדיקת אולטרסאונד (40 מגה-הרץ) 90 ° עד שייתן להם תמונה קצר ציר parasternal, ולהקליט M-mode תמונות אקו.
- מדוד את הדיאסטולי סוף ולסיים בקטרים חדרית פנימיים השמאלי סיסטולי מתמונות M-mode קצר הציר. חישוב מקטע פליטה ו fractioקיצור סופי.
6. מדידת שריר לב אוטם גודל 24 שעות לאחר MI
- אפשר גורים להתאושש בטיפול אם אומנת CD-1 לתקופה של 24 שעות. הסר את הגור מהכלוב עם אמו להרדים אותו על ידי יתר isoflurane ואחריו עריפת ראש במספריים גדולים.
- פתח את חלל החזה כמו בשלב 4.2. לפני מוציא את הלב, בזהירות לתפוס את אבי העורקים החזי בדיוק מעל הסרעפת עם מלקחיים בסדר. החזק מספריים בסדר במישור העטרה, שטוחים על קיר החזה, וחותכי האאורטה החזי מקיר החזה האחורי נע מספריים בכיוון גולגולתי.
- חותך את אב עורקים חינם מקיר החזה וכל חיבורים אחרים עד שהוא מגיע אל הלב. ובלו הלב ידי אחיזת הווריד הנבוב המעולה חיתוך כל החיבורים של כלי הדם אחרים בגוף.
- שוטף את הלב (עם אב עורקים המצורפים) סליין. בזהירות cannulate האאורטה החזה עם מחט 30 מד ולקשוראורטה כדי צינורית עם חוט תפר ניילון 8-0.
- Perfuse הלב עם 1 מ"ל של תמיסת מלח דרך אבי העורקים באמצעות המחט 30 מד בשיעור של 1 מ"ל / דקה. Perfuse הלב עם 150 μl של פתרון כחול -2% אוונס בשיעור של 1 מ"ל / דקה. הסר את הלב מן הצינורית, סעיף אותו לתוך שלוש חתיכות ללכלך אותם עם TTC כמפורט בסעיף 4.
- כדי לחשב את הגודל אוטם, סעיפי לב תצלום ולמדוד אזור אוטם על תוכנת הדמיה. שריר לב קיימא כתמים כחול, באזור ב כתמי סיכון אדום, ואזור האוטם הוא תחום כמו לבן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההליך אוטם שריר הלב בבית P1 יכול להסתיים בתוך כ -10 - 15 דקות ויש לו שיעור תמותה של 7.8% (5 מתוך 64 גורים). לאחר ניתוח, עכברים להתאושש מן ההרדמה היפותרמיה בתוך 5 הבאות - 20 הדקות (זמן החלמה תלוי טמפרטורת גוף הגיע במהלך הרדמה ומהירות המנתח). בעת שימוש גורי P7 (להשוואה עם שריר לב הלא רגנרטיבית), תקופה ארוכה יותר של קירור נדרשה להגיע קהות חושים. גורי P7 הם הרבה יותר גדולים ויש להם יותר קשיי מחלים הן מפציע לב היפותרמיה, וכתוצאה מכך שיעור תמותה גבוה יותר של 26.9% (14 מתוך 52 גורים).
תוצאות ממחקרים קודמים הם אישרו בזאת, המציין אינדוקציה של הרדמה היפותרמיה על קרוב ל 10 מעלות צלזיוס (בין 8 ° C ו -15 ° C) 19. בתוך חלון בטמפרטורה זו, קצב לב עושה איטי,אבל הקצב ממשיך בשיעורים של בין 24 פעימות לדקה ו -11 פעימות לדקה. קצב הלב הנמוך ברמה זו של קירור מפחית באופן משמעותי דימום במהלך ניתוח. הנער ניתן דמיינו בקלות ligated בטמפרטורות אלה (תרשים 1). הנער נשאר גלוי עד טמפרטורות הגוף להגיע בין 9.6 ° C ו -4.9 ° C, גורמת הורדת קצב הלב 2 פעימות לדקה או asystole.
