Summary
Målet med denne protokollen er å invasivt vurdere hjerte strukturelle og funksjonelle endringer i en musemodell for hjertesykdom skapt av tverrgående aorta innsnevring, ved hjelp av B- og M-modus ekkokardiografi og farge / puls bølge Doppler.
Protocol
Protokollen følger retningslinjene for Institutional Animal Care og bruk komité University of Washington.
1. Kirurgisk prosedyre og forberedelse til Imaging
- Subject C57BL / 6 mus til TAC eller humbug kirurgi som tidligere beskrevet 10.
- En uke etter TAC eller sham kirurgi, bedøve mus i induksjonskammeret med 2% isofluran blandet med 1 liter / min O 2. Bekreft riktig anesthetization ved manglende respons på tå eller hale knipe. Bruk veterinær salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi. Fjern hår på brystet ved å bruke hårfjerningskrem. Desinfiser mus huden med 70% etanol.
- Fest musen til et dyr håndteringsplattform i liggende stilling. For å opprettholde et jevnt nivå av anestesi, bruk en nosecone å levere 0,5 til 1% isofluran blandet med en L / min O 2.
- Påfør elektrodegel på potene av musen og tape dem til elektroden pad.
- Sett inn en rektal probe for å overvåke kroppstemperatur. At kroppstemperaturen ved 37 ° C via en oppvarming puten eller lampe.
- Påføre et lag av forvarmede ultralyd gel til musen brystet, hovedsakelig i området som ligger over hjertet. Merk: Fjern ultralyd gel og tørk mus med steril kompress etter bildebehandling prosedyren.
2. I aortabuen View, bruk B-modus og Doppler Imaging å evaluere Tverr aorta Innsnevring
- Bruk innstillingen B-modus for å få aortabuen visningen for å visual aorta, store arterielle grener, og innsnevring nettstedet.
- Vippe den venstre side av plattformen opp så langt som mulig for å rotere musen i venstre decubitus stilling. Hold ultralyd Giver stå i vertikal stilling og plassere den på brystet langs høyre parasternal linje med hakket peker mot haken av musen. Merk: Ikke komprimere musen thorax når du senker transducer; minimal mengde trykk som kreves.
- Vipp svinger opp på nivå med scapula og roter litt mot høyre til aortabuen kommer til syne. Observer tverrgående aorta innsnevring området, som ligger mellom forgrening av innominate arterie (IA) og venstre halspulsåre (LCCA) (figur 1).
Merk: Ingen innsnevring er oppdaget i sham-opererte mus.
- Klikk på "farge Doppler" -knappen på arbeidsstasjonen for å bytte til fargedoppler modus for å overvåke retningen og hastigheten på blodstrømmen over innsnevring nettstedet. Erverve og lagre bilder ved å klikke på "cine store" -knappen.
- Klikk på "PW Doppler" knappen for å bytte til puls bølge Doppler-modus, og sted prøvevolum (stiplet markøren boksen) umiddelbart distalt for innsnevring området for å søke etter den stenotisk jet med høyest hastighet, klikk på "PW Doppler" -knappen å få bølgeformer av aorta flow og måle topphastighet (figur 2).
- Beregn trykkgradient over innsnevringen området ved hjelp av den modifiserte Bernoullis likning: trykkgradient = 4 x V max 2. omfatte bare mus med en trykk-gradient i området fra 40 til 80 mmHg for videre analyse.
3. I parasternal Long Axis View, bruk B-modus og M-modus Imaging å vurdere Hjerte Dimensjoner og kontraktilitet
- Med musen ligge i ryggleie på plattformen, holder svingeren i vertikal mote med hakket peker musen hode. Senk svingeren på thorax parallell til venstre parasternal linje og rotere 30 ° mot klokken.
- Bruk B-mode bildebehandling for å få en full lang akse "sagittal" visning av hjertet. Justere vinkelen på transduseren og fokus dybde for å visualisere venstre hjertekammer, det intraventrikulære septal vegg, og en liten del av den høyre ventrikkel vegg. Save bildene for senere målinger av hjerteveggtykkelse og kammerdimensjon. Ved hjelp av "cardiac pakke", velger parametere som IVS eller LVAW, LVID, og LVPW, og klikk på bildet for å trekke tilsvarende linjer for hver parameter for å oppnå målene.
- Observere hjerteveggbevegelsesmønstre og se etter mulige bevegelses abnormiteter, inkludert akinesi, hypokinesi, og asynchrony.
Merk: Akinesia og hypokinesi betegner fullstendig og delvis tap av bevegelse av hjerteveggen, henholdsvis. Asynchrony betegner uregelmessig, ukoordinert hjerteveggen bevegelse. - Bytt til M-modus, sted M-modus markør vinkelrett på LV veggene i høyde med den papillære muskel, og skaffe bilder for senere måling av hjerte dimensjoner og fraksjonell forkortning (figur 3).
4. I parasternal Short Axis View, bruk B-modus og M-modus Imaging å vurdere Cardiac morfologi og funksjon
- From den parasternal lange aksen visning, få parasternal korte aksen visning ved å rotere svingeren 90 ° med klokken. Juster svinger å gi et horisontalt tverrsnitt "tverrgående" visning av hjertet i B-mode, med både papillemusklene klart synlige og plassert til høyre (2 og fire posisjon).
- Bytt til M-modus og plassere M-modus aksen på middels nivå av venstre ventrikkel. Erverve og lagre bilder for senere målinger av hjerteveggtykkelse, kammerdimensjon, og brøk forkorting (figur 4). Ved hjelp av "cardiac pakke", for å velge parametere i SAX (kort akse) inkludert IVS eller LVAW, LVID, og LVPW, og klikk på bildet trekke tilsvarende linjer for hver parameter for å oppnå målene.
Merk: Målinger oppnådd her bør i høy grad til de som ble oppnådd i parasternal lange aksen view (figur 5).
5. I Apical Fire-kammer View, brukDoppler Imaging å vurdere systolisk og diastolisk funksjon
- Skaff apikale fire-kammer sikte på å visualisere både venstre og høyre ventrikkel med atriene nederst på skjermen. I B-mode, fra den korte aksen utsikt, vipp øverst i venstre hjørne av plattformen å vinkle mus hode ned og orientere svinger mot høyre skulder av musen. Dette er i hovedsak for å oppnå en "coronal" visning av hjertet ser opp mot toppen.
- Visual mitralklaffen i B-mode, og bytte til fargedoppler modus, plassere prøvevolumet (den stiplede markøren boks) på tuppen av mitralklaffen.
- Bytt til PW Doppler-modus for å vurdere strømningsmønster over mitralklaffen. Juster Doppler sonden markøren parallelt med retningen for mitral blodstrøm. Bruke en sonde vinkel mindre enn 20 ° for å bestemme topphastighet (figur 6).
- Lagre bildene for senere målinger. Bruk "cardiac pakke" og velg "MV flyt. "Klikk hver parameter og trekke tilsvarende linjer for å oppnå målene Tilgjengelige målinger inkluderer:. Peak E-hastighet (tidlig fylling med aktiv ventrikkel avslapping), peak En hastighet (sen fylling med atrial sammentrekning), mitral Isovolumisk avslapping og sammentrekning ganger (IVRT og IVCT henholdsvis), og utstøting tid (ET).
- Beregn hjerteinfarkt Performance Index (MPI) ved MPI = (IVCT + IVRT) / ET.
6. Post-prosessuell Behandling av dyr
- Gi analgesi og / eller sterilt saltvann intraperitonealt til kirurgiske dyr når det er nødvendig.
- La dyret å komme på en varmepute i liggende stilling. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Ikke returner et dyr som har gjennomgått prosedyren til selskap med andre dyr før fullt restituert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser B-mode bilder av aortabuen visning av mus hjerte utsatt for humbug (figur 1A) eller TAC kirurgi (figur 1B). Aortabuen, innominate arterie, venstre halspulsåre og venstre arteria subclavia vises. Merk at aorta innsnevring er godt synlig i TAC, men ikke hykle hjerte. Doppler-fargebilder fra aorta vis er vist i figur 2A. Bølgeformene aortic flyt over innsnevring nettstedet ble tatt til fange av PW Doppler (figur 2B). Vellykket TAC vil føre til en betydelig økt strømningshastighet nedstrøms for innsnevringen område (typisk ~ 4 m / sek i TAC-mus). Trykkgradient over innsnevringen ble beregnet på grunnlag av toppstrømningshastighet, i henhold til den modifiserte Bernoullis likning (figur 2C).
Figur 3 (figur 3A) eller TAC hjerte (Figur 3B). Øvre felt viser B-mode bilder av venstre ventrikkel, det interventrikulære septum, og et parti av den høyre ventrikkel fra sham eller TAC mus. Den nederste panelet viser M-mode tracings av flere hjertesykluser fra humbug eller TAC mus. Målingene av hjerte dimensjoner er vist, inkludert venstre ventrikkel fremre vegg tykkelse (LVAW), venstre ventrikkel indre diameter (LVID), venstre ventrikkel bakre veggtykkelse (LVPW) i diastolen og systolen. Legg merke til betydelig økt veggtykkelse i mus hjerte kastet TAC sammenlignet med narre kirurgi.
Figur 4 viser bilder av parasternal korte aksen visning av humbug (figur 4A) eller TAC hjertet (figur 4B). Det øvre parti av hvert panel viser M-modus-aksen (den dotted linje) som er plassert i midten av den venstre ventrikkel. Den nedre del av hver plate er det M-modus tracing med linjer som angir hjerte dimensjoner som beskrevet ovenfor. Som en markør for hypertrofi, ventrikulær og septal veggtykkelse kan være nøyaktig bestemt. Mus utsatt for TAC viste økt veggtykkelse som vurdert ved LVAWd og LVPWD, ventrikulær dilatasjon som vurdert av LVISd og LVISs, redusert kontraktilitet som vurdert av LVFS og LVEF, og øket LV masse (figur 5).
Figur 6 viser B-mode apikal fire-kammer view (figur 6A, B) og PW Doppler bilder av transmitral strømningsmønster (figur 6C, D). Målinger av peak E og A hastighet, IVCT, IVRT, og ET vises. E / A-forholdet og MPI beregnes (Figur 6E - I). En sunn mus hjerte har en E / A-forholdet ≥1 og en MPI verdi ≤0.5. I patologiske tilstander med diaStolic eller systolisk hjertefunksjon, for eksempel i mus utsatt for TAC, en redusert E / A-forhold og / eller en økt MPI verdi er vanligvis observeres.
Figur 1. B-mode Bilde av aortabuen View of Mouse Hjerte Utsatt for humbug Surgery (A) eller TAC (B). Store aorta grener inkludert innominate arterie (IA), venstre halspulsåre (LCCA), og venstre arteria subclavia (LSA) er vist. Merk at tverrgående aorta innsnevring (markert med en hvit pil) kan visualiseres i TAC, men ikke hykle hjerte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Farge / PW Doppler Imaging av TransveRSE Aorta Blood Fow fra aortabuen View. farge (A) og PW (B) Doppler bilder fra humbug og TAC hjerter vises. Topp aortic hastighet som oppnås fra PW Doppler brukes til å beregne trykkgradienten i henhold til den modifiserte Bernoullis ligning (C). Disse data bekrefter en vellykket operasjon TAC med trykkgradienten til ~ 70 mmHg. * P <0,05 vs. Sham. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM n = 15 for Sham og n = 13 for TAC. T-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. parasternal Long Axis (Plax) Utsikt Mus Hjerte Utsatt for humbug Surgery (A) eller TAC (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Figur 4. parasternal Kort Axis (PSAX) Utsikt Mus Hjerte Utsatt for humbug Surgery (A) eller TAC (B). M-modus bildene viser plasseringen av prøvevolum (stiplet gul linje i øvre panel) og måling av hjerte dimensjoner i diastolen og systolen (blå linje i nedre panel). Stjernene indikerer papillemusklene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. ekkokardiografivurdering av Cardiac morfologiske og funksjonelle endringer Følger TAC. M-modus bildebehandling i korte aksen visningen ble utført som i Figur 4. (A) LVAWd, venstre ventrikkel fremre vegg tykkelse i diastolen. (B) LVPWD, venstre ventrikkel bakre veggtykkelse i diastolen. (C) LVIDd, venstre ventrikkel indre diameter i diastolen. (D) LVIDs, venstre ventrikkel indre diameter i systolen. (E) LVFS, venstre ventrikkel brøk forkorting. LVFS (%) = (LVIDd-LVIDs) / LVIDd x100%. (F) LVEF, venstre ventrikkel ejeksjonsfraksjon. LVEF (%) = (LVEDV-LVESV) / LVEDV x100%. LVEDV og LVESV betegne venstre ventrikkel ende-diastolisk og end-systolisk volum, henholdsvis. LV volum og ejeksjonsfraksjon er nøyaktig vurdert av Simpso n metode. LV volum beregnes ved å montere en rekke disker i ventrikkelen: Simpson volum = [området (1) + område (2) + ... + område (n)] x lengde. Simpson område og lengde blir oppnådd ved å trekke den endokardiale grensen av LV i den lange akse og korte akse vis. (G) LV (venstre ventrikkel) masse. LV masse (mg) = 1,05 x [(LVIDd + LVPWD + IVSD) 3 - (LVIDd) 3]. Faktoren 1,05 representerer den spesifikke tetthet av myokard. (H) HR, hjertefrekvens. * P <0,05 vs. Sham. Antall mus som ble analysert, er vist i stolpene i hvert panel. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM t-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
p_upload / 54101 / 54101fig6.jpg "/>
Figur 6. Vurdering av transmitral Blood Flow av Doppler Imaging. (A og B) B-mode apikal fire-kammer visning av humbug (A) eller TAC (B) hjerte. LV, venstre ventrikkel; RV, høyre ventrikkel; MV, mitral ventil; TV, trikuspidalklaff; LA, venstre atrium; RA, høyre atrium. (C og D) PW-doppler bølgeform av trans-mitral blodstrømmen i sham (C) eller TAC (D) hjerte. Aktuelle målinger er vist. (E) E / A, topp A og E hastighetsforholdet. (F) IVCT, isovolumisk sammentrekning tid. (G) IVRT, Isovolumisk avslapping tid. (H) ET, utstøting tid. (I) MPI, hjerteinfarkt ytelsen indeksen. * P <0,05 vs. Sham. Antall mus som ble analysert, er vist i stolpene i hvert panel. Data er uttrykt som middel77; sem t-test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekkokardiografi har blitt mye brukt for å vurdere hjertefunksjonen i gnagermodeller av hjertesykdom 2,6. Sammenlignet med invasive eller terminal metoder som trykk-volum sløyfe måling 11 og ex vivo arbeider hjerte 12, gir ekkokardiografi en kraftig, ikke-invasiv verktøy for å vurdere pågående hjerte strukturelle og funksjonelle endringer i levende dyr. For å oppnå pålitelige data, er det viktig å opprettholde kroppstemperaturen og hjertefrekvensen innenfor fysiologiske området 13 ved forsiktig justering av varmeapparatet og den anestesi nivå. Alle bilder skal fanges opp og analysert konsistent i henhold til de standardiserte avbildningsprosedyrer, for å lette sammenligningen mellom mus av forskjellig belastning eller genotype.
TAC blir ofte brukt for å indusere hjertehypertrofi og hjertesvikt hos mus 1. Ikke-invasiv måling av trykk gradient over innsnevring nettstedet ved Doppleravbildning representerer en pålitelig vurdering av graden av overbelastning trykket i mus. Vellykket TAC gir typisk en trykkgradient ≥40 mmHg. Kun mus som utsettes for tilsvarende grad av trykk overbelastning bør inkluderes for ytterligere analyse, mens mus med en trykkgradient for lav eller for høy, må utelukkes. Etter TAC blir mus forventes å utvikle hjertehypertrofi i løpet av 1-2 uker, og hjerte utvidelse etter 4 uker, avhengig av graden av trykk overbelastning og den genetiske bakgrunn av mus testes. Den dynamiske hjerteremodellering og funksjonelle endringer følgende TAC kan bli pålitelig vurderes av ekkokardiografisk avbildning, som beskrevet ovenfor.
I motsetning til sin hyppige bruk hos mennesker 14, farge / PW Doppler har bare nylig blitt tilgjengelig i gnager ultralydavbildning 9. Her finner vi også beskrevet anvendelser av Doppler i måling av trykk gradient samt systolisk og diastolisk ytelse. Måleling av mitral og trikuspidalklaff blodstrøm retningen og hastighet (ie., E / A ratio, IVRT, IVCT, ET, og MPI) gir viktig informasjon om hjertefunksjon. Dermed ekkokardiografisk bildebehandling er et viktig verktøy for å studere hjertets fysiologi og patofysiologi i små dyr.
Begrensningen av hjerteultralydavbildning er knyttet til måling variabilitet og reproduserbarhet. For å redusere inter- og intra- operatør variasjon, er det viktig å standardisere hvordan bilder blir kjøpt og analysert. Målinger skal utføres fra flere akustiske vinduer og moduser (B-mode, M-modus, og PW / fargedoppler) og minst 3 separate målinger skal i gjennomsnitt for å sikre nøyaktighet og pålitelighet. I tillegg er det begrenset akustiske vinduer og bilder og til lav kvalitet er oppnådd i smågnagere utsatt for kirurgiske prosedyrer som TAC, på grunn av vev hevelse, kirurgiske arr, og lungeødem som forstyrrer ultralydbjelker. For Doppler, noen ganger er det vanskelig å separere E- og A-bølger og oppnå en fullstendig bølgeform av mitral-strømning, på grunn av en relativt høy puls i smågnagere, særlig hos mus utsatt for TAC eller MI kirurgi. Senker pulsen kan være nyttig å få målinger, men dette vil påvirke verdier oppnådd ved Doppler avbildning og dermed data tolkning.
Med siste tekniske fremskritt, nylig utgitte ultralyd systemer gir høy bildeoppløsning og ramme / samplingsfrekvens for å sikre nøyaktig kvantitativ måling i små dyr. Nye ekkokardiografi teknologier vil også forbedre følsomheten ekkokardiografisk evaluering av hjertefunksjon og tillate tidlig påvisning av hjerte patologi. For eksempel har spettet-sporing av stammen avbildning 15 blitt brukt til å måle nøyaktig regional myokardial funksjon. Nye svinger teknologi som er under utvikling vil gi mulighet for sanntids, 3D eller 4Dbildebehandling. Kontrast ekkokardiografi som er i avansert utvikling vil gi rom for volumetriske målinger, vev perfusjon vurderinger, molekylær avbildning av hjerte-og karsykdommer, og levering av terapeutiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia equipment | Harvard Apparatus, 84 October Hill Road Holliston, MA |
723015 | |
| Vevo 2100 Imaging System | VisualSonics Inc., 3080 Yonge Street Suite 6100, Box 66, Toronto, Ontario, Canada | Vevo 2100 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories, 286 Eldridge Rd, Fairfield, NJ | 03-50 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare, Inc, 3950 Schelden Circle Bethlehem, PA |
NDC 66794-017-25 | |
| F/air anesthesia gas filter unit | A.M. Bickford, Inc, 12318 Big Tree Rd, Wales Center, NY | 80120 |
References
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Tanaka, N., et al. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1117 (1996).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2 (2), 138-144 (2009).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 589-600 (2006).
- Oka, T., et al. Cardiac-specific deletion of Gata4 reveals its requirement for hypertrophy, compensation, and myocyte viability. Circ Res. 98 (6), 837-845 (2006).
- Gardin, J. M., Siri, F. M., Kitsis, R. N., Edwards, J. G., Leinwand, L. A. Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice. Circ Res. 76 (5), 907-914 (1995).
- Respress, J. L., Wehrens, X. H. Transthoracic echocardiography in mice. J Vis Exp. (39), e1738 (2010).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. Murine echocardiography and ultrasound imaging. J Vis Exp. (42), e2100 (2010).
- Patten, R. D., Aronovitz, M. J., Bridgman, P., Pandian, N. G. Use of pulse wave and color flow Doppler echocardiography in mouse models of human disease. J Am Soc Echocardiogr. 15 (7), 708-714 (2002).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), e1729 (2010).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Larsen, T. S., et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 437 (6), 979-985 (1999).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Pearlman, A. S., Stevenson, J. G., Baker, D. W. Doppler echocardiography: applications, limitations and future directions. Am J Cardiol. 46 (7), 1256-1262 (1980).
- Bauer, M., et al. Echocardiographic speckle-tracking based strain imaging for rapid cardiovascular phenotyping in mice. Circ Res. 108 (8), 908-916 (2011).
