Introduction
כרגע הצבת תאים בודדים בנפרד בחלל תרבות מושגת בדרך כלל באמצעות דילול מגביל או תא מופעל קרינת מיון (FACS). למעבדות רבות, הגבלת דילול היא שיטה נוחה, כמו זה רק דורש צלחות תרבות פיפטה ורקמות, אשר זמינות. במקרה זה, השעית תא הוא מדולל סדרתי צפיפות תאים מתאימה, ולאחר מכן להציב לתוך בארות תרבות באמצעות פיפטה ידנית. תאים בודדים המחולקים אלה משמשים לניתוח תא, כגון מגוון גנטי הקרנת היווצרות 1 ו מושבת 2. עם זאת, שיטה זו היא נמוכה תפוקה ועבודה אינטנסיבית, ללא ניצול זרוע רובוטית עבור סיוע, כי טבעו התפלגות פואסון של שיטת הדילול המגבילה מגביל אירועים-תא בודד כדי הסתברות מקסימלית של 37% 3. מכונית FACS עם זרוע רובוטית משולבת יכול להתגבר על המגבלה של התפלגות פואסון ידי במדויק Placing מתא בודד אחד בתרבות היטב בכל פעם 4. עם זאת, לחץ הגזירה המכאני הגבוה (ובכך, הוריד כדאיויות תא) 5 ורכישת מכונית ועלויות תפעול מוגבלות השימוש שלה במעבדות רבות.
כדי להתגבר על המגבלות לעיל, התקנים microscale פותחו כדי מאוד ביעילות לטעון תאים בודדים לתוך microwells 6. עם זאת, microwells אינו מספק מרחב מספיק עבור התאים הטעונים להתרבות, בשל הצורך של עשייה את הגודל של כל microwell קרוב לזה של תא בודד כדי להגביר את סיכוי טעינת תא הבודד. כמו מבחני תרבות נדרשים ביישומים רבים מבוסס תאים (למשל, clonogenic assay 7), microwells הגדול (מ 90 - 650 מיקרומטר בקוטר או באורך צד) גם כבר נוצל כדי לאפשר בתרביות תאים מורחבות. עם זאת, כמו שיטת הדילול המגבילה, הם גם בעלי יעילות טעינת תא בודדת נמוכה, הנעים בין 10 -. 30% 8, 9
בעבר, פיתחנו פלטפורמה microfluidic תפוקה גבוהה לבודד תאים בודדים microwells הפרט להפגין היישום שלה assay clonogenic של תאים בודדים. 10 המכשיר נעשתה עם פולי-dimethylsiloxane (PDMS), ונחלק לשני סטים של מערכים microwell עם גדלי microwell שונים, אשר יכול לשפר את היעילות בעיקר בטעינת תא בודד בתוך microwell שגודל הוא גדול יותר באופן משמעותי מאשר התא. יש לציין, זה "כפול גם" המושג מאפשר גודל השטח תרבות להיות מותאם באופן גמיש מבלי להשפיע על יעילות לכידת תא בודד, מה שהופך אותו פשוט כדי להתאים את העיצוב של המכשיר כדי להתאים סוגים ויישומים סלולריים שונים. שיטת יעילות גבוהה זה צריכה להיות שימושי עבור ניסויים בתרביות תאים לטווח ארוכים ללימודי ההטרוגניות תא הקמת קו סלולארי חד שבטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עיצובי photomask עבור ייצור מכשיר microfluidic שלנו נמשכו באמצעות תוכנת מחשב תכנון בעזרת מחשב (CAD). העיצובים נוצלו אז לפברק photomasks כרום באמצעות שירות מסחרי. מכשירי PDMS נעשו באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות. 11
ייצור 1. של תבניות הורים על ידי ליתוגרפיה
- לפני תהליך photolithography 12, השתמשו פרוסות סיליקון 4 אינץ 'כמו מצע מייבש את הפרוסות בתנור רגיל ב 120 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- נקו את פרוסות סיליקון מיובש באמצעות טיפול פלזמה חמצן ב 100 וואט למשך 30 שניות בתוך שואב פלזמה.
- מחמם שתי כיריים על 65 מעלות צלזיוס ו -95 מעלות צלזיוס, בהתאמה, עבור תהליך האפייה הבאה.
- מעיל 5 גרם של photoresist שלילית (PR) על פרוסות סיליקון ניקה ידי coater ספין; ספין ב -1,200 סל"ד (SU-8 50) למשך 30 שניות כדי לייצר את שכבת microchannel.
- מניחים את PRמצופה רקיק על פלטה חמה שחוממה מראש ב 65 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות ולהעביר אותו למקום אחר פלטה חשמלית שחוממה מראש ב 95 מעלות צלזיוס במשך 33 דקות (עבור 100 מיקרומטר דפוסים עבים) לבצע תהליך לאפות רך.
- לאחר אפייה, מניחים את פרוסות סיליקון מצופה PR על בעל aligner מסכת חצי אוטומטי וליישר אותו photomask שקיפות ברזולוציה 25,400 dpi.
- לחשוף את פרוסות סיליקון מצופה PR לאור UV (365 ננומטר) במינון של 500 mJ / 2 ס"מ כדי ליצור את דפוס יחסי ציבור על פרוסות סיליקון.
- הסר את אפיפית aligner ומניח אותו על פלטה חמה עבור שלאחר אפייה על 95 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות.
- משרה את הפרוסות ב מפתח SU-8 (יצטט אתר monomethyl פרופילן גליקול, PGMEA) פתרון לשטוף PR uncrosslinked במשך 12 דקות ויבשות בעדינות באמצעות גז חנקן כדי לחשוף את סימני היישור.
- שוב, מעיל 5 גרם של photoresist שלילית על ופלים ידי coater ספין; ספין ב 700 סל"ד (SU-8 100) למשך 30 שניות ו -1,200 סל"ד (SU-8 10) למשך 30 שניות ב -300 &# 181; דפוס מ 'עובי ו -27 מיקרומטר דפוס עבה בהתאמה להפוך את שכבת microwell.
- מניחים את פרוסות PR מצופה על פלטה חמה על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות (עבור 27 מיקרומטר שכבה ללכוד היטב עמוק); ו ב 65 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות ו 95 מעלות צלזיוס למשך 110 דקות (עבור 300 מיקרומטר שכבת התרבות-באר עמוקה).
- לאחר הקירור, מניחים את פרוסות סיליקון מצופה PR על aligner מסכה מצויד אור UV.
- לחשוף את פרוסות סיליקון מצופה PR אל אור UV (365 ננומטר) במינון של 250 mJ / 2 ס"מ (עבור 27 מיקרומטר דפוס עבה) ו -700 mJ / 2 ס"מ (עבור 300 מיקרומטר דפוס עבה).
- אופים את פרוסות על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (27 מיקרומטר דפוס עבה) ו -30 דקות (300 מיקרומטר דפוס עבה), בהתאמה.
- לשטוף את ה- PR uncrosslinked ידי PGMEA במשך 6 דקות (27 מיקרומטר דפוס עבה) ו -25 דקות (300 מיקרומטר דפוס עבה), בהתאמה, ולאחר מכן לייבש אותם עם גז חנקן.
- למדוד את גובהם של דפוס תכונותרקיק עם profilometer לייזר סריקה על ידי הנחת פרוסות על-הבמה XY של profilometer לייזר סריקה.
- התאם את מישור המוקד כדי מראים בבירור את התבנית כולל על פרוסות סיליקון באמצעות "תצוגת המצלמה" מצב תצפית תחת עדשה אובייקטיבי 20X.
- לעבור את מצב התצפית מן "תצוגת מצלמה" ל "נוף ליזר", ולהגדיר את העמדות העליונות ותחתונות של התכונות.
- הגדרת מצב המדידה, שטח, איכות, ו- Z-המגרש עד (למעלה) שקופים, 1 הקו (1,024 x 1), דיוק גבוה ו -0.5 מיקרומטר, בהתאמה, ולאחר מכן לחץ על החלקה התחתונה כדי להתחיל את המדידה.
2. הכנת התקני PDMS עבור בידוד תא בודד
- לפני ליהוק PDMS, silanize תבניות ההורים עם trichlorosilane כדי ליצור משטח הידרופובי, מה שהופך אותו קל יותר לקלף את העתקי PDMS מן תבניות ההורים.
- מניחים את תבניות הורים וסירה שקלול המכיל200 μl של trichlorosilane ייבוש, ולהחיל ואקום (-85 kPa) במשך 15 דקות.
- עצור את הוואקום ולאחר מכן לעזוב את תבניות ההורים בבית הייבוש silanize התבניות מאסטר בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 לפחות.
- הסר את תבניות הורים מתא הייבוש ומקום כל עובש אמן בצלחת 10 ס"מ פטרי.
- מערבבים בסכום כולל של ערכת פולימר PDMS 17.6 גרם המכיל בסיס ואת סוכן ריפוי ביחס של 10: 1, ואז לשפוך את PDMS על עובש אמן בצלחת פטרי.
- מניחים את צלחת פטרי ייבוש ולהחיל ואקום (-85 kPa) במשך שעה 1 כדי להסיר בועות אוויר בתוך PDMS.
- הסר את צלחת פטרי מן הייבוש ומניח אותו בתנור רגיל על 65 מעלות צלזיוס למשך 3 - 6 שעות כדי לרפא את PDMS.
- הסרת העותקים המשוכפלים PDMS נרפא מן תבניות הורים ומחייג שני חורים כמו מפרצון ולשקע על שני הקצוות של microchannel על העתק PDMS מערך היטב ללכוד ידי אגרופן עם קוטר פנימי של 0.75 מ"מ עבור ערוץ fluidic (איור 2 א).
- השתמש קלטת לניקוי המשטח של העתקי PDMS, ולאחר מכן למקם את העתקי PDMS בתוך שואב פלזמה לטיפול פלזמת חמצן קצר (100 ואט במשך 14 שניות).
- הסרת העותקים המשוכפלת PDMS ממכונת פלזמת חמצן.
- יישר עליון (המכיל את microwells הלכידה) וכן PDMS תחתונה (המכיל את microwells התרבות) העתק ביד תחת סטראו ולהביאם במגע.
- מניח את העתקי PDMS מיושרים בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להשיג זוגיות קבועה בין העתקי PDMS כדי ליצור את המכשיר הסופי.
- משרים את המכשיר PDMS בתוך deionized (DI) -water מיכל מלא ומניחים את המיכל ייבוש תחת ואקום (-85 kPa) במשך 15 דקות כדי להסיר אוויר מן microchannel של המכשיר PDMS.
- מניחים את המכשיר PDMS מלא מים DI במנדף בתרבית רקמה ולהשתמש אור UV (אורך הגל של האור: 254 ננומטר) לעקר של המכשיר עבור 30 מילn.
- החלף את המים DI במכשיר PDMS עם אלבומין 5% שור (BSA) בתמיסה 1x PBS ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי למנוע מתאי יידבקו אל פני השטח PDMS.
הערה: ציפוי BSA הוא קריטי כדי לשפר את יעילות העברת תאים מבודדים מתפיסה-היטב-היטב בתרבות. - החלף את פתרון BSA 5% במכשיר PDMS עם פתרון 1x PBS מעוקר.
3. הכנת ההשעיה תא בודד
- עצבי תרבות בתאי גזע KT98, ו A549 תאי קרצינומה אדם מד"א- MB-435 אנחנו בצלחת פטרי תרבית תאי חממה קונבנציונלית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו -95% לחות) להכין תאים לניסוי תא מכשיר PDMS .
- סר וזורק את מדיום תרבות בילו (בינוני הבזליים DMEM מסופק עם 10% בסרום שור עובריים 1% אנטיביוטיקה) מצלחת התרבות עם תאים שגודלו עד 70 - 80% מפגש.
- לשטוף בעדינות את התאים עם פעמים מעוקרות שלושה PBS. </ Li>
- סר וזורק את PBS, ולהוסיף 2 מיליליטר של תערובת אנזים רקומביננטי עם פרוטאוליטים, collagenolytic, ופעילויות DNase (עיין הרשימה חומר המידע המפורט).
- דגירה את מנת התרבות בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות, ולאחר מכן קש על מנת התרבות להקל ניתוק תא.
- הוסף 4 מ"ל של עיקור PBS לפזר תאים, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה לתא צינור חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה הצינור ב XG 300 במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
- בעדינות resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל מעוקר PBS ולספור את מספר תא חי בשיטת הרחקה Trypan כחול תקן 13.
הערה: צעד resuspension זה הוא קריטי עבור הכנת השעית תא בודד ניתקת גם כדי לשפר את יעילות בידוד התא הבודד.
4. בידוד תא בודד ותרבות משובטת
- טען 50 μl של השעית תא בריכוז של 2.2 - 2.5 x10
- טען עוד 50 μl של השעית תא דרך חור המפרצון כדי למלא את microchannel כולו באופן שווה עם תאים.
- לאטום את החור לשקע עם תקע (ארוך 3 מ"מ, 1 מ"מ חוט חכת ניילון לחתוך קוטר), כדי למנוע זרימת מושרה על ידי לחץ ההידרוסטטי מן הטיפין על חורי כניסה ויציאה.
הערה: התקעים היו UV עיקור בתוך ברדס בתרבית רקמה לפני השימוש. - מלאו את מזרק סטרילי 1 מ"ל עם המדיום תרבות, להוציא בועות אוויר ממנו, ולהגדיר אותו על משאבת מזרק.
- חברו את המזרק טעון בינוני עד החור מפרצון של המכשיר PDMS באמצעות מחט 23 G בוטה בצינור פולי-tetrafluoroethene (PTFE).
- הסר את התקע לשקע חור וכלow מרווח זמן של 2 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב לתוך בארות לכידת תא בודד על ידי כוח הכבידה.
- לשטוף את התאים שלא נלכדו עם 300 μl של מדיום התרבות בקצב זרימה של 600 μl / min מונע על ידי משאבת המזרק.
- חכה 2 דקות כדי לייצב את המכשיר, ולאטום את חורי מפרצון ו לשקע עם אטמים כדי ליצור מערכת תרבות סגורה.
- תהפוך את המכשיר ביד להעביר את חד תאים שנתפסו על microwells התרבות.
- מניחים את המכשיר PDMS בצלחת בתרבית רקמה 100 מ"מ, ולהוסיף 10 מ"ל של PBS מעוקרים סביב המכשיר כדי למנוע אידוי תרבות בינוני מן microchannel.
- הזז את מנת תרבות חממת תרבית תאים קונבנציונלית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו -95% לחות) לתרבות המשובטת של-תאים הבודדים.
5. רענון בינוני תרבות
- לאחר 1 ד תרבות, להחליף את מדיום תרבות מכשיר PDMS עם מדיום חדש לשיפור יחסי ציבור תאoliferation.
- מניח שתי טיפות של מדיום תרבות על גבי מכשיר PDMS ליד אזורי חורי כניסה ויציאה כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך microchannel בעת ביצוע השלב הבא.
- פאנץ שני חורים מהחלק העליון של המכשיר PDMS ליד שני הקצוות של microchannel כקובץ מפרצון ולשקע עבור microchannel.
הערה: אל אגרוף דרך שתי שכבות שלמות של המכשיר PDMS; במקום, רק אגרוף דרך השכבה העליונה של PDMS. - חבר מזרק פלסטיק 1 מ"ל המכיל מדיום חדש אל מפרצון באמצעות מחט 23 G בוטה צינורות PTFE.
- זרימה בינונית טרי 120 μl לתוך המכשיר למשך 5 דקות כדי להחליף את המדיום הישן.
- הכנס שני תקעים לאטום את הכניסה ויציאה חורה, ולהחזיר את המכשיר אל האינקובטור תרבית תאים.
- רענן את מדיום התרבות כל 2 ד בתקופת התרבות ידי הסרת תקעי איטום, ואחריו חזרה על שלבי 5.4 עד 5.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פלטפורמת microfluidic לבידוד תא בודד והתרבות כוללת microchannel (200 מיקרומטר גובה) עם שני סטים של מערכי microwell (איור 2 א). שני סטים של מערכים microwell מכונים כמו-גם ללכוד (25 מיקרומטר בקוטר 27 מיקרומטר עומק) ו-גם תרבות (285 מיקרומטר בקוטר 300 מיקרומטר עומק) לבידוד תא בודד והתרבות, בהתאמה, וכל אחד לכידת היטב ממוקם במרכז א-היטב בתרבות כאשר הם מוצגים מתוך-מבט מלמעלה (תרשים 2B). עבור פעולת המכשיר (זרימת המבצע סכמטי מתוארת באיור 1), הציוד הנדרש (משאבת מזרק, החממה בתרבית רקמה, ומיקרוסקופים) ואספקה (מזרק, טפטפת, צינורות) זמינים נפוץ במעבדות ביולוגיות. יתר על כן, את הטלטלות ושקיפות של הפלטפורמה אפשר לתאים כדי לקרוא אות בקלות ונותחו מכשיר עם convenמיקרוסקופ תזונתית במהלך ניסוי תרבית תאים.
יעילות הלכידה של תאים בלכידה-הבארות לאחר טווחי כביסת צעד מ 67.80 ± 11.38% ל 85.16 ± 1.91% (תלוי בסוג התא) (איור 3 א). יתר על כן, רוב-הבארות ללכוד מכילים תא יחיד בלבד עבור כל שלושת סוגי התאים (89.89% - 92.98%), אשר אושרו על ידי ניתוח מספר התא העמוס-בארות התרבות (איור 3). יעילות בידוד התא בודד הסופית-בארות התרבות הייתה יותר מ -76% עבור KT98 ותאי מד"א- MB-435, אבל רק 61% עבור תאי A549 בשל הבדלים בגודל תא בין סוגי התאים הנבדקים.
לחקר הסרטן, assay clonogenic של תאים בודדים יכול להיות מנוצל כדי לבדוק עמידות לתרופות ושיעורי התפשטות של מושבות תאים בודדים. תרבות התא assay clonogenic של חד תאים המבודדים ב p שלנוlatform בוצע על ידי לרענן את מדיום התרבות כל 2 ד. הפגנה זה מדגישה את תחולתו של התקן זה ללימוד ההטרוגניות הסלולר ברמת התא הבודדה על ידי מדידת הבדלי הישרדות תא ושיעורי התפשטות של תאים בודדים.
שיעור ההטרוגניות תרבות התאים של התאים המבודדים נותח מתמונות יומיומיות רכשו. התוצאות הראו כי תאים בודדים בודדים יכול להיות מתורבת עבור 7 ד והציג דפוסי צמיחה שונים. לדוגמא, 13% של התאים המבודדים לא היו חלוקת תא ונשארו כמו תא אחד בודד (האיור 4B), בעוד 17.5% מכלל התאים מחולקים יותר מ -15 תאי מושבות תאים נוצרים (איור 4 א) במהלך התרבות. ההטרוגניות סלולרית בין התאים מתרבים העידה גם על ידי דפוסי הצמיחה השונים שלהם להרכיב שני תאים (4.3%), שלושה תאים (2.5%), ו 4 - 14 תאים(15%) בניסוי תרבית תאים (איור 4C).
תוצאות אלו הצביעו על כך הפלטפורמה יכול לשמש תרבית תאים לטווח ארוך, מבחני clonogenic, ומחקרים ההטרוגניות הסלולר. לאחר מספר רב של מושבות תאים בודדות גדלו באזור טביעת רגל קטן גם עושה ניתוח מיקרוסקופי של התאים קלים.
. באיור 1. איור סכמטי של זרימת מבצע לבידוד תא בודד תפוקה גבוהה ותרבות במצע microfluidic הליך הפעולה לבידוד תא בודד ותרבות המשובטת כולל 4 שלבים: א) תאי עומס לתוך microchannel ידי טיפ פלסטיק פיפטה ידנית; ii) לשטוף את התאים שלא נלכדו עם מדיום תרבות טרי המופעל ע"י משאבת מזרק; iii) לאחר איטום פתחי הכניסה והיציאה עם תקעים, את היאתאי olated הועברו-בארות ללכוד-בארות תרבות ידי הפיכת המכשיר; ו- IV) לבצע תרבות המשובטת (assay clonogenic) ב-בארות תרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
צילום איור 2. ותמונות SEM של פלטפורמת בידוד והתרבות תא בודד microfluidic. (א) פלטפורמת Microfluidic עמוסה צבע אדום שמראה המבנים microchannel ו microwell לתרבות תא בודד. (ב) תמונה מייצגת נלקח ממכשיר לחתוך, המציג את השקפת הצד של שלוש יחידות תא בודד בידוד המשובטים תרבות במצע microfluidic. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. SEM תמונות של תרבות תא בודד (C) ללכוד (D אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. KT98, A549, ו מד"א- MB-435 יעילות בידוד תא בודד במצע microfluidic. (א) יעיל של KT98, A549, ו מד"א- MB-435 תאים שנתפסו ללכוד-בארות לאחר שטיפת התאים בלתי הלכודים . יעילות לכידתו של תאים הייתה מן 67.80% ל 85.16% ב סוגי התאים השלושה. (ב) יחס התא הבודד ב-בארות תרבות כוללות (בר לוכסן) היה יותר מ -76% עבור KT98 ו מד"א- MB-435, אבל 61.63% עבור A549. (C) תמונה מייצגת של חד תאי KT98 הפרט(אדום, מוכתם גשש תא) מבודד-בארות תרבות גדולות לתרבות משובטת. סרגל קנה מידה: 300 מיקרומטר. (ד) מספר תא ב-בארות תרבות כבושי תא של המודל הסלולרי KT98. היחס-בארות התרבות היה 77.3% עם תא בודד, 16.31% ללא תאים, 5.96% עם שני תאים, ו 0.43% עם יותר משלושה תאים. ברי שגיאה מיוצגים ± SD. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תרבית תאים, assay clonogenic, ולימוד ההטרוגניות הסלולר של תאי A549 מבודדים במצע microfluidic עבור 7 ד. (א) גדלו תא בודד מבודד התרבו כדי מושבת תא היטב בתרבות. (ב) שרד תא בודד ומבודד, אך לא לחלק, לאחר 7 דתרבות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (ג) יחיד תאים מבודדים הציג דפוסי צמיחה הטרוגנית לאחר בתרבית למשך 7 ד. ברי שגיאה מיוצגים ± SD. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכות מכשירות מבוסס microwell 6,14 כבר נוצלו עבור מניפולצית תא בודד וניתוח, כגון תא בודד בקנה מידה גדולה השמן 6 ובחלוקה של תאי גזע hematopoietic יחיד 15. למרות גודל היטב, מספר, וצורה יכולה להיות מותאם עבור יישומים ספציפיים, את יעילות בידוד התא היחיד נפגעה תמיד כאשר הגודל של הבאר הוא גדל. 9,15
כדי להתגבר על מגבלה זו, פרק et al. דיווח על שבב microfluidic עם microwells המשולש בעלות שיעור השמנה גבוהה תא בודד (58.34%), ואילו גודל microwell מוגדל כדי לאפשר תא מתפשט וצמיחה. עם זאת, microwells (עם האורך של צד ~ 50 מיקרומטר) יכול לתמוך התפשטות תאים רק עד 2 ד. 16 באסטרטגיה דואלית היטב שלנו מאפשרת טעינת תא בודד ב microwells הגדול כדי לא להיות מוגבלת על ידי ההסתברות של פואסון הפצה נתקל בהגבלת diluשיטות tion ומערכות גם פתוחות 3, כפי שהוכח על ידי מתן יעילות בידוד תא בודד גבוהה (יותר מ -75%) ב microwells הגדול שגודל היה מספיק עבור התפשטות תאים עבור digit 7 לפחות (איור 4 א). בשל יכולתו ביעילות מאוד לבצע בידוד תא בודד ותרבות משובטת עם הליך מכשיר והפעלה פשוט, אנו צופים כי פלטפורמת microfluidic שלנו יכולה להוות כלי שימושי עבור מגוון רחב של יישומים, כוללים בחירה של תא גזע סרטני על ידי assay clonogenic 17 והקרנת קרדיאלית תפוקה גבוהה של תרופות 18,19.
מגבלה עיקרית של פלטפורמת הבידוד והתרבות התא הבודד שלנו היא שזה לא יוצר בנפרד סגורות בארות תרבות כדי למנוע crosstalk בין התאים בתרבית-בארות התרבות. לכן, ההתנהגות של התאים עשויה להיות מושפעי הפרשת paracrine של תאים בודדים מבודדים אחרים במכשיר microfluidic. בשטחיםהמגבלה שלה הפלטפורמה שלנו היא הצורך להכין השעית תא צפיפות גבוהה יחסית עבור בידוד תא בודד יעילות גבוהה. צריכת תא גבוהה זה יכול להגביל את היישומים של בידוד תאים נדיר ותרבות, כגון תאי הומור מימיים.
לפני פעולת המכשיר, חשוב להזריק מים די מחור הכניסה למלא את microchannel ובזהירות מבחינה בהתנהגות כלשהי דליפה נוזל ממכשיר PDMS המלוכדת. דליפת מים משפיעה על מצב זרימת microchannel ובכך עלול להשפיע לרעה על ללכוד תאים ותוצאת העברה. בנוסף, למרות תוצאות המחקר יעילות טעינת תא הבודד שלנו להראות אובדן תא נמוך מאוד לאחר העברת התאים המבודדים מן-בארות ללכוד-בארות תרבות, המציין כי רוב התאים ניתן להעביר באופן יעיל על ידי הפיכת המכשיר, יעילות ההעברה יורדת אם צעד חסימת BSA (2.12) לא מבוצע כהלכה. משתמשים יכולים לשנות את פרוטוקול חסימת BSA או להשתמש אלשיטות שינוי פני שטח ternative לצרכי ניסוי תאים הספציפיים שלהם (למשל, הגדלת זמן ריכוז או ציפוי BSA כאשר סוג תא חסיד יותר משמש). הממדים של לכידת-בארות סלולריים הם הגורמים הדומיננטיים, אשר צריך להיות מותאם במיוחד יעילות טעינת תא בודד ביותר-בארות ללכוד, תלוי בגודל של סוג תא מסוים של עניין. גבוהים מרובים תאים-ב-א-היטב ללכוד אירועים הם בגלל שיש בגודל היטב צילום גדול מדי עבור סוג ריבית התא, ואילו יעילות טעינת תא נמוכה בבאר ללכוד היא אינדיקציה לגודל ללכוד ורווחה קטן מדי. כמו כן, חשוב למזער צבירי תאי השעית התא הבודדה המוכנה, כאשכולות תא יכולים להקטין את היעילות של טעינת תא הבודד ב-הבארות ללכוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
- Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
- Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
- Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
- Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
- Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
- Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
- Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
- Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
- Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