לאחר קשירת LAD ב P1, גורים להחלים לחלוטין ולגדול לגודל גוף דומה לזה של בקרות להמלטה. לאחר להציב בחזרה עם אמו המאמצת שלהם, גורים מחזירים לעצמנו את כושר מודעות וההאכלה להשוותו להמלטה כ -10 דק '. בבדיקה היסטולוגית 3 ימים לאחר MI, יש ראיות של אוטם, עם חדירת תאים דלקתיים, תגובה פוסט-אוטם טיפוסית (איור 2). ביום 7 לאחר MI, רקמת חדר שמאלית נראית נורמלית. במשך היום 21 שלאחר MI, ג מלאהתחדשות ardiac התרחשה.
2,3,5-Triphenyltetrazolium כלוריד (TTC) מכתים 4 - 6 שעות לאחר MI שימש כאישור האינדוקציה עקבית של MI. האזור האדום מייצג שריר לב קיימא ואת האזור הלבן מייצג רקמה מתה איסכמי. ב סך של ניתוחי קשירה 13 LAD, 100% של הלבבות היו אוטמים, עם גודל אוטם ממוצע של 36% (איור 3). מכתים TTC עם זלוף אוונס כחול בוצע גם ב 24 שעות לאחר MI להפגין התמדה של רקמת אוטם ולמדוד גודל האוטם מבוסס על האזור בסיכון (איור 4). בשנת לבבות אלה, שריר לב קיימא מכתימה כחול, באזור ב כתמי סיכון אדומים, ואזור האוטם הוא תחום כמו לבן. גודל האוטם היה מחושב כאחוז באזור בסיכון. ב 4 ניתוחי קשירת LAD, 100% של הלבבות היו אוטמים, עם גודל אוטם ממוצע של 49% המשטח בסיכון (איור 4).
<p class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> כדי לאשר אינדוקציה האוטם, אקו בוצע ב 24 ו 48 שעות לאחר MI. בגיל 24 hr לאחר אוטם לבבי, מקטע פליטה (EF) צומצם משמעותית מ 84% ל -74%, וקיצור השבר (FS) משמעותית מ -50% ל -40% (איור 5). על ידי 48 שעות לאחר MI, EF הופחת נוספת ל -46%, לעומת 80% בקבוצת הביקורת ו FS גם צומצם משמעותית ל -25%, לעומת 50% בקבוצת הביקורת. כמו כן, חלה ירידה משמעותית הקוטר הפנימי של חדר השמאלי הסיסטולי ב 48 שעות (איור 6). עובי קיר קדמי LV היה לא ירד משמעותי בשני 24 או 48 שעות לאחר MI (איורים 5, 6).
איור 1. עורקים הכליליים הם גלויים במהלך הילודים LAD נוהל. Af עכבר בילוד P1הרדמה היפותרמיה ter, החתך בעור, חתך השריר לרוחב בית החזה במרחב צלעי הרביעי. א) שמאל הקדמי היורד לב כלילית (LAD) גלוי. BD) תפר ניילון 11-0 מועבר דרך החדר באמצע. E) LAD הוא ligated ו לבן ציין שמתחת לאזור התפר. F) ו- G) הן בהגדלה של א) ו- E) בהתאמה. תפוסה של. LAD, קדמי שמאלי מוסתר יורד עורק. LA, עזב אטריום. LV, החדר השמאלי של הלב. GCV, וריד כלילית רב. חץ לבן, LAD. ראש חץ שחור, בוהק מתאורה. ברי סולם הם 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ראיות איור 2. שלם Cardiac התחדשות לאחר LAD קשירה בעכברים עובריים. מכתים trichrome של מסון לאחר קשירת LAD בעכברי P1. לבבות בהגדלה כולו בבת האזורים האוטמים מוצגים ביום 3, 7 ו -21 לאחר קשירת LAD. הערה אובדן myocyte ותא דלקתיות לחדור באזור האוטם ביום 3 לאחר אוטם לבבי (חץ לבן). התחדשות אזור האוטם מלאה החל ביום 7 לאחר אוטם לבבי. מעט עדויות של פיברוזיס ציינו באותו יום 21-MI פוסט. ברי סולם הם 200, 100 ו -50 מיקרומטר עבור 40X, 200X, ו בהגדלת 630X, בהתאמה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. עובריים LAD הקשירה היא 100% לשחזור. א) קווי חתך של כל הלב כדי ליצור פיסת 0.75 מ"מ איפקס וחתיכת 1 מ"מ באמצע הבסיס TTCמכתים. B) נציג תמונות של שליטה דמה מוכתם TTC ולבבות ligated LAD. ברי סולם הם 1 מ"מ. C) גודל אוטם ב -13 קשירת LAD בעכברים ילודים P1. לבבות שנאספו 4 - 6 שעות לאחר MI וגודל האוטם נמדד לאחר מכתים TTC. אדום עולה שריר לב קיימא; לבן מציין נמק. הנתונים הם ממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. ילודי LAD קשירת תוצאות לאוטם אמין. א) גודל האוטם כפי% משטח איסכמי לאחר קשירת LAD בעכברים הילוד P1 (n = 4). לבבות נאספו 24 שעות לאחר MI וגודל אוטם נמדד לאחר אוונס מכתים כחול TTC. כחול עולה שריר לב קיימא; אדום עולה באזור בסיכון; לבן מציין necrosis. הנתונים הם ממוצע ± SEM. B) נציג תמונות של אוונס כחול TTC לבבות ligated LAD מוכתמת לאחר קשירת LAD. בר סולם = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
תוצאות איור 5. ילודים LAD קשירת ב חוסר תפקוד הלב לאחר 24 שעות לאחר MI. תפקוד הלב הוערכה על ידי אקו. A) נציג תמונות M-mode עבור שני עכברים ligated דמה המופעלים ו LAD. סוף-דיאסטולה ו-התכווצות הסוף מסומנות על ידי חצים. B) מדידות של קיצור חלקי, מקטע פליטה, ואת הקוטר הפנימי של חדר השמאלי היא דיאסטולה ואת ההתכווצות. נתונים הם ממוצעים ± SEM. N = 8 ו -7 עבור זיוף ו קשירת עורקים כליליים (CAL) בהתאמה. * P <0. 05. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תוצאות איור 6. ילודים LAD קשירת ב חוסר תפקוד לב ב 48 שעות לאחר MI. תפקוד הלב הוערכה על ידי אקו. א) נציג M-mode תמונות מראה סוף-דיאסטולה (חיצים ארוכים) וסוף-התכווצות (חיצים קצר) הן אחיזת עיניים מופעלים ועכברי ligated LAD. B) מדידות תפקודיות לב על ידי אקו כוללים קיצור חלקי, מקטע פליטה, ואת הקוטר הפנימי של חדר השמאלי ב דיאסטולה ואת התכווצות שניהם. נתונים הם ממוצעים ± SEM. N = 4 ו -6 עבור זיוף ו קשירת עורקים כלילית (CAL), בהתאמה. * P <0.05, ** P <0.01.Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קשירת LAD כירורגית הפגינו בזאת היא שיטה אמינה לייצר MI בעכברים הילוד. מודל זה מספק חוקרים עם מודל לשחזור שבה ללמוד התחדשות לב יונקת. ויזואליזציה של כלי הדם הכליליים היא מרכיב מרכזי של שיטה זו, הבטחת מיקום תפר נכון ובכך להבטיח שחזור. בעוד עכברים בוגרים אינם בעלי יכולות poikilothermic, טמפרטורת הגוף ואת קצב חילוף חומרים של עכברים בילוד קשור קשר הדוק עם טמפרטורת הסביבה. יתר על כן, הגודל הקטן של עכברים בילוד שהופך אותם אידיאליים עבור אינדוקציה היפותרמיה ידי קירור משטח. העיתוי של ניתוח ואת טמפרטורת גוף עכבר הוא קריטי עבור דיוק ב משכפלי הליך זה ובכך חייב להיות במעקב צמוד. קשירת בהקדם האפשרי לאחר קהות חושים הוא הגיע מספקת את ההזדמנות כדי להמחיש הלבנה של שריר הלב-קשירת פוסט, המאשר הצלחה כירורגית.
ישנם muשיטות רובים של שיכולה לשמש כדי לאשר אינדוקציה MI. אלה כוללים מכתים TTC, אקו וניתוח היסטולוגית. מכתים TTC היא עלות נמוכה, לשחזור ואמין, וביצע בקלות עם קצב העברת נתונים גבוה. מסיבות אלה, מכתים TTC כבר בשימוש נרחב. אקו יכול לשמש לשינויים צג הלא פולשני בתפקוד הלב לאחר אוטם לבבי לאורך זמן. ההוכחה של MI ניתן להדגים באמצעות ניתוח היסטולוגית. במחקר הנוכחי, כל השלוש הטכניקות הנ"ל הועסקו לאמת אינדוקציה מוצלחת של MI.
ויזואליזציה של LAD היא קריטית אינדוקצית MI מוצלחת. אם החוקר הוא חווה קושי להבין את LAD (בשל סביר אינדוקצית היפותרמיה עמוקה), אפרכסת השמאל ניתן הרים מעט עם מלקחיים, כשורש הראשי של LAD הוא גדול יותר מאשר המגזרים דיסטלי יותר ועלול להיות יותר לעין בקלות. אם הנער לא יכול להיות חזותי, החוקר צריך מתיימר עורק loקטיון. הגור הזה לא אמור לשמש עבור קשירה ניסיונית יכול דווקא לשמש דמה מופעל שליטה.
ערך נכון לתוך חלל החזה בחלל 4 th צלע חשוב כדי לקבל ראיה אופטימלית ומקום קשירת LAD. זו יכולה להיות מושגת באמצעות ספירה מדוקדקת של רווחים צלעי. בנוסף, אם כמות קטין של הדימום מתרחש במהלך ההליך, ניתן להסירו עם גזה סטרילי. אם הדימום הוא משמעותי, לעומת זאת, המנתח יש להניח שלא צנן את העכבר מספיק לפני תחילת ההליך, וקירור נוסף נדרש. שים לב כי מידת קירור צריך להיות מבוקרת בקפידה כדי להבטיח קצב לב בסביבות 20 פעימות לדקה כדי להמחיש את העורקים הכליליים.
בשל גודלו הקטן של עכברים בילוד, אקו ברזולוציה גבוה נדרש כדי להשיג תמונות M-mode ברורות לניתוח של תפקוד לב. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להבטיח קצב לבכ -400 פעימות לדקה עם הרדמה קלה (0.5 - שאיפת isoflurane 1%) ולשמור על טמפרטורת גוף נורמלית (מזח מחומם וחממו ג'ל הד). תמונות נרכשות הכי טוב אם הגוף הוא מוטה מעט כלפי הכתף הימנית (~ 5 ° cranially ו -5 ° ימינה). ודא ג'ל הד מספיק מוחל כדי למזער את הרעש.
למרות שגישה זו עושה להציע שחזור 100%, את גודל האוטם עשוי להיות מעט משתנה בהתאם העורק מכליל הסתעפות האנטומיה של הילוד הבודד (איור 3). כתוצאה מכך, מספרי n גבוהים יותר עשויים להידרש מובהקות סטטיסטיות בקביעת ההשפעות של טיפולים שונים או מניפולציות גנטיות על התחדשות לב. עם זאת, גישה זו מחזיקה יתרונות גדולים על שתי כריתת איפקס ילודי cryoinjury כמו בפתופיזיולוגיה של מנגנונים אלה של פציעה עשויה להיות שונה לחלוטין מאמ"ן ולכן לא יכולה במדויק מחדשהאדם הנוכחי MI 8,20. הגישה הזו באופן ישיר יותר מחקה פגיעה אנושי טיפוסי, וניתן להשתמש בו כדי ללמוד התחדשות לב במקרים של MI היונק.
מודל זה הוא ייחודי שכן היא מאפשרת לחקר ההבדלים במנגנוני התאוששות מפציעת לב בין הלא-משובים (המבוגר) ואת התחדשות שריר הלב היונק (בילוד). לדוגמה, תוצאות המודל מבוגר העכבר MI ב היווצרות צלקת קבועה. קרע חדרית לעתים קרובות מתרחש כתוצאה של התרחבות אוטמת. מניסיוננו עם המודל הזה (> 100 ניתוחים; נתונים שלא פורסמו), התחדשות מלאה ניכרת 21 ימים שלאחר אוטם קרע חדרית לא נצפה. המידע שנצבר משימוש מודל זה עשוי להציע תובנות הרומן לתוך המנגנונים שעשויים לקדם התחדשות הלב המבוגר.
הראיות אחרונות עולות שגשוג cardiomyocyte הוא תורם רב כדי התחדשות לב 9 4,21 התחדשות לב בילוד. מחקר נוסף באמצעות פרוטוקול המוצג כאן עשוי להצביע על מטרות טיפוליות לזירוז של אוטם לבבי פוסט התחדשות הלב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics--2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D'Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
