Introduction
Derzeit Einzelzellen einzeln in einem Kulturraum platziert wird üblicherweise durch Verwendung limitierende Verdünnung oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) erzielt. Für viele Laboratorien limitierende Verdünnung ist ein zweckmßiges Verfahren, da es nur eine Pipette und Gewebekulturplatten benötigt, die leicht verfügbar sind. In diesem Fall wird eine Zellsuspension zu einer geeigneten Zelldichte seriell verdünnt und dann in Kulturvertiefungen gegeben durch eine manuelle Pipette. Diese abgeteilten Einzelzellen werden dann für die Zellanalyse verwendet werden, wie genetische Heterogenität Screenen 1 und Koloniebildung 2. Jedoch ist dieses Verfahren mit niedrigem Durchsatz und arbeitsintensiv, ohne einen Roboterarm zur Unterstützung verwendet wird , weil die Poisson - Verteilung der Natur des Verfahrens limitierende Verdünnungseinzelzellereignisse bis zu einer maximalen Wahrscheinlichkeit von 37% 3 einschränkt. FACS-Maschinen mit einem integrierten Roboterarm kann die Begrenzung der Poisson-Verteilung zu überwinden, indem genau placing einer Einzelzelle in einer Kultur auch in einer Zeit 4. Die hohe mechanische Scherspannung jedoch (so senkte die Lebensfähigkeit der Zellen) 5 und Maschinenkauf und Betriebskosten haben seine Verwendung in vielen Labors beschränkt.
Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, mikroskaligen Geräte wurden entwickelt , um sehr effizient einzelne Zellen in Mikrovertiefungen 6 laden. Jedoch bieten die Mikrotitervertiefungen nicht ausreichend Platz für die beladenen Zellen zu proliferieren, aufgrund der Notwendigkeit der Herstellung der Größe jedes der von einer einzigen Zelle schließen Mikrotiterplatten-Einzelzelllade Wahrscheinlichkeit zu maximieren. Als Kulturassays in vielen zellbasierten Anwendungen erforderlich sind (zB Klonogentest 7), größere Kavitäten (90 bis 650 & mgr; m im Durchmesser oder in Seitenlänge) wurden ebenfalls verwendet worden , für längere Zellkulturen zu ermöglichen. Jedoch, wie das Grenzverdünnungsverfahren, sie besitzen auch eine niedrige einzelne Zelle Ladewirkungsgrade im Bereich von 10 -. 30% 89
Zuvor haben wir ein Hochdurchsatz - mikrofluidischen Plattform zu isolieren Einzelzellen in den einzelnen Kavitäten entwickelt und zeigen ihre Anwendung in klonogenen Assay der isolierten Zellen. Die Vorrichtung 10 mit poly-dimethylsiloxan (PDMS) hergestellt wurde, und weist zwei Sätze von Mikrovertiefungsarrays mit verschiedenen Mikrovertiefungsgrößen, was die Effizienz in dem Laden einer einzelnen Zelle in einer Mikrovertiefung, deren Größe wesentlich größer als die Zelle weitgehend verbessern. Bemerkenswert ist, ermöglicht diese "dual-well" -Konzept die Größe des Kulturbereich flexibel, ohne dass die Einzelzellen-Abscheidungseffizienz zu beeinflussen eingestellt werden, so dass es einfach, die Konstruktion der Vorrichtung zur Einstellung verschiedener Zelltypen und Anwendungen anzupassen. Diese hocheffiziente Methode sollte für die langfristige Zellkulturexperimente für die Zell Heterogenität Studien und monoklonale Zelllinie Einrichtung nützlich sein.
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Protocol
Hinweis: Die Fotomasken-Designs für unsere Mikrofluidik-Vorrichtung Fertigung wurden gezeichnet von einem Computer Aided Design (CAD) Software. Die Entwürfe wurden dann verwendet, um Chrom Photomasken herzustellen Kommerzielle Dienst. Die PDMS - Geräte wurden unter Verwendung von weichen Lithographietechniken hergestellt. 11
1. Herstellung von Urformen von Lithography
- Vor dem photolithographischen Prozeß 12, verwenden , um die 4-Zoll - Siliziumwafer als Substrat und entwässern um die Wafer in einem konventionellen Ofen bei 120 ° C für 10 min.
- Reinigen Sie die dehydriert Silizium-Wafern durch Sauerstoffplasmabehandlung bei 100 Watt für 30 Sekunden in einem Plasma-Reiniger.
- Vorwärmen zwei Kochplatten bei 65 ° C und 95 ° C, jeweils für die nachfolgenden Backvorgang.
- Mantel 5 g negativer Photoresist (PR) auf den gereinigten Siliziumwafer durch eine Schleuderbeschichtungsvorrichtung; Spin bei 1200 Umdrehungen pro Minute (SU-8 50) für 30 Sekunden die Mikrokanalschicht zu erzeugen.
- Legen Sie die PRbeschichteten Wafers auf eine vorgeheizte Heizplatte bei 65 ° C für 12 min und übertragen sie für 33 min bei 95 ° C auf einen anderen vorgewärmte Heizplatte (100 & mgr; m dicken Muster) einen weichen Bake-Verfahren durchzuführen.
- Nach dem Backen, legen Sie die PR beschichteten Silizium-Wafer auf dem Halter eines halbautomatischen Mask Aligner und richten Sie sie auf eine 25.400 dpi Auflösung Transparenz Photomaske.
- Setzen Sie den PR beschichteten Silizium - Wafers mit UV - Licht (365 nm) in einer Dosis von 500 mJ / cm 2 , um die PR - Muster auf dem Silizium - Wafer zu schaffen.
- Entfernen Sie den Wafer von dem Ausrichter und legen Sie es auf einer Heizplatte für die Zeit nach dem Backen bei 95 ° C für 12 min.
- Weichen Sie die Wafer in SU-8-Entwickler (Propylenglykolmonomethylether Acetat, PGMEA) -Lösung nicht vernetzten PR für 12 min zu waschen und sanft mit Stickstoffgas trocken die Ausrichtungsmarken zu belichten.
- Wiederum Mantel 5 g negativen Photoresists auf den Wafern durch eine Schleuderbeschichtungsvorrichtung; Spin bei 700 Umdrehungen pro Minute (SU-8 100) für 30 Sekunden und 1200 Umdrehungen pro Minute (SU-8 10) 30 s für 300 &# 181; m dicke Muster und 27 & mgr; m dicken Muster jeweils die Mikrowell-Schicht zu machen.
- Platzieren Sie den PR beschichtete Wafer auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 4 min und bei 95 ° C für 8 min (27 & mgr; m tief capture-well layer); und bei 65 ° C für 40 min und bei 95 ° C für 110 min (bei 300 & mgr; m tief Kultur-well layer).
- Nach dem Abkühlen legen Sie die PR-beschichteten Silizium-Wafer auf dem Mask Aligner mit UV-Licht ausgestattet.
- Setzen Sie den PR beschichteten Silizium - Wafer mit dem UV - Licht (365 nm) in einer Dosis von 250 mJ / cm 2 (27 & mgr; m dicken Muster) und 700 mJ / cm 2 (300 & mgr; m dicken Muster).
- Backen Sie die Wafer bei 95 ° C für 5 min (27 & mgr; m dicken Muster) und 30 min (300 & mgr; m dicken Muster) sind.
- Waschen Sie die nicht vernetzten PR durch die PGMEA für 6 min (27 & mgr; m dicken Muster) und 25 min (300 & mgr; m dicken Muster) ab, bzw., und dann trocknen Sie sie mit Stickstoffgas.
- Messen Sie die Höhe der Muster-Funktionen aufder Wafer mit einem Scanning-Laser-Profilometer, indem der Wafer auf dem XY-Tisch eines abtastenden Laser-Profilometer platzieren.
- Stellen Sie die Brennebene deutlich das Muster zeigen, auf dem Wafer verfügt mit dem "Kameraansicht" Beobachtungsmodus unter einem 20X Objektiv.
- Schalten Sie den Beobachtungsmodus von "Kameraansicht" auf "Laser-Ansicht", und stellen Sie die oberen und unteren Positionen der Merkmale.
- Stellen Sie den Messmodus, Bereich, Qualität und z-Pitch bis transparent (oben), 1 Zeile (1.024 x 1), mit hoher Genauigkeit und 0,5 & mgr; m sind, und drücken Sie dann die Start unten, um die Messung zu beginnen.
2. Herstellung von PDMS-Geräte für Einzelzell-Isolierung
- Vor PDMS Gießen, silanisieren die Urformen mit Trichlorsilan eine hydrophobe Oberfläche zu schaffen, die es leichter zu schälen die PDMS Repliken von den Urformen macht.
- Legen Sie die Urformen und einen Gewichtungs Schiffchen mit200 & mgr; l von Trichlorsilan in einem Exsikkator und gelten Vakuum (-85 kPa) für 15 min.
- Stoppen Sie das Vakuum und dann die Stammformen im Exsikkator verlassen für mindestens 1 Stunde die Urformen bei Raumtemperatur silanisieren.
- Entfernen Sie die Urformen aus dem Exsikkator und platzieren Sie jede Master-Form in einer 10 cm Petrischale.
- Mischen Sie eine Gesamtmenge von 17,6 g PDMS-Polymer-Kit eine Basis und einen Härter in einem Verhältnis von 10: 1 enthält, und dann gießen Sie die PDMS auf die Urform in der Petrischale.
- Legen Sie die Petrischale in einem Exsikkator und gelten Vakuum (-85 kPa) für 1 h Luftblasen in den PDMS zu entfernen.
- Entfernen Sie die Petrischale aus dem Exsikkator und legen Sie sie in einem herkömmlichen Ofen bei 65 ° C für 3-6 Stunden die PDMS zu heilen.
- Entfernen des ausgehärteten PDMS Replikate aus den Stammformen und Punch zwei Löcher als Einlass und einen Auslass an den beiden Enden des Mikrokanals auf der capture-Well Array PDMS Replik durch eine Stanze mit einem Innendurchmesser von 0.75 mm für den fluidischen Kanal (2A).
- Verwenden Sie Klebeband um die Oberfläche der PDMS-Repliken zu reinigen, und dann die PDMS-Repliken in einem Plasma-Reiniger für kurze Sauerstoffplasmabehandlung (100 Watt für 14 sec).
- Entfernen Sie die PDMS-Repliken aus der Sauerstoffplasma-Maschine.
- Richten Sie eine Top (mit den Capture-Mikrotitervertiefungen) und eine untere PDMS (mit den Kultur Mikrotiterstreifen) Replik von Hand unter einem Stereomikroskop und bringt sie in Kontakt.
- Platzieren der ausgerichteten PDMS Replikate in einem Ofen bei 65 ° C für 24 h dauerhafte Verbindung zwischen den PDMS Repliken zu erreichen, um die endgültige Vorrichtung zu bilden.
- Genießen Sie die PDMS-Gerät in einem deionisierten (DI) -Wasser gefüllten Behälter und stellen Sie den Behälter in einem Exsikkator unter Vakuum (-85 kPa) für 15 Minuten Luft aus dem Mikrokanal des PDMS-Gerät zu entfernen.
- Legen Sie das DI-Wasser gefüllten PDMS-Gerät in einer Gewebekultur Haube und verwenden UV-Licht (Wellenlänge des Lichts: 254 nm) der Vorrichtung zu sterilisieren 30 min.
- Ersetzen den DI-Wasser in der PDMS-Gerät mit einer 5% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS-Lösung und Inkubation für 30 min bei 37 ° C-Zellen zu verhindern, auf die Oberfläche PDMS kleben.
Hinweis: Die BSA-Beschichtung kritisch ist die Übertragungseffizienz von isolierten Zellen von der Aufnahme-gut zu kultur gut zu verbessern. - Ersetzen Sie die 5% BSA-Lösung in der PDMS-Gerät mit sterilisiertem 1x PBS-Lösung.
3. Herstellung von Einzelzellsuspension
- Kultur neurale Stammzelle KT98 und menschliche Karzinomzell A549 und MDA-MB-435 wir in Petrischale in konventionellen Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit) Zellen für die PDMS Vorrichtungszelle Experiment vorzubereiten .
- Entfernen und entsorgen Sie die verbrauchte Kulturmedium (DMEM Basismedium versorgt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Antibiotika) aus der Kulturschale mit Zellen auf 70 gewachsen - 80% Konfluenz.
- Waschen Sie sich leicht die Zellen mit sterilisiertem PBS dreimal. </ Li>
- Entfernen und entsorgen Sie die PBS und 2 ml eines rekombinanten Enzymmischung mit proteolytischen, kollagenolytischer und DNase Aktivitäten (bitte die Materialliste für die detaillierte Informationen).
- Inkubieren der Kulturschale bei Raumtemperatur für 5 min und dann auf die Kulturschale Abgriffzelle Ablösung zu erleichtern.
- 4 ml sterilisiertem PBS Zellen zu dispergieren, und dann übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml konischen Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g für 3 Minuten und entfernen Sie den Überstand.
- Resuspendieren vorsichtig das Zellpellet in 1 ml sterilisiertem PBS und zählen Sie die Live - Zellzahl 13 den Standard Trypanblau Ausschlussverfahren.
Hinweis: Dieser Aufwirbelung Schritt zur Herstellung von gut distanzierte Einzelzellsuspension kritisch ist es, die Einzelzellisolierung Effizienz zu verbessern.
4. Single-Zell-Isolierung und Geklonte Kultur
- Last 50 ul Zellsuspension in einer Konzentration von 2,2 bis 2,5 x10
- Laden Sie weitere 50 ul Zellsuspension durch das Einlassloch gleichmäßig den gesamten Mikrokanal mit Zellen füllen.
- Verschließen Sie die Austrittsöffnung mit einem Stopfen (3 mm lang, 1 mm Durchmesser geschnitten Nylon Angelschnur) um den Fluss zu vermeiden, induziert durch hydrostatischen Druck aus den Tröpfchen auf Eintritts- und Austrittslöcher.
Hinweis: Die Stecker UV in einer Gewebekultur Haube sterilisiert waren vor der Verwendung. - Füllen Sie eine 1 ml sterile Spritze mit Kulturmedium nach oben, werfen Luftblasen aus es und setzte es auf eine Spritzenpumpe auf.
- Schließen Sie das Medium geladen Spritze mit dem Einlassloch des PDMS-Gerät über einen 23 G stumpfe Nadel und einem Poly-tetrafluorethen (PTFE) Schläuche.
- Ziehen Sie den Stecker aus der Steckdose Loch und alleow eine 2-Minuten Zeitintervall, damit die Zellen in die Single-Cell-Capture-Brunnen durch die Schwerkraft zu regeln.
- Waschen der nicht erfaßten Zellen mit 300 & mgr; l Kulturmedium mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 600 ul / min entfernt von der Spritzenpumpe angetrieben.
- Warten für 2 min um das Gerät zu stabilisieren, und Abdichten der Eintritts- und Austrittsöffnungen mit Stopfen einen geschlossenen Kultursystem zu bilden.
- Drehen Sie das Gerät mit der Hand die aufgenommenen Einzelzellen auf die Kultur Mikrotitervertiefungen zu übertragen.
- Legen Sie die PDMS-Gerät in einem 100-mm-Gewebekulturschale, und dann werden 10 ml sterilisiertem PBS um das Gerät Kulturmedium Verdampfen aus dem Mikrokanal zu vermeiden.
- Bewegen der Kulturschale mit einem herkömmlichen Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit) für klonale Kultur der einzelnen Zellen.
5. Kulturmedium Replenishment
- Nach 1 d der Kultur, ersetzen Sie das Kulturmedium in der PDMS-Gerät mit frischem Medium Zelle pr zu verbessernoliferation.
- Platzieren zwei Tröpfchen von Kulturmedium auf der Oberseite des PDMS-Gerät in der Nähe der Eintritts- und Austrittsöffnungen Bereiche Einführen von Luftblasen in den Mikrokanal zu vermeiden, während der nächste Schritt durchgeführt wird.
- Stanzen zwei Löcher von der Oberseite der PDMS Vorrichtung in der Nähe der beiden Enden des Mikrokanals als Einlass und einem Auslass für den Mikrokanal.
Hinweis: Verwenden Sie nicht durch die ganze zwei Schichten des PDMS Gerät Punch; statt, Punsch nur durch die oberste Schicht des PDMS. - Schließen Sie eine 1-ml-Plastikspritze mit frischem Medium mit dem Einlass über eine 23 G stumpfe Nadel und PTFE-Schlauch.
- Strom 120 & mgr; l frisches Medium in das Gerät für 5 min das alte Medium zu ersetzen.
- Legen Sie zwei Stecker den Ein- und Austrittslöcher abzudichten, und schicken Sie das Gerät an die Zellkultur-Inkubator.
- Aktualisieren das Kulturmedium alle 2 d während der Dauer der Kultur durch die Verschlussstopfen zu entfernen, gefolgt von den Schritten von 5,4 bis 5,5 zu wiederholen.
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Representative Results
Die mikrofluidische Plattform für Einzelzellisolierung und Kultur umfasst einen Mikrokanal (200 & mgr; m in der Höhe) mit zwei Sätzen von Mikrovertiefungsanordnungen (2A). Die zwei Sätze von Mikrovertiefungsarrays werden als capture-Well (25 um Durchmesser und 27 um Tiefe) und Kultur-Well (285 & mgr; m im Durchmesser und 300 & mgr; m in der Tiefe) bezeichnet für die Einzelzell-Isolierung und Kultur sind und jeweils Capture-gut ist in der Mitte einer Kultur gut positioniert , wenn sie aus der Draufsicht (2B) zu sehen. Für Gerätebetrieb (die schematische Betriebsablauf ist in Abbildung 1), die erforderliche Ausrüstung (Spritzenpumpe, Gewebekultur - Inkubator und Mikroskope) und Verbrauchsmaterialien (Spritze, Pipette und Schläuche) sind in biologischen Laboratorien allgemein verfügbar. Darüber hinaus erlaubt die Portabilität und die Transparenz der Plattform die Zellen leicht mit einem conven in einer Vorrichtung beobachtet und analysiert werden,tionale Mikroskop während des Zellkulturexperiment.
Der Capture - Effizienz von Zellen in den capture-wells nach dem Waschschritt im Bereich von 67,80 ± 11,38% auf 85,16 ± 1,91% ( in Abhängigkeit vom Zelltyp) (3A). Außerdem enthalten die meisten der Capture-wells nur eine einzelne Zelle für alle drei Zelltypen (89,89% - 92,98%), die durch Analysieren der Anzahl der geladenen Zellen in den Kulturvertiefungen (3B) bestätigt wurde. Die endgültige Einzelzellisolierungseffizienz in den Kultur-Wells war mehr als 76% für KT98 und MDA-MB-435-Zellen, aber nur 61% für die wegen einer Zellengrößenunterschiede unter den getesteten Zelltypen A549-Zellen.
Für die Krebsforschung kann klonogenen Assay von Einzelzellen Medikament verwendet werden, um Widerstand und Proliferationsraten der einzelnen Zellkolonien zu testen. Die Zellkultur und Klonogentest der isolierten Einzelzellen in unserem platform wurden durch erfrischende das Kulturmedium alle 2 d durchgeführt. Diese Demonstration unterstreicht die Anwendbarkeit dieser Vorrichtung zur durch zelluläre Heterogenität auf Einzelzellebene die Untersuchung der Unterschiede in der das Überleben der Zellen und Proliferationsraten einzelner Zellen zu messen.
Die zelluläre Heterogenität und Proliferationsrate der isolierten Zellen wurden täglich aufgenommenen Bildern analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die isolierten Einzelzellen für 7 d gezüchtet werden konnten und unterschiedliche Wachstumsmuster aufwiesen. Beispielsweise 13% der isolierten Zellen hatte keine Zellteilung und blieb als eine einzelne Zelle (4B), während 17,5% der in mehr als 15 Zellen unterteilt Zellen und Zellkolonien gebildet (4A) während der Kultur. Zellulärer Heterogenität unter den proliferierenden Zellen wurde auch durch ihre unterschiedliche Wachstumsmuster von zwei Zellen bilden, nachgewiesen (4,3%), drei Zellen (2,5%), und 4-14-Zellen(15%) in der Zellkulturexperiment (4C).
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Plattform für die Langzeitzellkultur, klonogenen Assays verwendet werden, und zellulärer Heterogenität Studien. eine große Anzahl von einzelnen Zellkolonien zu haben, macht auch mikroskopische Analyse der Zellen in einem kleinen Aufstandsfläche angebaut einfacher.
. Abbildung 1. Schematische Darstellung der Arbeitsablauf für Hochdurchsatz - Einzelzellisolierung und Kultur in der mikrofluidischen Plattform das Betriebsverfahren für die Einzelzellisolierung und klonalen Kultur umfasst vier Schritte: i) Wägezellen in den Mikrokanal durch eine Kunststoffspitze und Handpipette; ii) Waschen der nicht erfassten Zellen mit frischem Kulturmedium angetrieben durch eine Spritzenpumpe entfernt; iii) Nach dem Ein- und Austrittsöffnungen mit Verschlussstopfen, der istolated Zellen wurden von der Aufnahme-Brunnen zu Kultur-Vertiefungen übertragen, indem das Gerät Spiegeln; und iv) durchführen klonalen Kultur (Klonogentest) in Kultur-Brunnen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Fotografie und REM - Aufnahmen von der mikrofluidischen Einzelzellisolierung und Kulturplattform. (A) Mikrofluidik - Plattform mit rotem Farbstoff beladen, die die Mikrokanal und Mikrotiterplatten - Strukturen für die Einzelzellkultur zeigt. (B) ein repräsentatives Bild von einem Schnitt Vorrichtung genommen, die Seitenansicht von drei Einzelzellisolierung und klonalen Kultur Einheiten in der mikrofluidischen Plattform zeigt. Maßstabsbalken: 100 & mgr; m. REM - Aufnahmen von Einzelzellkultur (C) und Erfassen (D Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. KT98, A549 und MDA-MB-435 Einzelzellisolierung Effizienz in der mikrofluidischen Plattform. (A) Wirkungsgrad der KT98, A549 und MDA-MB-435 gefangenen Zellen in Capture-Vertiefungen nach der nicht erfassten Zellen weggewaschen . Der Abscheidegrad von Zellen war von 67.80% auf 85,16% in den drei Zelltypen. (B) Die Einzelzellen - Verhältnis insgesamt Kultur-Brunnen (slash bar) war mehr als 76% für KT98 und MDA-MB-435, aber 61,63% für A549. (C) Ein repräsentatives Bild der einzelnen KT98 Einzelzellen(Rot, gefärbt mit Zelle Tracker) isoliert in großen Kultur-Brunnen für klonalen Kultur. Maßstabsbalken: 300 & mgr; m. (D) Die Zellzahl in der Zelle besetzt Kultur-Vertiefungen der KT98 Zellmodell. Das Verhältnis von Kultur-Wells war 77,3% mit einer Einzelzelle, 16,31% ohne Zellen, 5,96% mit zwei Zellen und 0,43% mit mehr als drei Zellen. Die Fehlerbalken sind als ± SD dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Zellkultur klonogenen Assay und zellulärer Heterogenität Untersuchung von isolierten A549 - Zellen in der mikrofluidischen Plattform für 7 d. (A) einer isolierten Einzelzelle wuchs und proliferierten zu einer Zellkolonie in Kultur-Well. (B) Eine isolierte Einzelzelle überlebt, aber nicht teilen, nach 7 dder Kultur. Maßstabsbalken: 100 & mgr; m. (C) Die isolierten Einzelzellen heterogenen Wachstumsmuster zeigten nach 7 d kultiviert wird. Die Fehlerbalken sind als ± SD dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Mikrowell-basierten Gerätesysteme 6,14 wurden für die Einzelzell - Manipulation und Analyse, wie beispielsweise großflächige Einzelzelle verwendet und 6 einzigen hämatopoetischen Stammzellproliferation Trapping 15. Obwohl gut Größe, Anzahl und Form können für spezifische Anwendungen angepasst werden, die Einzelzellisolierung Effizienz wird immer gefährdet , wenn die Größe des Bohrlochs erhöht. 9,15
Um diese Einschränkung zu überwinden, Park et al. Berichteten über eine Mikrofluidik - Chip mit dreieckigem Mikrotitervertiefungen , die eine hohe Single-Cell - -Auffangrate (58,34%), während die Mikrowell - Größe vergrößert ist für Zellausbreitung und Wachstum zu ermöglichen. Die Vertiefungen (mit der Länge einer Seite ~ 50 & mgr; m) konnte jedoch nur die Zellproliferation bis 2 d. 16 Unser Dual-well Strategie erlaubt Einzelzellenbelastung in großen Mikrotitervertiefungen nicht durch die Wahrscheinlichkeit des Poisson unterstützen begrenzt Verteilung angetroffen Dilu bei der Begrenzungmethoden und offene gut Systemen 3, wie für mindestens 7 d (4A) für die Zellproliferation durch die Bereitstellung hoher Einzelzellisolierung Effizienz (mehr als 75%) in großen Kavitäten , deren Größe war ausreichend unter Beweis gestellt. Aufgrund seiner Fähigkeit , Einzelzellisolierung und klonalen Kultur mit einer einfachen Vorrichtung und Betriebsverfahren zu hoch effizient durchführen, stellen wir uns vor, dass unsere mikrofluidischen Plattform ein nützliches Werkzeug für eine breite Palette von Anwendungen darstellen könnten, einschließlich Krebsstammzellselektion durch Klonogentest 17 und Hochdurchsatz - Screening - Kardiotoxizität von Medikamenten 18,19.
Eine große Einschränkung der Einzelzellisolierung und Kulturplattform ist, dass sie nicht einzeln geschlossenen Kultur-wells Übersprechens zwischen den Zellen in den Kulturvertiefungen kultiviert zu verhindern bildet. Daher wird durch die parakrine Sekretion von anderen isolierten Einzelzellen in der mikrofluidischen Vorrichtung das Verhalten der Zellen betroffen sein. Die otihre Beschränkung unserer Plattform ist die Notwendigkeit zur Herstellung von relativ hochdichten Zellsuspension für eine hohe Effizienz Einzelzellisolierung. Dieser hohe Zellverbrauch können die Anwendungen von seltenen Zellisolierung und Kultur, wie wässrige Humor Zellen begrenzen.
Vor dem Betrieb des Gerätes ist es wichtig, DI-Wasser von der Einlassöffnung zu injizieren, um die Mikrokanal zu füllen und zu beobachten, um eventuelle Flüssigkeitsaustritt aus dem gebundenen PDMS-Gerät. Flüssigkeitsaustritt wirkt sich in den Mikrokanal der Strömungszustand so könnte sich negativ auf die Zelle erfassen und übertragen Ergebnis beeinflussen. Darüber hinaus, obwohl die Single-Zelle sehr niedrigen Zellverlust zeigen Studienergebnisse Beladungseffizienz nach der isolierten Zellen von der Aufnahme-Brunnen zu Kultur-Brunnen zu übertragen, was darauf hinweist, dass die meisten Zellen effektiv durch Umklappen das Gerät übertragen werden konnte, wird die Übertragung Effizienz verringert, wenn die BSA Blockierungsschritt (2,12) nicht richtig durchgeführt wird. Nutzer können die BSA Sperr Protokoll zu ändern oder zu al verwendenternative Oberflächenmodifikationsverfahren für ihre spezifischen Zellexperiment Bedarf (zB Erhöhung BSA Konzentration oder Beschichtungszeit , wenn eine adhärente Zelltyp verwendet wird). Die Abmessungen der Zell capture-wells sind die dominierenden Faktoren, die für die beste Einzelzellbeladungseffizienz in capture-wells optimiert werden müssen, abhängig von der Größe der spezifischen Zelltyp von Interesse. Hohe Mehrzellen-in-a-Capture-und Ereignisse zurückzuführen sind, die Erfassung und Größe zu groß für den Zelltyp von Interesse zu haben, während niedrige Zellbeladungseffizienz in der Erfassung auch ein Hinweis auf die Größe des Fang gut wird zu klein. Es ist auch wichtig, Zellcluster in der hergestellten Einzelzellsuspension zu minimieren, als Zellcluster, die Effizienz der Einzelzellenbelastung in den capture-wells verringern.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
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