Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Påvisning af Anastasis In Vivo af CaspaseTracker Biosensor

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/54107
Automatic Translation
1,2, 2, 3
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Anastasis teknisk udfordrende for at opdage i vivo , fordi de celler, der har vendt den celle død proces kan være morfologisk umulig at skelne fra normale sunde celler. Her beskriver vi protokoller til påvisning og spore celler, der undergår anastasis i levende dyr ved hjælp af vores nyudviklede i vivo CaspaseTracker biosensor system.

Abstract

Anastasis (græsk for "stigende til liv") er en nylig opdaget celle opsving fænomen hvor døende celler kan tilbageføre sene celle død processer, som generelt antages for at være uløseligt irreversibel. Fremme anastasis kunne i princippet redning eller Bevar sårede celler, der er svære at erstatte såsom cardiomyocytes eller neuroner, dermed at lette væv opsving. Omvendt, undertrykke anastasis i kræftceller, undergår apoptose efter anti-kræft behandlinger, kan sikre kræft celledød og mindske risikoen for tilbagefald. Men disse undersøgelser har været hæmmet af manglen på værktøjer til at spore skæbnen af celler, der undergår anastasis med levende dyr. Udfordringen er at identificere de celler, der har vendt celle dødsprocessen trods deres morfologisk normale udseende efter helbredelse. For at overvinde denne vanskelighed, har vi udviklet Drosophila og pattedyr CaspaseTracker biosensor systemer, der kan identificere og permanent spore anastatic celler in vitro eller i vivo. Vi præsenterer her, i vivo protokoller til produktion og brug af CaspaseTracker dual biosensor system til at registrere og spore anastasis i Drosophila melanogaster efter forbigående eksponering for celle død stimuli. Mens konventionelle biosensorer og protokoller kan mærke cellerne aktivt undergår apoptotisk celledød, CaspaseTracker biosensor permanent kan mærke celler, der har genvundet efter caspase aktivering - kendetegnende for sene apoptose, og samtidig identificere aktive apoptotiske processer. Denne biosensor kan også spore inddrivelse af de celler, der forsøgte andre former for celledød, der direkte eller indirekte involveret caspase aktivitet. Derfor, denne protokol giver os løbende spore disse celler og deres afkom, lette fremtidige studier af biologiske funktioner, molekylære mekanismer, fysiologiske og patologiske konsekvenser og terapeutiske virkninger af skæbne Anastasis. Vi diskuterer også de passende kontrol for at skelne mellem celler, der undergår anastasis fra dem, der viser ikke-apoptotiske caspase aktivitet in vivo.

Introduction

Programmeret celledød, såsom apoptose, spiller en væsentlig rolle i embryonale udvikling og normal homøostase ved at fjerne uønskede, tilskadekomne eller farlige celler i flercellede organismer1,2,3. Tab af balance mellem celledød og overlevelse kan føre til fatale konsekvenser som kræft, hjertesvigt, autoimmunitet og degeneration4,5,6,7,8. Aktivering af bøddel caspases har traditionelt været betragtet som "point of no return" i apoptose9,10,11, som det udløser hurtig og massiv cellulære nedrivning12, 13,14,15,16. Udfordrende denne generelle dogme, viste vi at kulturperler døende primære celler og kræftceller kan genoprette ikke kun efter caspase aktivering, men også følgende vigtige celle død kendetegnende herunder plasma membran blebbing, celle svind, mitokondrie fragmentering, frigivelse af mitokondrie cytokrom c i cytosol, nukleare og kromatin kondens, DNA-skader, nukleare fragmentering, celle overflade eksponering af Phosphatidylserin (PS), og dannelsen af apoptotiske organer 17 , 18 , 19 , 20 , 21. foreslår vi at anastasis er en iboende celle opsving fænomen, som døende celler kan genoprette efter fjernelse af celle død stimuli17,18,19,20, 21. Vi opfandt udtrykket "Anastasis" (Αναστάσης)18, hvilket betyder "stiger til livet" på græsk, at beskrive fænomenet uventede celle opsving. Vores observation af anastasis understøttes yderligere af de seneste uafhængige undersøgelser, der også afslører inddrivelse af celler efter phosphatidylserin udlægning22,23,24, begrænset mitokondrie ydre membran permeabilization25, aktivering af blandet lineage kinase-lignende (MLKL), og celle svind26.

Kendetegner de mekanismer, der regulerer anastasis vil have paradigme-shifting fysiologiske, patologiske og terapeutiske virkninger. Anastasis kunne repræsentere en hidtil ukendt cytoprotective mekanisme til at redde eller bevare vigtige postmitotic celler og væv, der er vanskelig at erstatte, og eventuelt konto for hjertesvigt tilbageførsel af ventrikulær losning med venstre ventrikel hjælpe enheder (LVADs)27,28, inddrivelse af fotoreceptor celler efter forbigående eksponering af overdreven lys29,30,31, eller reparation af neuroner efter hjernen skade32. Hvis så fremme anastasis kunne øge celle og væv opsving. Omvendt kunne anastasis være en uventet undslippe taktik bruges af kræftceller til at overleve celle-død-inducerende terapi, forårsager kræft tilbagefald17,18. Derfor, undertrykke anastasis døende kræftceller under og efter kræftbehandling kan være en roman terapeutisk strategi at helbrede kræft ved at forhindre deres tilbagefald.

Under processen med anastasis, har vi fundet at nogle gendannede celler erhvervet permanent genetiske ændringer og undergik muterede transformation, sandsynligvis på grund af DNA-skader opstået under apoptose18,20,21 . Vende dødsprocessen af DNA-beskadigede celler kunne være en mekanisme af tumordannelse, potentielt underliggende den observation, at gentagne vævsskade øger risikoen for kræft i en række forskellige væv, såsom kronisk termisk skade i spiserøret induceret ved indtagelse af meget varme drikke33,34,35, leverskader på grund af alkoholisme36,37, tumor udvikling efter genotoksiske kræft terapi38, 39,40, og udvikling af nye kræfttilfælde fra normale væv, der opstår under intervallerne mellem cyklusser af anti-cancer terapi41,42,43,44 . Hvis sand, kunne målretning anastasis forhindre eller anholde kræft udvikling og progression. Vi har fundet, at sult-induceret døende kønsceller gennemgå anastasis i re fodret Drosophila19.  Hvis anastasis forekommer i kimceller med DNA-skader, kunne det være konto for den iagttagelse, at langvarig miljømæssige stress fremmer udviklingen af genetiske sygdomme. For eksempel, bidrage hungersnød til udviklingen af transgenerationel arvelige sygdomme som diabetes og koronar hjertesygdomme45. Derfor kunne forståelse anastasis føre til strategier til forebyggelse af udvikling af arvelige sygdomme forårsaget af denne potentielle mekanisme.

For at udnytte opdagelsen af anastasis og direkte til at udvikle innovative behandlinger, er det vigtigt at undersøge årsag og konsekvens af anastasis med levende dyr. Men det er en teknisk udfordring at identificere og spore anastatic celler i vivo, fordi de celler, der inddrives fra celle dødsprocessen vises morfologisk umulig at skelne fra normale raske celler, og der er ingen biomarkør for anastasis identificeret endnu17,18,21. For at løse disse problemer, vi for nylig udviklet en ny i vivo caspase biosensor udpeget "CaspaseTracker"19, til at identificere og spore celler, der overlever apoptose efter caspase aktivering19,46, den Hallmark af apoptose10,14. Adskiller det fra "real-time" caspase biosensorer såsom SCAT12,47, Apoliner48, CA-normal god landbrugspraksis49, ApoAlert18,50, C3AIs51 og iCasper52 der registrerer løbende caspase aktivitet, CaspaseTracker biosensor desuden egenskaber evne hen til permanent mærke cellerne at udtrykke caspase aktivitet selv forbigående. Derfor muliggør CaspaseTracker biosensor lang sigt sporing af anastasis efter tilbageførsel af caspase-medieret celle død proces in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1) forberedelse af CaspaseTracker Biosensor fluer

  1. Bedøver fluer med CO2, og brug en pensel til at overføre 7 til 10 caspase-følsomme Gal4 (DQVD)19 jomfruelige hunner og 7 til 10 G-Trace53 Gal4 reporter unge mandlige fluer (eller omvendt) i den samme hætteglas med flyve mad og frisk gær pasta.
    Bemærk: Tværs af Caspase-følsomme (DQVD) Gal4 og G-Trace fluer vil producere CaspaseTracker afkom fluer. Krydse af Caspase -ifølsomme (DQVA)19 Gal4 og G-Trace fluer vil give negativ kontrol flyver (Se diskussion). Frisk gær pasta fungerer som proteinkilde til at øge ægproduktionen, så det øger antallet af afkom. Vælg jomfruelige hunner og unge mandlige fluer ifølge deres fænotyper54.
  2. Inkuber fluer på 18 grader Celsius (oC) under korset i 3-7 dage, og derefter overføre fluer til en ny hætteglas til at oprette et nyt Kors ved 18 ° C. Fortsat at udruge det oprindelige hætteglas på 18 ° C, indtil afkom flyver velsmagende.
    Bemærk: Overføre de overordnede fluer til nye hætteglas at undgå overbefolkning af afkom på den oprindelige hætteglas. Overordnede fluer kan producere afkom med frisk mad og gær pasta på de første 2-3 parametre, og derefter produktiviteten mindskes betydeligt med tiden. At hæve fluer 18 ° C kan reducere uspecifikke signal af CaspaseTracker biosensor (Se diskussion).
  3. Vælg afkom flyver med korrekte fænotyper54 for følgende eksperimenter.
    Bemærk: Transgener både caspase-følsomme Gal4 og G-spor her er placeret på det andet kromosom, afbalanceret med CyO balancer. Vælg ikke-krøllede wing afkom (uden CyO), som har både transgener caspase-følsomme Gal4 og G-spor.

2) anvendelsen af forbigående celle død induktion til CaspaseTracker Biosensor fluer

  1. Overfør 10 til 20 nyligt eclosed kvindelige flyver til en ny hætteglas med friske flyve mad og frisk gær pasta i 1 dag ved 18 ° C til at tillade kammer ægproduktion ved oogenesen.
    Bemærk: At holde kvindelige med mandlige fluer kan øge ægproduktionen kammer.
  2. For at fremkalde æg kamre til at gennemgå apoptose ved cold stød, overføre de kvindelige fluer til nye tomme hætteglas, som derefter placeres på-7 ° C i 1 time.
    Bemærk: Cold stød skader celler ved at inducere plasmamembran brud55,56.
  3. For at fremkalde æg kamre til at gennemgå apoptose af protein sult, overføre de kvindelige fluer til en ny hætteglas med 8% saccharose og 1% agar mad ved 18 ° C i 3 dage.
    Bemærk: Protein sult (ikke-proteinholdige fødevarer) kan udløse æg kamre for at gennemgå apoptose57,58,59 og autophagy60,61. Skifte flyver til en ny hætteglas med 8% saccharose og 1% agar mad hver dag til at holde optimal tilstand af saccharose flyve mad.
  4. Overføre de stressede fluer tilbage til en ny hætteglas med friske flyve mad og frisk gær pasta i 3 dage på 18 ° C til at tillade dem at inddrive. Dissekere den sultet og udsultet-genvundet fluer at få æg kamre på æggestokkene som beskrevet62.
    Bemærk: For at dissekere Drosophila for at få æggestokkene, bedøver fluer med CO2, og brug 2 par pincet til at fjerne flyve hoved og bruge pincet til at trække bunden af maven til at fjerne æggestokkene af fluer.

