Introduction
Actualmente la colocación de las células individuales de forma individual en un espacio de cultivo se logra comúnmente mediante el uso de la dilución limitante o células activadas por fluorescencia (FACS). Para muchos laboratorios, dilución limitante es un método conveniente, ya que sólo requiere una pipeta y del tejido placas de cultivo, que son fácilmente disponibles. En este caso, una suspensión de células se diluye en serie a una densidad celular apropiada, y después se colocó en pocillos de cultivo mediante el uso de una pipeta manual. Estas células individuales compartimentados se utilizan entonces para el análisis de células, tales como la heterogeneidad genética de detección 1 y 2 Formación de Colonias. Sin embargo, este método es de bajo rendimiento y de trabajo intensivo, sin utilizar un brazo robótico para la asistencia, ya que la naturaleza distribución de Poisson del método de dilución limitante restringe eventos de una sola célula a una probabilidad máxima de 37% 3. máquinas de FACS con un brazo robótico integrado que pueden superar la limitación de la distribución de Poisson con precisión por placing una sola célula en un pocillo de cultivo a la vez 4. Sin embargo, el alto esfuerzo de cizalla mecánica (por lo tanto, disminuye la viabilidad celular) 5 y la compra de la máquina y los costes operativos han limitado su uso en muchos laboratorios.
Para superar las limitaciones anteriores, los dispositivos a microescala se han desarrollado para altamente eficiente cargar células individuales en micropocillos 6. Sin embargo, los micropocillos no proporcionan un espacio adecuado para las células cargadas proliferen, debido a la necesidad de hacer que el tamaño de cada pocillo, próxima a la de una sola célula para maximizar la probabilidad de carga de una sola célula. Como se requieren ensayos de cultivo en muchas aplicaciones basadas en células (por ejemplo, ensayo clonogénico 7), micropocillos de mayor tamaño (90 a 650 micras de diámetro o de longitud lateral) también se han utilizado para permitir cultivos celulares prolongados. Sin embargo, como el método de dilución limitante, también poseen bajas eficiencias individuales de carga de células, que van desde 10 -. 30% 8, 9
Anteriormente, hemos desarrollado una plataforma de microfluidos de alto rendimiento para aislar células individuales en micropocillos individuales y demostrar su aplicación en ensayo clonogénico de las células aisladas. 10 El dispositivo se hizo con poli-dimetilsiloxano (PDMS), y comprende dos conjuntos de matrices de micropocillos con diferentes tamaños de micropocillos, que pueden mejorar en gran medida la eficiencia en la carga de una sola célula en un micropocillo cuyo tamaño es significativamente más grande que la célula. Cabe destacar que este concepto de "doble bien" permite que el tamaño de la zona de cultivo para ajustarse de manera flexible sin afectar a la eficiencia de la captura de una sola célula, por lo que es fácil de ajustar el diseño del dispositivo para adaptarse a diferentes tipos de células y aplicaciones. Este método de alta eficiencia debería ser útil para experimentos de cultivo celular a largo plazo para los estudios de heterogeneidad celular y el establecimiento línea celular monoclonal.
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Protocol
Nota: Los diseños photomask para nuestra fabricación de dispositivos de microfluidos se elaboraron mediante el uso de un software de diseño asistido por ordenador (CAD). Los diseños fueron luego utilizados para la fabricación de máscaras de cromo utilizando un servicio comercial. Los dispositivos de PDMS se hicieron usando técnicas de litografía blanda. 11
1. La fabricación de moldes por Maestro Litografía
- Antes de que el proceso de fotolitografía 12, utilizar las obleas de silicio de 4 pulgadas como sustrato y deshidratar las obleas en un horno convencional a 120 ° C durante 10 min.
- Limpiar las obleas de silicio deshidratados mediante el uso de tratamiento con plasma de oxígeno a 100 vatios durante 30 segundos en un limpiador de plasma.
- Precalentar dos placas de cocción a 65 ° C y 95 ° C, respectivamente, para el siguiente proceso de cocción.
- Escudo 5 g de resina fotosensible negativo (PR) sobre las obleas de silicio limpiados por una recubridora de rotación; centrifugado a 1200 rpm (SU-8 50) durante 30 segundos para producir la capa de microcanal.
- Coloque el PRrecubierto de la oblea en una placa caliente precalentado a 65 ° C durante 12 min y la transfiere a otra placa de cocción precalentado a 95 ° C durante 33 min (para 100 micras patrones de espesor) para llevar a cabo un proceso de horneado suave.
- Después de la cocción, colocar la oblea de silicio recubierto de PR en el titular de un alineador de máscara semiautomático y alinearla a una fotomáscara transparencia 25.400 dpi de resolución.
- Exponer el revestido PR oblea de silicio a la luz UV (365 nm) a una dosis de 500 mJ / cm 2 para crear el patrón de PR en la oblea de silicio.
- Retire la oblea del alineador y colocarlo sobre una placa caliente para la post-cocción a 95 ° C durante 12 minutos.
- Remojar las obleas en SU-8 desarrollador de soluciones (acetato de éter monometílico de propilenglicol, PGMEA) para lavar PR no reticulado para 12 min y secar suavemente con gas nitrógeno para exponer las marcas de alineación.
- Una vez más, la capa 5 g de resina fotosensible negativo en las obleas por una recubridora de rotación; centrifugado a 700 rpm (SU-8 100) durante 30 seg y 1.200 rpm (SU-8 10) durante 30 seg para 300 y# 181; m patrón de espesor y 27 micras de espesor, respectivamente patrón para hacer la capa de microplaca.
- Colocar la oblea PR recubierta por una placa caliente a 65 ° C durante 4 min y a 95 ° C durante 8 minutos (de 27 micras capa de captura-pozo profundo); y a 65 ° C durante 40 min ya 95 ° C durante 110 minutos (para 300 micras capa de cultivo de pozo profundo).
- Después de enfriar, colocar la oblea de silicio recubierto de PR en el alineador de máscara equipada con luz UV.
- Exponer la oblea de silicio recubierto de PR a la luz UV (365 nm) a una dosis de 250 mJ / cm 2 (para 27 micras patrón de espesor) y 700 mJ / cm 2 (para 300 micras patrón de espesor).
- Hornear las obleas a 95 ° C durante 5 min (27 m patrón de espesor) y 30 min (300 m patrón de espesor), respectivamente.
- Lavar el PR no reticulado por el PGMEA durante 6 minutos (27 micras patrón de espesor) y 25 min (300 m patrón de espesor), respectivamente, y luego secarlos con gas nitrógeno.
- Medir la altura del modelo ofrece enla oblea con un perfilómetro láser de barrido mediante la colocación de la oblea en el xy etapa de un perfilómetro láser de barrido.
- Ajustar el plano focal para mostrar claramente el modelo ofrece en la oblea mediante el uso de la "vista de la cámara" modo de observación bajo un lente objetivo de 20X.
- Cambiar el modo de observación a partir de "vista de la cámara" a "vista de láser", y establecer las posiciones superior e inferior de las características.
- Ajuste el modo de medición, área, calidad, y z-terreno de juego hasta transparente (arriba), 1 línea (1.024 x 1), de alta precisión y 0,5 micras, respectivamente, y luego presione la parte inferior de inicio para comenzar la medición.
2. Preparación de dispositivos PDMS para el aislamiento de células individual
- Antes de PDMS de colada, se silaniza los moldes maestros con triclorosilano para crear una superficie hidrófoba, que hace que sea más fácil de pelar las réplicas de PDMS de los moldes maestros.
- Colocar los moldes maestros y un bote que contiene ponderación200 l de triclorosilano en un desecador, y aplicar vacío (-85 kPa) durante 15 min.
- Detener el vacío y luego dejar los moldes maestros en el desecador hasta silaniza los moldes maestros a temperatura ambiente durante al menos 1 hora.
- Retirar los moldes maestros del desecador y coloque cada molde maestro en una placa de Petri de 10 cm.
- Mezcle una cantidad total de 17,6 g de polímero PDMS kit que contiene una base y un agente endurecedor en una proporción de 10: 1, y luego verter el PDMS en el molde maestro en la placa de Petri.
- Coloque la placa de Petri en un desecador y aplicar vacío (-85 kPa) durante 1 hora para eliminar las burbujas de aire en el PDMS.
- Retire la placa de Petri del desecador y colocarlo en un horno convencional a 65 ° C por 3 - 6 horas para curar el PDMS.
- Retire las réplicas de PDMS curado de los moldes maestros y perforar dos agujeros como una entrada y una salida en los dos extremos del microcanal en la matriz PDMS réplica de captura-bien por un golpeador con diámetro interno de 0.75 mm para el canal fluídico (Figura 2A).
- Use cinta para limpiar la superficie de las réplicas de PDMS y, a continuación, colocar las réplicas de PDMS en un limpiador de plasma para el tratamiento con plasma de oxígeno breve (100 vatios para 14 seg).
- Retire las réplicas de PDMS de la máquina de plasma de oxígeno.
- Alinear una parte superior (que contiene los pocillos de captura) y un fondo (PDMS que contienen los pocillos de cultivo) réplica de la mano bajo un microscopio estereoscópico y ponerlos en contacto.
- Colocar las réplicas de PDMS alineados en un horno a 65 ° C durante 24 horas para conseguir una unión permanente entre las réplicas de PDMS para formar el dispositivo final.
- Remojar el dispositivo de PDMS en una desionizada (DI) contenedor lleno -agua y colocar el recipiente en un desecador a vacío (-85 kPa) durante 15 minutos para eliminar el aire del microcanal del dispositivo de PDMS.
- Coloque el dispositivo de PDMS lleno de agua DI en una campana de cultivo de tejidos y el uso de la luz ultravioleta (longitud de onda de la luz: 254 nm) para esterilizar del dispositivo de 30 minorte.
- Reemplazar el agua DI en el dispositivo de PDMS con una albúmina de suero bovino 5% (BSA) en solución 1x PBS y se incuba a 37 ° C durante 30 min para evitar que las células se adhieran a la superficie de PDMS.
Nota: El revestimiento BSA es crítica para mejorar la eficacia de la transferencia de células aisladas de captura-bien a la cultura pocillos. - Reemplazar la solución de BSA 5% en el dispositivo de PDMS con solución de 1x PBS esterilizado.
3. Preparación de la suspensión de células individual
- Cultura Neural vástago KT98 celular, y A549 de células de carcinoma humano y MDA-MB-435 que en placa de Petri en una incubadora de cultivo celular convencional (37 ° C, 5% de CO 2, y 95% de humedad) para preparar células para el experimento de células dispositivo PDMS .
- Retirar y desechar el medio de cultivo gastado (medio basal DMEM suministrado con 10% de suero bovino fetal y 1% de antibióticos) de la placa de cultivo con las células cultivadas a 70 - 80% de confluencia.
- Lave suavemente las células con PBS tres veces esterilizados. </ Li>
- Retirar y desechar el PBS y añadir 2 ml de una mezcla de enzimas proteolíticas, con recombinante, y las actividades de DNasa colagenolıticas (consulte la Lista de materiales para la información detallada).
- Incubar la placa de cultivo a temperatura ambiente durante 5 minutos, y luego pulse en la placa de cultivo para facilitar el desprendimiento de células.
- Añadir 4 ml de PBS esterilizada para dispersar las células, y luego transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar el tubo a 300 xg durante 3 min y separar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS esterilizados y contar el número de células vivas mediante el método de exclusión con azul de tripano estándar de 13.
Nota: Este paso de resuspensión es crítica para la preparación de la suspensión de una sola célula así disociado-para mejorar la eficacia de aislamiento de una sola célula.
4. Aislamiento de celda única y Cultura clonal
- Carga de 50 l de suspensión de células a una concentración de 2.2 a 2.5 x10
- Cargar otros 50 l de suspensión celular a través del orificio de entrada para llenar de manera uniforme por todo el microcanal con las células.
- Sellar el orificio de salida con un tapón (a, diámetro de la línea de pesca corte nylon 1 mm 3 mm de largo) para evitar el flujo inducido por la presión hidrostática de las gotitas en orificios de entrada y de salida.
Nota: Los tapones eran UV esterilizado dentro de una campana de cultivo de tejido antes de su uso. - Llenar una jeringa estéril de 1 ml con medio de cultivo, expulsar las burbujas de aire, y lo puso en una bomba de jeringa.
- Conectar la jeringa cargada medio para el orificio de entrada del dispositivo de PDMS a través de un G aguja roma 23 y un tubo de poli-tetrafluoroethene (PTFE).
- Retire el enchufe del orificio de salida y todosow un intervalo de tiempo de 2 minutos para permitir que las células se asiente sobre la captura de una sola célula de pozos por la fuerza gravitatoria.
- Lavar las células no capturadas con 300 l de medio de cultivo a una velocidad de flujo de 600 l / min impulsado por la bomba de jeringa.
- Espere 2 min para estabilizar el dispositivo, y sellar los orificios de entrada y de salida con tapones para formar un sistema de cultivo cerrado.
- Da la vuelta al dispositivo de mano para transferir las células únicas capturadas a los pocillos de cultivo.
- Coloque el dispositivo de PDMS en una placa de cultivo tisular de 100 mm, y añadir 10 ml de PBS esterilizado alrededor del dispositivo para evitar la evaporación cultura medio del microcanal.
- Mover la placa de cultivo a una incubadora convencional de cultivo de células (37 ° C, 5% de CO 2, y 95% de humedad) para el cultivo clonal de las células individuales.
5. Medio de cultivo Reposición
- Después de 1 d de la cultura, sustituir el medio de cultivo en el dispositivo de PDMS con un nuevo medio para mejorar la pr celularoliferation.
- Colocar dos gotas de medio de cultivo en la parte superior del dispositivo de PDMS cerca de las zonas orificios de entrada y de salida para evitar la introducción de burbujas de aire en el microcanal en el desempeño de la siguiente etapa.
- Haga dos agujeros de la parte superior del dispositivo de PDMS cerca de los dos extremos de la microcanal como una entrada y una salida para el microcanal.
Nota: No perforar a través enteras las dos capas del dispositivo de PDMS; En su lugar, simplemente perforar a través de la capa superior del PDMS. - Conectar una jeringa de plástico que contenía 1 ml de medio fresco a la entrada a través de una aguja de punta roma G 23 y el tubo de PTFE.
- El flujo medio de 120 l fresco en el dispositivo durante 5 minutos para reemplazar el medio de edad.
- Inserte dos tapones para sellar la entrada y salida agujeros, y devolver el dispositivo a la incubadora de cultivo celular.
- Refrescar el medio de cultivo cada 2 d durante el período de la cultura mediante la eliminación de los tapones de sellado, seguido de la repetición de los apartados 5.4 a 5,5.
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Representative Results
La plataforma de microfluidos para el aislamiento y cultivo de células individuales comprende un microcanal (200 micras de altura) con dos conjuntos de matrices de micropocillos (Figura 2A). Los dos conjuntos de matrices de micropocillos se denominan como de captura de pocillos (25 m de diámetro y 27 m de profundidad) y la cultura pocillos (285 micras de diámetro y 300 m de profundidad) para el aislamiento de células individuales y la cultura, respectivamente, y cada captura-bien se coloca en el centro de una cultura pocillos cuando se ve desde la vista superior (Figura 2B). Para el funcionamiento del dispositivo (el flujo de operación esquemática se ilustra en la Figura 1), el equipo requerido (bomba de jeringa, la incubadora de cultivo de tejidos, y microscopios) y materiales de construcción (jeringa, pipeta, y la tubería) son comúnmente disponibles en laboratorios biológicos. Por otra parte, la portabilidad y la transparencia de la plataforma permite que las células se pueden observar fácilmente y se analizaron en un dispositivo con una convenmicroscopio cional durante el experimento de cultivo celular.
La eficiencia de la captura de las células en la captura pozos después de los intervalos de paso de lavado a partir de 67,80 ± 11,38% a 85,16 ± 1,91% (dependiendo del tipo de célula) (Figura 3A). Por otra parte, la mayor parte de las capturas de los pozos contienen solamente una sola célula para los tres tipos de células (89.89% - 92.98%), lo que fue confirmado por el análisis del número de células cargadas en la cultura pozos (Figura 3B). La eficacia de aislamiento de una sola célula final en la cultura pozos fue de más de 76% para KT98 y células MDA-MB-435, pero sólo 61% para las células A549 debido a las diferencias de tamaño de celda entre los tipos de células ensayadas.
Para la investigación del cáncer, ensayo clonogénico de las células individuales se puede utilizar para probar la resistencia a fármacos y las tasas de proliferación de colonias de células individuales. El cultivo de células y ensayo clonogénico de las células individuales aisladas en nuestra platform se llevaron a cabo mediante la actualización del medio de cultivo cada 2 d. Esta demostración pone de relieve la aplicabilidad de este dispositivo para el estudio de la heterogeneidad celular en el nivel de células individuales mediante la medición de las diferencias en la supervivencia celular y las tasas de proliferación de las células individuales.
La tasa de heterogeneidad y la proliferación celular de las células aisladas se analizaron a partir de las imágenes adquiridas diaria. Los resultados mostraron que las células individuales aisladas podrían ser cultivadas para 7 d y exhiben diferentes patrones de crecimiento. Por ejemplo, 13% de las células aisladas no tenía la división celular y se mantuvo como una sola célula (Figura 4B), mientras que 17,5% de las células divide en más de 15 células y colonias de células formadas (figura 4A) durante el cultivo. heterogeneidad celular entre las células en proliferación también se evidenció por sus diferentes patrones de crecimiento de la formación de dos células (4,3%), tres células (2,5%), y 4 - 14 células(15%) en el experimento de cultivo celular (Figura 4C).
Estos resultados indicaron que la plataforma puede ser utilizado para el cultivo a largo plazo de células, ensayos clonogénicos, y los estudios heterogeneidad celular. Tener un gran número de colonias de células individuales que crecen en una pequeña área de la huella también hace que el análisis microscópico de las células más fácil.
. Figura 1. Esquema del flujo de la operación para el aislamiento de células individuales de alto rendimiento y la cultura en la plataforma de microfluidos El procedimiento de operación para el aislamiento de células individuales y cultivo clonal incluye 4 etapas: i) las células de carga en el microcanal por una punta de plástico y pipeta manual; ii) lavar las células no capturadas con medio de cultivo fresco impulsado por una bomba de jeringa; iii) después de sellar las aberturas de entrada y de salida con tapones, es elolated células fueron transferidas de captura de los pozos de cultivo a pocillos por voltear el dispositivo; y iv) realizar cultivos clonales (ensayo clonogénico) en la cultura pozos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Fotografía y las imágenes de SEM de la plataforma de aislamiento y cultivo de una sola célula de microfluidos. (A) plataforma microfluídica cargado con colorante rojo que muestra las estructuras de microcanales y de pocillos para el cultivo de una sola célula. (B) Una imagen representativa tomada de un dispositivo de corte, que muestra la vista lateral de tres unidades de aislamiento y cultivo clonal de una sola célula en la plataforma de microfluidos. Barra de escala: 100 micras. Imágenes de SEM de la cultura de una sola célula (C) y (D captura Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. KT98, A549, y MDA-MB-435 eficiencia de aislamiento de una sola célula en la plataforma de microfluidos. (A) La eficiencia de KT98, A549, y las células 435 MDA-MB-capturado en la captura de los pozos después de lavar las células de distancia no capturadas . La eficiencia de la captura de las células era de 67,80% a 85,16% en los tres tipos de células. (B) La relación de una sola célula de un total de cultivo de pozos (barra de barra) fue más del 76% de KT98 y MDA-MB-435, pero 61,63% para el A549. (C) Una imagen representativa de las células individuales KT98 individuo(Rojo, manchado con el perseguidor celular) aislado en grandes cultura pozos de cultivo clonal. Barra de escala: 300 micras. El número de células (D) en la celda ocupada de cultivo de los pozos de el modelo celular KT98. La relación de la cultura pozos fue 77,3%, con una sola célula, 16,31% sin células, 5.96% con dos células, y 0,43% con más de tres células. Las barras de error se representan como ± SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Cultivo de células, ensayo clonogénico, y el estudio heterogeneidad celular de las células A549 aislados en la plataforma de microfluidos para 7 d. (A) Una sola célula aislada crecieron y proliferaron a una colonia de células en cultivo de pocillos. (B) Una sola célula aislada sobrevivió, pero no dividió, después de 7 díasde la cultura. Barra de escala: 100 micras. (C) Las células individuales aisladas mostraron patrones de crecimiento heterogéneos después de haber sido cultivadas durante 7 días. Las barras de error se representan como ± SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Sistemas de dispositivos basados en micropocillos 6,14 se han utilizado para la manipulación de una sola célula y análisis, como única célula a gran escala atrapando 6 y la proliferación de células madre hematopoyéticas única 15. Aunque el tamaño así, el número y forma se puede ajustar para aplicaciones específicas, la eficacia de aislamiento de una sola célula se ve comprometida siempre cuando se aumenta el tamaño del pozo. 9,15
Para superar esta limitación, Park et al. Informó de un chip de microfluidos con micropocillos triangulares que tienen un alto de una sola célula atrapando tasa (58,34%), mientras que el tamaño de micropocillos se amplía para permitir la propagación de células y el crecimiento. Sin embargo, los micropocillos (con la longitud de un lado ~ 50 M) sólo podían apoyar la proliferación de células durante un máximo de 2 d. 16 Nuestra estrategia de doble así permite la carga de una sola célula en grandes micropocillos a no estar limitada por la probabilidad de que el Poisson distribución encontró en la limitación de Dilumétodos de y sistemas de pozos abiertos 3, como se ha demostrado, proporcionando una alta eficiencia de una sola célula de aislamiento (más de 75%) en grandes micropocillos cuyo tamaño era suficiente para la proliferación celular por lo menos durante 7 d (Figura 4A). Debido a su capacidad para llevar a cabo muy eficientemente el aislamiento de una sola célula y la cultura clonal con un dispositivo simple y procedimiento de operación, prevemos que nuestra plataforma de microfluidos podría constituir una herramienta útil para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la selección de células madre de cáncer por ensayo clonogénico 17 y el cribado de alto rendimiento de la cardiotoxicidad de los fármacos 18,19.
Una limitación importante de nuestro aislamiento y cultivo plataforma de una sola célula es que no se forma de cultivo de los pozos cerrados individualmente para evitar la interferencia entre células cultivadas en la cultura pozos. Por lo tanto, el comportamiento de las células puede ser afectada por la secreción paracrina de otras células individuales aisladas en el dispositivo microfluídico. el otsu limitación de nuestra plataforma es la necesidad de preparar relativamente suspensión de células de alta densidad para una alta eficiencia de aislamiento de una sola célula. Este consumo celular de alta puede limitar las aplicaciones de aislamiento de células raras y la cultura, tales como células de humor acuoso.
Antes de la operación del dispositivo, es importante para inyectar agua DI desde el orificio de entrada para llenar el microcanal y cuidadosamente observar cualquier fuga de fluido desde el dispositivo de PDMS de servidumbre. Las fugas de fluido afecta a la condición de flujo en el microcanal por tanto, podría afectar negativamente a la captura de células y el resultado la transferencia. Además, aunque nuestros resultados del estudio de una sola célula de eficiencia de carga muestran la pérdida de células muy baja después de la transferencia de las células aisladas de la captura de los pozos a la cultura pozos, lo que indica que la mayoría de las células podrían ser transferidos eficazmente por dar la vuelta al dispositivo, la eficiencia de la transferencia se reduce si la etapa de bloqueo BSA (2.12) no se realiza correctamente. Los usuarios pueden modificar el protocolo de bloqueo BSA o utilizar otrosmétodos alternati- vas de modificación de superficie para sus necesidades del experimento de células específicas (por ejemplo, aumentando la concentración o revestimiento tiempo BSA cuando se utiliza un tipo de célula más adherente). Las dimensiones de las células de captura-pozos son los factores dominantes, que necesitan ser optimizados para la mejor eficiencia de carga de una sola célula en la captura de los pozos, en función del tamaño del tipo de células específico de interés. Los altos múltiples células-in-a-captura-y eventos son debido a tener el tamaño de captura bien demasiado grande para el tipo de célula de interés, mientras que la baja eficiencia de carga de las células en el pozo de captura es una indicación de la magnitud de la captura de bienestar demasiado pequeña. También es importante para reducir al mínimo las agrupaciones de células en la suspensión de células individuales preparadas, como grupos de células pueden disminuir la eficiencia de carga de una sola célula en la captura-pozos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| SU-8 50 negative photoresist | MicroChem | Y131269 | |
| SU-8 100 negative photoresist | MicroChem | Y131273 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Scanning laser profilometer | KEYENCE | VK-X 100 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15072 | with 0.75 mm inner-diameter |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bersing Technology | ALB001.500 | |
| DMEM basal medium | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Hyclone | SH30071.03HI | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| Recombinant enzyme mixture | Innovative cell technology | AM-105 | Accumax |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Plastic syringe (1 ml) | BD Biosciences | 309659 | |
| 23 gauge blunt needles | Ever Sharp Technology, Inc. | TD21 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
References
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