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Medicine

用 CaspaseTracker 生物传感器检测 Anastasis体内

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis 在技术上具有挑战性检测在体内, 因为逆转细胞死亡过程的细胞可以从形态上区分正常健康细胞。在这里, 我们描述了通过使用我们新近开发的体内CaspaseTracker 生物传感器系统来检测和跟踪在活体动物中 anastasis 的细胞的协议。

Abstract

Anastasis (希腊语为 "上升到生活") 是最近被发现的细胞补救现象, 藉以垂危的细胞能逆转被假设是固有地不可逆转的晚阶段细胞死亡过程。促进 anastasis 原则上可以挽救或保存难以取代的细胞, 如心肌细胞或神经元, 从而促进组织的恢复。相反, 抑制癌细胞中的 anastasis, 在抗肿瘤治疗后细胞凋亡, 可确保癌细胞死亡, 减少复发几率。然而, 由于缺乏追踪活动物 anastasis 细胞命运的工具, 这些研究受到了阻碍。面临的挑战是确定细胞死亡的过程, 尽管它们在恢复后的形态正常的外观。为了克服这一困难, 我们开发了果蝇和哺乳动物 CaspaseTracker 生物传感器系统, 可以识别和永久跟踪 anastatic 细胞的体外或体内。在这里, 我们提出的在体内协议的产生和使用的 CaspaseTracker 双生物传感器系统检测和跟踪 anastasis 在果蝇后短暂接触细胞死亡刺激。虽然传统的生物传感器和协议可以标记细胞积极进行凋亡细胞死亡, CaspaseTracker 传感器可以永久标签细胞已经恢复后, 酶活化-一个标志的晚期细胞凋亡, 并同时确定活动的凋亡过程。这种生物传感器还可以追踪那些直接或间接参与酶活动的其他细胞死亡的细胞的恢复。因此, 这项议定书使我们能够不断追踪这些细胞及其后代的命运, 促进未来的生物学功能、分子机制、生理和病理后果的研究, 以及治疗的意义anastasis我们还讨论了适当的控制, 以区分接受 anastasis 的细胞从那些显示非凋亡的酶活动在体内。

Introduction

程序性细胞死亡, 如细胞凋亡, 通过在多细胞生物体中消除不需要的、受伤或危险的细胞, 在胚胎发育和正常的稳态中起重要作用1,2,3。细胞死亡和生存之间的平衡丧失可能导致致命的后果, 如癌症, 心力衰竭, 自身免疫和变性4,5,6,7,8。刽子手半的激活传统上被认为是 "没有返回点" 在细胞凋亡9,10,11, 因为它触发快速和大规模的蜂窝拆除12, 13、14、15、16。挑战这一一般教条, 我们证明, 培养的垂死的原细胞和癌细胞不仅可以恢复后酶活化, 而且还遵循重要的细胞死亡标志, 包括细胞膜起泡, 细胞萎缩,线粒体分裂, 线粒体细胞色素c释放到胞, 核和染色质缩合, DNA 损伤, 核分裂, 细胞表面暴露磷脂 (PS), 并形成凋亡体17,18,19,20,21. 我们建议, anastasis 是一种内在的细胞恢复现象, 因为死亡细胞可以恢复后, 细胞死亡的刺激17,18,19,20,21. 我们创造了术语 "Anastasis" (Αναστάσης)18, 这意味着 "上升到生活" 在希腊, 描述这个意想不到的细胞恢复现象。最近的独立研究进一步支持了我们对 anastasis 的观察, 这也显示了在磷脂外化22、23、24、有限的线粒体外部的恢复后的细胞膜性25, 混合谱系激酶样 (MLKL) 的激活, 和单元收缩26。

定性的机制调节 anastasis 将有范式转移的生理, 病理和治疗的影响。Anastasis 可能代表一个以前未知的细胞机制, 以抢救或保存重要的 postmitotic 细胞和组织难以取代, 并可能考虑心力衰竭逆转心室卸载左心室辅助设备 (LVADs)27,28, 在瞬态曝光过多光后恢复感光细胞29,3031, 或修复脑损伤后的神经元32。如果这样促进 anastasis 可以增强细胞和组织的恢复。相反, anastasis 可能是一个意想不到的逃生策略, 用于癌症细胞生存细胞死亡诱导治疗, 导致癌症复发17,18。因此, 在癌症治疗期间和之后抑制癌细胞的 anastasis 可能是一种新的治疗癌症的方法, 防止肿瘤复发。

在 anastasis 过程中, 我们发现一些恢复细胞获得永久性的基因改变, 并进行了致癌转化, 可能是由于在细胞凋亡期间发生的 DNA 损伤18,20,21.逆转 DNA 受损细胞的死亡过程可能是一种肿瘤发生的机制, 潜在的潜在的观察, 重复组织损伤增加了癌症的风险在各种组织, 如慢性热损伤的食道诱发由非常热的饮料的消耗量33,34,35, 由于酒精中毒的肝脏损伤36,37, 肿瘤演变在毒性癌症治疗以后38, 39,40, 以及在抗肿瘤治疗周期的间隔期间出现的正常组织的新癌症的发展41,4243,44.如果属实, 靶向 anastasis 可以预防或阻止癌症的发展和进展。我们发现, 饥饿诱导的垂死生殖细胞在再喂食的果蝇19中接受 anastasis。 如果 anastasis 发生在 DNA 损伤的生殖细胞中, 则可以解释长期环境压力促进遗传疾病的发展。例如, 饥荒有助于代遗传性疾病如糖尿病和冠心病的发展,45。因此, 了解 anastasis 可能导致预防这种潜在机制引起的遗传性疾病的战略。

利用 anastasis 的发现, 引导其发展创新的治疗方法, 研究 anastasis 在活体动物中的病因和后果是十分必要的。然而, 在技术上挑战识别和追踪 anastatic 细胞在体内, 因为从细胞死亡过程中恢复的细胞在形态上与正常的健康细胞没有区别, 并且没有生物标志物 anastasis已识别17,18,21。为了解决这些问题, 我们最近开发了一个新的体内酶生物传感器指定的 "CaspaseTracker"19, 以识别和跟踪细胞凋亡后, 酶激活19,46,凋亡的标志10,14。区别于 "实时" 酶生物传感器, 如散射12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51和 iCasper52检测正在进行的酶活动, CaspaseTracker 生物传感器另外还具有永久性标记酶活动的细胞的能力, 甚至是瞬时的。因此, CaspaseTracker 生物传感器可以在逆转酶介导的细胞死亡过程的 anastasis 后进行长期跟踪,在体内。

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Protocol

1) CaspaseTracker 生物传感器蝇的制备

  1. 麻醉飞行与 CO2, 并使用画笔将7到10酶敏感的 Gal4 (DQVD)19处女母和7到 10 G 跟踪53 Gal4 记者年轻的雄性苍蝇 (反之亦然) 在同一个小瓶中的苍蝇食品和新鲜酵母糊。
    注意:交叉的酶敏感 (DQVD) Gal4 和 G 迹蝇将产生 CaspaseTracker 后代苍蝇。跨酶-in 敏感 (DQVA)19 Gal4 和 G 跟踪苍蝇将提供负控制苍蝇 (见讨论)。新鲜的酵母糊作为蛋白质来源, 以提高卵子生产, 从而增加后代的数量。选择处女女性和年轻男性苍蝇根据他们的表型54。
  2. 在十字架上孵育18摄氏度 (oC), 在3至7天内, 然后将苍蝇转移到新的小瓶, 在18° c 下建立一个新的十字。继续孵化原瓶在18° c, 直到后代飞 eclose。
    注意:将母蝇转移到新的小瓶中, 以避免原瓶中的子代过度拥挤。在前2到3开关中, 母蝇可以产生新鲜食物和酵母糊的后代, 生产效率会随着时间的推移而显著降低。提高苍蝇18° c 可以减少非特异信号的 CaspaseTracker 生物传感器 (见讨论)。
  3. 选择后代与正确的表型54进行后续实验。
    注意:酶敏感 Gal4 和 G 迹的转基因位于第二染色体, 与天主教平衡。选择非卷曲翼子代 (无天主教), 转基因酶敏感 Gal4 和 G 迹。

2) 瞬态细胞死亡诱导在 CaspaseTracker 生物传感器飞行中的应用

  1. 将10至20新的 eclosed 雌性苍蝇移植到新的小瓶中, 新鲜的苍蝇食品和新鲜的酵母糊1天在18° c, 以允许蛋室生产由卵子。
    注意:雌蝇饲养雌性可提高蛋室产量。
  2. 通过冷休克诱导卵腔凋亡, 将雌性苍蝇转移到新的空瓶, 然后在-7 ° c 下放置1小时。
    注意: 通过诱导等离子膜破裂来伤害细胞的冷休克55,56。
  3. 为了诱导卵细胞通过蛋白质饥饿来进行凋亡, 将雌性苍蝇转移到一个新的小瓶中, 在18° c 的3天内用8% 蔗糖和1% 琼脂食品。
    注意:蛋白质饥饿 (非蛋白质食物) 可以触发卵子细胞凋亡57,58,59和自噬60,61。每天用8% 蔗糖和1% 琼脂食物切换到一个新的小瓶, 以保持蔗糖果蝇的最佳状态。
  4. 将受压力的苍蝇送回新的小瓶, 用新鲜的苍蝇食品和新鲜的酵母膏在18° c 的3天, 让他们恢复。解剖的饥饿和饥饿的恢复苍蝇获得卵子室在卵巢的描述62。
    注意:为了解剖果蝇以获得卵巢, 麻醉苍蝇与 CO2, 并使用2对镊子去除苍蝇头, 并使用镊子拉腹部的底部, 以消除苍蝇的卵巢。

3) 解剖蛋室的固定和染色

  1. 将解剖过的卵室连同大约0.5 毫升磷酸酯缓冲盐水 (PBS) 转移到1毫升离心管。让鸡蛋安定下来。
    注意:在水或 PBS 中溶解1% 牛血清白蛋白 (BSA) 的塑料吸管贴士, 防止蛋室粘在塑料表面的尖端。在黑暗中执行以下程序, 以避免漂白的红色荧光蛋白 (RFP, 也称为 DsRed) 和绿色荧光蛋白 (GFP) 在鸡蛋室。
  2. 通过移去除 pbs, 然后应用0.5 毫升4% 甲醛在 pbs, 以固定在室温下的鸡蛋室在黑暗中20至30分钟。
    注意:在此和以下孵化步骤中应用轻柔旋转。
  3. 用移去除甲醛, 然后用0.5 毫升 PBST (PBS + 0.1% 海卫 X-100) 清洗鸡蛋室3次。
    注意:长时间固定可以减少 RFP 和 GFP 信号。
  4. 在室温下或夜间在4° c 下用 PBST 孵育蛋室1至2小时, 以温和旋转 permeabilize 蛋室。
    注意: PBST 还可以避免蛋室粘在非 BSA 涂层塑料表面。
  5. 用移去除 PBST, 然后在室温下应用0.5 毫升10微克/毫升的蓝色核赫斯特染料在 PBST 到鸡蛋室中, 用1到2小时的温度来染色核。
    NOTE1:避免使用核染料延长潜伏期, 因为这会增加非特异信号。
    NOTE2:无赫斯特染色核的另一种方法是添加200μ l 抗漂白安装剂与 DAPI (见材料) 和孵化过夜63, 之前, 安装在玻璃覆盖滑动的组织, 如协议3.8 所述。
    NOTE3: 在黑暗中执行染色和以下步骤以避免漂白。
  6. 去除核染料由移, 然后应用0.5 毫升 PBST 洗蛋室在1毫升离心管3次, 与10到 20 min 孵化与柔和的自转在每个洗涤的步之间。
  7. 用细吸管移除所有 PBST, 然后应用200μ l 反漂白安装剂 (见材料), 在室温下孵育3小时或隔夜在4° c, 直到蛋室下沉到管子底部。
    注意: 已完全吸收安装代理下沉到管道底部的组织。
  8. 通过将200μ l 防漂剂在预清洗的玻璃玻片上转移, 将其安装在移上, 用 20 x 20 mm 预清洗过的玻璃盖板盖住蛋室, 并将玻璃滑块上的盖子滑动通过指甲油在盖子滑动的边缘。
    NOTE1:预清洗玻璃滑片和带水或70% 乙醇的盖子滑动。
    NOTE2:在玻片和盖板之间涂抹凡士林, 以避免 overcompression 的破坏。
  9. 使用荧光或共聚焦显微镜, 使用 20x, NA 0.8 计划-色差目标, 用激发光波长 405 nm 进行核染色 (检测发射 ~ 461 nm), 561 nm 为 RFP (正在进行或最近酶活动) 信号 (检测发射〜 590 nm), 和 488 nm GFP (过去酶活动) 信号 (检测发射〜 518 nm)。
    注意:查看我们的已发布的显微镜协议20,64。

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Representative Results

虽然时间推移活细胞显微镜是一种可靠的方法, 以道 anastasis 在培养细胞20, 它是挑战, 以确定哪些细胞已经经历了 anastasis 在动物, 因为恢复细胞出现形态上无法区分从没有尝试过细胞死亡的正常健康细胞。例如, 人宫颈癌 HeLa 细胞显示凋亡的形态学特征1,2,14, 如细胞萎缩, 核冷凝, 和细胞膜起泡, 以响应细胞死亡刺激 1µM staurosporine17 (图 1A,图 1B i-ii)。在去除细胞死亡刺激和孵化在新鲜的媒介之后, 垂危的细胞通过 anastasis17,18逆转细胞死亡过程, 如形态学恢复 (图 1B iii-iv所示),其次是增殖 (图 1B v-vi)。我们以前的研究也使用了 "实时" 酶生物传感器, 如 ApoAlert (其他 DEVD-YFP-), 以证明在酶激活18,20之后的细胞凋亡逆转。该生物传感器本地化于健康细胞中的胞 (图 1C, 1D i)。当细胞死亡刺激3.7% 乙醇触发的酶活化时, 这个 YFP 的生物传感器被半和移位切割成核, 在那里它积聚, 其 YFP 标记的核荧光识别细胞的持续酶活动 (图 1C, 1D ii-iii)。在乙醇诱导的过程中, 凋亡细胞也显示出形态学特征1,14,18,20, 如管状线粒体的碎裂, 核冷凝, 细胞收缩, 和等离子膜起泡 (图 1D ii-iii)。有趣的是, 在去除细胞死亡刺激后, 相同的细胞可以恢复, 并恢复正常形态 (图 1D iv-viii)。值得注意的是, ApoAlert (切割生物传感器) 的核荧光在1小时内消失在恢复的细胞 (图 1D iv-viii), 可能是由于类似的过程, 消除了 anastatic 细胞中损坏的组件18, 如 caspase-3、PARP 和 cad 在细胞凋亡过程中产生。因此, 需要一个新的策略来跟踪 anastasis 在较长时间内的帧, 特别是在体内。

为了追踪 anastatic 细胞的命运, 我们开发了哺乳动物 CaspaseTracker 生物传感器系统, 它在被刽子手酶活动切割后永久性的标记细胞。该生物传感器由一个酶敏感的 rtTA (反转四环素控制的反) 和一个以 LoxP 为基础的 rtTA 活动的记者 (图 2A-b) 组成。在没有酶活动的健康细胞中, 反 rtTA65被栓在等离子膜锚 (林恩11)6667, Map 激酶激酶 (MAPKK)68的核排除信号 (其他), 以及雌激素受体变体 (ERT2)69通过酶-裂解 (DEVD)70连接派生自 PARP (图 2A, 2B)。由于栓 rtTA 不能转移从胞到核, 它不能激活 rtTA 记者。然而, 当激活响应细胞死亡刺激, 半劈 DEVD 连接, 释放 rtTA 到转移的核心 (图 2B)。一旦在原子核中, rtTA 结合到春节反应元件 (重组) 和触发瞬态表达的综合考试, 这导致一个不可逆转的重组事件, 消除了停止密码盒之间的 CAG 启动子和编码序列红色荧光蛋白 (DsRed)。这就导致了 DsRed (图 2B) 的永久表达式, 它充当了那些在经历了酶活动后仍能存活的细胞的永久荧光标记, 以及它们的后代 (图 2C)。

为了测试哺乳动物 CaspaseTracker 生物传感器, 我们介绍了它进入 HeLa 细胞的瞬变转染, 治疗细胞的细胞死亡刺激 (1µM staurosporine), 并监测恢复细胞的时间推移活细胞共聚焦显微镜, 因为我们有描述了20。强力霉素 (1µg/毫升最终浓度), 这是必不可少的允许 rtTA 活动65,71, 被添加到细胞培养基上, 在整个实验中打开生物传感器。针对细胞死亡刺激, 治疗细胞显示凋亡的标志, 包括细胞萎缩和细胞膜起泡的预期 (图 2D i-iii)。在去除细胞死亡刺激之后, 冲洗细胞层一次, 并且增加新鲜培养基, anastasis 可以观察在垂危的细胞, 表明由他们的回归到正常形态学 (图 2D iv-vii)。诊断, 只有恢复的细胞在 anastasis (图 2D iv-vii) 期间和之后表达 DsRed 荧光标记, 并将它们与非恢复的单元 (图 2D iv-vii) 和控制单元区分开来没有暴露在细胞死亡刺激 (图 2E)。这说明了哺乳动物 CaspaseTracker 的应用和效用, 作为一种新的工具, 用于识别和永久标记 anastatic 细胞从酶激活恢复, 并提供了一种方法来跟踪和研究他们的长期命运。

为了检测和跟踪活体动物的 anastasis, 需要 CaspaseTracker 生物传感器转基因动物。因此, 我们首先使用果蝇作为模型系统19, 因为它是一个重要的基因驯服的有机体为研究动物发展和人类疾病72,73,74 ,75。从哺乳动物 CaspaseTracker 生物传感器的修改,果蝇双生物传感器可以识别和区分 "最近/正在进行" 从 "过去" 的酶活动。此双生物传感器由一个酶敏感的 Gal419和 Gal4 报告器 G 跟踪53 (图 3A) 组成。在没有酶活性的细胞中, 酵母转录因子 Gal4 通过从裂解 (图 3B) 派生的酶-DQVD 链接器 (DIAP1) 系到一个等离子膜锚 (mCD8) 域, 具有 21 nn/GV22 突变以防止退化Gal4 由 N 末端规则在链接器的酶分裂 afterAsp2076和 D135R 变异取消 drICE 酶抑制的作用在 BIR1 领域77。由于栓 Gal4 不可能转移对核没有分裂由酶释放它, Gal4 报告人 G 踪影保持不活泼在没有酶活动的细胞19。在酶激活, 但是, 激活半劈 DQVD 连接器, 释放 Gal4 到转移到核激活 G 跟踪记者 (图 3A)19。Gal4 绑定到特定的上游激活序列 (无人机), 以触发瞬态转录和 rfp 的表达, 然后作为一个荧光记者最近或当前的酶活动, 直到 Gal4 (酶) 活动停止, 然后 rfp 蛋白退化.Gal4 还触发了 FLP 重组从转基因的表达, 导致一个重组事件, 消除了在泛素 (Ubi) 启动子之间的停止密码盒和核目标 GFP (nucGFP) 的编码序列。这就导致了 nucGFP 的永久性表达, 它是那些经历过酶活动并活着的细胞的永久性标记。

为了测试果蝇CaspaseTracker 生物传感器检测细胞凋亡和 anastasis在体内, CaspaseTracker 雌性果蝇受到生理压力 (图 3C), 如冷休克19, 可以有效触发细胞死亡, 包括酶活化、核凝聚和细胞收缩等指示的细胞凋亡19,78, 还有导致膜完整性损失和细胞质渗漏的低温坏死。内容55,56。正如预期的那样, CaspaseTracker 在控制苍蝇的卵细胞中没有被激活 (图 3D)。相比之下, 受激苍蝇的卵腔在冷休克后的一天不仅表现出特征性凋亡细胞收缩和核凝结, 而且还有 rfp 和 gfp 表达, 表明最近或正在进行的 (rfp +) 和过去 (gfp +) 酶活动 (图 3E)。然而, 在3天后返回应力苍蝇到正常的非应力状态, GFP, 但没有 RFP, 在恢复的卵子室中检测到表达 (图 3F)。这表明, 在压力下表达酶活动的卵细胞能够克服细胞死亡的过程并存活。

为了进一步测试细胞死亡过程的可逆性在蛋室19, CaspaseTracker 女性苍蝇被强调蛋白质饥饿后被喂食8% 蔗糖1% 琼脂3天。先前的研究表明, 蛋白质饥饿可以触发酶介导的细胞凋亡和自噬在组织的体细胞和生殖细胞, 包括鸡蛋室57,60,61。正如所料, CaspaseTracker 在3天的蛋白质饥饿 (图 3G) 后在卵子室中被激活。垂死的卵子室显示了 RFP 和 gfp 生物传感器标记的凋亡形态和表达, 表明最近或正在进行的 (rfp +) 和过去 (gfp +) 酶活动 (图 3G)。为了证明 CaspaseTracker 可以追踪在死亡刺激之后酶激活的恢复细胞, 然后将饥饿的苍蝇转移到正常的含蛋白质的苍蝇食物中。如预期的, 这些再喂食苍蝇的恢复的蛋室缺乏 RFP 瞬态酶记者, 表明没有最近或正在进行的酶活动 (图 3H)。然而, 这些苍蝇的卵室在缓解压力后返回到正常的食品显示 GFP 酶记者 (图 3H), 表明这些卵细胞中的细胞已经逆转了启动的细胞死亡过程在一个点后酶激活。验证 CaspaseTracker 生物传感器活动是由酶触发的, 通过取代 DQVD 序列的 DQVA, 酶是无法切割和废除生物传感器活动 (图 3B, 3I).

在 CaspaseTracker 的果蝇从蛋白质饥饿中恢复后, 我们发现在卵细胞中的多种类型的细胞, 如体细胞 (卵泡) 细胞和系细胞 (护士细胞和卵母体), 只显示 GFP, 但不是 RFP (图3J)19, 指示这些单元格在酶激活后可以进行 anastasis。有趣的是, GFP 还标记了 germarium (图 3J)19中的单元格, 其中包含了干细胞, 以及它在同一 ovariole 链中的相关蛋室。因此, 这些 GFP 阳性的卵细胞可能来源于干细胞, 从细胞死亡过程中恢复酶活化后的细胞。重要的是, 饥饿和再饲养的雌性苍蝇产卵, 可以产生 GFP 表达的后代飞行19, 这表明潜在的细胞逆转细胞死亡过程后, 酶激活可以恢复明显正常功能。未来的研究是要确定是否后代果蝇, 生存的结果, anastasis 展览永久的后遗症。

Figure 1
图 1.细胞死亡诱导后 HeLa 细胞的恢复.
(A) 诱导细胞死亡的方法示意图, 随后允许死亡细胞在去除细胞死亡诱导后恢复。
(B) 对健康 HeLa 细胞 (i) 的时间推移活细胞 DIC 显微镜, 同组细胞在治疗后用 1µM staurosporine (ii), 然后用新鲜培养基冲洗和进一步孵育去除 staurosporine (三-vi)。白色箭头表示分隔单元格。
(C) 酶生物传感器融合蛋白的原理图-DEVD-YFP-免疫反应, 以及 YFP 在细胞死亡诱导和 anastasis 后的亚单位定位。
(D) 在暴露于3.7% 乙醇 (ii - iii) 中的一个 HeLa 细胞表达酶生物传感器融合蛋白 (DEVD YFP) 之前 (i) 的时间失效活细胞共聚焦显微镜, 并在从培养基中去除乙醇 (iv - viii)。这里显示的是酶生物传感器的图像 (绿色荧光, 顶排);合并图像的赫斯特染色核 (蓝色荧光) 和线粒体 (红色荧光) (中间行), 和图像在中间行进一步合并 DIC 图像 (底部行)。顶行的白色箭头表示核局部 YFP。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.哺乳动物 CaspaseTracker 生物传感器系统.
(A) 酶敏感 rtTA 的示意图。
(B) 哺乳动物 CaspaseTracker rtTA 生物传感器系统示意图。
(C) 使用 CaspaseTracker rtTA 生物传感器系统检测 anastasis 的流程图。红色或黄色三角 (应用细胞死亡诱导物) 和绿色或蓝色 (洗涤诱导者关闭) 符号是如图 1A。
(D) 在 (i) 之前, 在接触 1µM staurosporine (ii iii) 期间, 以及在移除staurosporine 来自区域性媒体 (iv - vii)。DIC 和 DsRed 信号的合并图像。箭头表示单元格 1 (黄色) 和单元格 2 (绿色)。
(E) 未处理的生物传感器表达 HeLa 细胞的时间推移活细胞共焦显微镜。DIC 和 DsRed 信号的合并图像。白色箭头表示分隔单元格。
强力霉素 (1 微克/毫升) 是存在于整个实验中, 在面板(D)和(E)中显示的。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.果蝇CaspaseTracker 双生物传感器系统。(获得唐 et al. 的批准, 科学报告 2015, 9: 901519).
(A)果蝇CaspaseTracker Gal4 生物传感器系统的原理图。
(B) 酶敏感 (DQVD) 和酶不灵敏控制 (DQVA) Gal4 的示意图。
(C)果蝇卵巢示意图, 以及在1天的果蝇中进行细胞死亡诱导的流程图, 然后在正常情况下进行3天的恢复。果蝇图像由达伦 Obbard 提供。
(D) 在6天 (未经处理) 用正常苍蝇喂食的雌性生物传感器的卵巢中, 有代表性的卵腔的共焦图像。
(E) 在-7 ° c 为1小时的冷休克雌性生物传感器的卵巢中, 有代表性的蛋室的共焦图像, 然后切换到正常的培养条件1天 (冷冲击, CS)。
(F) 像面板E一样, 除了冷休克苍蝇被切换到正常的文化条件3天 (恢复后 CS)。

(H) 象小组G , 除了被处理的苍蝇被交换了到正常飞行食物在蛋白质饥饿治疗以后3天 (再哺养)。
(I) 像面板G一样, 除了显示酶 in 敏感 CaspaseTracker (DQVA) 雌性生物传感器苍蝇的饥饿, 这是负控制.
(J) 从饥饿和再喂食的雌性果蝇中得到的具有代表性的卵子室的共焦图像。箭头表示核 GFP 表达在护士细胞 (黑色), 卵母细胞 (白色) 和卵泡 (黄色) 的卵腔, 并在 germarium (绿色)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.anastasis 的生理、病理和治疗意义。(获得唐等 al. 的许可, F1000Res 2017, 6:4321).请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

CaspaseTracker 双生物传感器系统是一种新颖和独特的工具, 允许检测最近或正在进行的酶活动, 并跟踪细胞已逆转细胞死亡的过程和生存后, 经历了酶活动在体内。虽然酶活动传统上被认为是细胞凋亡的标志, 但越来越多的研究表明, 非凋亡的酶活性在不同的正常细胞功能中扮演着潜在的角色, 如神经元活动的调节79,80,学习和内存81,82,83,84, 抑制 necroptotic 细胞死亡85,86, 精个性化87, 88、rna 处理89、单元增殖90和单元格命运模式91。除了细胞凋亡和 anastasis, CaspaseTracker 生物传感器系统可以检测非凋亡的酶活动, 这是存在于大脑和视神经叶, 贲门, 肠道, 氏管, 气管, 肌肉, 和其他组织的果蝇19,46,64。这种生物传感器信号也可以代表当前或过去的 anastatic 活动在胚胎发育或正常稳态的这些组织。研究活动物中瞬态细胞死亡诱发环境应激后的 anastasis, 在正常生理条件下选择无酶生物传感器活性的细胞组织是至关重要的, 但可诱发酶由瞬态细胞死亡诱导活化。蛋室是理想的为此目的, 因为他们通常没有酶活动从 germarium 到阶段10在卵子58,59,92。

将雌性果蝇暴露在短暂的环境压力下, 如蛋白质饥饿和冷休克, 可以有效地触发卵子中的酶活化和细胞死亡19,57,58, 78。该协议中的关键步骤包括避免对苍蝇进行长时间的细胞死亡诱导。蛋白质饥饿的优化条件 (8% 蔗糖在1% 琼脂3天) 和冷休克 (1 小时, 在-7 oC) 雌性苍蝇可以触发酶活化细胞死亡过程在鸡蛋室, 并允许他们恢复后, 受压力的苍蝇返回正常情况下为19。长期治疗的细胞死亡刺激可以触发更多的卵子室接受细胞死亡的过程, 但恢复率也减少, 大概是因为垂死的卵子室经历了巨大的损害无法修复。

该协议的另一个关键步骤是通过在较低温度 (如 18 oC) 交叉、提升和维护 CaspaseTracker 苍蝇, 减少卵腔中的 CaspaseTracker 背景信号。而大多数的蛋室从最佳饲养苍蝇不显示酶活动在 germarium 通过阶段10在卵子58期间, 大约1% 的蛋室可以展示酶生物传感器活动没有细胞死亡感应19.这可能反映了正常的损耗率, 由于先天的错误或可能被触发无意间在卵子的标准实验室条件。当 Gal4 在低温93中显示苍蝇的活动较少时, 在 18 oC 上提高苍蝇, 而不是在室温下, 可以减少激活 CaspaseTracker 系统的内源信号。或者, 将苍蝇转到更高的温度, 如 29 oC, 可以提高 CaspaseTracker 系统的灵敏度, 因为 Gal4 活动的增加是93, 而且可能还有其他内生温度依赖性酶活动.

重要的是要区分的 CaspaseTracker 阳性细胞, 经历细胞死亡过程或 anastasis 细胞, 表现出非凋亡的酶活动。凋亡细胞表达 RFP (正在进行或最近的酶活动的瞬态标记), 并且经常是 GFP (永久制造者为过去酶活动) 在细胞凋亡诱导的治疗, 因为这些垂危的细胞有持续的酶活动那劈激活的 Gal4,然后激活瞬态 (Gal4 活动依赖 RFP) 和永久性 (Gal4 触发 FLPase-首次登记的 GFP) 记者的 G 跟踪系统。这些细胞的凋亡可以通过形态学和生物化学的标志来证实. 核染料染色检测出的美国核凝结14、19、58和检测到的酶解理免疫19,94。由于 G 跟踪系统的 FLPase 介导的重组事件, 已经经历 anastasis 的细胞显示了永久性的 GFP 表达。这些细胞表达没有 RFP, 因为他们没有持续的酶活动, 也没有其他标志的凋亡19。这些细胞也显示正常的核形态。细胞确实有持续的非凋亡酶活动经常显示 RFP 和 GFP 表达, 也有正常的核形态19。

很难区分那些经历过非凋亡酶活动的细胞, 因为它们都只显示 GFP, 没有细胞死亡的 anastasis。因此, 仔细的控制实验必须包括19。举例来说, 要研究 anastasis 在鸡蛋室, 这是必要的审查 GFP 表达在两个应力恢复苍蝇和非应力苍蝇 (负控制)。如果 anastasis 在酶激活后发生, 恢复果蝇应显示更多的 GFP 表达细胞, 而非无重音的苍蝇。同样重要的是要区分 CaspaseTracker 荧光信号的非特异性自动荧光, 如观察到角质层, 颜料和脂肪体19。我们通过将生物传感器 (DQVD) 的酶裂解位置突变为非裂解序列 (DQVA), 从而使控制生物传感器不响应酶活动19, 从而产生了负控制生物传感器苍蝇。检测到的信号在酶敏感 (DQVD), 但不是在负控制 (DQVA) 生物传感器苍蝇是信号的兴趣, 触发的酶活动, 而不是自动荧光。

我们当前的果蝇双 CaspaseTracker 生物传感器可以通过 RFP 的表达式来识别具有 "最近" 酶活动的单元格, 并通过 GFP19的表达式通过 "过去" 酶活动的单元格。我们注意到, rfp 不是一个 "实时" 的酶活动指示器, 因为它需要几个小时的反应时间, Gal4 来驱动 rfp 的表达, 以响应酶的活动。为了添加 "实时" 功能,果蝇CaspaseTracker 生物传感器可以与最近开发的 iCasper 生物传感器52结合, 一个 "实时" 和 "暗到亮"的体内生物传感器, 只显示它的远红色信号, 当它是由半。

除了细胞凋亡外, CaspaseTracker 在其他类型的细胞死亡过程中也可能被激活, 因为细胞可以在其过程中直接或间接涉及酶激活的细胞死亡通路, 如自噬饥饿95,96, 由冷休克引起的等离子膜破裂的坏死19,55,56,78, 以及 staurosporine 诱导的 necroptosis97, 98。我们现在和以前的研究表明, CaspaseTracker 生物传感器可以标记细胞从这些细胞死亡归纳在体外或在体内17,18,19,20,21. 由于这些细胞死亡归纳单独可以同时激活多个细胞死亡通路在同一细胞中, 这些垂死细胞的恢复表明, anastasis 是一种普遍的细胞恢复现象, 可以逆转不同的细胞死亡包括细胞凋亡, 自噬, 坏死和 necroptosis, 单独或同时。

在体内CaspaseTracker 生物传感器将促进 anastasis 的未知功能、机制和治疗意义的追求, (图 4)21。为了揭示 anastasis 的分子特征, 我们在乙醇诱导的细胞凋亡逆转过程中, 对小鼠原发性肝细胞进行了全基因组基因表达微阵列的研究, 并发现了惊人的变化转录的基因涉及多个途径, 包括临生存, 抗氧化, DNA 损伤反应, 组蛋白修饰, 血管生成, 细胞迁移, 和转化18,21。这一发现得到了我们的证实. 人肝癌 HepG2 细胞凋亡恢复的研究18,21, 以及最近的一个独立的 RNA 测序研究 HeLa 细胞在细胞凋亡中的恢复99。有趣的是, 在心脏衰竭逆转, 肿瘤进展和癌症复发中也观察到 anastatic 细胞中一些临生存因子的调节,100,101,102, 建议anastasis 的潜在参与。为了研究 anastasis 的生理、病理和治疗潜能, 确定 anastatic 细胞并追踪它们在小动物中的命运是很重要的, 因为这将有助于机械和治疗研究。我们的果蝇和哺乳动物 CaspaseTracker 生物传感器将是测试 anastasis 在正常发育、稳态、组织恢复、肿瘤演变、癌症复发和转移等方面的潜在贡献的有用工具。从这些研究中发现, 将增加我们对 anastasis 的自然作用的理解, 并通过控制 anastasis 的细胞死亡和生存来为顽固性疾病的革命性的新治疗方法提供潜力。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢达伦 Obbard 为果蝇图像在图3C 和视频手稿;j ·哈德威克, 韦德吉布森和希瑟 m。这项工作由尤德爵士纪念研究金 (H.L.T.)、Dr. (H.L.T.)、富布赖特奖学金 (H.L.T.)、生命科学研究基金会奖学金 (H.L.T.)、K22 CA204458 (H.L.T.) 资助。Shurl 是生命科学研究基金会 (2014-2017) 的库尔奇基金会研究员。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

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药物 问题 132 Anastasis 凋亡 自噬 生物传感器 酶 CaspaseTracker 坏死 necroptosis 程序性细胞死亡 逆转细胞凋亡
用 CaspaseTracker 生物传感器检测 Anastasis<em>体内</em>
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Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

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