3) fiksering og farvning af dissekerede æg kamre til billedbehandling

  1. Overføre dissekeret æg kamre sammen med omkring 0,5 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til 1 mL centrifugeglas. Tillad æg at slå sig ned.
    Bemærk: Coat plast pipette tips med 1% bovint serumalbumin (BSA) opløst i vand eller PBS til at undgå æg kamre til at holde på plast overfladen af tips. Udfør følgende procedurer i mørke til at undgå photobleaching af rødt fluorescerende proteiner (RFP, også kendt som DsRed) og grøn fluorescerende proteiner (NGL) i ægget kamre.
  2. Fjern PBS af pipettering, og derefter anvende 0,5 mL 4% PARAFORMALDEHYD i PBS kan lave æg kamre ved stuetemperatur i mørke for 20-30 min.
    Bemærk: Anvende blide rotation i dette og de følgende skridt, inkubation.
  3. Fjerne PARAFORMALDEHYD af pipettering, og så vaskede æg kammer med 0,5 mL PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) nemlig 3 gange.
    Bemærk: Langvarig fiksering kunne reducere RFP og normal god landbrugspraksis signaler.
  4. Inkuber æg kamre med PBST i 1 til 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C med blide rotation til permeabilize æg kamre.
    Bemærk: PBST kan også undgå æg kamre til at holde sig til den ikke-BSA belagte plastic overflade.
  5. Fjerne PBST af pipettering, og derefter anvende 0,5 mL af 10 μg/mL af blå nukleare Hoechst farvestof i PBST til æg kamre i 1 til 2 timer ved stuetemperatur til at plette kerne.
    NOTE1: Undgå forlænget inkubering med nukleare farvestof, da dette vil øge uspecifikke signal.
    NOTE2: Alternativ fremgangsmåde at plette kerne uden Hoechst er at tilføje 200 μl anti-blegning montering agent med DAPI (Se materialer), og der inkuberes natten63, før montering væv på glas dækning slip, som beskrevet på protokollen 3.8.
    NOTE3: udføre farvning og følgende procedurer i mørke til at undgå photobleaching.
  6. Fjerne den nukleare farvestof af pipettering, og derefter anvende 0,5 mL PBST at vaske æg kamre i 1 mL centrifugeglas nemlig 3 gange, med 10-20 min inkubation med blide rotation mellem hver vask trin.
  7. Fjern alle PBST med fine pipette, og derefter anvende 200 μl anti-blegning montering agent (Se materialer) at udruge ægget kamre ved stuetemperatur i 3 timer eller natten over ved 4 ° C indtil ægget kamre synker til bunden af røret.
    Bemærk: væv, der er fuldt absorberet montering agent synker til bunden af røret.
  8. Montere de farvede æg kamre ved at overføre dem med 200 μl anti-blegning montering agent på forhånd renset glas dias til billeddannelse af pipettering, dække æg kamre med en 20 x 20 mm pre rengjorte glas dækning slip, og forsegle den dække slip på glas dias ved at sætte neglelak på kanten af dækslet slip.
    NOTE1: Pre rene glas dias og dække slip med vand eller 70% ethanol.
    NOTE2: Anvende Vaselin mellem glas dias og dække slip at undgå at ødelægge æg kamrene af overcompression.
  9. Billede æg kamre ved hjælp af fluorescens eller Konfokal mikroskop, ved hjælp af en 20 x, NA 0,8 Plan-Apochromat målsætning, med excitations lys bølgelængde 405 nm for nukleare farvning (opdager emission ~ 461 nm), 561 nm for RFP (igangværende eller nylig caspase aktivitet) signal ( opdage emission ~ 590 nm), og 488 nm for normal god landbrugspraksis (tidligere caspase aktivitet) signal (opdage emission ~ 518nm).
    Bemærk: Se vores offentliggjorte protokoller for mikroskopi20,64.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mens time-lapse levende celle mikroskopi er en pålidelig metode til tarmkanalen anastasis i kulturperler celler20, er det udfordrende at identificere, hvilke celler har undergået anastasis i dyr, fordi de gendannede celler vises morfologisk skelnes fra normale sunde celler, der ikke har forsøgt celledød. For eksempel, vises menneskelige livmoderhalskræft HeLa celler morfologiske kendetegnende for apoptose1,2,14, såsom celle svind, nukleare kondens og plasma membran blebbing svar på celledød stimulus af 1µM staurosporine17 (figur 1A, figur 1B i-ii). Efter fjernelse af celle død stimulus og inkubation i frisk medium, reverse de døende celler celle dødsprocessen af anastasis17,18, som angivet af morfologiske recovery (figur 1B iii-iv), efterfulgt af spredning (figur 1B v-vi). Vores tidligere undersøgelser har også brugt "real-time" caspase biosensorer, såsom ApoAlert (NES-DEVD-YFP-NLS) at demonstrere tilbageførsel af apoptose efter caspase aktivering18,20. Denne biosensor lokaliserer til cytosol i raske celler (figur 1 c, 1 D, jeg). Ved caspase aktivering udløst af celle død stimulus 3,7% ethanol, er denne YFP-baserede biosensor kløvet af caspases og omplantes til kernen, hvor det ophobes og den deraf følgende nukleare fluorescens af sin YFP tag identificerer celler med igangværende caspase aktivitet (figur 1 C, 1 D ii-iii). De døende celler også vise morfologiske kendetegnende for apoptose i ethanol-induktion1,14,18,20, såsom fragmentering af rørformede mitokondrier, nukleare kondens, celle svind og plasma membran blebbing (figur 1 d ii-iii). Interessant, efter fjernelse af celle død stimulus, de samme celler kan genoprette og genvinde normale morfologi (fig. 1 d iv-viii). Især den nukleare fluorescens af ApoAlert (kløvet biosensor) er væk inden for 1 time i de gendannede celler (fig. 1 d iv-viii), muligvis på grund af lignende processer, der fjerner beskadigede komponenter i anastatic celler18 , kløvet caspase-3, PARP og ICAD genereret under apoptose. Derfor er en ny strategi nødvendig for sporing anastasis over en længere tidsramme, især i vivo.

For at spore skæbnen af anastatic celler, udviklede vi pattedyr CaspaseTracker biosensor system, som permanent etiketter cellerne efter at være kløvet af bøddel caspase aktivitet. Denne biosensor er sammensat af en caspase-følsomme rtTA (omvendt tetracyklin-kontrollerede transaktivatoren), og Cre-LoxP-baserede reporter for rtTA aktivitet (figur 2A-B). I raske celler med ingen caspase aktivitet, transaktivatoren rtTA65 er bundet til plasma membran anker (Lyn11)66,67, nucleus udstødelse signal (NES) af kort Kinase Kinase (MAPKK)68, og østrogen receptor variant (ERT2)69 gennem caspase-cleavable (DEVD)70 linkers afledt af PARP (figur 2A, 2B). Som tøjret rtTA ikke kan translocate fra cytosol til kernen, kan det aktivere rtTA reporter. Dog ved aktivering som svar på en celle død stimulus spaltes caspases DEVD linkers, frigøre rtTA til translocate til kernen (figur 2B). En gang i kernen, rtTA binder til tet svar element (TRE) og udløser forbigående udtryk for Cre recombinase, hvilket fører til en uomstødelig rekombination begivenhed, der fjerner stop codon kassette mellem CAG-promotor og kodning sekvenser for rødt fluorescerende proteiner (DsRed). Dette resulterer i permanent udtryk for DsRed (figur 2B), der tjener som den permanente fluorescerende markør af de celler, der kan forblive i live, efter at de har oplevet caspase aktivitet, samt deres afkom (figur 2 c).

For at teste den mammale CaspaseTracker biosensor, vi tilføres HeLa celler af forbigående Transfektion, behandlede celler med en celle død stimulus (1µM staurosporine), og overvåges inddrivelse af cellerne af time-lapse levende celle Konfokal mikroskopi, som vi har beskrevet20. Doxycyclin (1µg/mL endelige koncentration), som er afgørende for at tillade rtTA aktivitet65,71, blev føjet til cellekulturmedium at tænde biosensor hele eksperimentet. Svar på celle død stimulus vises de behandlede celler kendetegnende for apoptose, herunder celle svind og plasma membran blebbing som forventet (figur 2D i-iii). Efter at fjerne celle død stimulus, kan skylning celle lag engang og tilføje frisk næringssubstrat, anastasis observeres i de døende celler, som angivet ved deres tilbagevenden til en normal morfologi (figur 2D iv-vii). Diagnostisk, kun genvundet celler express DsRed fluorescerende markøren under og efter anastasis (figur 2D iv-vii), skelne dem fra både ikke-inddrevet celler (figur 2D iv-vii), og kontrol celler ikke udsættes for celle død stimulus (figur 2E). Dette viser anvendelse og nytteværdi af de pattedyr CaspaseTracker som en roman ny værktøj til at identificere og permanent mærkning anastatic celler at inddrive fra caspase-aktivering, og giver en måde at spore og studere deres langsigtede skæbne.

For at registrere og spore anastasis med levende dyr, er CaspaseTracker biosensor transgene dyr påkrævet. Derfor, vi først anvendte Drosophila melanogaster som en model system19, fordi det er en vigtig genetisk tractable organisme for studiet af dyrs udvikling og menneskelige sygdomme72,73,74 ,75. Modificeret fra pattedyr CaspaseTracker biosensor, kan Drosophila dual biosensor identificere og skelne "seneste/igangværende" fra "forbi" caspase aktivitet. Denne dobbelte biosensor er sammensat af en caspase-følsomme Gal419, og Gal4 reporter G-Trace53 (figur 3A). I celler med ingen caspase aktivitet, gær transskription faktor Gal4 er bundet til et plasma membran anker (mCD8) domæne gennem en caspase-cleavable linker (DQVD) afledt af DIAP1 (figur 3B), at have en 21NN/GV22 mutation at forhindre nedbrydning af Gal4 i N-end reglen ved caspase kavalergang linker afterAsp2076, og en D135R mutation at afskaffe drICE caspase hæmmende funktion i BIR1 domæne77. Som tøjret Gal4 ikke kan translocate til kernen uden spaltning af caspase at frigive det, forbliver Gal4 reporter G-sporing inaktiv i cellerne har ingen caspase aktivitet19. Ved caspase aktivering, men kløver aktiveret caspases DQVD linker, frigøre Gal4 til translocate i kernen til at aktivere G-Trace reporter (figur 3A)19. Gal4 binder til specifikke opstrøms aktivering sekvenser (UAS) til at udløse forbigående transskription og udtryk for RFP, der derefter fungerer som en fluorescerende reporter fra de sidste eller aktuelle caspase aktivitet indtil Gal4 (caspase) aktivitet stopper og derefter RFP protein er nedbrudt. Gal4 udløser også udtryk for FLP recombinase fra transgene, fører til en rekombination begivenhed, der fjerner stop codon kassette mellem en ubiquitin (Ubi) promotor og en kodende sekvens for kerne-målrettet normal god landbrugspraksis (nucGFP). Dette resulterer i permanent udtryk for nucGFP, der fungerer som en permanent markør af de celler, der har oplevet caspase aktivitet og forblive i live.

For at teste i Drosophila CaspaseTracker biosensor til påvisning af apoptose og anastasis blev i vivo, CaspaseTracker kvindelige flyver udsat for fysiologiske stress (figur 3 c), såsom kolde chok19, som effektivt kan Trigger celledød, herunder apoptose, som angivet af caspase aktivering, nukleare kondens og celle svind19,78, og også nekrose som følge af nedkøling, der forårsager tab af membran integritet og udsivning af cytoplasmatisk indholdet55,56. Som forventet, CaspaseTracker blev ikke aktiveret i ægget kamre af kontrol fluer hvor stress-relaterede celledød ikke blev fremkaldt (figur 3D). Derimod æg kamre af stressede fluer dagen efter cold stød viste ikke kun karakteristiske apoptotiske celle svind og nukleare kondens, men også RFP og normal god landbrugspraksis udtryk, hvilket indikerer tilstedeværelsen af de seneste eller igangværende (RFP +) og sidste (normal god landbrugspraksis +) caspase aktivitet (figur 3). På 3 dage efter hjemkomsten stresset fluer til normale ikke-understreger betingelse, normal god landbrugspraksis, men ingen RFP, blev udtryk fundet i den gendannede æg kamre (figur 3F). Dette indikerer, at æg kamre, der havde udtrykt caspase aktivitet efter stress var i stand til at overvinde den celle død proces og overleve.

Du kan yderligere teste reversibilitet af celle dødsprocessen i ægget kamre19, blev CaspaseTracker kvindelige fluer fremhævet af protein sult efter at blive fodret 8% saccharose i 1% agar i 3 dage. Tidligere undersøgelser viste, at protein sult kan udløse caspase-medieret apoptose og autophagy i væv med somatiske og kønsceller, herunder æg kamre57,60,61. Som forventet, blev CaspaseTracker aktiveret i ægget kamre efter 3 dage af protein sult (figur 3 g). De døende æg kamre udstillet både apoptotiske morfologier og udtryk for RFP og normal god landbrugspraksis biosensor markører, med angivelse af de seneste eller igangværende (RFP +) og forbi (normal god landbrugspraksis +) caspase aktivitet (figur 3 g). For at demonstrere, at CaspaseTracker kan spore gendannede celler, som tidligere oplevet caspase aktivering efter en død stimulus, blev udsultet fluer derefter overført til normale protein-holdige flyve mad. Som forventet, mangler den gendannede æg kamre af disse re fodret fluer RFP forbigående caspase reporter, der angiver ikke de seneste eller igangværende caspase aktivitet (figur 3 H). Men æg kamre i disse fluer efter at lindre stress af dem tilbage til normal mad vises normal god landbrugspraksis caspase reporter (figur 3 H), der angiver, at cellerne i disse æg kamre havde vendt indviede celle død proces på et tidspunkt efter caspase aktivering. Kontrol at CaspaseTracker biosensor aktivitet er udløst af caspase blev opnået ved at erstatte kavalergang sekvens DQVD med rækkefølgen af DQVA, hvilke caspase er ude af stand til at Kløve og som afskaffe biosensor aktivitet (figur 3B, 3I ).

Efter CaspaseTracker Drosophila genvundet fra protein sult, fandt vi, at flere typer af celler i æg kamre, såsom somatiske (follikel) celler og kønscelleoverførsel celler (sygeplejerske celler og oocyter), vises kun normal god landbrugspraksis, men ikke RFP (figur 3J )19, der angiver, at disse celler kan gennemgå anastasis efter caspase aktivering. Interessant nok, mærket normal god landbrugspraksis også celler i den germarium (figur 3J)19, som indeholder stamceller, sammen med dens tilknyttede æg kamre i den samme ovariole kæde. Derfor kan disse normal god landbrugspraksis-positive æg kamre have været afledt af stamceller, der har genvundet fra celle dødsprocessen efter caspase aktivering. Vigtigere er, flyver den sultet og re fodret kvindelige lægge frugtbare æg, der kan producere udtryk for normal god landbrugspraksis afkom fluer19, tyder på, at potentielt cellerne vendt celle dødsprocessen efter caspase aktivering kan genvinde tilsyneladende normal funktion. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at bestemme, hvis afkom fluer, der overlever som følge af anastasis udstille permanent sequelae.

Figure 1
Figur 1 . Inddrivelse af HeLa celler efter celle død induktion.
(A) skematisk diagram over tilgangen til at fremkalde celledød og efterfølgende tillade døende celler til at inddrive efter fjernelse af celle død inducer.
(B) Time-lapse levende celle DIC mikroskopi af sunde HeLa celler, (jeg), den samme gruppe af celler efter behandling med 1µM staurosporine (ii), og derefter vasket og yderligere inkuberes med friske næringssubstratet at fjerne staurosporine ( III-vi). Hvid pil angiver en dividere celle.
(C) skematisk diagram af caspase biosensor fusion protein NES-DEVD-YFP-NLS, og subcellulært lokaliseringen af YFP under celle død induktion og efter anastasis.
(D) Time-lapse levende celle Konfokal mikroskopi af en HeLa celler udtrykker caspase biosensor fusion protein NES-DEVD-YFP-NLS før (jeg), under eksponering til 3,7% ethanol (ii - iii), og efter at fjerne ethanol fra næringssubstratet (iv - viii). Vist her er billeder af caspase biosensor kun (grøn fluorescens, øverste række); flettet billeder af Hoechst-farvede kernen (blå fluorescens) og mitokondrier (rød fluorescens) (midterste række), og billeder i den midterste række yderligere fusioneret med DIC billeder (nederste række). Hvid pilene i øverste række angiver nukleare lokaliserede YFP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Mammale CaspaseTracker biosensor system.
(A) skematisk diagram af caspase-følsomme rtTA.
B skematisk diagram over den mammale CaspaseTracker rtTA biosensor system.
C rutediagram for at bruge CaspaseTracker rtTA biosensor system til at opdage anastasis. Rød/gul trekant (gælder celle død inducer) og grøn/blå (vask inducer off) symboler er som i figur 1A.
(D) time-lapse levende celle Konfokal mikroskopi af en klynge af HeLa celler, der udtrykker den mammale CaspaseTracker rtTA biosensor før (jeg), og under eksponering for 1µM staurosporine (ii - iii), og efter at fjerne staurosporine fra næringssubstratet (iv - vii). Flettede billeder af DIC og DsRed signaler. Pilene angiver cellen 1 (gul) og cell 2 (grøn).
(E) time-lapse levende celle Konfokal mikroskopi af ubehandlet biosensor-udtrykker HeLa celler. Flettede billeder af DIC og DsRed signaler. Hvide pile angiver delende celler.
Doxycyclin (1ug/mL) var til stede i medium hele eksperimenter vist i paneler (D) og (E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Drosophila CaspaseTracker dobbelt biosensor system. (Vedtaget med tilladelse fra Tang et al., videnskabelige rapporter 2015, 9:9015 19 ).
(A) skematisk diagram over Drosophila CaspaseTracker Gal4 biosensor system.
B skematisk diagram af caspase-følsomme (DQVD) og caspase-ufølsom kontrol (DQVA) Gal4.
C skematisk Drosophila æggestokken og rutediagram for celle død-induktion i 1 dag gamle fluer, efterfulgt af 3 dages opsving på normal tilstand. Drosophila billede leveret af Darren Obbard.
(D) repræsentative Konfokal billede af æg kamre fra æggestokkene af en kvindelig biosensor flyver fodret med normal flyve mad til 6 dage (ubehandlet).
E repræsentative Konfokal billede af æg kamre fra æggestokkene af en kold chokeret kvindelige biosensor flue placeret på-7 ° C i 1 time og så skiftede til normale kultur betingelse for 1 dag (Cold stød, CS).
(F) som panel E undtagen de kolde chokeret fluer var skiftet til normale kultur betingelse for 3 dage (gendannet efter CS).
(G) repræsentative Konfokal billede af æg kamre fra æggestokkene af en udsultet kvindelige biosensor flyver fodret med 8% saccharose i 1% agar uden protein i 3 dage (Starved).
(H) som panel G undtagen behandlede fluerne var skiftet til normal flyve mad til 3 dage efter protein sult behandling (re fodret).
(I) indkvartering, bedømmelseskomite G undtagen viser udsultning af caspase ifølsomme CaspaseTracker (DQVA) kvindelig biosensor fluer, der fungerede som negativ kontrol.
J repræsentant Konfokal billede af æg kamre fra et udsultet og re fodret kvindelige Drosophila. Pilene angiver nukleare normal god landbrugspraksis udtrykker i sygeplejerske celler (sort), oocyter (hvid) og hårsækken celler (gule) æg kamre, og i germarium (grøn). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Fysiologiske, patologiske og terapeutiske virkninger af anastasis. (Vedtaget med tilladelse fra Tang et al., F1000Res 2017, 6:43 21 ). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CaspaseTracker dobbelt biosensor system er en roman og unikt værktøj, der tillader detektering af de seneste eller igangværende caspase aktivitet, og sporing af celler, der har vendt celledød og overleve efter at have oplevet caspase aktivitet i vivo. Mens caspase aktivitet er traditionelt blevet antaget som kendetegnende for apoptose, viser voksende undersøgelser, at ikke-apoptotiske caspase aktivitet spiller potentielle roller i forskellige normal cellefunktioner, såsom regulering af neuronal aktivitet79, 80, læring og hukommelse81,82,83,84, undertrykkelse af necroptotic celle død85,86, spermatid individualisering87, 88, mikroRNA forarbejdning89, celle spredning90og celle skæbne mønster91. Ud over apoptose og anastasis, kan CaspaseTracker biosensor system derfor afsløre ikke-apoptotiske caspase aktivitet, som er til stede i hjernen og optik fliger, cardia, gut, Malpighian tubuli, luftrør, muskler og andre væv af Drosophila19,46,64. Denne biosensor signal kunne også repræsentere de nuværende eller tidligere anastatic aktivitet i løbet af embryo udvikling eller normal homøostase i disse væv. For at studere anastasis efter forbigående celle død-inducerende miljømæssige stress med levende dyr, er det kritisk at vælge væv med celler, der udviser ingen caspase biosensor aktivitet under normale fysiologiske forhold, men der kan være tilskyndet til at gennemgå caspase aktivering af forbigående celle død induktion. Æg kamre er ideelle til dette formål, fordi de har typisk ingen caspase aktivitet fra germarium til fase 10 under oogenesen58,59,92.

Udsætter kvindelige Drosophila for forbigående miljøbelastninger, kan såsom protein sult og kulde chok, effektivt udløse caspase aktivering og celledød i ægget kamre19,57,58, 78. Kritiske trin i protokollen omfatter undgå langvarig celle død induktion til fluer. Optimeret betingelserne for protein sult (8% saccharose i 1% agar for 3-dage) og cold stød (1 h på-7 oC) til kvindelige fluer kan udløse caspase-aktiveret celle dødsprocessen i ægget kamre, og tillade dem at inddrive efter de stressede fluer er vendt tilbage til normal tilstand19. Langvarig behandling med en celle død stimulus kan udløse flere æg kamre for at gennemgå celle død proces, men genfindingsprocenten er også reduceret, formentlig fordi de døende æg kamre opleve massive skader repareres.

Et yderligere vigtigt skridt i denne protokol er at reducere CaspaseTracker baggrund signal i ægget kamre ved at krydse, at øge og opretholde CaspaseTracker fluer ved en lavere temperatur, såsom 18 oC. Mens størstedelen af æg kamre fra optimalt opdrættet fluer vise ikke caspase aktivitet i germarium gennem scenen 10 under oogenesen58, omkring 1% af æg kamre kunne udstille caspase biosensor aktivitet uden celle død induktion19 . Dette kan afspejle de normale nedslidning sats på grund af medfødte fejl eller kan udløses utilsigtet under oogenesen af standard laboratorieforhold. Som Gal4 viser mindre aktivitet i fluer på lav temperatur93, kan hæve fluer på 18 oC, snarere end ved stuetemperatur, reducere den endogene signal, der aktiverer CaspaseTracker systemet. Alternativt, skifte flyver til en højere temperatur, såsom 29 oC, kan øge følsomheden af CaspaseTracker system, grund til at øge i Gal4 aktivitet93og potentielt andre endogene temperatur-afhængige enzymatisk aktiviteter.

Det er vigtigt at skelne mellem de CaspaseTracker-positive celler, der undergår celle dødsprocessen eller anastasis fra celler, der udviser ikke-apoptotiske caspase aktivitet. Apoptotiske celler express RFP (forbigående markør for igangværende eller nylig caspase aktivitet) og ofte (permanent maker for tidligere caspase aktivitet) NGL i behandling af apoptose induktion, som disse døende celler har løbende caspase aktivitet at kløve-aktiveret Gal4 som derefter aktiverer forbigående (Gal4 aktivitet-afhængige RFP) og faste (Gal4 udløst FLPase-FRT medieret normal god landbrugspraksis) journalister af G-Trace-system. Apoptose af disse celler kan bekræftes ved morfologiske og biokemiske kendetegnende sådanne amerikanske nukleare kondens opdaget ved farvning med nukleare farvestoffer14,19,58, og caspase kavalergang opdaget af immunfarvning19,94. Celler, der allerede har gennemgået anastasis vise permanent normal god landbrugspraksis udtryk på grund af hændelsen FLPase-medieret rekombination af G-Trace system. Disse celler udtrykker ingen RFP, som de har ingen igangværende caspase aktivitet, og heller ikke andre kendetegnende for apoptose19. Disse celler også vise normale nukleare morfologi. Celler har løbende ikke-apoptotiske caspase aktivitet ofte vise både RFP og normal god landbrugspraksis udtryk, og også har en normal nukleare morfologi19.

Det kan være svært at skelne celler, der oplevede anastasis fra de celler, der var tidligere ikke-apoptotiske caspase aktiviteter, fordi begge vises kun normal god landbrugspraksis og har ingen kendetegnende for celledød. Omhyggelig kontrol eksperimenter skal derfor være inkluderet19. For eksempler, for at studere anastasis i ægget kamre, er det vigtigt at undersøge normal god landbrugspraksis udtryk i både understregede-genvundet fluer og ikke-understregede fluer (negativ kontrol). Gendannede fluer skal vise mere udtryk for normal god landbrugspraksis celler end tryksvage fluer, hvis anastasis opstod efter caspase aktivering. Det er også vigtigt at skelne CaspaseTracker fluorescerende signaler fra uspecifik auto-fluorescens, som observerede i hårstrået, pigmenter og fedt organer19. Vi genereret negativ kontrol biosensor fluer af muterer caspase kavalergang site af biosensor (DQVD) til en ikke-cleavable sekvens (DQVA) og paafoerer kontrol biosensor ikke-responderende caspase aktivitet19. Signal registreret i caspase følsomme (DQVD) men ikke i negative kontrol (DQVA) biosensor fluerne er signalet om interesse, udløst af caspase aktivitet i stedet for auto-fluorescens.

Vores nuværende Drosophila dual CaspaseTracker biosensor kan identificere celler med "nyere" caspase aktivitet ved ekspression af RFP, og celler med "tidligere" caspase aktivitet af udtryk for normal god landbrugspraksis19. Vi bemærke, at RFP ikke er en "real-time" caspase aktivitet indikator, fordi det tager et par timer af aktiveringstiden for Gal4 til at køre udtryk for RFP svar på caspase aktivitet. For at tilføje en "real time" funktion, Drosophila CaspaseTracker biosensor kan kombineres med den nyligt udviklede iCasper biosensor52, en "real-time" og "mørke til lys" i vivo biosensor, der kun viser sin far-red signal, når det er kløvet af caspases.

Bortset fra apoptose, CaspaseTracker potentielt kunne også være aktiveret under alternative former for celledød som celler kan skifte celle død veje under deres kursus, der direkte eller indirekte involverer caspase aktivering, som autophagy efter sult95,96, nekrose af cold stød-induceret plasmamembran brud19,55,56,78, og staurosporine-induceret necroptosis97, 98. Vores nuværende og tidligere studier påvist, at CaspaseTracker biosensorer kan mærke cellerne inddrives fra disse celle død induktion i in vitro eller vivo17,18,19 , 20 , 21. som disse celle død induktioner alene kunne samtidig aktivere flere celle død veje i de samme celler, inddrivelse af disse døde celler tyder på, at anastasis er en generel celle opsving fænomen, der kan vende forskellige celledød processer herunder apoptose, autophagy, nekrose og necroptosis, hver for sig eller samtidigt.

I vivo CaspaseTracker biosensor vil lette udøvelse endnu ukendte funktioner, mekanismer og terapeutiske virkninger af anastasis ()figur 4)21. For at afsløre den molekylære underskrift af anastasis, udførte vi tidsforløb hele-genom gen expression microarray undersøgelser for at analysere musen primære leveren celler under tilbageførsel af ethanol-induceret apoptose, og interessant nok fandt markante ændringer i transkription af gener involveret i flere veje herunder Pro overlevelse, anti-oxidation, DNA skader svar, Histon modifikation, angiogenese, celle migration og transformation18,21. Dette fund understøttes af vores valideringsundersøgelsen af inddrivelse af menneskelige leverkræft HepG2 celler fra apoptose18,21, og også en nylig uafhængig RNA-sekventering undersøgelse af HeLa celler i inddrivelse af apoptose99. Interessant, op-regulering af nogle Pro overlevelse faktorer fundet i anastatic celler er også observeret i hjertesvigt tilbageførsel, tumor progression og kræft tilbagefald100,101,102, tyder på, den potentielle deltagelse af anastasis. For at studere de fysiologiske, patologiske og terapeutiske potentialer af anastasis, er det vigtigt at identificere anastatic cellerne og spore deres skæbne i små dyr, som herved bliver mekanistiske og terapeutiske undersøgelser. Vores Drosophila og pattedyr CaspaseTracker biosensorer vil være nyttige værktøjer til at teste de potentielle bidrag af anastasis i normale udvikling, homøostase, væv opsving, tumor udvikling, kræft tilbagefald og metastaser. Fund fra disse undersøgelser vil øge vores forståelse af den naturlige rolle af anastasis, og har potentiale til at identificere revolutionerende nye terapeutiske tilgange for genstridig sygdomme af mægle celledød og overlevelse gennem kontrollerende anastasis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Darren Obbard for Drosophila billedet i figur 3 c og video manuskript; J. Marie Hardwick, Wade Gibson og Heather M. Lamb for værdifuld diskussion af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af en Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright give 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation stipendium (H.L.T.), og NIC K22 give CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang var en Mettes og Kay Curci Foundation Fellow af Life Sciences Research Foundation (2014-2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  3. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Narula, J., et al. Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure. N Engl J Med. 335, 1182-1189 (1996).
  6. Nagata, S. Apoptosis and autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci. 1209, 10-16 (2010).
  7. Mattson, M. P. Apoptosis in neurodegenerative disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 120-129 (2000).
  8. Hotchkiss, R. S., Strasser, A., McDunn, J. E., Swanson, P. E. Cell death. N Engl J Med. 361, 1570-1583 (2009).
  9. Green, D., Kroemer, G. The central executioners of apoptosis: caspases or mitochondria? Trends Cell Biol. 8, 267-271 (1998).
  10. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 897-907 (2004).
  11. Kroemer, G., et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 16, 3-11 (2009).
  12. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  13. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14, 641-650 (2007).
  14. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 231-241 (2008).
  15. Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol Cell. 37, 299-310 (2010).
  16. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death Differ. 24, 1380-1389 (2017).
  17. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. Br J Cancer. 100, 118-122 (2009).
  18. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  19. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  20. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. J Vis Exp. , (2015).
  21. Tang, H. M., Talbot, C. C., Fung, M. C., Tang, H. L. Molecular signature of anastasis for reversal of apoptosis. F1000Res. 6, 43 (2017).
  22. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Exp Cell Res. , 16-21 (1999).
  23. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death Differ. 8, 182-191 (2001).
  24. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. J Nucl Med. 51, 259-267 (2010).
  25. Ichim, G., et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol Cell. 57, 860-872 (2015).
  26. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III Acts Downstream of MLKL to Regulate Necroptotic Cell Death and Its Consequences. Cell. 169, 286-300 (2017).
  27. Narula, J., Haider, N., Arbustini, E., Chandrashekhar, Y. Mechanisms of disease: apoptosis in heart failure--seeing hope in death. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 3, 681-688 (2006).
  28. Drakos, S. G., et al. Bridge to recovery: understanding the disconnect between clinical and biological outcomes. Circulation. 126, 230-241 (2012).
  29. McKechnie, N. M., Foulds, W. S. Recovery of the rabbit retina after light damage (preliminary observations). Albrecht Von Graefes Arch Klin Exp Ophthalmol. 212, 271-283 (1980).
  30. Milligan, S. C., Alb, J. G. Jr, Elagina, R. B., Bankaitis, V. A., Hyde, D. R. The phosphatidylinositol transfer protein domain of Drosophila retinal degeneration B protein is essential for photoreceptor cell survival and recovery from light stimulation. J Cell Biol. 139, 351-363 (1997).
  31. Gordon, W. C., Casey, D. M., Lukiw, W. J., Bazan, N. G. DNA damage and repair in light-induced photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3511-3521 (2002).
  32. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084 (2016).
  33. Castellsague, X., et al. Influence of mate drinking, hot beverages and diet on esophageal cancer risk in South America. Int J Cancer. 88, 658-664 (2000).
  34. Islami, F., et al. Tea drinking habits and oesophageal cancer in a high risk area in northern Iran: population based case-control study. BMJ. 338, b929 (2009).
  35. Loomis, D., et al. Carcinogenicity of drinking coffee, mate, and very hot beverages. Lancet Oncol. 17, 877-878 (2016).
  36. Boffetta, P., Hashibe, M. Alcohol and cancer. Lancet Oncol. 7, 149-156 (2006).
  37. McKillop, I. H., Schrum, L. W. Alcohol and liver cancer. Alcohol. 35, 195-203 (2005).
  38. Davis, A. J., Tannock, J. F. Repopulation of tumour cells between cycles of chemotherapy: a neglected factor. Lancet Oncol. 1, 86-93 (2000).
  39. Demedts, I. K., Vermaelen, K. Y., van Meerbeeck, J. P. Treatment of extensive-stage small cell lung carcinoma: current status and future prospects. Eur Respir J. 35, 202-215 (2010).
  40. Wagle, N., et al. Dissecting therapeutic resistance to RAF inhibition in melanoma by tumor genomic profiling. J Clin Oncol. 29, 3085-3096 (2011).
  41. Smith, R. E., et al. Acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome after doxorubicin-cyclophosphamide adjuvant therapy for operable breast cancer: the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project Experience. J Clin Oncol. 21, 1195-1204 (2003).
  42. Travis, L. B., et al. Second cancers among 40,576 testicular cancer patients: focus on long-term survivors. J Natl Cancer Inst. 97, 1354-1365 (2005).
  43. Chaturvedi, A. K., et al. Second cancers among 104,760 survivors of cervical cancer: evaluation of long-term risk. J Natl Cancer Inst. 99, 1634-1643 (2007).
  44. Moteabbed, M., Yock, T. I., Paganetti, H. The risk of radiation-induced second cancers in the high to medium dose region: a comparison between passive and scanned proton therapy, IMRT and VMAT for pediatric patients with brain tumors. Phys Med Biol. 59, 2883-2899 (2014).
  45. Painter, R. C., et al. Transgenerational effects of prenatal exposure to the Dutch famine on neonatal adiposity and health in later life. BJOG. 115, 1243-1249 (2008).
  46. Ding, A. X., et al. CasExpress reveals widespread and diverse patterns of cell survival of caspase-3 activation during development in vivo. Elife. 5, (2016).
  47. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  48. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  49. Nicholls, S. B., Chu, J., Abbruzzese, G., Tremblay, K. D., Hardy, J. A. Mechanism of a genetically encoded dark-to-bright reporter for caspase activity. J Biol Chem. 286, 24977-24986 (2011).
  50. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  51. Zhang, J., et al. Visualization of caspase-3-like activity in cells using a genetically encoded fluorescent biosensor activated by protein cleavage. Nat Commun. 4, 2157 (2013).
  52. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  53. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  54. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology : wild-type and classical mutants. xviii, Academic Press. London ; Waltham, MA. 224 (2013).
  55. Drobnis, E. Z., et al. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model. J Exp Zool. 265, 432-437 (1993).
  56. Quinn, P. J. A lipid-phase separation model of low-temperature damage to biological membranes. Cryobiology. 22, 128-146 (1985).
  57. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  58. Pritchett, T. L., Tanner, E. A., McCall, K. Cracking open cell death in the Drosophila ovary. Apoptosis. 14, 969-979 (2009).
  59. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  60. McPhee, C. K., Baehrecke, E. H. Autophagy in Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1793, 1452-1460 (2009).
  61. Barth, J. M., Szabad, J., Hafen, E., Kohler, K. Autophagy in Drosophila ovaries is induced by starvation and is required for oogenesis. Cell Death Differ. 18, 915-924 (2011).
  62. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. (52), (2006).
  63. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  64. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J Vis Exp. , (2016).
  65. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  66. Yamanashi, Y., et al. The yes-related cellular gene lyn encodes a possible tyrosine kinase similar to p56lck. Mol Cell Biol. 7, 237-243 (1987).
  67. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat Methods. 2, 415-418 (2005).
  68. Fukuda, M., Gotoh, I., Gotoh, Y., Nishida, E. Cytoplasmic localization of mitogen-activated protein kinase kinase directed by its NH2-terminal, leucine-rich short amino acid sequence, which acts as a nuclear export signal. J Biol Chem. 271, 20024-20028 (1996).
  69. Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochem Biophys Res Commun. 237, 752-757 (1997).
  70. Lazebnik, Y. A., Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Poirier, G. G., Earnshaw, W. C. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature. 371, 346-347 (1994).
  71. Mansuy, I. M., et al. Inducible and reversible gene expression with the rtTA system for the study of memory. Neuron. 21, 257-265 (1998).
  72. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  73. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13, 172-183 (2013).
  74. Yamamoto, S., et al. A drosophila genetic resource of mutants to study mechanisms underlying human genetic diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  75. Wangler, M. F., Hu, Y., Shulman, J. M. Drosophila and genome-wide association studies: a review and resource for the functional dissection of human complex traits. Dis Model Mech. 10, 77-88 (2017).
  76. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  77. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  78. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Jr Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  79. Jonas, E. A., et al. Proapoptotic N-truncated BCL-xL protein activates endogenous mitochondrial channels in living synaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13590-13595 (2004).
  80. Li, Z., et al. Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization. Cell. 141, 859-871 (2010).
  81. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  82. Maor-Nof, M., Yaron, A. Neurite pruning and neuronal cell death: spatial regulation of shared destruction programs. Curr Opin Neurobiol. 23, 990-996 (2013).
  83. Yu, F., Schuldiner, O. Axon and dendrite pruning in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 27, 192-198 (2014).
  84. Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends Cell Biol. 24, 515-523 (2014).
  85. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471, 363-367 (2011).
  86. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  87. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  88. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  89. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, (2014).
  90. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Killers creating new life: caspases drive apoptosis-induced proliferation in tissue repair and disease. Cell Death Differ. 24, 1390-1400 (2017).
  91. Weaver, B. P., Weaver, Y. M., Mitani, S., Han, M. Coupled Caspase and N-End Rule Ligase Activities Allow Recognition and Degradation of Pluripotency Factor LIN-28 during Non-Apoptotic Development. Dev Cell. 41, 665-673 (2017).
  92. Baum, J. S., Arama, E., Steller, H., McCall, K. The Drosophila caspases Strica and Dronc function redundantly in programmed cell death during oogenesis. Cell Death Differ. 14, 1508-1517 (2007).
  93. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
  94. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  95. Codogno, P., Meijer, A. J. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12 Suppl 2, 1509-1518 (2005).
  96. Tsapras, P., Nezis, I. P. Caspase involvement in autophagy. Cell Death Differ. 24, 1369-1379 (2017).
  97. Dunai, Z. A., et al. Staurosporine induces necroptotic cell death under caspase-compromised conditions in U937 cells. PLoS One. 7, e41945 (2012).
  98. Simenc, J., Lipnik-Stangelj, M. Staurosporine induces different cell death forms in cultured rat astrocytes. Radiol Oncol. 46, 312-320 (2012).
  99. Sun, G., et al. A molecular signature for anastasis, recovery from the brink of apoptotic cell death. J Cell Biol. , (2017).
  100. Milting, H., et al. Altered levels of mRNA of apoptosis-mediating genes after mid-term mechanical ventricular support in dilative cardiomyopathy--first results of the Halle Assist Induced Recovery Study (HAIR). Thorac Cardiovasc Surg. 47, 48-50 (1999).
  101. Haider, N., et al. Concurrent upregulation of endogenous proapoptotic and antiapoptotic factors in failing human hearts. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 6, 250-261 (2009).
  102. Strik, H., et al. BCL-2 family protein expression in initial and recurrent glioblastomas: modulation by radiochemotherapy. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 67, 763-768 (1999).

Tags

Medicin sag 132 Anastasis apoptose autophagy biosensor caspase CaspaseTracker nekrose necroptosis programmeret celledød tilbageførsel af apoptose
Påvisning af Anastasis <em>In Vivo</em> af CaspaseTracker Biosensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H.… More

Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter