Abstract
रोधगलन कोरोनरी धमनी बंधाव से प्रेरित हृदय की मरम्मत और उत्थान के तंत्र का अध्ययन करने के लिए, और चिकित्सा विज्ञान के लिए नए लक्ष्य को परिभाषित करने के लिए एक उपकरण के रूप में कई पशु मॉडल में इस्तेमाल किया गया है। दशकों के लिए, पूरे दिल उत्थान के मॉडल उभयचर और मछली में ही अस्तित्व में है, लेकिन एक स्तनधारी समकक्ष उपलब्ध नहीं था। एक प्रसव के बाद खिड़की की हाल की खोज के दौरान जो चूहों पुनर्योजी क्षमताओं के अधिकारी हृदय उत्थान के एक स्तनधारी मॉडल की स्थापना करने के लिए प्रेरित किया है। नवजात माउस में स्तनधारी हृदय उत्थान के एक शल्य चिकित्सा मॉडल के साथ साथ प्रस्तुत किया है। संक्षेप में, प्रसव के बाद दिन 1 (P1) चूहों isoflurane द्वारा anesthetized और एक बर्फ पैड पर रखा हाइपोथर्मिया प्रेरित करने के लिए कर रहे हैं। बाद सीने में खोला जाता है, और छोड़ दिया पूर्वकाल कोरोनरी धमनी (लाड) उतरते कल्पना है, एक सिवनी बाएं वेंट्रिकल में दौरे दण्ड देना लाड के आसपास रखा गया है। शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया में 10-15 मिनट लगते हैं। कोरोनरी धमनी Visualizing हैसटीक सीवन नियुक्ति और reproducibility के लिए महत्वपूर्ण है। रोधगलन और हृदय रोग, द्वारा triphenyl-tetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला और इकोकार्डियोग्राफी पुष्टि कर रहे हैं क्रमशः। पूरा उत्थान 21 दिनों के बाद रोधगलन ऊतक विज्ञान द्वारा सत्यापित है। इस प्रोटोकॉल रोधगलन के बाद स्तनधारी हृदय उत्थान के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
रोधगलन (एमआई) दुनिया भर में मौत का एक प्रमुख कारण है, और दिल की विफलता के मामलों 1 के बारे में एक तिहाई के लिए जिम्मेदार बनी हुई है। percutaneous हस्तक्षेप और thrombolytics के उपयोग के सतत अनुकूलन के आगमन reperfusion निम्नलिखित एमआई, cardiomyocyte मौत और सिकुड़ा मायोकार्डियम के नुकसान में वृद्धि हुई है, वहीं फिर भी होता है। यह भी "नहीं" विकल्प है जो रोगियों के लिए उम्मीदवार नहीं हैं या इन उपायों से लाभ नहीं देख पा रहे हैं की बड़ी संख्या को वहाँ रहते हैं। इन रोगियों को अक्षम रोधगलितांश चिकित्सा का एक तंत्र के रूप में गठन और हानिकारक वेंट्रिकुलर remodeling निशान करने के लिए अग्रणी ischemia अनुभव करने के लिए जारी है। यह प्रक्रिया अंतत: दिल की विफलता है, जिसके लिए रोग का निदान एंजियोटेनसिन परिवर्तित एंजाइम (ऐस) अवरोधकों और बीटा ब्लॉकर्स के साथ इष्टतम pharmacologic प्रबंधन के बावजूद गरीब बना रहता है में परिणाम है। दुर्भाग्य से, गंभीर रूप से प्रभावित बाएं निलय समारोह के साथ रोगियों के लिए एक साल की मृत्यु दर अभी भी रूप में रहता है26% 2 के रूप में उच्च। हृदय प्रत्यारोपण दिल की विफलता के साथ रोगियों के लिए अंतिम उपचार विकल्प है। हालांकि, हृदय प्रत्यारोपण के लिए सीमित दाता पूल इस सबसे रोगियों के लिए एक व्यवहार्य विकल्प नहीं है। इस प्रकार, उपन्यास चिकित्सीय एजेंट की खोज क्षतिग्रस्त मायोकार्डियम बहाल करने के लिए हृदय रोग की समस्या को हल करने के लिए सर्वोपरि रहता है। हृदय की चोट के विश्वसनीय पशु मॉडल इसलिए इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक के रूप में आवश्यक हैं।
पारंपरिक हठधर्मिता तय किया है कि वयस्क cardiomyocytes बाद mitotic, टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं, विभाजन या क्षतिग्रस्त मायोकार्डियम 3 को बदलने के लिए डी-फर्क के काबिल नहीं हैं। जैसे, एक वयस्क स्तनधारी दिल पूरी तरह से चोट से उबर भी नहीं कर सकता, और खो cardiomyocytes रेशेदार ऊतक के साथ प्रतिस्थापित किया जाएगा। इस प्रकार, अनुसंधान रोधगलितांश विस्तार को कम करने और निशान गठन को कम करने के लिए मुख्य रूप से चिकित्सीय एजेंट पर ध्यान केंद्रित किया है। अभी हाल ही में हालांकि, एक बदलाव हुआ हैहृदय चिकित्सा और कई अनुसंधान प्रयासों आसपास के सोच में हृदय उत्थान 4 के लिए क्षमता पर ध्यान केंद्रित करने के लिए पुनः निर्देशित किया गया है।
अभी हाल तक, हृदय उत्थान के vivo अध्ययन में इस तरह के urodele उभयचर और Teleost मछली 5-7 में उन लोगों के रूप में गैर हड्डीवाला मॉडल, के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया था। हालांकि, नवजात माउस में हृदय उत्थान के लिए क्षमता की खोज के स्तनधारी हृदय उत्थान की दो शल्य चिकित्सा मॉडल के विकास के लिए प्रेरित किया: हृदय की सर्वोच्च और कोरोनरी धमनी रोड़ा की लकीर रोधगलन 8,9 प्रेरित करने के लिए। 2011 में, एक माउस सर्वोच्च लकीर मॉडल प्रदर्शित करने के लिए है कि पूरा हृदय उत्थान प्रसव के बाद दिन 1 (P1) पर संभव है इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, इस क्षमता में तेजी से प्रारंभिक नवजात अवधि के बाद गिरावट आती है। स्तनधारी दिल शीघ्र ही पूर्वज सेल नंबर गिरावट के रूप में P7 पर जन्म के बाद अपनी पुनर्योजी क्षमता खो देता है, और binucleated बन cardiomyocytes, खोनाउनकी proliferative योग्यता, और स्थायी रूप से कोशिका चक्र 10,11 से बाहर निकलें। नवजात और वयस्क स्तनधारी दिल के बीच बुनियादी अंतर को समझना हृदय उत्थान में उपन्यास अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
जबकि सर्वोच्च लकीर वास्तव में सिकुड़ा ऊतकों की फिर से विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, मॉडल ठेठ मानव हृदय की चोट अनुकरण नहीं है, और इस तरह खुद को चिकित्सा विज्ञान के विकास के रूप में अच्छी तरह से उधार नहीं करता है। कोरोनरी धमनी रोड़ा मॉडल, तथापि, अधिक सीधे एमआई विकृति की pathophysiologic पहलुओं simulates, और इस प्रकार तंत्र है कि मानव उपयोग के लिए चिकित्सीय उन्नति के लिए लागू किया जा सकता है में और अधिक उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।
सर्जिकल कोरोनरी बंधाव कई पशु मॉडल 12-14 में एक उपयोगी प्रयोगात्मक तकनीक के रूप में इस्तेमाल किया गया है। वयस्क कोरोनरी धमनी बंधाव मॉडल में, जानवरों anesthetized और जब respirati बनाए रखने छाती गुहा के उद्घाटन अनुमति देने के लिए कर रहे हैं intubatedपर। दिल नियमित रूप से हरा करने के लिए, कोरोनरी वाहिका के दृश्य की अनुमति देने और सटीक सिवनी प्लेसमेंट के लिए अनुमति देने के लिए जारी है। इसके अलावा, दिल गुलाबी बनी हुई है के रूप में छिड़काव जारी है, और बंधाव के बाद इस्कीमिक मायोकार्डियम पीला दिखाई देता है, सफल कोरोनरी धमनी बंधाव का संकेत है। प्रोटोकॉल नवजात चूहों के लिए वर्णित है, तथापि, के रूप में कोरोनरी धमनी की कल्पना नहीं की है और सर्जन का अनुमान करना चाहिए जहां सिवनी 15 के लिए जगह कम विश्वसनीय है। हालांकि कोरोनरी वाहिका के सामान्य शरीर रचना विज्ञान दिशा में एक ही है, व्यक्ति पशु परिवर्तनशीलता है और बालक की शाखाओं में 16 से मौजूद है। इस प्रकार, जब "अंधा में जा रहा है," धमनी आसानी से याद किया जा सकता है। ऐसे इकोकार्डियोग्राफी के रूप में अन्य तकनीकों तो एमआई के सफल प्रेरण पुष्टि करने के लिए, और यह सुनिश्चित करने के लिए सभी सर्जरी के लिए एक समान रोधगलितांश आकार में परिणाम के लिए आवश्यक हैं। यहां एक हाल ही में प्रकाशित विधि 15, जहां बालक की स्थिति स्थापित किया जा सकता है पर वर्णित एक सुधार हैlished और इस तरह लाड reproducibly एमआई प्रेरित करने के लिए ligated जा सकता है।
इस तकनीक नवजात माउस में एक hypothermic राज्य में अंतःश्वासनलीय इंटुबैषेण या यांत्रिक वेंटीलेशन, thoracotomy के रूप में की आवश्यकता नहीं है फेफड़ों के पतन में परिणाम नहीं करता है। हालांकि, पहले से वर्णित विधि में, गंभीर हाइपोथर्मिया दोनों पूरा एपनिया और हृदय लय 15 की समाप्ति के बिंदु के लिए प्रेरित किया जाना चाहिए। इस दृष्टिकोण के प्रमुख सीमा है कि कोरोनरी धमनी नहीं रह भरकर रखा जाता है और दिल भी लाड बंधाव से पहले पीला दिखाई देता है। दृष्टिकोण वर्णित में, कोरोनरी धमनी दृश्य गहरी हाइपोथर्मिया और हृदय लय समाप्ति, सर्जरी के बाद नवजात माउस की पूरी वसूली के साथ पहले अकर्मण्यता के एक बिंदु पर संभव है। इस विधि 100% reproducibility के एक प्रमुख लाभ प्रदान करता है।
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Protocol
C57BL / 6 और CD-1 पुलिस महानिरीक्षक एस चूहों की प्रजनन जोड़े चार्ल्स नदी से खरीदे गए थे। इस अध्ययन में इस्तेमाल पशु पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद के दिशा निर्देशों के अनुसार संभाल रहे थे, और अध्ययन प्रोटोकॉल पश्चिमी विश्वविद्यालय, लंदन, कनाडा में पशु उपयोग उपसमिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. पशु की देखभाल
- birthing पूरा हो गया है और पिल्ले शुरू में स्तन खिलाया में कुछ घंटे के लिए अपनी माँ से किया गया है के बाद, उन्हें एक सीडी -1 पालक माँ के साथ एक अलग पिंजरे में जगह है। सीडी-1 माताओं एक मजबूत बढ़ावा देने वृत्ति के साथ एक शांत फेनोटाइप प्रदर्शन, और घायल पिल्ले 15 cannibalize के लिए एक कम प्रवृत्ति है।
2. सर्जरी
- एक मोहरबंद isoflurane कक्ष में पिल्ला रखकर संज्ञाहरण प्रेरित (लगभग 100% वी / वी isoflurane के 500 μl 1,300 से अधिक 3 सेमी चैम्बर फैलने के लिए अनुमति)। आंदोलन के बारे में (30 सेकंड) की समाप्ति तक कक्ष में माउस रखें।
- मो हटायेisoflurane कक्ष से उपयोग करें और गीला बर्फ पर माउस रखकर hypothermic संज्ञाहरण प्रेरित। शीतदंश से बचने के लिए, एक बाँझ सर्जिकल दस्ताने के अंदर बर्फ जगह है, दस्ताने के भीतर माउस लपेट और बर्फ के साथ दस्ताना कवर या बाँझ गीला धुंध में माउस लपेट और बर्फ पर जगह है।
नोट: चूहे तेजी से शांत जब बर्फ के साथ संपर्क एक बड़ा सतह क्षेत्र खत्म हो गया है, और इस तरह पिघल बर्फ के रूप में हाइपोथर्मिया प्रेरण समय कम कर सकते हैं। - पैर के अंगूठे और पूंछ चुटकी करने के लिए आंदोलन प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
नोट: उकसाया आंदोलन की समाप्ति 15 डिग्री सेल्सियस और 8 डिग्री सेल्सियस के बीच एक शरीर के तापमान पर होता है। (इस तापमान लगभग 1 मिनट के लिए समय ठंडा)। पूरा एपनिया और asystole लाड बंधाव लिए आवश्यक नहीं है। - शल्य एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के साथ सुसज्जित क्षेत्र के लिए बर्फ बिस्तर पर ले जाएँ। सुनिश्चित करें कि माउस पिल्ला पूरे शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर बनी हुई है।
नोट: शल्य चिकित्सा क्षेत्र, धुंध और शल्य चिकित्सा उपकरण निष्फल होना चाहिए। maintaप्रक्रिया के दौरान बाँझ क्षेत्र, और एकल उपयोग, बाँझ सर्जिकल दस्ताने पहनते हैं। के रूप में चूहों पैदा कर रहे हैं के साथ उनकी आँखों 17 को बंद कर दिया नेत्र मरहम की आवश्यकता नहीं है। - सही पार्श्व decubitus स्थिति में माउस पिल्ला रखें। धीरे povidone आयोडीन समाधान एक इथेनॉल झाड़ू द्वारा पीछा के साथ पोंछते द्वारा छाती कीटाणुरहित।
- बाएं अगली टांग नीचे कुछ मिलीमीटर xyphoid और बाएं कांख के बीच की त्वचा काटने से मध्य कक्षा रेखा के साथ बाएं सीने पर त्वचा चीरा प्रदर्शन करना। यह भी अंतर्निहित कवच की मांसपेशियों परत के माध्यम से कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें।
- संदंश के साथ पसलियों और पसलियों के बीच मांसपेशियों को अलग करके 4 वें पसलियों के बीच अंतरिक्ष में एक छोड़ दिया thoracotomy प्रदर्शन।
ध्यान दें: नवजात पसलियों बहुत नाजुक हैं और आसानी से तोड़ा जा सकता है। पसलियों के बीच मांसपेशियों के साथ संदंश खोलने (बजाय पसलियों लोभी) द्वारा इस, धीरे से अलग पसलियों से बचने के लिए। - बाईं पूर्वकाल कोरोनरी धमनी (लाड) उतरते बाईं Aur से उभर कल्पनाफेफड़े के नस पीछे icle और महान हृदय नस परे उतरते।
नोट: इस जल्दी नवजात विंडो में, थाइमस अक्सर कल्पना है और हृदय आधार के हिस्से को कवर कर सकते हैं। लाड थाइमस की स्थिति के बगल में उभरते देखा जा सकता है, वक्ष चीरा के कोण पर निर्भर करता है। - बाएं अलिन्द (चित्रा 1 सी) नीचे मध्य वेंट्रिकल के माध्यम से धमनी के नीचे एक 11-0 नायलॉन सीवन (0.007 मिमी व्यास सुई) से गुजर रहा लाड ligate। Ischemia सिवनी साइट (चित्रा 1G) नीचे मायोकार्डियम के blanching के साथ की पुष्टि की है।
- वक्ष चीरा 8-0 नायलॉन टांके (0.15 मिमी व्यास सुई) का उपयोग बंद कर दें। पसलियों बंद करने के लिए दो टांके का प्रयोग करें। सुई सुनिश्चित करने के लिए जब शरीर गुहा से गुजर फेफड़ों पंचर नहीं है ligating से पहले दोनों पसली टांके रखें।
- पसलियों बंद करने के बाद, बर्फ बिस्तर से माउस को हटा दें। शल्य चिकित्सा के क्षेत्र के भीतर माउस रखें और बाँझ शल्य चिकित्सा पर सीधे जगह37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म हीटिंग पैड पर wel वार्मिंग शुरू करने के लिए।
- एक बार जब बाँझ गर्म क्षेत्र पर, 8-0 नायलॉन टांके (0.15 मिमी व्यास सुई) का उपयोग मांसपेशियों और त्वचा की परतों को बंद करें। पेशी परत के लिए एक सीवन का प्रयोग करें और त्वचा चीरा के लिए दो टांके का उपयोग करें।
नोट: मांसपेशियों और त्वचा की परतों एक हीटिंग पैड हाइपोथर्मिया समय जोखिम को कम करने के लिए पर बंद किया जा सकता है। माउस तापमान एक बार हीटिंग पैड पर रखा वृद्धि करने के लिए शुरू होता है, लेकिन मांसपेशियों और त्वचा बंद होने के दौरान एनेस्थीसिया रखरखाव के लिए पर्याप्त पर्याप्त रूप से कम रहता है।
3. सर्जिकल वसूली
- सहज आंदोलन की वापसी तक एक गर्म हीटिंग पैड पर तेजी से वार्मिंग जारी रखें। एक जानवर की पहुंच से बाहर छोड़ जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए नहीं है। धीरे इथेनॉल झाड़ू के साथ चोट साइट पोंछते द्वारा povidone आयोडीन और रक्त निकालें।
- संज्ञाहरण से पर्याप्त वसूली के बाद, बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र से हटा दें, पालक से बिस्तर के साथ यह धब्बामां के पिंजरे, और बदले पिल्ला मां को बढ़ावा के लिए। यह मातृ अस्वीकृति या cannibalization को रोकने में मदद करता है।
नोट: अन्य जानवरों के साथ एक पिंजरे में पिल्ले वापस नहीं है जब तक पूरी तरह से बरामद किया। एक पूरी कूड़े में प्रयोग नहीं किया गया है, और littermates पालक माँ के साथ रहते हैं, कूड़े के बीच में बरामद पिल्ले जगह है। यदि एक से अधिक सर्जरी प्रदर्शन, पूरा सभी सर्जरी से उनके पालक मां को चूहों लौटने से पहले एक व्यक्ति कूड़े के लिए जरूरी है। - 2 के लिए 15 मिनट - - पिल्ला की ओर पालक मां के व्यवहार का निरीक्षण हर 10 3 घंटा पिल्ला की स्वीकृति सुनिश्चित करने के लिए। मां घायल पिल्ला के प्रति आक्रामकता प्रदर्शित करता है, पिल्ला हटाने और isoflurane अधिक मात्रा द्वारा euthanize (> 5%; सांस लेने की समाप्ति तक), शिरच्छेद द्वारा पीछा किया। नोट: के रूप में केंद्रीकृत दर्द सजगता पूरी तरह से इस कम उम्र 15 पर विकसित नहीं कर रहे PeriOperative पीड़ानाश दवाओं की आवश्यकता नहीं है।
4. Myocardial का मापन रोधगलितांश आकार 4 -6 घंटा बाद एमआई
- 6 घंटा - पिल्ले 4 की अवधि के लिए एक सीडी -1 पालक मां की देखभाल में ठीक करने के लिए अनुमति दें। मां के साथ पिंजरे से पिल्ला निकालें और isoflurane बड़ी कैंची के साथ कत्ल के द्वारा पीछा जरूरत से ज्यादा द्वारा यह euthanize।
- विदारक माइक्रोस्कोप के तहत दिल आबकारी, सावधान नहीं मायोकार्डियम चीर करने के लिए।
- छाती के शीर्ष करने के xyphoid प्रक्रिया से त्वचा कट। ribcage नीचे खुला पेट की दीवार। कम रिब पिंजरे समझ और अनुदैर्ध्य पसलियों और मांसलता के माध्यम से कटौती करने के लिए बगल डायाफ्राम से बाईं मध्य कक्षा रेखा के साथ।
- अनुप्रस्थ विमान में कैंची पकड़ो और ध्यान से डायाफ्राम के माध्यम से कटौती सही पक्ष को छोड़ दिया। दिल के स्तर से नीचे कैंची जगह इतनी के रूप में शीर्ष करने के लिए किसी भी नुकसान से बचने के लिए सुनिश्चित करें।
- रिब पिंजरे समझ और सही मध्य कक्षा रेखा के साथ पसलियों के सही पक्ष और मांसलता काटा। कैंची से दिल के सभी संवहनी कनेक्शन निकालें। लोभी से छाती गुहा से दिल हटायेआधार।
- धारा एक शल्य कार्बन इस्पात धार का उपयोग तीन टुकड़ों में दिल। सिवनी और हृदय की सर्वोच्च बीच मध्य में दिल की छोटी-धुरी के साथ पहली कटौती करें। सिवनी (चित्रा 3 ए) के स्तर पर दूसरी कटौती करें।
नोट: यह एक शीर्ष अनुभाग लगभग 0.75 मिमी मोटी 0.0018 ग्राम वजन छोड़ देता है; एक मध्य अनुभाग आधार लगभग 1 मिमी मोटी, 0.0065 ग्राम वजन; और दिल के आधार। - 15 मिनट - 10 के लिए कमरे के तापमान पर 1% 2,3,5-triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) में दिल वर्गों रखें। ध्यान से धुंधला से बचने के लिए नमूना देखना।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर विपरीत बढ़ाने के लिए, 4% paraformaldehyde के साथ दाग दिल स्लाइस को ठीक। % रोधगलितांश क्षेत्र, फोटोग्राफ दिल वर्गों की गणना और इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर रोधगलितांश क्षेत्र को मापने के लिए। व्यवहार्य मायोकार्डियम लाल धब्बे, जबकि रोधगलितांश क्षेत्र व्हाइट 18 के रूप में सीमांकन है।
5. मापनइकोकार्डियोग्राफी के बाद एमआई द्वारा हृदय समारोह
- 48 घंटा - पिल्ले 24 की अवधि के लिए एक सीडी -1 पालक मां की देखभाल में ठीक करने के लिए अनुमति दें। एक मोहरबंद isoflurane कक्ष (5% isoflurane) में पिल्ला रखकर संज्ञाहरण प्रेरित। आंदोलन के बारे में (30 सेकंड) की समाप्ति तक कक्ष में माउस रखें।
- (संज्ञाहरण रखरखाव के लिए) 1% isoflurane - एक गर्म गोदी (तापमान 37 डिग्री सेल्सियस) एक कोन में अपनी नाक के साथ पर लापरवाह स्थिति 0.5 देने के लिए पिल्ला सुरक्षित। बाएँ वक्ष क्षेत्र पर पूर्व गरम गूंज जेल रखें।
- बाएं वेंट्रिकल (एल.वी.) की एक parasternal लंबे अक्ष दृश्य प्राप्त करते हैं। सुनिश्चित करें छवियों एल.वी. में सीवन के स्तर से नीचे प्राप्त कर रहे हैं। स्थिति प्राप्त करने के बाद, अल्ट्रासाउंड जांच (40 मेगाहर्ट्ज) 90 ° एक parasternal कम अक्ष दृश्य प्राप्त करने के लिए, और रिकॉर्ड एम मोड एचोकर्दिओग्रफिक छवियों की बारी है।
- अंत डायस्टोलिक उपाय और लघु अक्ष एम मोड छवियों से सिस्टोलिक बाएं निलय आंतरिक व्यास खत्म होता है। इंजेक्शन फ्रैक्शन और fractio की गणनाएनएएल छोटा।
6. Myocardial का मापन रोधगलितांश आकार 24 घंटा के बाद एमआई
- पिल्ले 24 घंटे की अवधि के लिए एक सीडी -1 पालक मां की देखभाल में ठीक करने के लिए अनुमति दें। मां के साथ पिंजरे से पिल्ला निकालें और isoflurane बड़ी कैंची के साथ कत्ल के द्वारा पीछा जरूरत से ज्यादा द्वारा यह euthanize।
- 4.2 कदम के रूप में छाती गुहा खोलें। दिल excising से पहले, ध्यान से बस ठीक संदंश के साथ डायाफ्राम से ऊपर वक्ष महाधमनी समझ। राज्याभिषेक विमान में ठीक कैंची, वक्ष दीवार के खिलाफ फ्लैट पकड़ो, और पीछे की दीवार वक्ष कपाल दिशा में कैंची चलती बंद वक्ष महाधमनी काटा।
- महाधमनी वक्ष दीवार और किसी भी अन्य कनेक्शन से मुक्त कट जब तक यह दिल तक पहुँचता है। बेहतर रग कावा लोभी और शरीर के अन्य सभी संवहनी कनेक्शन काटने से दिल आबकारी।
- दिल खारा में (संलग्न महाधमनी) के साथ कुल्ला। ध्यान से एक 30 गेज सुई के साथ वक्ष महाधमनी cannulate और एक टाईOrta 8-0 नायलॉन सीवन धागे के साथ प्रवेशनी।
- 1 मिलीग्राम / मिनट की दर से एक 30 गेज सुई के माध्यम से महाधमनी के माध्यम से खारा के 1 मिलीलीटर के साथ दिल छिड़कना। 1 मिलीग्राम / मिनट की दर से 2% इवांस नीले समाधान के 150 μl के साथ दिल छिड़कना। तीन टुकड़ों में प्रवेशनी से दिल निकालें, खंड इसे और धारा 4 में वर्णित के रूप में टीटीसी के साथ यह दाग।
- रोधगलितांश आकार, फोटोग्राफ दिल वर्गों की गणना और इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर रोधगलितांश क्षेत्र को मापने के लिए। व्यवहार्य मायोकार्डियम नीले रंग के धब्बे, जोखिम दाग पर क्षेत्र, लाल और सफेद रंग के रूप रोधगलितांश क्षेत्र सीमांकन है।
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Representative Results
P1 पर रोधगलन प्रक्रिया 10 में पूरा किया जा सकता है - 15 मिनट और 7.8% (64 में से 5 पिल्ले) के एक मृत्यु दर है। सर्जरी के बाद, चूहों अगले 5 भीतर hypothermic संज्ञाहरण से उबरने - 20 मिनट (वसूली के समय शरीर के तापमान को संज्ञाहरण और सर्जन की गति के दौरान पहुँचा पर निर्भर करता है)। P7 पिल्ले का उपयोग करते हैं (एक गैर पुनर्योजी मायोकार्डियम के साथ तुलना के लिए), ठंडा करने की एक लंबी अवधि के अकर्मण्यता तक पहुँचने के लिए आवश्यक है। P7 पिल्ले ज्यादा बड़े होते हैं और 26.9% (52 से 14 पिल्ले) का एक बहुत उच्च मृत्यु दर में जिसके परिणामस्वरूप, अधिक कठिनाई दोनों हृदय की चोट और हाइपोथर्मिया से उबरने की है।
पिछले अध्ययनों से परिणाम के साथ साथ इस बात की पुष्टि कर रहे हैं, बंद करने के लिए 10 डिग्री सेल्सियस पर hypothermic संज्ञाहरण की प्रेरण का संकेत 19 (8 डिग्री सेल्सियस और 15 डिग्री सेल्सियस के बीच)। इस तापमान खिड़की के भीतर, दिल की दर धीमी गति से होता है,लेकिन लय 24 बीपीएम और 11 बीपीएम के बीच की दर पर जारी है। ठंडा करने के इस स्तर पर कम से दिल की दर में काफी अंतर शल्य चिकित्सा खून बह रहा है कम कर देता है। लाड आसानी से कल्पना और इन तापमान (चित्रा 1) में ligated जा सकता है। लाड दिखाई रहता है जब तक शरीर का तापमान 9.6 डिग्री सेल्सियस और 4.9 डिग्री सेल्सियस के बीच तक पहुंच, 2 बीपीएम या asystole करने के लिए हृदय की दर को कम करने के कारण।
P1 पर लाड बंधाव के बाद, पिल्ले पूरी तरह से ठीक है और एक शरीर के आकार littermate नियंत्रण के बराबर करने के लिए बढ़ता है। एक बार उनके पालक मां के साथ वापस रखा, पिल्ले जागरूकता और खिला क्षमताओं के बारे में 10 मिनट में littermates के लिए तुलनीय आ। ऊतकीय परीक्षा 3 दिन बाद एमआई पर, वहाँ भड़काऊ कोशिकाओं, एक ठेठ बाद रोधगलन प्रतिक्रिया (चित्रा 2) घुसपैठ साथ रोधगलन का सबूत है। दिन 7 के बाद एमआई में बाएं निलय ऊतक सामान्य दिखाई देता है। ब दिन 21 के बाद एमआई, पूरा गardiac उत्थान हुआ है।
2,3,5-Triphenyltetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला हो जाना 4 - 6 घंटे बाद Mi Mi के अनुरूप प्रेरण की पुष्टि के रूप में इस्तेमाल किया गया था। लाल क्षेत्र व्यवहार्य मायोकार्डियम प्रतिनिधित्व करता है और सफेद क्षेत्र इस्कीमिक मृत ऊतक का प्रतिनिधित्व करता है। 13 लाड बंधाव सर्जरी के कुल में, दिल की 100%, infarcted थे 36% (चित्रा 3) के एक औसत आकार के साथ रोधगलितांश। इवांस नीले छिड़काव के साथ टीटीसी धुंधला भी 24 घंटे के बाद एमआई पर प्रदर्शन किया गया था infarcted ऊतक के हठ का प्रदर्शन और रोधगलितांश आकार खतरे में क्षेत्र के आधार पर (चित्रा 4) को मापने के लिए। इन दिलों में, व्यवहार्य मायोकार्डियम लाल जोखिम दाग पर क्षेत्र नीले रंग के धब्बे, और रोधगलितांश क्षेत्र के रूप में सफेद सीमांकन है। रोधगलितांश आकार खतरे में क्षेत्र के एक प्रतिशत के रूप में गणना की गई। 4 लाड बंधाव सर्जरी में, दिल की 100%, infarcted थे औसत रोधगलितांश (चित्रा 4) खतरे में क्षेत्र के 49% के आकार के साथ।
<पी वर्ग = "jove_content" fo: रख-together.within-पेज = "1"> इस बात की पुष्टि करने के लिए रोधगलितांश प्रेरण, इकोकार्डियोग्राफी 24 और 48 घंटे के बाद एमआई पर प्रदर्शन किया गया था। 24 घंटे बाद एमआई में इजेक्शन अंश (एफई) काफी 74% से 84% से कम हो गया था, और आंशिक छोटा (एफएस) काफी 40% (चित्रा 5) को 50% से कम हो। 48 घंटे बाद एमआई, एफई आगे 46% करने के लिए, नियंत्रण में 80% की तुलना में और FS भी नियंत्रण में 50% की तुलना में 25% करने के लिए काफी कम हो गया था के रूप में कम हो गया था। इसके अलावा, वहाँ 48 घंटा (चित्रा 6) में सिस्टोलिक बाएं निलय आंतरिक व्यास में एक महत्वपूर्ण कमी थी। (आंकड़े 5 और 6) एल.वी. पूर्वकाल दीवार मोटाई काफी या तो 24 या 48 घंटे के बाद एमआई में कमी आई नहीं था।
चित्रा 1. कोरोनरी धमनी नवजात लाड प्रक्रिया। P1 नवजात माउस वायुसेना के दौरान दिखाई दे रहा हैआतंकवाद hypothermic संज्ञाहरण, त्वचा चीरा, मांसपेशियों में चीरा और पार्श्व thoracotomy चौथे पसलियों के बीच अंतरिक्ष। ए) वाम पूर्वकाल उतरते कोरोनरी धमनी (लाड) में दिख रहा है। बी) 11-0 नायलॉन सीवन मध्य वेंट्रिकल। ई) के माध्यम से पारित कर दिया है लाड ligated है और क्रमश: सीवन साइट। एफ) और जी) ए के आवर्धन कर रहे हैं) और ई) के नीचे मनाया blanching। ओसीसी। बालक, अवरोधित बाईं पूर्वकाल धमनी उतरते। ला, आलिंद छोड़ दिया है। एल.वी., निलय छोड़ दिया है। जीसीवी, महान कोरोनरी नस। सफेद तीर, बालक। काला तीर सिर, प्रकाश से चमक। स्केल सलाखों 1 मिमी हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. पूरा Cardi के साक्ष्यनवजात चूहों में एसी पुनर्जनन लाड ligation के बाद। P1 चूहों में लाड बंधाव के बाद मेसन के trichrome धुंधला हो जाना। पूरे दिल और आवर्धन रोधगलन क्षेत्रों में लाड बंधाव के बाद दिन 3, 7 और 21 पर दिखाए जाते हैं। नोट myocyte घटाने और भड़काऊ सेल 3 दिन के बाद एमआई (सफेद तीर) पर रोधगलितांश क्षेत्र में घुसपैठ। पूरा रोधगलितांश क्षेत्र के उत्थान के दिन 7 के बाद एमआई में शुरुआत। फाइब्रोसिस के कुछ सबूत 21 दिन बाद एमआई पर संतोष व्यक्त किया। स्केल सलाखों 200, 100 और 40X के लिए 50 माइक्रोन हैं, 200X, और 630X आवर्धन, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. नवजात लाड Ligation 100% प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। ए) और टीटीसी के लिए एक 1 मिमी के मध्य आधार टुकड़ा एक 0.75 मिमी शीर्ष टुकड़ा बनाने के लिए पूरे दिल से सेक्शनिंग की रेखाएँधुंधला हो जाना। बी) टीटीसी दाग नकली नियंत्रण और बालक ligated दिलों की छवियों प्रतिनिधि। स्केल सलाखों 1 मिमी हैं। P1 नवजात चूहों में 13 लाड ligations में सी) रोधगलितांश आकार। दिल एकत्र 4 - 6 घंटे बाद एमआई और रोधगलितांश आकार टीटीसी धुंधला के बाद मापा जाता है। लाल व्यवहार्य मायोकार्डियम इंगित करता है; सफेद नेक्रोसिस इंगित करता है। डेटा मतलब ± SEM कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4 नवजात लाड Ligation विश्वसनीय Infarction में परिणाम है। ए) P1 नवजात चूहों में लाड बंधाव के बाद इस्कीमिक क्षेत्र के% के रूप रोधगलितांश आकार (एन = 4)। दिल एकत्र किए गए 24 घंटे बाद एमआई और रोधगलितांश आकार इवांस नीले और टीटीसी धुंधला के बाद मापा गया था। ब्लू व्यवहार्य मायोकार्डियम इंगित करता है; लाल खतरे में क्षेत्र इंगित करता है; सफेद n इंगित करता हैecrosis। डेटा मतलब हैं ± SEM। बी) लाड बंधाव के बाद इवांस नीले और टीटीसी दाग लाड ligated दिलों की छवियों प्रतिनिधि। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
24 घंटे में हृदय रोग में चित्रा 5. नवजात लाड Ligation परिणाम के बाद एमआई। हृदय समारोह में दोनों दिखावा संचालित और बालक ligated चूहों के लिए इकोकार्डियोग्राफी। ए) प्रतिनिधि एम मोड छवियों द्वारा मूल्यांकन किया गया था। अंत पाद लंबा और अंत सिस्टोल तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। बी) आंशिक छोटा करने, इंजेक्शन फ्रैक्शन, और दोनों पाद लंबा और सिस्टोल पर बाएं निलय आंतरिक व्यास की माप। डेटा मतलब ± SEM हैं। एन = 8 और 7 दिखावा और कोरोनरी धमनी बंधाव (ल) क्रमशः के लिए। * पी <0। 05. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
48 घंटा बाद एमआई में हृदय रोग में चित्रा 6 नवजात लाड Ligation परिणाम। हृदय समारोह इकोकार्डियोग्राफी। ए) द्वारा मूल्यांकन किया गया था प्रतिनिधि एम मोड दोनों दिखावा के लिए अंत पाद लंबा (लंबी तीर) और अंत सिस्टोल (लघु तीर) दिखा छवियों संचालित और आंशिक छोटा करने, इंजेक्शन फ्रैक्शन, और दोनों पाद लंबा और सिस्टोल पर बाएं निलय आंतरिक व्यास सहित लाड ligated चूहों। बी) इकोकार्डियोग्राफी द्वारा हृदय कार्यात्मक माप। डेटा मतलब ± SEM हैं। एन = 4 और 6 दिखावा और कोरोनरी धमनी बंधाव (ल), क्रमशः के लिए। * पी <0.05, ** पी <0.01।लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
शल्य लाड बंधाव के साथ साथ प्रदर्शन किया एक विश्वसनीय विधि नवजात चूहों में MI का उत्पादन होता है। यह मॉडल एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल के साथ जो स्तनधारी दिल उत्थान का अध्ययन करने के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है। कोरोनरी वाहिका के दृश्य के लिए इस विधि का एक प्रमुख घटक है, सही सीवन नियुक्ति को सुनिश्चित करने और इस प्रकार reproducibility की गारंटी है। जबकि वयस्क चूहों poikilothermic क्षमताओं के पास नहीं है, शरीर का तापमान और नवजात चूहों के चयापचय दर बारीकी से परिवेश के तापमान के साथ जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, नवजात चूहों के छोटे आकार उन्हें सतह ठंडा द्वारा hypothermic शामिल करने के लिए आदर्श बनाता है। सर्जरी और माउस के शरीर के तापमान के समय इस प्रक्रिया नकल करने में सटीकता के लिए महत्वपूर्ण हैं और इस प्रकार ध्यान से निगरानी की जानी चाहिए। बंधाव संभव के रूप में जल्द ही के बाद अकर्मण्यता पर पहुंच गया है मायोकार्डियम के बाद बंधाव की blanching, शल्य चिकित्सा की सफलता इस बात की पुष्टि की कल्पना करने का अवसर प्रदान करता है।
वहाँ म्यू हैंltiple तरीकों कि एमआई प्रेरण पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये टीटीसी धुंधला हो जाना, इकोकार्डियोग्राफी और histological विश्लेषण शामिल हैं। टीटीसी धुंधला कम लागत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय है, और आसानी से उच्च throughput के साथ प्रदर्शन किया है। इन कारणों के लिए, टीटीसी धुंधला व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है। इकोकार्डियोग्राफी समय के साथ हृदय समारोह के बाद एमआई में गैर invasively मॉनिटर परिवर्तन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एमआई के पक्का सबूत ऊतकीय विश्लेषण के माध्यम से प्रदर्शन किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में, ऊपर तकनीक के सभी तीन एमआई के सफल प्रेरण सत्यापित करने के लिए कार्यरत थे।
बालक की विज़ुअलाइज़ेशन सफल एमआई प्रेरण के लिए महत्वपूर्ण है। अन्वेषक कठिनाई लाड (संभावना गहरी हाइपोथर्मिया प्रेरण के कारण) visualizing सामना कर रहा है, तो बाएं अलिन्द, संदंश के साथ थोड़ा उठाया जा सकता है के रूप में बालक की मुख्य जड़ अधिक दूरवर्ती क्षेत्रों की तुलना में बड़ा है और अधिक आसानी से दिखाई हो सकता है। लाड कल्पना नहीं की जा सकती हैं, अन्वेषक धमनी लो अनुमान नहीं करना चाहिएकेशन। यह पिल्ला प्रयोगात्मक बंधाव के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए और नहीं बल्कि एक दिखावा संचालित नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
4 वें पसलियों के बीच अंतरिक्ष में छाती गुहा में सही प्रविष्टि इष्टतम दृश्य और लाड बंधाव के लिए जगह हासिल करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस पसलियों के बीच रिक्त स्थान की सावधान गिनती के माध्यम से हासिल किया जा सकता है। इसके अलावा, यदि खून बह रहा है की एक छोटी सी राशि की प्रक्रिया के दौरान होता है, यह बाँझ धुंध के साथ हटाया जा सकता है। यदि रक्त स्राव महत्वपूर्ण है, तथापि, सर्जन संभावना माउस पर्याप्त प्रक्रिया शुरू करने से पहले ठंडा नहीं हुआ है, और आगे ठंडा करने की आवश्यकता है। कृपया ध्यान दें कि ठंडा करने की डिग्री ध्यान से आदेश कोरोनरी धमनी की कल्पना करने में करीब 20 बीपीएम पर दिल की दर सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए।
नवजात चूहों के छोटे आकार के कारण, उच्च संकल्प इकोकार्डियोग्राफी हृदय समारोह के विश्लेषण के लिए स्पष्ट एम मोड छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, पर दिल की दर सुनिश्चितप्रकाश संज्ञाहरण के साथ लगभग 400 बीपीएम (0.5 - 1% isoflurane साँस लेना) और सामान्य शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए (गर्म गोदी और गूंज जेल गरम)। छवियाँ सबसे अच्छा है अगर शरीर दाएँ कंधे की ओर थोड़ा झुका हुआ है अर्जित कर रहे हैं (~ 5 ° cranially और 5 डिग्री दाहिनी ओर)। सुनिश्चित करें पर्याप्त गूंज जेल शोर को कम करने के लिए लागू किया जाता है।
हालांकि इस दृष्टिकोण 100% reproducibility की पेशकश करता है, रोधगलितांश का आकार (चित्रा 3) व्यक्ति नवजात शिशु का शरीर रचना विज्ञान शाखाओं में कोरोनरी धमनी के आधार पर कुछ हद तक चर हो सकता है। नतीजतन, उच्च n संख्या अलग उपचार या हृदय उत्थान पर आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभाव का निर्धारण करने में सांख्यिकीय महत्व तक पहुँचने के लिए आवश्यक हो सकता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण दोनों नवजात सर्वोच्च लकीर और चोट के इन तंत्रों के pathophysiology के रूप में cryoinjury से अधिक प्रमुख फायदे रखती एमआई से पूरी तरह से अलग हो सकता है और इस तरह सही फिर से नहीं हो सकतावर्तमान मानव एमआई 8,20। यह दृष्टिकोण अधिक सीधे ठेठ मानव चोट mimics, और स्तनधारी एमआई की सेटिंग में हृदय उत्थान अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
के रूप में यह पुनर्योजी (नवजात) स्तनधारी मायोकार्डियम गैर पुनर्योजी (वयस्क) के बीच हृदय की चोट से उबरने के तंत्र में मतभेद के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और यह मॉडल अनूठा है। उदाहरण के लिए, वयस्क माउस स्थायी निशान गठन में MI मॉडल का परिणाम है। वेंट्रिकुलर टूटना अक्सर रोधगलितांश विस्तार का एक परिणाम के रूप में होता है। इस मॉडल (> 100 सर्जरी, अप्रकाशित डेटा) के साथ हमारे अनुभव में, पूरा उत्थान 21 दिनों के बाद रोधगलन और वेंट्रिकुलर टूटना मनाया नहीं किया गया है स्पष्ट है। जानकारी इस मॉडल के उपयोग से अर्जित तंत्र है कि वयस्क में हृदय उत्थान को बढ़ावा कर सकते में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।
हाल ही में सबूत इंगित करता है cardiomyocyte प्रसार हृदय उत्थान 9 के लिए एक प्रमुख योगदान रहा है 4,21 के महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में पहचान की गई है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग इसके अलावा अनुसंधान हृदय उत्थान के बाद एमआई के शामिल होने के लिए चिकित्सकीय लक्ष्य के लिए बात कर सकते हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
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