Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

उच्च throughput एकल सेल अलगाव और संस्कृति के लिए एक microfluidic मंच

Published: June 16, 2016 doi: 10.3791/54105
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, Taiwan, 2Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University, 3Institute of NanoEngineering and MicroSystems, National Tsing Hua University

Introduction

वर्तमान में एक संस्कृति अंतरिक्ष में व्यक्तिगत रूप से एकल कक्षों रखने आमतौर पर सीमित कमजोर पड़ने या प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग करके हासिल की है। कई प्रयोगशालाओं के लिए, कमजोर पड़ने सीमित, एक सुविधाजनक तरीका है, क्योंकि यह केवल एक पिपेट और टिशू कल्चर प्लेटें, जो आसानी से उपलब्ध हैं की आवश्यकता है। इस मामले में, एक सेल निलंबन क्रमानुसार एक उपयुक्त सेल घनत्व को पतला है, और फिर एक मैनुअल पिपेट का उपयोग करके संस्कृति कुओं में रखा। ये compartmented एकल कक्षों तो ऐसे आनुवंशिक विविधता 1 और 2 कॉलोनी गठन स्क्रीनिंग के रूप में, सेल विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, इस विधि क्योंकि सीमित कमजोर पड़ने विधि के पॉसों वितरण प्रकृति 37% 3 की अधिकतम संभावना करने के लिए एकल कोशिका घटनाओं प्रतिबंधित, कम throughput और श्रम प्रधान, सहायता के लिए एक रोबोट भुजा के उपयोग के बिना है। एक एकीकृत रोबोट भुजा के साथ FACS मशीनों सही Plac द्वारा पॉसों वितरण की सीमा को पार कर सकते हैंएक समय 4 में एक संस्कृति में अच्छी तरह से एक एकल कोशिका हैैं। हालांकि, उच्च यांत्रिक कतरनी तनाव (इस प्रकार, सेल व्यवहार्यता उतारा) 5 और मशीन खरीद और परिचालन लागत को कई प्रयोगशालाओं में इसके उपयोग सीमित है।

ऊपर सीमाओं को पार करने के लिए, microscale उपकरणों अत्यधिक कुशलता microwells 6 में एकल कक्षों लोड करने के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, microwells पर्याप्त जगह भरी हुई कोशिकाओं को पैदा करने के लिए, प्रत्येक का आकार बनाने के लिए एक एकल कोशिका के करीब microwell एकल कोशिका लोडिंग संभावना को अधिकतम करने की जरूरत के कारण प्रदान नहीं करते। के रूप में संस्कृति assays के कई सेल आधारित अनुप्रयोगों (जैसे, clonogenic परख 7), बड़ा microwells में आवश्यक हैं (90 से - व्यास में या पक्ष लंबाई में 650 माइक्रोन) भी विस्तारित सेल संस्कृतियों के लिए अनुमति देने के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, सीमित कमजोर पड़ने विधि की तरह, वे भी कम एकल कक्ष लोडिंग क्षमता के अधिकारी, 10 से लेकर -। 30% 89

इससे पहले, हम व्यक्तिगत microwells में एकल कक्षों को अलग और अलग कक्षों की clonogenic परख में अपने आवेदन प्रदर्शित करने के लिए एक उच्च throughput microfluidic मंच विकसित किया है। 10 डिवाइस पाली dimethylsiloxane (PDMS) के साथ बनाया गया था, और microwell सरणियों के दो सेट शामिल अलग microwell आकार, जो मोटे तौर पर एक microwell जिसका आकार में एक एकल कोशिका लोड में दक्षता में सुधार कर सकते हैं के साथ सेल की तुलना में काफी बड़ा है। विशेष रूप से, इस "दोहरे अच्छी तरह से" अवधारणा संस्कृति क्षेत्र का आकार लचीले ढंग से एकल कोशिका कब्जा दक्षता को प्रभावित कर रहा है, यह सीधा विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और अनुप्रयोगों के अनुरूप करने के लिए डिवाइस के डिजाइन को समायोजित करने के लिए बनाने के बिना समायोजित करने की अनुमति देता है। इस उच्च दक्षता विधि सेल विविधता के अध्ययन और मोनोक्लोनल सेल लाइन स्थापना के लिए लंबी अवधि के सेल संस्कृति प्रयोगों के लिए उपयोगी होना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: हमारे microfluidic युक्ति निर्माण के लिए photomask डिजाइन एक कंप्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके तैयार किया गया। डिजाइन फिर से एक व्यावसायिक सेवा का उपयोग क्रोम photomasks निर्माण करने के लिए उपयोग किया गया। PDMS उपकरणों नरम लिथोग्राफी तकनीक का उपयोग किया गया था। 11

लिथोग्राफी द्वारा मास्टर Molds के निर्माण 1.

  1. फोटोलिथोग्राफी प्रक्रिया 12 से पहले, एक सब्सट्रेट के रूप में 4 इंच सिलिकॉन वेफर्स का उपयोग करें और 10 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर एक पारंपरिक ओवन में वेफर्स निर्जलीकरण।
  2. एक प्लाज्मा क्लीनर में 30 सेकंड के लिए 100 वाट पर ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार का उपयोग करके निर्जलित सिलिकॉन वेफर्स साफ करें।
  3. क्रमश: 65 डिग्री सेल्सियस पर दो हॉट प्लेट और 95 डिग्री सेल्सियस, पहले से गरम, निम्नलिखित पाक प्रक्रिया के लिए।
  4. नकारात्मक photoresist (पीआर) एक स्पिन coater द्वारा साफ सिलिकॉन वेफर्स पर की कोट 5 ग्राम; 30 सेकंड के लिए 1,200 आरपीएम (SU-8 50) पर स्पिन microchannel परत का उत्पादन करने के लिए।
  5. पीआर रखें12 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक preheated hotplate पर लेपित वेफर और 33 मिनट (100 माइक्रोन मोटी पैटर्न के लिए) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक और तीखा hotplate को हस्तांतरण एक नरम सेंकना प्रक्रिया प्रदर्शन करने के लिए।
  6. पाक के बाद, एक अर्द्ध स्वचालित मुखौटा aligner के धारक पर पीआर लेपित सिलिकॉन वेफर जगह और एक 25,400 डीपीआई संकल्प पारदर्शिता photomask के लिए यह पंक्ति।
  7. 500 MJ / 2 सेमी की एक खुराक पर पराबैंगनी प्रकाश (365 एनएम) के लिए पीआर लेपित सिलिकॉन वेफर बेनकाब सिलिकॉन वेफर पर पीआर पैटर्न बनाने के लिए।
  8. एलाइनर से वेफर निकालें और 12 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पोस्ट-पाक के लिए एक hotplate पर जगह है।
  9. SU-8 डेवलपर (प्रोपलीन ग्लाइकोल monomethyl ईथर एसीटेट, PGMEA) के घोल में भिगोकर रख दें वेफर्स 12 मिनट और धीरे नाइट्रोजन गैस के साथ सूखे के लिए uncrosslinked पीआर को धोने के लिए संरेखण के निशान को बेनकाब करने के लिए।
  10. फिर, एक स्पिन coater द्वारा वेफर्स पर नकारात्मक photoresist की कोट 5 ग्राम; 300 और के लिए 30 सेकंड के लिए 30 सेकंड और 1,200 आरपीएम (SU-8 10) के लिए 700 आरपीएम (SU-8 100) पर स्पिन# 181; मीटर मोटी पैटर्न और 27 माइक्रोन मोटी पैटर्न क्रमशः microwell परत बनाने के लिए।
  11. 4 मिनट के लिए और 8 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर (27 माइक्रोन गहरी कब्जा अच्छी तरह से परत के लिए) 65 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर पीआर लेपित वेफर प्लेस, और 40 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर और 110 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस (300 माइक्रोन गहरी संस्कृति अच्छी तरह से परत के लिए) पर।
  12. ठंडा करने के बाद, मुखौटा पराबैंगनी प्रकाश से सुसज्जित एलाइनर पर पीआर लेपित सिलिकॉन वेफर जगह है।
  13. 250 MJ / 2 सेमी (27 माइक्रोन मोटी पैटर्न) और 700 MJ / 2 सेमी की एक खुराक (300 माइक्रोन मोटी पैटर्न) पर पराबैंगनी प्रकाश (365 एनएम) के लिए पीआर लेपित सिलिकॉन वेफर बेनकाब।
  14. 5 मिनट (27 माइक्रोन मोटी पैटर्न) और 30 मिनट (300 माइक्रोन मोटी पैटर्न) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर वेफर्स सेंकना क्रमशः।
  15. 6 मिनट (27 माइक्रोन मोटी पैटर्न) और 25 मिनट (300 माइक्रोन मोटी पैटर्न), क्रमशः के लिए PGMEA द्वारा uncrosslinked पीआर से धो लें, और फिर उन्हें नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी।
  16. ऊंचाई मापने की तर्ज पर सुविधाओंएक स्कैनिंग लेजर profilometer की XY-मंच पर वेफर रखकर एक स्कैनिंग लेजर profilometer साथ वेफर।
    1. फोकल विमान को समायोजित स्पष्ट रूप से पैटर्न एक 20x उद्देश्य लेंस के तहत "कैमरे के दृश्य" अवलोकन मोड का उपयोग कर वेफर पर सुविधाओं को दिखाने के लिए।
    2. "लेजर दृश्य" के लिए "कैमरा देखने" से अवलोकन मोड स्विच, और सुविधाओं के ऊपरी और निचले पदों पर निर्धारित किया है।
    3. माप मोड, क्षेत्र, गुणवत्ता, और पारदर्शी (ऊपर) को जेड पिच, 1 लाइन (1024 एक्स 1), उच्च सटीकता और 0.5 माइक्रोन, क्रमशः सेट और फिर प्रारंभ नीचे माप शुरू करने के लिए दबाएँ।

एकल-सेल अलगाव के लिए PDMS उपकरणों की 2. तैयारी

  1. PDMS कास्टिंग से पहले, एक हाइड्रोफोबिक सतह है, जो यह आसान मास्टर नए नए साँचे से PDMS प्रतिकृतियां छील करने के लिए बनाता है बनाने के लिए trichlorosilane के साथ मास्टर नए नए साँचे silanize।
    1. मास्टर molds और एक भार युक्त नाव की जगहDesiccator में trichlorosilane के 200 μl, और 15 मिनट के लिए वैक्यूम (-85 केपीए) लागू होते हैं।
    2. वैक्यूम बंद करो और फिर कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर गुरु के नए नए साँचे silanize को desiccator में मास्टर नए नए साँचे छोड़ दें।
    3. desiccator से मास्टर नए नए साँचे निकालें और एक 10 सेमी पेट्री डिश में प्रत्येक मास्टर मोल्ड जगह है।
  2. 17.6 जी PDMS बहुलक एक आधार है और 10 के अनुपात में एक इलाज एजेंट युक्त किट की कुल राशि का मिश्रण: 1, और उसके बाद पेट्री डिश में मास्टर मोल्ड पर PDMS डालना।
  3. Desiccator में पेट्री डिश में रखें और PDMS में हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए 1 घंटे के लिए वैक्यूम (-85 केपीए) लागू होते हैं।
  4. desiccator से पेट्री डिश निकालें और 3 के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक पारंपरिक ओवन में जगह - PDMS इलाज करने के लिए 6 घंटा।
  5. मास्टर molds से ठीक PDMS प्रतिकृतियां निकालें और 0 का भीतरी व्यास के साथ एक पंचर द्वारा एक इनलेट के रूप में दो छेद और कब्जा अच्छी तरह सरणी PDMS प्रतिकृति पर microchannel के दोनों सिरों पर एक दुकान के पंच।Fluidic चैनल (2A चित्रा) के लिए 75 मिमी।
  6. PDMS प्रतिकृतियां की सतह को साफ, और उसके बाद संक्षिप्त ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार (14 सेकंड के लिए 100 वाट) के लिए एक प्लाज्मा क्लीनर में PDMS प्रतिकृतियां जगह के लिए टेप का प्रयोग करें।
  7. ऑक्सीजन प्लाज्मा मशीन से PDMS प्रतिकृतियां निकालें।
  8. एक stereomicroscope के तहत हाथ से एक शीर्ष (कब्जा microwells युक्त) और एक नीचे PDMS (संस्कृति microwells युक्त) प्रतिकृति संरेखित करें और उन्हें संपर्क में लाने के लिए।
  9. अंतिम डिवाइस के लिए फार्म के बीच PDMS प्रतिकृतियां स्थायी संबंधों को प्राप्त करने के लिए 24 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर जगह एक ओवन में गठबंधन PDMS प्रतिकृतियां।
  10. एक विआयनीकृत (डीआई) -जल भरा कंटेनर में PDMS डिवाइस लेना और कंटेनर PDMS डिवाइस के microchannel से हवा निकालने के लिए 15 मिनट के लिए वैक्यूम (-85 केपीए) के तहत एक desiccator में जगह है।
  11. डि पानी से भरे PDMS डिवाइस एक टिशू कल्चर हुड में रखें और पराबैंगनी प्रकाश (प्रकाश की तरंग दैर्ध्य: 254 एनएम) का उपयोग 30 मील के लिए डिवाइस के बाँझएन।
  12. एक 5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) 1x पीबीएस समाधान के साथ PDMS डिवाइस में डि पानी बदलें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते PDMS सतह से चिपके से कोशिकाओं को रोकने के लिए।
    नोट: बीएसए कोटिंग से अलग कक्षों के हस्तांतरण दक्षता में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है पर कब्जा अच्छी तरह से करने के लिए संस्कृति में अच्छी तरह से।
  13. निष्फल 1x पीबीएस समाधान के साथ PDMS डिवाइस में 5% बीएसए समाधान बदलें।

3. एकल सेल निलंबन की तैयारी

  1. संस्कृति तंत्रिका कोशिका KT98, और मानव कार्सिनोमा सेल A549 और एमडीए MB-435 हम स्टेम सेल PDMS डिवाइस के प्रयोग के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए पारंपरिक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, और 95% आर्द्रता) में पेट्री डिश में ।
  2. निकालें और खर्च की संस्कृति के माध्यम से 70 विकसित कोशिकाओं के साथ संस्कृति पकवान से (DMEM बेसल मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ आपूर्ति) त्यागें - 80% संगम।
  3. धीरे निष्फल पीबीएस तीन बार के साथ कोशिकाओं को धो लें। </ Li>
  4. निकालें और पीबीएस त्यागें, और प्रोटिओलिटिक, कोलेजनोलिटिक, और DNase गतिविधियों के साथ एक पुनः संयोजक एंजाइम मिश्रण के 2 मिलीलीटर जोड़ने (कृपया विस्तृत जानकारी के लिए सामग्री की सूची देखें)।
  5. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संस्कृति पकवान सेते हैं, और उसके बाद सेल टुकड़ी की सुविधा के लिए संस्कृति पकवान नल।
  6. निष्फल पीबीएस के 4 मिलीलीटर कोशिकाओं को फैलाने के लिए जोड़ें, और उसके बाद एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण।
  7. 3 मिनट के लिए 300 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  8. धीरे निष्फल पीबीएस 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend और मानक Trypan नीले अपवर्जन विधि का उपयोग कर 13 जीवित कोशिका संख्या गिनती।
    नोट: यह मेजबान कदम अच्छी तरह से अलग एकल कक्ष निलंबन की तैयारी कर एकल कोशिका अलगाव दक्षता में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है।

4. एकल सेल अलगाव और संस्कृति क्लोनल

  1. 2.5 x10 - 2.2 एकाग्रता में लोड सेल निलंबन के 50 μl नोट: सेल निलंबन लोड हो रहा है पिपेट बंद कर दिया और पहला पड़ाव स्थिति पर आयोजित होने वाले microchannel में हवा के बुलबुले शुरू करने से बचने की जरूरत है।
  2. इनलेट छेद के माध्यम से सेल निलंबन के एक और 50 μl लोड समान रूप से कोशिकाओं के साथ पूरे microchannel को भरने के लिए।
  3. एक प्लग (एक 3 मिमी लंबा, 1 मिमी व्यास कटौती नायलॉन मछली पकड़ने लाइन) प्रवाह इनलेट और आउटलेट छेद पर बूंदों से हीड्रास्टाटिक दबाव से प्रेरित बचने के साथ दुकान का छेद सील।
    नोट: प्लग एक टिशू कल्चर हुड का उपयोग करने से पहले अंदर निष्फल यूवी थे।
  4. , संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज भरें इसे से हवा के बुलबुले बेदखल करना है, और एक सिरिंज पंप पर यह स्थापित किया है।
  5. एक 23 जी कुंद सुई और एक पाली tetrafluoroethene (PTFE) टयूबिंग के माध्यम से PDMS डिवाइस के इनलेट छेद करने के लिए मध्यम भरी हुई सिरिंज कनेक्ट।
  6. दुकान का छेद और सभी से प्लग निकालेंओउ एक 2 मिनट का समय अंतराल कोशिकाओं गुरुत्वाकर्षण बल द्वारा एकल कोशिका कब्जा-कुओं में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए।
  7. 600 μl / सिरिंज पंप द्वारा संचालित मिनट की एक प्रवाह दर पर संस्कृति के माध्यम से 300 μl के साथ uncaptured कोशिकाओं दूर धो लें।
  8. 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें डिवाइस को स्थिर करने के लिए, और प्लग के साथ इनलेट और आउटलेट छेद सील एक बंद संस्कृति प्रणाली के रूप में।
  9. संस्कृति microwells पर कब्जा कर लिया एकल कोशिकाओं को हस्तांतरण करने के लिए हाथ से डिवाइस पलटें।
  10. PDMS डिवाइस एक 100 मिमी टिशू कल्चर डिश में रखें, और microchannel से संस्कृति के माध्यम से वाष्पीकरण से बचने के लिए डिवाइस के आसपास निष्फल पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  11. एकल कक्षों के प्रतिरूप संस्कृति के लिए एक पारंपरिक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, और 95% आर्द्रता) संस्कृति पकवान ले जाएँ।

5. संस्कृति मध्यम पुनःपूर्ति

  1. बाद संस्कृति का 1 डी, सेल जनसंपर्क में सुधार के लिए ताजा माध्यम के साथ PDMS डिवाइस में संस्कृति के माध्यम की जगहoliferation।
  2. microchannel में हवा के बुलबुले का परिचय करते हुए अगले चरण का पालन करने से बचने के लिए इनलेट और आउटलेट छेद क्षेत्रों के पास PDMS डिवाइस के शीर्ष पर संस्कृति के माध्यम से दो बूंदों रखें।
  3. एक इनलेट रूप microchannel के दो सिरों के पास PDMS डिवाइस के शीर्ष और microchannel के लिए एक दुकान से दो छेद पंच।
    नोट: PDMS डिवाइस के पूरे दो परतों के माध्यम से पंच मत करो; इसके बजाय, बस PDMS के ऊपर परत के माध्यम से पंच।
  4. एक 1 मिलीलीटर की प्लास्टिक एक 23 जी कुंद सुई और PTFE ट्यूबिंग के माध्यम से प्रवेश करने के लिए नए सिरे से युक्त मध्यम सिरिंज कनेक्ट।
  5. 5 मिनट के लिए डिवाइस में 120 μl ताजा माध्यम के प्रवाह पुराने मध्यम बदलने के लिए।
  6. इनलेट सील और छेद आउटलेट, और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर करने के लिए डिवाइस लौटने के लिए दो प्लग डालें।
  7. ताज़ा करे संस्कृति के माध्यम से संस्कृति की अवधि के दौरान हर 2 डी सील प्लग, 5.5 करने के लिए कदम 5.4 दोहरा द्वारा पीछा किया हटाने के द्वारा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एकल कोशिका अलगाव और संस्कृति के लिए microfluidic मंच microwell सरणियों के दो सेट (2A चित्रा) के साथ एक microchannel (ऊंचाई 200 मीटर) शामिल हैं। microwell सरणियों के दो सेट पर कब्जा अच्छी तरह से (व्यास में 25 माइक्रोन और गहराई में 27 माइक्रोन) और एकल कोशिका अलगाव और संस्कृति के लिए क्रमश: संस्कृति में अच्छी तरह से (व्यास में 285 माइक्रोन और गहराई में 300 माइक्रोन), और प्रत्येक के रूप में कहा जाता है कब्जा अच्छी तरह से एक संस्कृति-अच्छी तरह से केंद्र पर तैनात है जब शीर्ष-दृश्य (चित्रा 2 बी) से देखा जाता है। डिवाइस ऑपरेशन (योजनाबद्ध आपरेशन प्रवाह चित्रा 1 में सचित्र है), आवश्यक उपकरण (सिरिंज पंप, टिशू कल्चर इनक्यूबेटर, और माइक्रोस्कोप) और आपूर्ति (सिरिंज, पिपेट, और ट्यूबिंग) के लिए आमतौर पर जैविक प्रयोगशालाओं में उपलब्ध हैं। इसके अलावा, पोर्टेबिलिटी और मंच की पारदर्शिता की अनुमति दी कोशिकाओं को आसानी से एक conven के साथ मनाया और विश्लेषण किया जा के लिए एक उपकरण मेंसेल संस्कृति प्रयोग के दौरान राष्ट्रीय माइक्रोस्कोप।

67.80 ± 11.38% से धोने कदम पर्वतमाला के बाद कब्जा कुओं में कोशिकाओं का कब्जा दक्षता 85.16 ± 1.91% (सेल प्रकार पर निर्भर करता है) (चित्रा 3) के लिए। है, जो संस्कृति कुओं (चित्रा 3 बी) में भरी हुई कोशिकाओं की संख्या का विश्लेषण करके इसकी पुष्टि की थी - इसके अलावा, कब्जा-कुओं की सबसे सभी तीन प्रकार की कोशिकाओं (92.98% 89.89%) के लिए केवल एक ही सेल होते हैं। अंतिम संस्कृति कुओं में एकल कोशिका अलगाव दक्षता KT98 और एमडीए MB-435 कोशिकाओं के लिए 76 से अधिक% थी, लेकिन परीक्षण किया प्रकार की कोशिकाओं के बीच सेल आकार मतभेद के कारण A549 कोशिकाओं के लिए केवल 61%।

कैंसर अनुसंधान के लिए, एकल कक्षों की clonogenic परख दवा प्रतिरोध और अलग-अलग सेल कालोनियों के प्रसार दरों परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। हमारे पी में सेल संस्कृति और पृथक एकल कक्षों की clonogenic परखlatform संस्कृति के माध्यम ताज़ा हर 2 डी द्वारा आयोजित की गई। इस प्रदर्शन सेल अस्तित्व और व्यक्ति की कोशिकाओं के प्रसार दरों में अंतर को मापने के द्वारा एकल कोशिका के स्तर पर सेलुलर विविधता के अध्ययन के लिए इस उपकरण की प्रयोज्यता पर प्रकाश डाला गया।

अलग कक्षों के सेलुलर विविधता और प्रसार दर दैनिक अधिग्रहीत छवियों से विश्लेषण किया गया। नतीजे बताते हैं कि पृथक एकल कक्षों 7 डी के लिए संवर्धित किया जा सकता है और विभिन्न विकास पैटर्न का प्रदर्शन किया। उदाहरण के लिए, अलग कक्षों का 13%, जबकि कोशिकाओं के 17.5% 15 से अधिक कोशिकाओं और गठन सेल कालोनियों (चित्रा 4 ए) संस्कृति के दौरान में बांटा गया है, कोई कोशिका विभाजन था और एक एकल कक्ष (चित्रा 4 बी) के रूप में बने रहे। 14 कोशिकाओं - proliferating कोशिकाओं के बीच सेलुलर विविधता भी दो कोशिकाओं (4.3%), तीन कोशिकाओं (2.5%), और 4 के गठन के अपने विभिन्न विकास पैटर्न इसका सबूत था(15%) सेल संस्कृति प्रयोग (चित्रा 4C) में।

इन परिणामों से संकेत दिया कि मंच लंबे समय तक सेल संस्कृति, clonogenic assays, और सेलुलर विविधता के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक छोटे पदचिह्न क्षेत्र में उगाई व्यक्ति सेल कालोनियों की एक बड़ी संख्या होने का भी कोशिकाओं आसान की सूक्ष्म विश्लेषण करता है।

आकृति 1
। चित्रा 1. उच्च throughput एकल कोशिका अलगाव और microfluidic मंच में संस्कृति के लिए आपरेशन के प्रवाह की योजनाबद्ध चित्रण एकल कोशिका अलगाव और प्रतिरूप संस्कृति के लिए ऑपरेशन प्रक्रिया 4 चरणों में शामिल हैं: एक प्लास्टिक की नोक से microchannel में i) लोड कोशिकाओं और मैनुअल पिपेट; ii) एक सिरिंज पंप द्वारा संचालित ताजा संस्कृति के माध्यम से uncaptured कोशिकाओं को धो; iii) प्लग के साथ इनलेट और आउटलेट के उद्घाटन के बाद सील, हैolated कोशिकाओं डिवाइस flipping द्वारा संस्कृति-कुओं पर कब्जा-कुओं से स्थानांतरित कर दिया गया; और चतुर्थ) संस्कृति कुओं में प्रतिरूप संस्कृति (clonogenic परख) प्रदर्शन करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. फोटोग्राफ और microfluidic एकल कोशिका अलगाव और संस्कृति मंच के SEM छवियों। (ए) लाल रंग कि एकल सेल संस्कृति के लिए microchannel और microwell संरचनाओं से पता चलता है के साथ भरी हुई microfluidic मंच। (बी), एक कट डिवाइस से लिया microfluidic मंच में तीन एकल कोशिका अलगाव और प्रतिरूप संस्कृति इकाइयों की ओर देखने दिखा एक प्रतिनिधि छवि। स्केल पट्टी: 100 माइक्रोन। एकल कोशिका संस्कृति (सी) और कब्जा के SEM छवियों (डी कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. KT98, A549, और एमडीए MB-435 microfluidic मंच में एकल कोशिका अलगाव दक्षता। (ए) KT98, A549, और एमडीए MB-435 कोशिकाओं की दक्षता uncaptured कोशिकाओं दूर धोने के बाद कब्जा कुओं में कब्जा । कोशिकाओं के कब्जा दक्षता तीन प्रकार की कोशिकाओं में 85.16% से 67.80% से था। (बी) के कुल संस्कृति कुओं में एकल कोशिका अनुपात (स्लेश बार) KT98 और एमडीए MB-435 के लिए 76 से अधिक% है, लेकिन A549 के लिए 61.63% थी। (सी) व्यक्तिगत KT98 एकल कोशिकाओं के एक प्रतिनिधि छवि(लाल, सेल पर नजर रखने के साथ दाग) प्रतिरूप संस्कृति के लिए बड़े-संस्कृति कुओं में अलग। स्केल पट्टी: 300 माइक्रोन। (डी) KT98 सेल मॉडल की सेल पर कब्जा कर लिया संस्कृति कुओं में सेल नंबर। संस्कृति कुओं का अनुपात एक एकल कोशिका के साथ 77.3% थी, कोई कोशिकाओं के साथ 16.31%, दो कोशिकाओं, और अधिक से अधिक तीन कोशिकाओं के साथ 0.43% के साथ 5.96%। त्रुटि सलाखों ± एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. सेल संस्कृति, clonogenic परख, और 7 डी के लिए microfluidic मंच में पृथक A549 कोशिकाओं के सेलुलर विविधता का अध्ययन। (ए) एक अलग एकल कोशिका वृद्धि हुई है और संस्कृति अच्छी तरह से एक सेल कॉलोनी के लिए प्रचुर मात्रा में। (ख) एक पृथक एकल कोशिका बच गया, लेकिन विभाजित नहीं किया था, के बाद 7 घसंस्कृति की। स्केल पट्टी: 100 माइक्रोन। (सी) पृथक एकल कोशिकाओं 7 डी के लिए सुसंस्कृत होने के बाद विषम विकास पैटर्न का प्रदर्शन किया। त्रुटि सलाखों ± एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microwell आधारित डिवाइस सिस्टम 6,14 ऐसे बड़े पैमाने पर एकल कक्ष 6 फँसाने और एकल hematopoietic स्टेम सेल प्रसार के रूप में 15 एकल कोशिका हेरफेर और विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि अच्छी तरह से आकार, संख्या, और आकार विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए समायोजित किया जा सकता है, एकल कोशिका अलगाव दक्षता हमेशा समझौता किया है जब अच्छी तरह से आकार में वृद्धि हुई है। 9,15

इस सीमा को पार करने के लिए, पार्क एट अल।, जबकि microwell आकार सेल प्रसार और विकास के लिए अनुमति देने के लिए बढ़े हुए है, त्रिकोणीय microwells एक उच्च एकल कोशिका को फँसाने की दर (58.34%) है के साथ एक microfluidic चिप की सूचना दी। हालांकि, microwells (एक तरफ ~ 50 माइक्रोन की लंबाई के साथ) केवल के लिए साइन अप करने के लिए 2 डी सेल प्रसार का समर्थन कर सकता है। 16 हमारी दोहरे अच्छी तरह से रणनीति देता बड़ी microwells में एकल कोशिका लोड हो रहा है पॉसों की संभावना के द्वारा ही सीमित नहीं किया जा करने के लिए वितरण Dilu को सीमित करने में सामना करना पड़ाtion के तरीकों और खुले में अच्छी तरह से सिस्टम 3, के रूप में बड़े microwells जिसका आकार के लिए कम से कम 7 डी (चित्रा -4 ए) सेल प्रसार के लिए पर्याप्त था में उच्च एकल कोशिका अलगाव दक्षता (75% से अधिक) प्रदान करके प्रदर्शन किया। अत्यधिक कुशलता से एक साधारण उपकरण और ऑपरेशन की प्रक्रिया के साथ एकल कोशिका अलगाव और प्रतिरूप संस्कृति प्रदर्शन करने की क्षमता के कारण, हम कल्पना है कि हमारे microfluidic मंच clonogenic परख 17 से कैंसर स्टेम सेल के चयन सहित आवेदन की एक व्यापक श्रेणी के लिए एक उपयोगी उपकरण, का गठन कर सकता और उच्च throughput cardiotoxicity दवाओं 18,19 की स्क्रीनिंग।

हमारे एकल कोशिका अलगाव और संस्कृति मंच का एक प्रमुख सीमा है कि यह व्यक्तिगत रूप से बंद संस्कृति कुओं फार्म नहीं करता संस्कृति कुओं में संवर्धित कोशिकाओं के बीच crosstalk को रोकने के लिए है। इसलिए, कोशिकाओं के व्यवहार microfluidic युक्ति में अन्य पृथक एकल कक्षों की पैराक्राइन स्राव से प्रभावित किया जा सकता है। ओ.टी.हमारे मंच की उसकी सीमा उच्च दक्षता एकल कोशिका अलगाव के लिए अपेक्षाकृत उच्च घनत्व सेल निलंबन तैयार करने की जरूरत है। इस उच्च सेल की खपत में इस तरह के जलीय हास्य कोशिकाओं के रूप में दुर्लभ सेल अलगाव और संस्कृति, के आवेदनों सीमित कर सकते हैं।

पहले डिवाइस आपरेशन, यह इनलेट छेद से डि पानी इंजेक्षन करने के लिए microchannel को भरने के लिए और ध्यान से निरीक्षण बंधुआ PDMS डिवाइस से किसी भी तरल पदार्थ के रिसाव से महत्वपूर्ण है। द्रव रिसाव इस प्रकार microchannel में प्रवाह हालत को प्रभावित करता है पर प्रतिकूल सेल पर कब्जा है और स्थानांतरित करने के परिणाम को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, हालांकि हमारी एकल कोशिका लदान क्षमता अध्ययन के परिणामों संस्कृति-कुओं पर कब्जा-कुओं से अलग कक्षों में परिवर्तित करने के बाद बहुत कम सेल नुकसान दिखाने के लिए, यह दर्शाता डिवाइस flipping द्वारा कि सबसे कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से स्थानांतरित किया जा सकता है, के हस्तांतरण दक्षता यदि कम हो जाती है बीएसए अवरुद्ध कदम (2.12) ठीक से नहीं किया जाता है। उपयोगकर्ता बीएसए अवरुद्ध प्रोटोकॉल को संशोधित करने या अल उपयोग कर सकते हैंउनकी विशेष सेल प्रयोग की जरूरत के लिए ternative सतह संशोधन तरीकों (जैसे, बढ़ती बीएसए एकाग्रता या कोटिंग समय था जब एक अधिक पक्षपाती सेल प्रकार प्रयोग किया जाता है)। सेल पर कब्जा कुओं के आयामों के प्रमुख कारक है, जो कब्जा कुओं में सर्वश्रेष्ठ एकल कोशिका लोडिंग दक्षता के लिए अनुकूलित किया जाना है, ब्याज की विशेष सेल प्रकार के आकार पर निर्भर करता है की जरूरत है। उच्च एकाधिक कोशिकाओं में एक-कब्जा अच्छी तरह की घटनाओं पर कब्जा अच्छी तरह से आकार ब्याज की सेल प्रकार के लिए बहुत बड़ी होने की वजह से कर रहे हैं, जबकि कब्जा कुएं में कम सेल लदान क्षमता अच्छी तरह से किया जा रहा है पर कब्जा के आकार का एक संकेत है बहुत छोटा। यह भी तैयार एकल कक्ष निलंबन में सेल समूहों को कम करने के रूप में सेल समूहों पर कब्जा-कुओं में एकल कोशिका लोडिंग की दक्षता में कमी कर सकते हैं महत्वपूर्ण है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD software Autodesk AutoCAD LT 2011 Part No. 057C1-74A111-1001
Silicon wafer  Eltech corperation SPE0039
Conventional oven YEONG-SHIN company ovp45
Plasma cleaner Nordson AP-300 Bench-Top Plasma Treatment System
SU-8 50 negative photoresist MicroChem Y131269
SU-8 100 negative photoresist MicroChem Y131273
Spin coater Synrex Co., Ltd. SC-HMI 2" ~ 6"
Hotplate YOTEC company YS-300S
Msak aligner Deya Optronic CO. A1K-5-MDA
SU-8 developer Grand Chemical Companies GP5002-000000-72GC Propylene glycol monomethyl ether acetate
Scanning laser profilometer KEYENCE VK-X 100
Trichlorosilane Gelest, Inc SIT8174.0 Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Desiccator Bel-Art Products F42020-0000 Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit Dow corning Sylgard 184
Harris Uni-Core puncher Ted Pella Inc. 15072 with 0.75 mm inner-diameter
Removable tape 3M Company Scotch Removable Tape 811
Stereomicroscope Leica Microsystems Leica E24
Bovine serum albumin (BSA) Bersing Technology ALB001.500
DMEM basal medium Gibco 12800-017
Fetal bovine serum Thermo Hyclone SH30071.03HI
Antibiotics Biowest L0014-100 Glutamine-Penicillin-Streptomycin
Recombinant enzyme mixture Innovative cell technology AM-105 Accumax
DiIC12(3) cell membrane dye BD Biosciences 354218 Used as a cell tracker
Syringe pump Harvard Apparatus 703007
Plastic syringe (1 ml) BD Biosciences 309659
23 gauge blunt needles Ever Sharp Technology, Inc. TD21
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing Ever Sharp Technology, Inc. TFT-23T inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  2. Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
  3. Shapiro, H. M. Practical flow cytometry. , John Wiley & Sons. (2005).
  4. Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).
  5. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  6. Rettig, J. R., Folch, A. Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays. Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).
  7. Liu, J., et al. Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells. Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).
  8. Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture. Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).
  9. Lindstrom, S., et al. High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells. PloS one. 4 (9), e6997 (2009).
  10. Lin, C. H., et al. A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture. Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).
  11. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).
  12. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
  14. Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses. Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).
  15. Lecault, V., et al. High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays. Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).
  16. Park, J. Y., et al. Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation. Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).
  17. Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).
  18. Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays. Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).
  19. Liang, P., et al. Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 112 microfluidics उच्च throughput उच्च दक्षता सिंगल सेल सेल अलगाव सेल संस्कृति clonogenic परख
उच्च throughput एकल सेल अलगाव और संस्कृति के लिए एक microfluidic मंच
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, C. H., Chang, H. C., Hsu, C. H. … More

Lin, C. H., Chang, H. C., Hsu, C. H. A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture. J. Vis. Exp. (112), e54105, doi:10.3791/54105 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter