Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Published: June 16, 2016 doi: 10.3791/54105

Introduction

Momenteel plaatsen enkele cellen afzonderlijk in een kweekruimte wordt gewoonlijk bereikt door beperkende verdunning of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Voor veel laboratoria beperkende verdunning een geschikte methode, aangezien het slechts vereist een pipet en weefselkweek platen, die gemakkelijk beschikbaar zijn. In dit geval wordt een celsuspensie serieel verdund tot een geschikte celdichtheid, en vervolgens in cultuur putjes geplaatst met een manuele pipet. Deze compartimenten enkele cellen worden vervolgens gebruikt voor cellulaire analyse, zoals genetische heterogeniteit screenen 1 en 2 kolonievorming. Deze methode is low-throughput en arbeidsintensief, zonder gebruikmaking van een robotarm om bijstand omdat de Poisson verdeling aard van de beperkende verdunningsmethode beperkt eencellige events een maximale waarschijnlijkheid van 37% 3. FACS machines met een geïntegreerde robotarm kan de beperking van de Poisson-verdeling overwonnen door nauwkeurig placing een single-cell in een cultuur goed in een tijd 4. De hoge schuifspanning mechanische (dus verminderde cellevensvatbaarheid) 5 en machine aankoop en bedrijfskosten hebben het gebruik ervan beperkt in veel laboratoria.

Om de bovenstaande beperkingen te overwinnen, zijn microschaal apparaten zijn ontwikkeld om zeer efficiënt enkele cellen in microwells 6 laden. Echter, de microputjes niet voldoende ruimte voor het beladen cellen prolifereren, vanwege de noodzaak om de grootte van elk microputje dicht bij die van een enkele cel om de eencellige loading waarschijnlijkheid maximaliseren. Aangezien cultuur assays vereist in veel cellen gebaseerde toepassingen (bijvoorbeeld klonogene assay 7), grotere microputjes (90-650 pm in diameter of lengte) zijn ook gebruikt om langere celculturen. Echter, zoals de beperkende verdunning methode, ze bezitten ook low single cell laden efficiëntie, variërend van 10 -. 30% 8, 9

Eerder hebben we een high-throughput microfluïdische platform ontwikkeld om enkele cellen te isoleren in afzonderlijke microwells en tonen de toepassing ervan in klonogene assay van de geïsoleerde cellen. 10 De inrichting werd gemaakt met polydimethylsiloxaan (PDMS) en omvat twee stellen microputje arrays microwell met verschillende afmetingen, die grotendeels de efficiëntie van het laden van een enkele cel in een microtiterplaat waarvan de grootte kan verbeteren is aanzienlijk groter dan de cel. Met name de "dual-well" concept maakt de grootte van de kweek gebied flexibel worden aangepast zonder dat de eencellige capture efficiency, waardoor het eenvoudig om de vormgeving van de inrichting aan te passen aan verschillende celtypen en toepassingen. Deze high-efficiency methode moet nuttig zijn voor de lange termijn celkweek experimenten voor mobiele heterogeniteit studies en monoklonale cellijn vestiging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: De fotomasker ontwerpen voor onze microfluïdische apparaat fabricage werden getekend door het gebruik van een computer-aided design (CAD) software. De ontwerpen werden vervolgens gebruikt om chroom fotomaskers met behulp van een commerciële dienst te fabriceren. De PDMS-apparaten werden gemaakt met behulp van zachte lithografie technieken. 11

1. Fabricage van Master Molds door Lithography

  1. Voordat het fotolithografieproces 12 Gebruik de 4-inch silicium wafers als een substraat en drogen van de wafels in een conventionele oven bij 120 ° C gedurende 10 minuten.
  2. Reinig de gedehydrateerde silicium wafers met zuurstofplasma behandeling bij 100 watt gedurende 30 seconden in een plasma schoner.
  3. Verwarm twee kookplaten bij 65 ° C en 95 ° C respectievelijk, de volgende bakproces.
  4. Coat 5 g negatieve fotoresist (PR) op de gereinigde silicium wafers door een spin coater; centrifugeren op 1200 rpm (SU-8 50) gedurende 30 seconden op het microkanaal laag produceren.
  5. Plaats de PRgecoate wafer op een voorverwarmde verwarmingsplaat bij 65 ° C gedurende 12 minuten en overgebracht naar een voorverwarmde verwarmingsplaat bij 95 ° C gedurende 33 min (bij 100 urn dik patronen) om een ​​zacht bakproces voeren.
  6. Na het bakken, plaatst u de PR gecoat silicium wafer op de houder van een semi-automatische masker aligner en lijn het een 25.400 dpi resolutie transparantie fotomasker.
  7. Blootstellen PR beklede siliciumwafel aan UV-licht (365 nm) bij een dosis van 500 mJ / cm2 aan de PR patroon op de siliciumwafel te maken.
  8. Verwijder de wafer uit de aligner en plaats deze op een kookplaat voor post-bakken bij 95 ° C gedurende 12 min.
  9. Week de wafers in SU-8 ontwikkelaaroplossing (propyleenglycolmonomethyletheracetaat, PGMEA) te wassen verknoopte PR 12 min en voorzichtig droog met stikstofgas om de uitlijnmerktekens bloot.
  10. Nogmaals, jas 5 g van de negatieve fotolak op de wafers door een spin coater; centrifugeren op 700 rpm (SU-8 100) voor 30 sec en 1200 rpm (SU-8 10) gedurende 30 seconden voor 300 &# 181; m dik patroon en 27 micrometer dik patroon respectievelijk de microwell laag te maken.
  11. Plaats de PR beklede wafer op een verwarmingsplaat bij 65 ° C gedurende 4 minuten en bij 95 ° C gedurende 8 minuten (bij 27 urn deep capture-gat laag); en bij 65 ° C gedurende 40 min en bij 95 ° C gedurende 110 min (bij 300 um diepe kweek-gat laag).
  12. Na afkoeling zet de PR beklede siliciumwafel op de mask aligner met UV licht.
  13. Blootstellen PR beklede siliciumwafel het UV-licht (365 nm) bij een dosis van 250 mJ / cm2 (bij 27 pm dik patroon) en 700 mJ / cm2 (bij 300 urn dik patroon).
  14. Bak de plakken bij 95 ° C gedurende 5 min (27 urn dik patroon) en 30 min (300 urn dik patroon), respectievelijk.
  15. Wegwassen verknoopte PR door de PGMEA gedurende 6 min (27 urn dik patroon) en 25 min (300 urn dik patroon), respectievelijk, en vervolgens drogen met stikstofgas.
  16. Meet de hoogte van het patroon is voorzien opde wafer met een aftastende laser profilometer door het plaatsen van de wafer op het xy-fase van een scanning laser profilometer.
    1. Pas de focal plane om duidelijk te laten zien het patroon is voorzien op de wafer met behulp van de "camera view" observatie mode onder een 20X objectief.
    2. Schakel de observatie-modus van "camera view" naar "laser view", en stel de bovenste en onderste posities van de functies.
    3. Stel de meetmodus, ruimte, kwaliteit en z-pitch tot transparante (top), 1 lijn (1024 x 1), hoge nauwkeurigheid en 0,5 urn, respectievelijk, en druk vervolgens op de start bodem om de meting te beginnen.

2. Voorbereiding van de PDMS Inrichtingen voor het Single-cell Isolation

  1. Voordat PDMS casting, silaniseren de meester mallen met trichloorsilaan tot een hydrofoob oppervlak, waardoor het makkelijker te pellen van de PDMS replica's van de master mallen maken.
    1. Plaats de master mallen en een weging boot met200 pl van trichloorsilaan in een exsiccator en vacuüm (-85 kPa) gelden voor 15 min.
    2. Stop de stofzuiger en laat de master mallen in de exsiccator tot de meester schimmels bij kamertemperatuur silaniseren gedurende tenminste 1 uur.
    3. Verwijder de master mallen uit de exsiccator en leg elke master schimmel in een 10 cm petrischaal.
  2. Meng een totale hoeveelheid van 17,6 g PDMS polymeer kit met een base en een hardingsmiddel in een verhouding van 10: 1, en giet het PDMS op de master schimmel in de petrischaal.
  3. Plaats de petrischaal in een exsiccator en vacuüm (-85 kPa) gelden voor 1 uur om luchtbellen te verwijderen in het PDMS.
  4. Verwijder de petrischaal uit de exsiccator en plaats deze in een conventionele oven op 65 ° C gedurende 3-6 uur naar het PDMS te genezen.
  5. Verwijder de uitgeharde PDMS replica van de master mallen en punch twee gaten als een inlaat en een uitlaat aan beide uiteinden van het microkanaal op het capture-reeks van holtes PDMS replica van een perforatie met inwendige diameter van 0.75 mm voor de vloeibare kanaal (Figuur 2A).
  6. Gebruik tape om het oppervlak van het PDMS replica's schoon te maken, en plaats dan de PDMS replica's in een plasma reiniger voor kort zuurstof plasma behandeling (100 watt voor 14 sec).
  7. Verwijder de PDMS replica van het zuurstofplasma machine.
  8. Lijn een top (met de capture microwells) en een bodem PDMS (met de cultuur microwells) replica met de hand onder een stereomicroscoop en brengen hen in contact.
  9. Plaats de uitgelijnde PDMS replica in een oven bij 65 ° C gedurende 24 uur permanente hechting tussen de PDMS replica bereiken de uiteindelijke inrichting te vormen.
  10. Week de PDMS apparaat in een gedeïoniseerd (DI) -water gevulde container en de container te plaatsen in een exsiccator onder vacuüm (-85 kPa) gedurende 15 min om lucht uit de microkanaal van de PDMS apparaat te verwijderen.
  11. Plaats de DI-water gevulde PDMS inrichting in een weefselkweek kap en gebruik UV-licht (golflengte van licht: 254 nm) te steriliseren van de inrichting voor 30 min.
  12. Vervang de DI water in het PDMS apparaat met een 5% runderserumalbumine (BSA) in 1x PBS-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min ter voorkoming cellen plakken aan de PDMS oppervlak.
    Opmerking: De BSA coating is van cruciaal belang voor de overdracht efficiëntie van de geïsoleerde cellen uit het verbeteren van capture-well cultuur-goed.
  13. Vervang de 5% BSA oplossing in de PDMS apparaat met gesteriliseerd 1x PBS oplossing.

3. Voorbereiding van de Single-cell Suspension

  1. Cultuur neurale stamcel KT98 en humane carcinoma cellen A549 en MDA-MB-435 we petrischaal in conventionele celkweek incubator (37 ° C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid) om cellen te bereiden op het PDMS inrichting celexperiment .
  2. Verwijder de verbruikte kweekmedium (DMEM basaal medium met 10% foetaal runderserum en 1% antibiotica meegeleverd) om de kweekschaal met cellen gekweekt tot 70-80% confluentie.
  3. Voorzichtig te wassen van de cellen met gesteriliseerde PBS driemaal. </ Li>
  4. Verwijder de PBS en voeg 2 ml van een recombinant enzym mengsel met proteolytische, collagenolytisch en DNase activiteiten (zie de materialen lijst voor gedetailleerde informatie).
  5. Incubeer de cultuur schotel bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, en tik op de cultuur schotel naar cel onthechting te vergemakkelijken.
  6. Voeg 4 ml gesteriliseerde PBS aan cellen te dispergeren en breng de celsuspensie om een ​​15 ml conische buis.
  7. Centrifugeer de buis bij 300 g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant.
  8. Voorzichtig resuspendeer de cel pellet in 1 ml gesteriliseerde PBS en tel de live aantal cellen met behulp van de standaard trypan Blue uitsluiting methode 13.
    Opmerking: deze resuspensie stap is van cruciaal belang voor het bereiden van goed gescheiden single-cell schorsing tot de single-cell isolatie efficiëntie te verbeteren.

4. Single-cell Isolatie en Cultuur van klonen

  1. Belasting 50 ui celsuspensie bij een concentratie van 2,2-2,5 x10 Opmerking: De celsuspensie laden pipet moet worden gestopt en gehouden op de eerste stop positie te voorkomen dat er luchtbellen in de microkanaal.
  2. Plaats een ander 50 pi celsuspensie door de inlaat opening gelijkmatig vullen de hele microkanaal met cellen.
  3. Seal de uitlaat gat met een plug (3 mm lang, 1 mm diameter gesneden nylon vislijn) aan stroom veroorzaakt door de hydrostatische druk van de druppels op inlaat en uitlaat een gaatje te voorkomen.
    Opmerking: De pluggen werden UV gesteriliseerd in een weefselkweek kap voor gebruik.
  4. Vul een 1 ml steriele spuit met kweekmedium, uitwerpen luchtbellen uit, en zet deze op een injectiepomp.
  5. Sluit het medium geladen spuit naar de inlaat gat van de PDMS apparaat via een 23 G stompe naald en een poly-tetrafluoretheen (PTFE) slangen.
  6. Haal de stekker uit het stopcontact gat en alleow een 2-min tijdsinterval om de cellen om zich te vestigen in de single-cell capture-putten door zwaartekracht.
  7. Wegspoelen de ongevangen cellen met 300 pl cultuurmedium bij een stroomsnelheid van 600 pl / min aangedreven door de injectiepomp.
  8. Wacht 2 minuten om het apparaat te stabiliseren, en sluit de inlaat en uitlaat gaten pluggen een gesloten kweeksysteem vormen.
  9. Draai het apparaat met de hand om de gevangen single-cellen over te dragen aan de cultuur microwells.
  10. Plaats het PDMS inrichting in een 100-mm weefselkweekplaat en voeg 10 ml gesteriliseerde PBS rondom het apparaat kweekmedium verdamping uit het microkanaal voorkomen.
  11. Verplaats de kweekschaal met een conventionele celkweek incubator (37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid) voor klonale kweek van de single-cellen.

5. Cultuur Medium Replenishment

  1. Na 1 d van de cultuur, vervangt het kweekmedium in het PDMS apparaat met vers medium naar cel pr te verbeterenoliferation.
  2. Plaats twee druppeltjes kweekmedium bovenop het PDMS apparaat nabij de inlaat- en uitlaatgaten gebieden te voorkomen dat er luchtbellen in het microkanaal tijdens het uitvoeren van de volgende stap.
  3. Punch twee gaten aan de bovenkant van het PDMS apparaat nabij de beide uiteinden van het microkanaal een inlaat en een uitlaat voor het microkanaal.
    Let op: niet punch via de hele twee lagen van het PDMS apparaat; in plaats daarvan slechts punch door de bovenste laag van het PDMS.
  4. Sluit een 1 ml plastic spuit met vers medium aan de inlaat via een 23 G stompe naald en PTFE-buis.
  5. Stroom 120 ul vers medium in de inrichting voor 5 minuten van het oude medium vervangen.
  6. Plaats twee pluggen aan de inlaat en uitlaat af te dichten gaten, en de terugkeer van de inrichting aan de celkweek incubator.
  7. Vernieuwen het kweekmedium elke 2 d gedurende de cultuur door het verwijderen van de afdichtpluggen, gevolgd door stap 5,4-5,5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De microfluïdische platform eencellige het kweken omvat een microkanaal (200 urn hoog) met twee sets microwell arrays (Figuur 2A). De twee stellen microwell arrays worden genoemd als capture-well (25 urn in diameter en 27 urn in diepte) en cultuur putjes (285 urn in diameter en 300 urn diepte) van eencellige isolatie en kweek, respectievelijk, en elk capture goed gepositioneerd in het midden van een kweek-well gezien vanuit het bovenaanzicht (figuur 2B). Voor bedieningsinrichting (het schema bewerkingsstroom is geïllustreerd in figuur 1), de benodigde apparatuur (spuitpomp weefselkweek incubator en microscopen) en onderdelen (spuit, pipet, en leidingen) zijn algemeen verkrijgbaar in biologische laboratoria. Bovendien, de overdraagbaarheid en de transparantie van het platform konden de cellen gemakkelijk worden waargenomen en geanalyseerd in een inrichting met een conventionale microscoop tijdens de celkweek experiment.

Het afvangrendement cellen in de capture-putjes na de wasstap varieert van 67,80 ± 11,38% tot 85,16 ± 1,91% (afhankelijk van het celtype) (Figuur 3A). Bovendien zijn de meeste van de capture-putjes die slechts een enkele cel voor alle drie celtypen (89,89% - 92,98%), hetgeen werd bevestigd door analyse van het aantal beladen cellen in de kweek-putjes (Figuur 3B). De uiteindelijke eencellige isoleerrendement in de kweek-wells was meer dan 76% voor KT98 en MDA-MB-435 cellen, maar slechts 61% van A549-cellen door celgrootte verschillen tussen de geteste celtypes.

Voor het onderzoek naar kanker, kan klonogene assay van de single-cellen worden gebruikt om resistentie tegen geneesmiddelen en proliferatie tarieven van de individuele cel kolonies te testen. De celkweek en klonogene assay van de geïsoleerde enkele cellen in onze platform werden uitgevoerd door het verversen van het kweekmedium elke 2 d. Deze demonstratie belicht de toepassing van deze inrichting voor het bestuderen van cellulaire heterogeniteit bij de enkele celniveau door meting van de verschillen in celoverleving en proliferatiesnelheden van afzonderlijke cellen.

De cellulaire heterogeniteit en proliferatie snelheid van de geïsoleerde cellen werden geanalyseerd vanuit dagelijks verkregen beelden. De resultaten toonden dat de geïsoleerde enkele cellen kunnen worden gekweekt voor 7 dagen en vertoonden verschillende groeipatronen. Bijvoorbeeld, 13% van de geïsoleerde cellen had geen celdeling en bleef als één enkele cel (figuur 4B), terwijl 17,5% van de cellen in meer dan 15 cellen en kolonies vormden cellen (Figuur 4A) tijdens het kweken verdeeld. Cellulaire heterogeniteit onder de prolifererende cellen werd aangetoond door hun verschillende groeipatronen vormen twee cellen (4,3%), drie cellen (2,5%) en 4-14 cellen(15%) in de celkweek experiment (Figuur 4C).

Deze resultaten gaven aan dat het platform kan worden gebruikt voor lange termijn celkweek klonogene assays en cellulaire heterogeniteit studies. Met een groot aantal individuele cel kolonies gekweekt in een kleine voetafdruk maakt microscopische analyse van de cellen vergemakkelijken.

Figuur 1
. Figuur 1. Schematische weergave van de werking flow voor high-throughput single-cell isolatie en cultuur in de microfluïdische platform De operatie procedure voor single-cell isolatie en klonale cultuur omvat 4 stappen: i) load cells in de microkanaal door een plastic tip en handmatige pipet; ii) het wegspoelen van de niet-opgevangen cellen met vers kweekmedium aangedreven door een injectiepomp; iii) na het afsluiten van de inlaat- en uitlaatopeningen stekkers, is deolated cellen werden overgebracht van capture-wells tot cultuur-putten door het wegknippen van de inrichting; en iv) het uitvoeren van klonale cultuur (klonogene assay) in de cultuur-wells. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Foto en SEM beelden van de microfluïdische single-cell isolatie en cultuur platform. (A) microfluïdische platform geladen met rode kleurstof die het microkanaal en microwell structuren voor single-cell cultuur toont. (B) een representatief beeld uit een cut apparaat, waarin de zij-aanzicht van drie eencellige isolatie en klonale kweek eenheden in de microfluïdische platform. Schaal bar: 100 micrometer. SEM beelden van de single-celkweek (C) en capture (D Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. KT98, A549 en MDA-MB-435 single-cell isolatie-efficiëntie in de microfluïdische platform. (A) Efficiency van KT98, A549 en MDA-MB-435 cellen meegenomen in capture-wells na het wegwassen van de niet-opgevangen cellen . De vangst efficiëntie van de cellen was van 67,80% naar 85,16% in de drie celtypen. (B) De eencellige verhouding in hele kweek-wells (slash bar) was meer dan 76% voor KT98 en MDA-MB-435, maar 61,63% voor A549. (C) een representatief beeld van de individuele KT98 single-cellen(Rood, gekleurd met een mobiele tracker) geïsoleerd in grote cultuur-wells voor klonale cultuur. Schaal bar: 300 micrometer. (D) Het aantal cellen in cel bezette cultuur-putjes van de KT98 cel model. De verhouding van kweek-wells was 77,3% met een eencellige, 16,31% zonder cellen, 5,96% met twee cellen, en 0,43% met meer dan drie cellen. Error bars worden weergegeven als ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Celkweek, klonogene assay en cellulaire heterogeniteit studie van geïsoleerde A549-cellen in de microfluïdische platform 7 d. (A) Een geïsoleerde eencellige groeide en verspreid naar een cel kolonie in kweek putjes. (B) Een geïsoleerde eencellige overleefd, maar niet verdelen, na 7 dvan de cultuur. Schaal bar: 100 micrometer. (C) De geïsoleerde single-cellen vertoonden heterogene groeipatronen nadat ze gekweekt voor 7 dagen. Error bars worden weergegeven als ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

-Microwell-apparaat systemen 6,14 werden gebruikt voor single-cell bewerking en analyse, zoals grootschalige eencellige trapping 6 en één hematopoietische stamcel proliferatie 15. Hoewel goed grootte, aantal en vorm kan worden aangepast voor specifieke toepassingen, de eencellige isoleerrendement altijd gevaar wanneer de grootte van de put toeneemt. 9,15

Om deze beperking te overwinnen, Park et al. Rapporteerde een microfluïdische chip met driehoekige microwells dat een high single-cell trapping tarief (58,34%), terwijl de microwell grootte wordt vergroot om voor cel spreiding en groei. Echter, de microputjes (de lengte van een zijde ~ 50 urn) in ondersteuning celproliferatie tot 2 d. 16 De dual-well strategie biedt eencellige geladen grote microputjes niet worden beperkt door de waarschijnlijkheid dat de Poisson distributie ondervonden bij het beperken Diluthoden en vide systemen 3, zoals bewezen door hoge eencellige isoleerrendement (meer dan 75%) in grote microputjes waarvan de grootte was voldoende voor celproliferatie ten minste 7 d (figuur 4A). Vanwege zijn vermogen om single-cell isolatie en klonale cultuur zeer efficiënt uit te voeren met een eenvoudig apparaat en de werking procedure voor ogen we dat onze microfluïdische platform een nuttig hulpmiddel voor een breed scala van toepassingen, met inbegrip van kanker stamcellen selectie door klonogene assay 17 kunnen vormen en high-throughput screening van geneesmiddelen cardiotoxiciteit 18,19.

Een belangrijke beperking van onze single-cell isolatie en cultuur platform is dat het niet individueel gesloten cultuur-wells hoeft te vormen om overspraak tussen de cellen gekweekt in de cultuur-wells te voorkomen. Derhalve kunnen het gedrag van de cellen worden beïnvloed door de paracriene secretie van andere geïsoleerde enkele cellen in de microfluïdische apparaat. de othaar beperking van onze platform is de noodzaak om relatief hoge dichtheid bereiden celsuspensie voor hoogrendabele eencellige isolatie. Deze hoge cel verbruik kan de toepassingen van zeldzame cel isolatie en kweek beperken zoals waterige humor cellen.

Voordat de bedieningsinrichting is het belangrijk DI water injecteren van de inlaatopening naar de microkanaal eventuele lekken van de gebonden PDMS apparaat voeren zorgvuldig te observeren. Vloeistof lekken van invloed op de stroming in de microkanaal kon dus nadelige invloed op de cel vast te leggen en over te dragen resultaat. Bovendien, hoewel onze eencellige beladingsrendement studieresultaten tonen zeer lage celverlies na het overbrengen van de geïsoleerde cellen van capture-putjes cultuur putjes, wat aangeeft dat de meeste cellen effectief kunnen worden overgedragen door het wegknippen van de inrichting, de overdragende efficiëntie wordt verlaagd als de BSA blokkerende stap (2.12) is niet goed uitgevoerd. Gebruikers kunnen de BSA blokkerende protocol te wijzigen of te gebruiken alve oppervlaktemodificatie werkwijzen voor hun specifieke behoeften celexperiment (zoals meer BSA concentratie of bekleding tijdstip waarop een hechtende celtype wordt gebruikt). De afmetingen van de cel capture-putjes zijn de dominante factoren, die moeten worden geoptimaliseerd voor de beste eencellige beladingsrendement capture-putjes, afhankelijk van de grootte van het specifieke celtype. High multiple-cellen-in-a-capture-well gebeurtenissen zijn te wijten aan het hebben van de vangst goed te groot voor het celtype van belang, terwijl lage cel laden efficiëntie in de vangst en is een indicatie van de omvang van de vangst welzijn te klein. Het is ook belangrijk om celgroepen minimaliseren de bereide enkele celsuspensie zoals celclusters de efficiëntie van eencellige lading in het capture-putjes kan afnemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD software Autodesk AutoCAD LT 2011 Part No. 057C1-74A111-1001
Silicon wafer  Eltech corperation SPE0039
Conventional oven YEONG-SHIN company ovp45
Plasma cleaner Nordson AP-300 Bench-Top Plasma Treatment System
SU-8 50 negative photoresist MicroChem Y131269
SU-8 100 negative photoresist MicroChem Y131273
Spin coater Synrex Co., Ltd. SC-HMI 2" ~ 6"
Hotplate YOTEC company YS-300S
Msak aligner Deya Optronic CO. A1K-5-MDA
SU-8 developer Grand Chemical Companies GP5002-000000-72GC Propylene glycol monomethyl ether acetate
Scanning laser profilometer KEYENCE VK-X 100
Trichlorosilane Gelest, Inc SIT8174.0 Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Desiccator Bel-Art Products F42020-0000 Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit Dow corning Sylgard 184
Harris Uni-Core puncher Ted Pella Inc. 15072 with 0.75 mm inner-diameter
Removable tape 3M Company Scotch Removable Tape 811
Stereomicroscope Leica Microsystems Leica E24
Bovine serum albumin (BSA) Bersing Technology ALB001.500
DMEM basal medium Gibco 12800-017
Fetal bovine serum Thermo Hyclone SH30071.03HI
Antibiotics Biowest L0014-100 Glutamine-Penicillin-Streptomycin
Recombinant enzyme mixture Innovative cell technology AM-105 Accumax
DiIC12(3) cell membrane dye BD Biosciences 354218 Used as a cell tracker
Syringe pump Harvard Apparatus 703007
Plastic syringe (1 ml) BD Biosciences 309659
23 gauge blunt needles Ever Sharp Technology, Inc. TD21
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing Ever Sharp Technology, Inc. TFT-23T inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  2. Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
  3. Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
  4. Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
  5. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  6. Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
  7. Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
  8. Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
  9. Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
  10. Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
  11. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
  12. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
  14. Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
  15. Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
  16. Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
  17. Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
  18. Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
  19. Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).

Tags

Bioengineering Microfluidics High-throughput High-efficiency Single cel isolatie Cell cultuur Klonale assay
Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, C. H., Chang, H. C., Hsu, C. H. More

Lin, C. H., Chang, H. C., Hsu, C. H. A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture. J. Vis. Exp. (112), e54105, doi:10.3791/54105 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter