Abstract
El infarto de miocardio inducido por ligadura de la arteria coronaria se ha utilizado en muchos modelos animales como una herramienta para estudiar los mecanismos de la reparación cardíaca y la regeneración, y para definir nuevas dianas para la terapéutica. Durante décadas, los modelos de la regeneración cardíaca completa existían en anfibios y peces, sino un homólogo de mamíferos no estaba disponible. El reciente descubrimiento de una ventana postnatal durante el cual los ratones poseen capacidades regenerativas ha llevado a la creación de un modelo de mamífero de la regeneración cardíaca. Un modelo quirúrgico de la regeneración cardiaca de mamífero en el ratón neonatal se presenta en este documento. En pocas palabras, postnatal día 1 (P1) los ratones se anestesian por isoflurano y se coloca sobre una almohadilla de hielo para inducir la hipotermia. Después se abre el pecho, y la descendente anterior de la arteria coronaria (LAD) se visualiza, una sutura se coloca alrededor de la LAD para causar isquemia de miocardio en el ventrículo izquierdo. El procedimiento quirúrgico tarda 10-15 minutos. La visualización de la arteria coronaria secrucial para colocación de la sutura precisa y reproducibilidad. El infarto de miocardio y disfunción cardíaca se confirman por el cloruro de trifenil-tetrazolio tinción y la ecocardiografía (TTC), respectivamente. regeneración completa 21 días después de un infarto de miocardio es verificada por la histología. Este protocolo se puede utilizar como una herramienta para dilucidar los mecanismos de regeneración cardiaca de mamífero después de un infarto de miocardio.
Introduction
El infarto de miocardio (IM) es la principal causa de muerte en el mundo, y sigue siendo responsable de aproximadamente un tercio de los casos de insuficiencia cardiaca 1. Mientras que la llegada de la intervención percutánea y optimización continua del uso de trombolíticos ha aumentado la reperfusión después de un IM, la muerte de los cardiomiocitos y la pérdida de miocardio contráctil, sin embargo, ocurre. También queda un gran número de pacientes "sin opción" que no son candidatos para o que no vea los beneficios de estas intervenciones. Estos pacientes continúan experimentando isquemia incapacitantes que conducen a la formación de la cicatriz y el remodelado ventricular perjudicial como un mecanismo de curación del infarto. Este proceso resulta en última instancia, la insuficiencia cardíaca, para los que el pronóstico sigue siendo pobre a pesar del tratamiento farmacológico óptimo con inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) y los bloqueadores beta. Por desgracia, la tasa de mortalidad a un año en pacientes con función ventricular izquierda severamente dañada todavía permanece comoalto como 26% 2. El trasplante de corazón es la última opción de tratamiento para los pacientes con insuficiencia cardíaca. Sin embargo, el grupo limitado de donantes para el trasplante de corazón no hacer de esto una opción viable para la mayoría de los pacientes. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos para restaurar el miocardio dañado sigue siendo primordial para resolver el problema de la enfermedad cardíaca. Por lo tanto, se requieren modelos animales fiables de lesión cardíaca como un componente crítico de este proceso.
El dogma tradicional ha dictado que los cardiomiocitos adultos son post-mitótico, terminales células diferenciadas, incapaces de dividir o cierre definitivo de diferenciación para reemplazar el miocardio dañado 3. Como tal, un corazón de los mamíferos adultos nunca pudo recuperarse completamente de una lesión, y cardiomiocitos perdidos sería reemplazado por tejido fibroso. Por lo tanto, la investigación se ha centrado principalmente en agentes terapéuticos para reducir al mínimo la expansión del infarto y reducir la formación de cicatrices. Sin embargo, más recientemente, se ha producido un cambio de paradigmaen el pensamiento que rodea la cicatrización cardíaca y muchos esfuerzos de investigación se han redirigido a centrarse en el potencial para la regeneración cardiaca 4.
Hasta hace poco, el estudio in vivo de regeneración cardiaca se restringió a los modelos no de vertebrados, tales como los que en anfibios y peces teleósteos urodelos 5-7. Sin embargo, el descubrimiento de la capacidad de regeneración cardiaca en el ratón neonatal ha llevado al desarrollo de dos modelos quirúrgicos de la regeneración cardiaca de mamífero: la resección de la oclusión de la arteria coronaria cardiaca ápice y para inducir el infarto de miocardio 8,9. En 2011, se utilizó un modelo de la resección del ápice del ratón para demostrar que la regeneración cardiaca completa es posible en el día postnatal 1 (P1). Sin embargo, esta capacidad disminuye rápidamente después del período neonatal inicial. El corazón de los mamíferos pierde su potencial regenerativo poco después del nacimiento en P7 como el número de células progenitoras declive, y cardiomiocitos llegar a ser binucleadas, perdersu competencia proliferativa, y permanentemente salen del 10,11 ciclo celular. La comprensión de las diferencias fundamentales entre el recién nacido y corazón de los mamíferos adultos puede conducir a nuevos conocimientos sobre la regeneración cardiaca.
Si bien la resección del ápice de hecho ofrece una visión de re-crecimiento de tejido contráctil, el modelo no simula una lesión cardiaca humano típico, y por lo tanto no se presta también para el desarrollo de la terapéutica. El modelo de oclusión de la arteria coronaria, sin embargo, simula de forma más directa los aspectos fisiopatológicos de la patología MI, y por lo tanto pueden proporcionar información más útil sobre los mecanismos que pueden ser aplicables al avance terapéutico para uso humano.
Ligadura coronaria quirúrgica se ha utilizado como una técnica experimental útil en muchos modelos animales 12-14. En el modelo de ligadura de la arteria coronaria de adultos, los animales se anestesiaron y se intubados para permitir la apertura de la cavidad torácica, manteniendo respiratien. El corazón sigue latiendo regularmente, permitiendo la visualización de la vasculatura coronaria y permitiendo la colocación de la sutura precisa. Por otra parte, el corazón sigue siendo de color rosa como la perfusión continua, y después de la ligadura del miocardio isquémico se ve pálido, lo que indica éxito ligadura de la arteria coronaria. El protocolo descrito para ratones recién nacidos, sin embargo, es menos fiable como la arteria coronaria no se visualiza y el cirujano debe estimar dónde colocar la sutura 15. Aunque la anatomía general de la vasculatura coronaria es el mismo, la variabilidad animal individual en la dirección y la ramificación de la LAD existe 16. Por lo tanto, cuando "ir a ciegas", la arteria podría perderse fácilmente. entonces se requieren otras técnicas, como la ecocardiografía para confirmar la inducción exitosa de MI, y para asegurar que todas las cirugías como resultado un tamaño del infarto similar. Aquí se describe una mejora en un método recientemente publicado 15, donde la posición de la LAD Se puede establecercado y por lo tanto LAD se pueden ligar para inducir reproducible MI.
Esta técnica no requiere intubación endotraqueal o ventilación mecánica, como la toracotomía en un estado hipotérmico en el ratón neonatal no resulta en el colapso pulmonar. Sin embargo, en el método anteriormente descrito, la hipotermia severa debe ser inducida hasta el punto de tanto apnea completa y el cese del ritmo cardíaco 15. La principal limitación de este enfoque es que la arteria coronaria ya no es perfundido y el corazón se ve pálido, incluso antes de la ligadura de LAD. En el enfoque descrito en el presente documento, la visualización de las arterias coronarias es posible en un punto de letargo antes de la hipotermia profunda y la cesación del ritmo cardíaco y la recuperación completa del ratón neonatal después de la cirugía. Este método ofrece una ventaja importante de 100% de reproducibilidad.
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Protocol
Las parejas reproductoras de C57BL / 6 y CD-1 IG-S ratones fueron adquiridos de Charles River. Los animales utilizados en este estudio fueron manejados de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales, y los protocolos de estudio fueron aprobados por el Subcomité Uso de Animales de la Universidad de Western, Londres, Canadá.
1. Cuidado de Animales
- Después de dar a luz es completa y crías de haber sido inicialmente amamantado por su madre para unos pocos horas, colocarlos en una jaula diferente, con una madre adoptiva CD-1. Madres CD-1 presentan un fenotipo más tranquilo con un fuerte instinto de fomento, y tienen una menor tendencia a recuperar las piezas aprovechables cachorros heridos 15.
2. Cirugía
- Inducir la anestesia mediante la colocación de la cría en una cámara sellada isoflurano (aproximadamente 500 l de 100% v / v isoflurano permite disipar más de 1.300 cm 3 de cámara). Mantenga el ratón en la cámara hasta el cese de movimiento (aproximadamente 30 segundos).
- Retire moutilizar de la cámara y de inducir la anestesia con isoflurano hipotermia mediante la colocación del ratón sobre hielo húmedo. Para evitar la congelación, coloque hielo dentro de un guante quirúrgico estéril, envuelva el ratón dentro del guante y cubrir el guante con hielo o envolver el ratón en una gasa húmeda estéril y colocarlo sobre hielo.
NOTA: Los ratones enfrían más rápido cuando el contacto con el hielo es sobre un área superficial más grande, y como tal hielo derretido puede acortar el tiempo de inducción de hipotermia. - Confirmar la anestesia por la falta de respuesta del movimiento a los pies y de pinzamiento del rabo.
NOTA: cese del movimiento provocado ocurre a una temperatura corporal entre 15 ° C y 8 ° C. (Tiempo de enfriamiento a esta temperatura aproximadamente 1 min). La apnea completa y asistolia no se requiere para la ligadura de LAD. - Mover la cama hielo en el área quirúrgica equipado con un microscopio quirúrgico. Asegúrese de que la cría de ratón se mantiene en hielo durante todo el procedimiento quirúrgico.
NOTA: El área quirúrgica, gasas y los instrumentos quirúrgicos deben ser esterilizados. maintaen el campo estéril durante todo el procedimiento, y el desgaste de un solo uso, guantes quirúrgicos estériles. No se requiere pomada oftálmica ya que los ratones nacen con los ojos cerrados 17. - Coloque la cría de ratón en la posición de decúbito lateral derecho. Desinfectar el pecho limpiando suavemente con solución de povidona yodada seguido de un algodón empapado en etanol.
- Realizar incisión en la piel en el pecho izquierdo a lo largo de la línea axilar media cortando la piel entre el xifoides y la axila izquierda de unos pocos milímetros por debajo de la pata delantera izquierda. También utilizar tijeras para cortar a través de la capa de músculo pectoral subyacente.
- Realizar una toracotomía izquierda en el espacio intercostal 4º separando las costillas y los músculos intercostales con unas pinzas.
NOTA: costillas neonatales son muy frágiles y pueden romperse fácilmente. Para evitar esto, suavemente costillas separadas mediante la apertura de pinzas a lo largo del músculo intercostal (en lugar de agarrar costillas). - Visualizar el anterior izquierda arteria coronaria descendente (LAD) que emerge de la aur izquierdaIcle detrás de la vena pulmonar y descender más allá de la gran vena cardíaca.
NOTA: En esta ventana neonatal precoz, el timo a menudo se visualiza y puede cubrir parte de la base cardiaca. La LAD se puede ver emergente al lado de la posición del timo, en función del ángulo de incisión torácica. - Ligar la LAD pasando una sutura de nylon 11-0 (aguja de 0,007 mm de diámetro) por debajo de la arteria a través de mediados del ventrículo por debajo de la aurícula izquierda (Figura 1C). La isquemia se confirma con el escaldado del miocardio por debajo del sitio de la sutura (Figura 1G).
- Cerrar la incisión torácica usando 8-0 suturas de nylon (aguja de 0,15 mm de diámetro). Use dos suturas para cerrar las costillas. Coloque ambas suturas de nervio antes de ligación para asegurar que la aguja no perforar los pulmones cuando pasa a través de la cavidad del cuerpo.
- Después de cerrar las costillas, retire el ratón del lecho de hielo. Mantenga el ratón dentro del área quirúrgica y colocarlo directamente en la estéril quirúrgico parawel sobre una almohadilla térmica a 37 ° C para comenzar el calentamiento.
- Una vez en la zona caliente estéril, cerrar las capas musculares y de la piel utilizando 8-0 suturas de nylon (aguja de 0,15 mm de diámetro). Utilice una sutura para la capa muscular y el uso de dos suturas para la incisión de la piel.
NOTA: Músculo y capas de la piel pueden estar cerradas en una almohadilla térmica para reducir el tiempo de exposición hipotermia. la temperatura del ratón comienza a elevarse una vez colocado sobre el cojín eléctrico, pero sigue siendo lo suficientemente baja para el mantenimiento de la anestesia durante el cierre de los músculos y la piel.
3. recuperación quirúrgica
- Continuar el calentamiento rápido sobre una almohadilla térmica hasta el regreso de circulación espontánea. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Retire la povidona yodada y la sangre limpiando suavemente sitio de la lesión con la esponja de etanol.
- Después de la recuperación de la anestesia suficiente, eliminarlo de la zona quirúrgica estéril, untarlo con ropa de cama de Fosterjaula de la madre y las crías de retorno para estimular la madre. Esto ayuda a prevenir el rechazo de la madre o la canibalización.
NOTA: No devuelva los cachorros a una jaula con otros animales hasta que esté completamente recuperado. Si no se ha utilizado una camada entera, y sus compañeros de camada permanecer con la madre de crianza, colocar cachorros recuperados en el medio de la camada. Si se realiza más de una cirugía, completa todas las cirugías necesarias para una litera individual antes de devolver los ratones a su madre adoptiva. - Observar el comportamiento de la madre adoptiva hacia el cachorro cada 10 - 15 min para 2 - 3 horas para asegurar la aceptación del cachorro. Si la madre muestra la agresión hacia el cachorro herido, retire el cachorro y la eutanasia por sobredosis de isoflurano (> 5%; hasta el cese de la respiración), seguido por decapitación. NOTA: perioperatoria medicamentos analgesia no son necesarios ya que los reflejos de dolor centralizados no están completamente desarrollados en esta temprana edad de 15 años.
4. Medición de miocardio tamaño del infarto 4 -6 horas después de la MI
- Permitir a los cachorros a recuperarse en el cuidado de una madre adoptiva CD-1 por un período de 4 - 6 horas. Retire el cachorro de la jaula con la madre y practicar la eutanasia por sobredosis de isoflurano seguido por decapitación con grandes tijeras.
- Escindir el corazón bajo microscopio de disección, con cuidado de no rasgar el miocardio.
- Cortar la piel del proceso xifoides a la parte superior del tórax. pared abdominal abierta debajo de la caja torácica. Agarre la caja torácica inferior y cortar a través de las costillas y la musculatura longitudinalmente a lo largo axilar media izquierda de la línea desde el diafragma hasta la axila.
- Mantenga tijeras en plano transversal y cortar cuidadosamente a través del diafragma de izquierda a derecha. Asegúrese de colocar las tijeras por debajo del nivel del corazón a fin de evitar cualquier daño al ápice.
- Agarre la caja torácica y la parte cortada hacia la derecha de las costillas y la musculatura junto axilar media la línea derecha. Retire todas las conexiones vasculares en el corazón con unas tijeras. Retire el corazón de la cavidad del pecho agarrandola base.
- Sección el corazón en tres pedazos usando una cuchilla de afeitar de acero al carbono quirúrgica. Haga el primer corte a lo largo del eje corto del corazón en el punto medio entre la sutura y el ápex cardíaco. Hacer que el segundo corte en el nivel de la sutura (Figura 3A).
NOTA: Esto deja una sección ápice de aproximadamente 0,75 mm de espesor, que pesa 0,0018 g; una sección mediados de base de aproximadamente 1 mm de espesor, con un peso 0,0065 g; y la base del corazón. - Colocar las secciones del corazón en 1% de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) a temperatura ambiente durante 10 - 15 min. Tenga mucho cuidado con la muestra para evitar el exceso de tinción.
- Para aumentar el contraste, corregir las rebanadas del corazón manchadas con paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C. Para calcular el área del infarto%, secciones del corazón fotografía y medir el área del infarto de software de imágenes. El miocardio viable se tiñe de color rojo, mientras que el área de infarto es demarcada como blanco de 18.
5. Medición de laLa función cardíaca mediante ecocardiografía post-MI
- Permitir a los cachorros a recuperarse en el cuidado de una madre adoptiva CD-1 por un período de 24 - 48 h. Inducir la anestesia mediante la colocación de la cría en una cámara sellada isoflurano (5% de isoflurano). Mantenga el ratón en la cámara hasta el cese de movimiento (aproximadamente 30 segundos).
- Asegure que el cachorro en la posición supina en un muelle climatizada (temperatura de 37 ° C), con su nariz en un cono de entregar 0,5 - 1% isoflurano (para el mantenimiento de la anestesia). Coloque gel de eco pre-calentado en la zona torácica izquierda.
- Obtener una vista de eje largo paraesternal del ventrículo izquierdo (VI). Asegurar que las imágenes se obtienen por debajo del nivel de la sutura en el VI. Tras la adquisición de la posición, gire la sonda de ultrasonido (40 MHz) 90 ° para obtener una vista de eje corto paraesternal, y grabar en modo M imágenes ecocardiográficas.
- Medir la diastólica final y terminar con diámetros internos sistólica del ventrículo izquierdo de las imágenes en modo M de eje corto. Calcular la fracción de eyección y fractioacortamiento nal.
6. Medición de miocardio tamaño del infarto 24 horas después de la MI
- Permitir a los cachorros a recuperarse en el cuidado de una madre adoptiva CD-1 por un período de 24 horas. Retire el cachorro de la jaula con la madre y practicar la eutanasia por sobredosis de isoflurano seguido por decapitación con grandes tijeras.
- Abrir la cavidad torácica como en el paso 4.2. Antes de ablación del corazón, cuidado, sujete la aorta torácica justo por encima del diafragma con unas pinzas finas. Mantenga tijeras finas en el plano coronal, planas contra la pared torácica, y cortar la aorta torácica de la pared torácica posterior tijeras se mueve en la dirección craneal.
- Cortar la aorta libre de la pared torácica y cualquier otra conexión hasta que llega al corazón. Escindir el corazón sujetando la vena cava superior y cortar todas las demás conexiones vasculares en el cuerpo.
- Enjuague el corazón (aorta con adjuntos) en solución salina. cannulate cuidadosamente la aorta torácica con una aguja de calibre 30 y atar unaorta a la cánula con hilo de sutura de nylon 8-0.
- Perfundir el corazón con 1 ml de solución salina a través de la aorta a través de una aguja de calibre 30 a una velocidad de 1 ml / min. Perfundir el corazón con 150 l de solución de azul de Evans al 2% a una velocidad de 1 ml / min. Retire el corazón de la cánula, la sección en tres pedazos y teñirla con TTC como se describe en la sección 4.
- Para calcular el tamaño del infarto, las secciones del corazón fotografía y medir el área del infarto de software de imágenes. El miocardio viable mancha azul, en la zona de riesgo manchas de color rojo, y el área del infarto está demarcado como blanco.
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Representative Results
El procedimiento de infarto de miocardio en P1 puede ser completado en el 10 - 15 min y tiene una tasa de mortalidad del 7,8% (5 de 64 cachorros). Después de la cirugía, los ratones se recuperan de la anestesia de hipotermia en el próximo de 5 - 20 minutos (tiempo de recuperación depende de la temperatura corporal alcanzado durante la anestesia y la velocidad del cirujano). Cuando se utiliza crías P7 (para la comparación con un miocardio no regenerativa), se requiere un período de enfriamiento más largo para alcanzar letargo. crías P7 son mucho más grandes y tienen más dificultades para recuperarse de una lesión cardiaca tanto e hipotermia, lo que resulta en una tasa de mortalidad mucho más alta de 26,9% (14 de los 52 cachorros).
Los resultados de los estudios anteriores se confirman en el presente documento, lo que indica la inducción de la anestesia de hipotermia en cerca de 10 ° C (entre 8 ° C y 15 ° C) 19. Dentro de esta ventana de temperatura, frecuencia cardiaca lenta,pero el ritmo continúa a tasas de entre el 24 y el 11 lpm lpm. La frecuencia cardíaca baja en este nivel de enfriamiento reduce significativamente el sangrado intraoperatorio. La LAD puede ser fácilmente visualizado y se liga a estas temperaturas (Figura 1). El LAD permanece visible hasta que la temperatura del cuerpo alcanzan entre 9,6 ° C y 4,9 ° C, causando disminución de la frecuencia cardíaca a 2 ppm o asistolia.
Después de la ligación LAD en P1, las crías se recuperan completamente y crecen hasta un tamaño de cuerpo comparable a la de los controles de la misma camada. Una vez colocado vuelta con su madre adoptiva, cachorros recuperar las capacidades de sensibilización y de alimentación comparables a los compañeros de camada en aproximadamente 10 minutos. En el examen histológico de 3 días post-IM, hay evidencia de infarto, con la infiltración de células inflamatorias, una respuesta post-infarto típica (Figura 2). En el día 7 post-IM, tejido ventricular izquierda parece normal. En el día 21 post-IM, completa cse ha producido la regeneración ardiac.
2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro de (TTC) tinción 4-6 horas después de la MI se utilizó como una confirmación de la inducción consistente de MI. El área roja representa el miocardio viable y el área blanca representa el tejido muerto isquémica. En un total de 13 cirugías de ligadura de LAD, el 100% de los corazones fueron infartado, con un tamaño medio de infarto del 36% (Figura 3). Tinción de TTC con Evans perfusión azul también se realizó a las 24 horas post-MI para demostrar la persistencia de tejido infartado y medir el tamaño del infarto en base al área en riesgo (Figura 4). En estos corazones, miocardio viable mancha azul, en la zona de riesgo manchas rojas, y el área del infarto está demarcado como blanco. El tamaño del infarto se calculó como un porcentaje del área en riesgo. En 4 cirugías de ligadura de LAD, el 100% de los corazones fueron infartado, con un tamaño del infarto promedio de 49% del área en riesgo (Figura 4).
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Para confirmar la inducción del infarto, la ecocardiografía se realizó a las 24 y 48 horas después de la MI. A las 24 h post-MI, fracción de eyección (EF) se redujo significativamente del 84% al 74%, y la fracción de acortamiento (FS) redujo significativamente del 50% al 40% (Figura 5). Por 48 horas después de la MI, EF se redujo adicionalmente a 46%, en comparación con 80% en los controles y FS también se redujo significativamente a 25%, en comparación con 50% en los controles. Además, hubo una reducción significativa en el diámetro interno del ventrículo izquierdo sistólica en 48 hr (Figura 6). LV espesor de pared anterior no se redujo significativamente en cualquiera de 24 o 48 horas después de la MI (Figuras 5 y 6).
Figura 1. Arterias Coronarias es visible durante neonatal LAD Procedimiento. P1 af ratón neonatalter anestesia hipotermia, incisión en la piel, el músculo y la incisión de toracotomía lateral en el cuarto espacio intercostal. A) anterior izquierda arteria coronaria descendente (LAD) es visible. BD) 11-0 sutura de nylon se hace pasar por el centro del ventrículo. E) LAD se liga y la palidez observada por debajo del sitio de sutura. F) y G) son fragmentos ampliados de A) y e), respectivamente. Occ. LAD, anterior ocluida la arteria descendente. LA, aurícula izquierda. LV: ventrículo izquierdo. GCV, gran vena coronaria. flecha blanca, LAD. punta de la flecha negro, el brillo de la iluminación. Las barras de escala son de 1 mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Evidencia de Cardi completaac Regeneración Después de LAD ligadura en ratones recién nacidos. tinción de tricrómico de Masson después de la ligadura de LAD en ratones P1. corazones enteros y aumentos en las áreas de infarto se muestran en los días 3, 7 y 21 después de la ligadura de LAD. Tenga en cuenta la pérdida de miocitos y células inflamatorias infiltrarse en la región del infarto en el día 3 post-IM (flecha blanca). Completa la regeneración zona de infarto comenzando el día 7 post-IM. Poca evidencia de fibrosis observó en el día 21 post-IM. Las barras de escala son 200, 100 y 50 micras para 40X, 200X aumentos, y 630x, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. neonatal LAD ligadura es 100% reproducible. A) Las líneas de la sección del corazón entero para crear una pieza ápice 0,75 mm y un pedazo de 1 mm a mediados de base para TTCtinción. B) Imágenes representativas de TTC manchado control simulado y corazones LAD se ligó. Las barras de escala son de 1 mm. De tamaño C) infarto en 13 ligaduras de LAD en ratones recién nacidos P1. Corazones recogieron 4 - 6 horas después de la IM y el tamaño del infarto medido después de la tinción de TTC. El color rojo indica miocardio viable; blanca indica necrosis. Los datos son la media ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Resultados neonatal LAD ligadura en el infarto fiable. A) El tamaño del infarto como% del área isquémica después de la ligadura LAD en ratones neonatal P1 (n = 4). Los corazones se recogieron 24 horas después de la MI y se midió el tamaño del infarto después de la tinción con azul de Evans y TTC. El color azul indica miocardio viable; rojo indica el área en riesgo; blanca indica necrosis. Los datos son la media ± SEM. B) Imágenes representativas de Evans LAD manchado corazones azules y TTC ligados después de la ligadura de LAD. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Resultados de ligación neonatal LAD en disfunción cardíaca a las 24 horas post-IM. La función cardíaca se evaluó mediante ecocardiografía. A) Representante de modo M imágenes de los dos ratones con operación simulada y se ligó LAD. Final de la diástole y la sístole final se indican con flechas. B) Las mediciones de la fracción de acortamiento, fracción de eyección, y el diámetro interno del ventrículo izquierdo en la diástole y la sístole tanto. Los datos son la media ± SEM. N = 8 y 7 para farsa y ligadura de la arteria coronaria (CAL), respectivamente. * P <0. 05. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Resultados de ligación neonatal LAD en disfunción cardíaca a las 48 h post-IM. La función cardíaca se evaluó mediante ecocardiografía. A) Representante modo M imágenes que muestran final de la diástole (flechas largas) y al final de la sístole (flechas cortas) para ambos simulada operado y LAD ligó ratones. B) mediciones funcionales cardíacos por ecocardiografía incluyendo la fracción de acortamiento, fracción de eyección, y el diámetro interno del ventrículo izquierdo, tanto en la diástole y la sístole. Los datos son la media ± SEM. N = 4 y 6 para farsa y ligadura de la arteria coronaria (CAL), respectivamente. * P <0,05, ** p <0,01.target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La ligadura de LAD quirúrgico demostrado en el presente documento es un método fiable para producir MI en ratones neonatales. Este modelo proporciona a los investigadores un modelo reproducible con el que para estudiar la regeneración del corazón de los mamíferos. La visualización de la vasculatura coronaria es un componente clave de este método, asegurando la colocación de sutura correcta y garantizando así la reproducibilidad. Mientras que los ratones adultos no poseen capacidades poiquilotermos, la temperatura corporal y la tasa metabólica de los ratones recién nacidos se asocia estrechamente con la temperatura ambiente. Además, el pequeño tamaño de los ratones neonatal hace ideales para la inducción de hipotermia por enfriamiento de la superficie. El momento de la cirugía y la temperatura corporal del ratón son cruciales para la precisión en la reproducción de este procedimiento y por lo tanto se debe controlar cuidadosamente. La ligadura tan pronto como sea posible después de que se alcanza torpor ofrece la oportunidad de visualizar el escaldado del miocardio post-ligación, confirmando el éxito quirúrgico.
Hay mumétodos ltiple que se pueden utilizar para confirmar la inducción de MI. Estos incluyen la tinción de TTC, la ecocardiografía y el análisis histológico. tinción TTC es de bajo costo, reproducible y fiable, de fácil realización y con un alto rendimiento. Por estas razones, la tinción de TTC se ha utilizado ampliamente. La ecocardiografía se puede utilizar para vigilar los cambios de forma no invasiva en la función cardíaca post-IM a través del tiempo. La prueba definitiva de IM puede ser demostrado a través del análisis histológico. En el presente estudio, los tres de las técnicas anteriores se emplearon para verificar la inducción exitosa de MI.
La visualización de LAD es crítico para el éxito de la inducción MI. Si el investigador está experimentando dificultades visualización de la LAD (probablemente debido a la inducción de la hipotermia profunda), la aurícula izquierda puede ser levantada ligeramente con las pinzas, ya que la raíz principal de la DA es más grande que los segmentos más distales y puede ser más fácilmente visible. Si el muchacho no puede ser visualizado, el investigador no debe suponer lo arteriacatión. Este perrito no debe ser utilizado para la ligadura experimental y más bien se podría utilizar como una farsa operado control.
Entrada correcta en la cavidad torácica en el espacio intercostal 4º Es importante obtener una óptima visualización y el espacio para la ligadura de LAD. Esto puede lograrse mediante una cuidadosa recuento de los espacios intercostales. Además, si una cantidad menor de sangrado se produce durante el procedimiento, se puede quitar con una gasa estéril. Si el sangrado es significativo, sin embargo, el cirujano ha probablemente no enfriado el ratón suficientemente antes de comenzar el procedimiento, y se requiere un enfriamiento adicional. Tenga en cuenta que el grado de enfriamiento debe ser controlada cuidadosamente para asegurar la frecuencia cardiaca en alrededor de 20 latidos por minuto con el fin de visualizar la arteria coronaria.
Debido al pequeño tamaño de los ratones neonatal, se requiere una alta resolución ecocardiografía para obtener imágenes en modo M claras para el análisis de la función cardíaca. Para obtener los mejores resultados, asegúrese de frecuencia cardíaca enalrededor de 400 latidos por minuto con anestesia ligera (0,5 - 1% por inhalación de isoflurano) y mantener la temperatura corporal normal (muelle se calienta y se calentó gel de eco). Las imágenes se adquieren mejor si el cuerpo se inclina ligeramente hacia el hombro derecho (~ 5 ° en sentido craneal y 5 ° hacia la derecha). Asegurar suficiente gel de eco se aplica para minimizar el ruido.
Aunque este enfoque es que ofrece 100% de reproducibilidad, el tamaño del infarto puede ser algo variable dependiendo de la anatomía de las arterias coronarias del neonato individuo de ramificación (Figura 3). Como resultado, n números más altos pueden ser necesarios para alcanzar significación estadística en la determinación de los efectos de diferentes tratamientos o manipulaciones genéticas sobre la regeneración cardíaca. Sin embargo, este enfoque tiene importantes ventajas con respecto a tanto la resección del ápice neonatal y criolesión como la fisiopatología de estos mecanismos de la lesión puede ser completamente diferente de MI y por tanto no puede volver precisiónpresente humana MI 8,20. Este enfoque imita más directamente lesión humano típico, y puede ser usado para estudiar la regeneración cardiaca en la fijación de los mamíferos MI.
Este modelo es único, ya que permite el estudio de las diferencias en los mecanismos de recuperación de la lesión cardiaca entre la no regenerativa (adulto) y el regenerador (neonatal) miocardio mamífero. Por ejemplo, los resultados del modelo de ratón adulto MI en la formación de cicatrices permanentes. ruptura ventricular a menudo se produce como resultado de la expansión del infarto. En nuestra experiencia con este modelo (> 100 cirugías; datos no publicados), la regeneración completa es evidente que no se ha observado 21 días después del infarto y la ruptura ventricular. La información acumulada por el uso de este modelo puede ofrecer nuevos conocimientos sobre los mecanismos que pueden promover la regeneración cardiaca en el adulto.
La evidencia reciente indica proliferación de los cardiomiocitos es un importante contribuyente a la regeneración cardiaca 9 4,21 regeneración cardíaca. La investigación adicional utilizando el protocolo presentado aquí puede apuntar a dianas terapéuticas para inducir la regeneración cardiaca post-infarto de miocardio.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics--2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D'Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
